Summary
यहां, हम मोनोकुलर दृश्य अभाव और नेत्र प्रभुत्व प्लास्टिसिटी विश्लेषण के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, जो महत्वपूर्ण अवधि के दौरान दृश्य प्लास्टिसिटी के तंत्रिका तंत्र और विशिष्ट जीन के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण तरीके हैं दृश्य विकास।
Abstract
प्राथमिक दृश्य कॉर्टिकल प्रतिक्रिया प्लास्टिसिटी को प्रेरित करने के लिए मोनोकुलर दृश्य अभाव एक उत्कृष्ट प्रयोगात्मक प्रतिमान है। सामान्य तौर पर, उत्तेजना के लिए कॉन्ट्रालेटरल आंख के लिए कॉर्टेक्स की प्रतिक्रिया माउस प्राथमिक दृश्य प्रांतस्था (V1) के दूरबीन खंड में इप्सिलेटरल आंख की प्रतिक्रिया की तुलना में बहुत मजबूत है। स्तनधारी महत्वपूर्ण अवधि के दौरान, कॉन्ट्रालेटरल आंख को मजबूत करने से वी 1 कोशिकाओं की जवाबदेही का तेजी से नुकसान होगा। ट्रांसजेनिक प्रौद्योगिकियों के सतत विकास के साथ, अधिक से अधिक अध्ययन नेत्र प्रभुत्व (ओडी) प्लास्टिसिटी पर विशिष्ट जीन के प्रभावों की जांच करने के लिए प्रयोगात्मक मॉडल के रूप में ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग कर रहे हैं। इस अध्ययन में, हम मोनोकुलर दृश्य अभाव के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल पेश करते हैं और माउस V1 में ओडी प्लास्टिसिटी में परिवर्तन की गणना करते हैं। महत्वपूर्ण अवधि के दौरान 4 दिनों के लिए मोनोकुलर अभाव (एमडी) के बाद, प्रत्येक न्यूरॉन के अभिविन्यास ट्यूनिंग घटता मापा जाता है, और V1 में परत चार न्यूरॉन्स की ट्यूनिंग घटता इप्सिलेटरल और कॉन्ट्रालेटरल आंखों की उत्तेजना के बीच तुलना की जाती है। ऑड प्लास्टिसिटी की डिग्री को इंगित करने के लिए प्रत्येक सेल के नेत्र ओडी स्कोर का उपयोग करके कॉन्ट्रालेटरल पूर्वाग्रह सूचकांक (सीबीआई) की गणना की जा सकती है। यह प्रायोगिक तकनीक महत्वपूर्ण अवधि के दौरान ओडी प्लास्टिसिटी के तंत्रिका तंत्र का अध्ययन करने और तंत्रिका विकास में विशिष्ट जीन की भूमिकाओं का सर्वेक्षण करने के लिए महत्वपूर्ण है। प्रमुख सीमा यह है कि तीव्र अध्ययन एक अलग समय में एक ही माउस की तंत्रिका प्लास्टिसिटी में परिवर्तन की जांच नहीं कर सकता।
Introduction
मोनोकुलर दृश्य अभाव V1 प्लास्टिसिटी की जांच करने के लिए एक उत्कृष्ट प्रयोगात्मक प्रतिमान है। तंत्रिका विकास में दृश्य अनुभव के महत्व का अध्ययन करने के लिए, डेविड ह्यूबेल और टोरस्टन विसेल1,2 विभिन्न समय बिंदुओं पर और अलग-अलग समय के लिए एक आंख में सामान्य दृष्टि के बिल्ली के बच्चे से वंचित हैं। इसके बाद उन्होंने वंचित और वंचित आंखों के लिए V1 में प्रतिक्रिया तीव्रता में परिवर्तन देखा । उनके परिणामों ने पहले तीन महीनों में बंद हो गई आंख पर प्रतिक्रिया व्यक्त करने वाले न्यूरॉन्स की असामान्य रूप से कम संख्या दिखाई । हालांकि, बिल्ली के बच्चे में न्यूरॉन्स से प्रतिक्रियाएं एक सामान्य वयस्क बिल्ली की आंख के उन लोगों के लिए सभी मामलों में समान रहीं जो एक साल के लिए बंद हो गई थी, और बिल्ली के बच्चे ठीक नहीं हुए। वयस्क बिल्लियों में एमडी ओडी प्लास्टिसिटी को प्रेरित नहीं कर सकता। इसलिए, V1 तारों पर दृश्य अनुभव का प्रभाव विकास के एक संक्षिप्त, अच्छी तरह से परिभाषित चरण के दौरान मजबूत है, जिसके बाद एक ही उत्तेजनाओं का प्रभाव कम होता है। दृश्य इनपुट के लिए बढ़ी हुई संवेदनशीलता के इस तरह के चरण को दृश्य प्रांतस्था में महत्वपूर्ण अवधि के रूप में जाना जाता है।
हालांकि माउस एक रात्रिभोज जानवर है, माउस V1 में व्यक्तिगत न्यूरॉन्स3,4,5बिल्लियों में पाया न्यूरॉन्स के समान गुण है । हाल के वर्षों में, ट्रांसजेनिक तकनीक के तेजी से विकास के साथ, दृश्य तंत्रिका विज्ञान में अध्ययन की बढ़ती संख्या ने चूहों को एक प्रयोगात्मक मॉडल6,7,8के रूप में इस्तेमाल किया है। माउस विजुअल स्टडीज में न्यूरोसाइंटिस्ट म्यूटेंट और नॉकआउट माउस लाइन्स का इस्तेमाल करते हैं, जो चूहों के जेनेटिक मेकअप पर कंट्रोल की इजाजत देते हैं । हालांकि चूहों V1 में ओडी कॉलम की कमी है, V1 दूरबीन क्षेत्र में एकल न्यूरॉन्स महत्वपूर्ण ओडी गुण दिखाते हैं। उदाहरण के लिए, अधिकांश कोशिकाएं इप्सिलेटरल उत्तेजना की तुलना में कॉन्ट्रालेटरल उत्तेजना का अधिक दृढ़ता से जवाब देती हैं। महत्वपूर्ण अवधि के दौरान एक आंख को अस्थायी रूप से बंद करने से ओडी इंडेक्स वितरण9,10,11में महत्वपूर्ण बदलाव होता है . इसलिए, एमडी का उपयोग यह जांचने के लिए एक ओडी प्लास्टिसिटी मॉडल स्थापित करने के लिए किया जा सकता है कि तंत्रिका विकास संबंधी विकारों में शामिल जीन वीवो में कॉर्टिकल प्लास्टिसिटी को कैसे प्रभावित करते हैं।
यहां, हम एमडी के लिए एक प्रयोगात्मक विधि पेश करते हैं और मोनोकुलर दृश्य अभाव के दौरान ओडी प्लास्टिसिटी में परिवर्तन का विश्लेषण करने के लिए आमतौर पर उपयोग की जाने वाली विधि (इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग) का सुझाव देते हैं। इस विधि का कई प्रयोगशालाओं में 20 वर्षों सेभी अधिक समय से12,13,14,15,16से अधिक समय से व्यापक रूप से उपयोग किया जाता रहा है . ओडी प्लास्टिसिटी को मापने में अन्य तरीके भी हैं, जैसे क्रोनिक विजुअल पैदा की गई क्षमता (वीईपी)17रिकॉर्डिंग, और आंतरिक ऑप्टिकल इमेजिंग (आईओआई)18। इस तीव्र विधि का महत्वपूर्ण लाभ यह है कि इसका पालन करना आसान है, और परिणाम उल्लेखनीय रूप से विश्वसनीय हैं।
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Protocol
इस प्रोटोकॉल में, पुरुष C57Bl/6 चूहों सिचुआन चिकित्सा विज्ञान अकादमी और सिचुआन प्रांतीय पीपुल्स अस्पताल के प्रयोगशाला पशु संस्थान से प्राप्त किए गए थे । सभी पशु देखभाल और प्रायोगिक प्रक्रियाओं को संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति, चीन के इलेक्ट्रॉनिक विज्ञान और प्रौद्योगिकी विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया ।
1. चूहों में प्रसवके बाद के दिन 28 पर मोनोकुलर वंचन (एमडी)
- सर्जिकल उपकरण, सीवन सुई (0.25 मिमी व्यास, स्ट्रिंग व्यास 0.07 मिमी) और एक एल्यूमीनियम बॉक्स में कपास झाड़ू रखो और उन्हें 0.5 घंटे इथेनॉल के साथ हुड स्टरलाइज करने के लिए 120 डिग्री सेल्सियस पर स्वचालित करें। एक सुखाने ओवन में शल्य चिकित्सा उपकरण सूखी।
- 2% अगारोज समाधान तैयार करें, इसे जमना से बचने के लिए 75 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में रखें।
- माउस (2% इंडक्शन और 1.2-1.5% रखरखाव) को एनेस्थेटाइज़ करने के लिए ऑक्सीजन के साथ मिश्रित आइसोफ्लोरीन का उपयोग करें। स्टीरियोटैक्सिक उपकरण पर माउस को ठीक करें और माउस शरीर के तापमान को 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखने और हाइपोथर्मिया को रोकने के लिए हीट रेगुलेटिंग डिवाइस का उपयोग करें।
- दोनों आंखों पर पेट्रोलियम आधारित आंख ों के मरहम की पतली परत लगाएं।
- रोशनी के साथ शारीरिक माइक्रोस्कोप के नीचे, पलक को एक आंख पर टांका। सुई को पास करें हालांकि पलक 2x(चित्रा 1ए)के दोनों किनारों पर और लगभग चार टांके बनाएं।
- धागा 2-3x गांठ और फिर धागा ट्रिम। इसकी स्थिरता बढ़ाने के लिए गाँठ पर तत्काल सुखाने वाले गोंद के 3 μL लागू करें। इसके बाद एक्स्ट्रा सूटिंग थ्रेड काट लें।
- माउस को बुप्रेनोरफिन (1 मिलीग्राम/किलो) का इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन प्रदान करें।
- माउस को 37 डिग्री सेल्सियस पर अपने शरीर के तापमान को बनाए रखने और हाइपोथर्मिया को रोकने और चेतना हासिल होने तक इसकी निगरानी करने के लिए माउस को एक हीटिंग पैड पर स्थानांतरित करें।
- जब माउस पूरी तरह से जाग रहा है तो इसे एक अलग होल्डिंग पिंजरे में रखें।
- पलकों की रोजाना जांच करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि वे बंद और असंक्रमित रहें। यदि पलक खोलने पाया जाता है तो माउस को बाहर निकाल दें।
- इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग से पहले, माउस (2% इंडक्शन और 1.2-1.5% रखरखाव) को एनेस्थेटिज करने के लिए ऑक्सीजन के साथ मिश्रित आइसोफ्लोरीन का उपयोग करें।
- आंखों की पुतली को बेनकाब करने के लिए आंखों की कैंची से टांके हटा एं। ध्यान से आंखों के ढक्कन ट्रिम करें।
- लेंस समाधान के साथ आंख फ्लश और स्पष्टता के लिए एक माइक्रोस्कोप के नीचे आंख की जांच करें। कॉर्नियल ऑपसिटी या संक्रमण के लक्षणों के साथ चूहों को बाहर करें।
2. चौथे दिन मोनोकुलर अभाव के बाद माउस V1 दूरबीन क्षेत्र में क्रैनिओटॉमी
- माउस को एनेस्थेटाइज़ करने के बाद, एक अंगूठे की चुटकी के जवाब की कमी से संज्ञाहरण की गहराई की जांच करें।
- माउस को स्टीरियोटैक्सिक उपकरण पर रखें और ठीक करें। मस्तिष्क को सपाट और स्थिर रखने के लिए कान के बार और दांत की छड़ की ऊंचाई को समायोजित करें।
- शरीर के तापमान को बनाए रखने के लिए हीटिंग पैड का इस्तेमाल करें।
- उन्हें नम रखने के लिए आंखों की सतह पर पेट्रोलियम आधारित आंखों का मरहम लगाएं।
- इसकी त्वचा को बेनकाब करने के लिए माउस के सिर पर बाल निकालें। आयोडीन और 70% इथेनॉल 3x के बारी-बारी से स्क्रब के साथ त्वचा को रगड़ें।
- खोपड़ी को बेनकाब करने और खोपड़ी के ऊतकों को हटाने के लिए कानों के बीच त्वचा का 8 x 8 मिमी क्षेत्र छेदना। फिर 30% हाइड्रोजन पेरोक्साइड के साथ अंतर्निहित संयोजी ऊतक को हटा दें।
- सेरिबैलम के ऊपर खोपड़ी में 1 x 1 मिमी छेद ड्रिल करें। संदर्भ के रूप में छेद में एक छोटी सी हड्डी पेंच प्रत्यय।
- कॉन्ट्रालेटरल गोलार्द्ध से वंचित आंख(चित्रा 1बी,ए-पी: लैम्ब्डा-0.51-लैम्ब्डा +1.67 मिमी) से V1 दूरबीन क्षेत्र में व्यास में 1 मिमी का एक छोटा सा क्रैनिओटॉमी करें; एम-एल: -2.6- -3.0 मिमी; डी-वी: 0-1 मिमी)। दिमाग को चोट पहुंचाए बिना खोपड़ी के टुकड़े को सावधानी से हटा दें।
- सुखाने से रोकने के लिए 40 डिग्री सेल्सियस पर 2% अगारोज के 75 माइक्रोन के साथ उजागर कॉर्टिकल सतह को कवर करें।
- स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम पर एक टंगस्टन इलेक्ट्रोड को ठीक करें। टंगस्टन इलेक्ट्रोड को उजागर कॉर्टेक्स की सतह पर खड़ी रखें, V1 के दूरबीन क्षेत्र, यह सुनिश्चित करने के लिए कि दर्ज की गई कोशिकाएं दोनों आंखों पर प्रतिक्रिया करती हैं।
- आंखों के जेल को हटाने के लिए कॉटन झाड़ू का इस्तेमाल करें और हर 2 घंटे में आंखों पर सिलिकॉन ऑयल लगाएं।
3. दृश्य उत्तेजना और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग
- एक आंख को गैर पारदर्शी प्लास्टिक प्लेट के साथ मास्क। माउस की आंख से 23 सेमी एक एलसीडी मॉनिटर की स्थिति।
- जब माउस पूरी तरह से एनेस्थेटाइज्ड हो ताहै तो एनेस्थीसिया को 0.5-0.8% तक कम करें।
- माइक्रोइलेक्ट्रोड इलेक्ट्रोड को धीरे-धीरे तेल हाइड्रोलिक माइक्रोजोड़क के साथ आगे बढ़ाएं। उच्च सिग्नल-टू-शोर अनुपात देखे जाने पर इसे बंद कर दें और इलेक्ट्रोड को परत 4(चित्रा 1सी,लगभग 250-450 माइक्रोन गहराई में उन्नत किया जाता है)। सुनिश्चित करें कि प्रवर्धन कारक 1,000 पर सेट किया गया है, 300-100 हर्ट्ज पर फ़िल्टर, और 40 हर्ट्ज पर नमूना दर।
- एलईडी मॉनिटर पर एक पूर्ण क्षेत्र चलती सिनुसोइडल झंझरी(चित्रा 1डी,12 दिशाएं, 100% विपरीत, अस्थायी आवृत्ति के 2 हर्ट्ज, स्थानिक आवृत्ति के प्रति डिग्री 0.04 चक्र) पेश करें।
- इप्सिलेटरल और कॉन्ट्रालेटरल आई को अलग से उत्तेजित करके सेल की प्रतिक्रिया को मापें। वर्तमान 3-5x कुल।
- प्रत्येक प्रवेश में पांच से आठ कोशिकाओं की प्रतिक्रियाओं को मापें। प्रत्येक माउस में चार से छह प्रवेश करें।
- रिकॉर्डिंग के बाद, आइसोफ्लोरीन प्रवाह दर को 5% या उससे अधिक तक समायोजित करें, 1 मिन के लिए आइसोफ्लोरीन एक्सपोजर जारी रखें, और फिर गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था करें।
नोट: अलग प्रवेश V1 दूरबीन क्षेत्र में कम से २०० μm के अलावा दूरी पर थे ।
4. ऑफ लाइन स्पाइक छंटाई और डेटा विश्लेषण
- जब कच्चा सिग्नल सीमा स्तर को पार करता है तो स्पाइक्स का पता लगाएं। पहले सकारात्मक या नकारात्मक चोटी पर कब्जा कर लिया स्पाइक्स संरेखित करें। विभिन्न कोशिकाओं से स्पाइक्स का पता लगाने के लिए सॉफ्टवेयर का उपयोग करें।
- दो कर्सर सेट करें: एक सकारात्मक के लिए और दूसरा नकारात्मक विक्षेप के लिए। स्पाइक टेम्पलेट सेट करें(चित्रा 2ए)। स्पाइक्स के विभिन्न वर्गों के बीच सबसे महत्वपूर्ण भिन्नता के साथ टेम्पलेट क्षेत्र को सेट करें।
- उन्हें समूहों में अलग करने के लिए प्रमुख घटक विश्लेषण का उपयोग करें। क्लस्टरिंग विधियां विभिन्न प्रयोगशालाओं के बीच भिन्न हो सकती हैं।
- कश्मीर का मतलब एल्गोरिथ्म का उपयोग करके एक सीमा की स्पाइक वर्गीकृत।
- स्पाइक फायरिंग दर के साथ अभिविन्यास को सहसंबंधित करें और इप्सिलेटरल और कॉन्ट्रालेटरल आंख के लिए ओरिएंटेशन ट्यूनिंग घटता की साजिश करें।
- एकल इकाई के लिए ओडी इंडेक्स की गणना करें, जो कॉन्ट्रालेटरल/ipsilateral प्रतिक्रिया शक्ति अनुपात का प्रतिनिधित्व करता है:
जहां आरकॉन्ट्रा और आरआईपीएसआई क्रमशः कॉन्ट्रालेटरल और इप्सिलेटरल आंख के लिए सेल की इष्टतम प्रतिक्रिया है, और आरस्पॉन सेल की सहज गतिविधि है। - इस प्रकार 1-7 को ओडी स्कोर आवंटित करें: − 1 से −0.75 = 1; −0.75 से −0.45 = 2; −0.45 से −0.15 = 3; −0.15 से 0.15 = 4; 0.15 से 0.45 = 5; 0.45 से 0.75 = 6; और 0.75 से 1 = 7.
- कॉन्ट्रालेटरल पूर्वाग्रह सूचकांक (सीबीआई) की गणना करें:
जहां एन सेल नंबर है, और एनएक्स एक्स के बराबर ओडी स्कोर के साथ सेल संख्या के बराबर होती है।
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Representative Results
यहां वर्णित प्रायोगिक परिणाम महत्वपूर्ण अवधि (P19-P32) के दौरान एक वंचित और वंचित माउस से सफल एमडी और ओडी प्लास्टिसिटी मापन सक्षम करते हैं। चित्रा 1 से पता चलता है कि एमडी के 4 दिन बाद इप्सिलेटरल और कॉन्ट्रालेटरल आई में प्रतिक्रियाओं की तुलना करने के लिए दूरबीन क्षेत्र से वी 1 से परत 4 में एकल इकाई रिकॉर्डिंग कैसे करें। चित्रा 2 ipsilateral और कॉन्ट्रालेटरल आंखों उत्तेजक के लिए स्पाइक छंटाई और अभिविन्यास ट्यूनिंग माप दिखाता है। स्पाइक छंटाई के लिए, स्पाइक टेम्पलेट स्पाइक्स के प्रमुख घटक वजन को क्लस्टर करके स्थापित किया गया था। में एक उदाहरण के रूप में(चित्रा 2ए, बी),सेल 01 और सेल 02 स्पाइक छंटाई द्वारा वर्गीकृत किया गया । एकल इकाइयों के अभिविन्यास ट्यूनिंग घटता को इप्सिलेटरल और कॉन्ट्रालेटरल आंखों की उत्तेजना से मापा गया था। चित्रा 2सी, डी चार नमूना कोशिकाओं के अभिविन्यास ट्यूनिंग घटता दिखाता है, जिसमें दो माउस से हैं जो एमडी से गुजरते थे और माउस से अन्य जो नहीं थे। हमारे परिणाम बताते हैं कि एमडी के प्रदर्शन के 4 दिन बाद माउस में कॉन्ट्रालेटरल और इप्सिलेटरल आंख को उत्तेजित करके फायरिंग दर अपेक्षाकृत करीब थी(चित्रा 2सी)। हालांकि, कॉन्ट्रालेटरल आंख को उत्तेजित करके प्राप्त फायरिंग दर गैरवंचित माउस(चित्रा 2डी)में ipsilateral आंख उत्तेजक द्वारा प्राप्त की तुलना में बहुत मजबूत था । चित्रा 3ए सभी इकाइयों के लिए ओडी स्कोर के वितरण और एक माउस के लिए सीबीआई सूचकांक से पता चलता है जो एमडी (P28, एमडी के 4 दिन बाद) से गुजरा था। चित्रा 3बी सभी इकाइयों के लिए ओडी स्कोर और एक गैर वंचित C57/BL6 माउस (P26, कोई एमडी) से सीबीआई सूचकांक से पता चलता है । सीबीआई इंडेक्स में एमडी माउस के लिए 0.38 और एमडी के बिना एक दूसरे के लिए 0.67 है।
परिणाम बताते हैं कि उत्तेजना के लिए कॉन्ट्रालेटरल आंख के लिए V1 न्यूरॉन्स की प्रतिक्रिया गैर वंचित माउस के दूरबीन खंड में इप्सिलेटरल आंख की प्रतिक्रिया से बहुत मजबूत थी। हालांकि, महत्वपूर्ण अवधि में एमडी के बाद 4 दिन, कॉन्ट्रालेटरल आंख के लिए उत्तेजना के लिए अधिकांश न्यूरॉन्स की प्रतिक्रिया अपेक्षाकृत करीब या ipsilateral आंख के जवाब से कमजोर था । इसलिए, महत्वपूर्ण अवधि में वी 1 न्यूरॉन्स में महत्वपूर्ण ओडी प्लास्टिसिटी होती है। एमडी कॉन्ट्रालेटरल और इप्सिलेटरल आंख को उत्तेजित करके सेल की प्रतिक्रिया की सापेक्ष ताकत को बदल देता है।
चित्रा 1: दृश्य अभाव प्रयोग की योजनाबद्ध । (क)पलक को मजबूत करने के लिए एक योजनाबद्ध। सुई पलक 2x से गुजरती है और फिर 2-3 नॉट बनाई जाती है। छवियां 1-4 स्थिति को दिखाती हैं जहां सुई पलक से गुजरती है। (ख)एक एनेस्थेटाइज्ड, हेड-फिक्स्ड माउस में योजनाबद्ध रिकॉर्डिंग। V1 का एक बढ़ा हुआ दृश्य ग्रे सर्कल में प्रदर्शित किया जाता है, और दूरबीन क्षेत्र गहरे भूरे रंग के साथ इंगित किया जाता है। दूरबीन क्षेत्र के भीतर रिकॉर्डिंग साइटों छोटे हलकों के साथ दिखाया गया है। (ग)माउस ब्रेन का कोरोनल प्लेन और रिकॉर्डिंग साइट्स को वी1 की लेयर 4 में दिखाया गया है। (D)विभिन्न झुकाव के दृश्य उत्तेजना के चित्र। प्रत्येक माप में बारह अलग-अलग झुकाव पूरी तरह से उपयोग किए गए थे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र ा 2: डेटा विश्लेषण प्रक्रिया के चित्र। (A)स्पाइक्स को एक वाणिज्यिक सॉफ़्टवेयर (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके हल किया गया था। हरे रंग में तरंग फ़िल्टर किए गए सिग्नल (0.3-10 किलोवाट) को दिखाती है। फ़िल्टर किए गए डेटा से दो कोशिकाओं को छांटा गया। (ख)स्पाइक छंटाई द्वारा एक माइक्रोइलेक्ट्रोड पर स्पाइकिंग गतिविधि को अलग करने का उदाहरण । स्पाइक छंटाई विधि विश्लेषण का एक प्रमुख घटक है। (ग)एक मोनोकुलर-वंचित माउस (सेल 01 और सेल 02) में कॉन्ट्रालेटरल (लाल ठोस रेखा) और इप्सिलेटरल (लाल बिंदीदार रेखा) उत्तेजनाओं का जवाब देने के लिए दो कोशिकाओं से ओरिएंटेशन ट्यूनिंग। (घ)एक गैर वंचित माउस (सेल 03 और सेल 04) में कॉन्ट्रालेटरल (ब्लू सॉलिड लाइन) और इप्सिलेटरल (ब्लू डॉटेड लाइन) आंख उत्तेजनाओं का जवाब देने के लिए दो कोशिकाओं से ओरिएंटेशन ट्यूनिंग। त्रुटि बार प्रत्येक माप में मतलब (एसईएम) की मानक त्रुटि को इंगित करता है। काली रेखा सहज गतिविधि को इंगित करती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3: एमडी द्वारा ओडी इंडेक्स में बदलाव । हमने व्यक्तिगत रूप से इप्सिलेटरल और कॉन्ट्रालेटरल आंखों को उत्तेजित करके दूरबीन मस्तिष्क में दूरबीन क्षेत्र से सेल की प्रतिक्रिया दर्ज की। हमने एकल इकाइयों के लिए ओडी इंडेक्स की गणना की और जोड़ा। (A)एक C57/BL6 माउस से दर्ज ३८ न्यूरॉन्स के लिए ओडी स्कोर का वितरण जो P28-P32 से एमडी से गुजरा था । (ख)एक गैर वंचित C57/BL6 माउस से ३८ न्यूरॉन्स के लिए ओडी स्कोर का वितरण । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Discussion
हम एमडी के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल पेश करते हैं और एकल इकाई रिकॉर्डिंग द्वारा ओडी प्लास्टिसिटी को मापने के लिए। इस प्रोटोकॉल का व्यापक रूप से दृश्य तंत्रिका विज्ञान में उपयोग किया जाता है। हालांकि एमडी प्रोटोकॉल जटिल नहीं है, कुछ महत्वपूर्ण शल्य चिकित्सा प्रक्रियाएं हैं जिनका सावधानीपूर्वक पालन किया जाना चाहिए। सबसे पहले, सिलाई की गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए दो महत्वपूर्ण विवरण हैं। यदि टांके पलक के मध्यस्थ भाग में केंद्रित होते हैं तो सीवन पर्याप्त रूप से स्थिर होता है। इसके अलावा, आंख को फिर से खोलने से रोकने के लिए गाँठ की स्थिरता बढ़ाने के लिए गाँठ के सिर पर गोंद का 3 μl लगाया जाता है। दूसरा, घाव भरने में सुधार और असुविधा को कम करने के लिए कुछ महत्वपूर्ण कदम उठाए जाने चाहिए। सीवन विधि प्रोटोकॉल के लिए बहुत महत्वपूर्ण है। पिछले अध्ययनों से साबित हो गया है कि एक साधारण सतत स्तोत पैटर्न में बेहतर घाव भरने और कम मजबूत समय19,20के लाभ होते हैं । धागा पतला और स्थिर होना चाहिए ताकि एक बड़ा घाव पैदा करने और असुविधा को कम करने से बचा जा सके। लगभग 0.25 मिमी व्यास के साथ एक सीवन सुई टांके के लिए उपयुक्त है और दो से तीन समुद्री मील आवश्यक हैं।
कुछ प्रमुख बिंदु भी हैं जिन पर रिकॉर्डिंग में ध्यान देने की आवश्यकता है। एनेस्थेटिक एकाग्रता का नियंत्रण इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग में एक महत्वपूर्ण कारक है। एनेस्थेटाइज्ड जानवरों में, प्रयोग को नियंत्रित करना बहुत आसान है, और परिणाम अत्यधिक स्थिर और विश्वसनीय हैं। पिछले कई अध्ययनों में यूरेथेन को एनेस्थेटिक के रूप में इस्तेमाल किया गया था। हालांकि चूहों में एनेस्थीसिया की गहराई को नियंत्रित करने के लिए यूरिनरी का इस्तेमाल करना मुश्किल होता है। निचले स्तरों पर, चूहों को पूरी तरह से एनेस्थेटाइज्ड नहीं किया जाता है, और उच्च स्तर पर, चूहों को मौत का खतरा होता है। आइसोफ्लुराने माउस अध्ययन में एक संवेदनानक के रूप में अधिक उपयुक्त है। हालांकि चूहों के नियोकॉर्टेक्स में अच्छी तंत्रिका गतिविधि प्राप्त करना लगभग असंभव है जो 1% से अधिक आइसोटुरान21प्राप्त कर रहे हैं, अधिकांश वी 1 न्यूरॉन्स में आइसोफ्लोरीन के निचले स्तरों पर अच्छी दृश्य पैदा की गई गतिविधि होती है। इस प्रकार, आइसोफ्लोरीन (1%) की उच्च एकाग्रता के साथ शुरू करें माउस को एनेस्थेटिज़ करने के लिए, और फिर आइसोफ्लोरीन (0.5-0.8%) को कम करने के लिए जब चूहों को पूरी तरह से एनेस्थेटाइज्ड किया जाता है। इसके अलावा, वंचित आंख और वंचित आंख से बारी माप प्रायोगिक परिणामों की सटीकता सुनिश्चित कर सकते हैं । एक आंख की प्रतिक्रिया को कई बार मापना और फिर दूसरी आंख को मापना उचित नहीं है, क्योंकि इलेक्ट्रोड आगे बढ़ सकता है, और लंबी अवधि की रिकॉर्डिंग के दौरान सेल की प्रतिक्रिया की तीव्रता बदल सकती है। इसके अलावा, यह प्रोटोकॉल परत 4 में न्यूरॉन्स को लक्षित करता है, जो V1 में प्राथमिक थैलामो-प्राप्तकर्ता परत है। लेकिन पुराने चूहों में, जो मुख्य रूप से खुली आंख शक्तिशाली द्वारा मध्यस्थता ओडी प्लास्टिसिटी का प्रदर्शन करते हैं, यह 2 या 3 परतों में रिकॉर्ड करना बेहतर है, जो महत्वपूर्ण अवधि से परे प्लास्टिसिटी बनाए रखते हैं। इसलिए, रिकॉर्डिंग में कॉर्टिकल लैमिनार का निर्धारण करना महत्वपूर्ण है।
अभी भी तरीकों में कुछ सीमाएं हैं। अपेक्षाकृत सटीक सीबीआई सूचकांक की गणना करने के लिए 4-6 प्रवेश और 30 से अधिक इकाइयों की आवश्यकता होती है क्योंकि बहुत कम नमूनों की रिकॉर्डिंग से गलत परिणाम सामने आएंगे। लेकिन एक ही माउस से 30 से अधिक उच्च गुणवत्ता वाली इकाइयों को प्राप्त करना आसान नहीं है। एक बेहतर तरीका मल्टीयूनिट रिकॉर्डिंग का उपयोग करना है, जो एक ही माप में पर्याप्त इकाइयां प्रदान कर सकता है। इसके अलावा, वीईपी रिकॉर्डिंग और आईओआई का उपयोग ओडी प्लास्टिसिटी17,18को मापने के लिए भी किया जा सकता है। एकल इकाई रिकॉर्डिंग में व्यक्तिगत न्यूरॉन्स की गतिविधि शामिल है, जबकि वीईपी में इलेक्ट्रोड के पास न्यूरॉन्स के योग की गतिविधि रिकॉर्ड करना शामिल है। लेकिन डेटा रिकॉर्ड करने वाले एकल इकाई न्यूरॉन्स के बीच सिंक्रोनाइजेशन के बारे में कोई जानकारी नहीं देता है, जबकि वीईपी आयाम न्यूरॉन्स22के बीच अस्थायी सिंक्रोनाइजेशन पर निर्भर करते हैं। एक उलट झंझरी अक्सर वीईपी माप के लिए प्रयोग किया जाता है। सबसे अधिक उपयोग की जाने वाली रिवर्सल फ्रीक्वेंसी 3-4 हर्ट्ज है। हालांकि, सटीक मूल्य कंप्यूटर ताज़ा दर द्वारा निर्धारित किया जाता है जब झंझरी पेश । ओडी प्लास्टिसिटी को वंचित और वंचित आंखों द्वारा पैदा किए गए वीईपी आयामों के औसत की तुलना करके मापा जाता है। आईओआई तकनीक प्रभावी रूप से रक्त ऑक्सीजन स्तर पर निर्भर संकेत का पता लगा सकती है जो कॉन्ट्रालेटरल और इप्सिलेटरल उत्तेजना द्वारा पैदा किया जाता है। यह V1 में एक बड़े क्षेत्र की ओडी प्लास्टिसिटी दिखा सकता है ।
संक्षेप में, एकल इकाई रिकॉर्डिंग और आईओआई तीव्र संज्ञाहरण प्रयोगों के लिए उपयुक्त हैं। भविष्य में, एमडी और ओडी प्लास्टिसिटी मापन संयोजन के रूप में व्यापक रूप से एक प्रयोगात्मक विधि के रूप में तंत्रिका प्लास्टिसिटी के अध्ययन में इस्तेमाल किया जाएगा ।
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Disclosures
लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की है ।
Acknowledgments
इस अध्ययन को चीन के नेशनल नेचुरल साइंस फाउंडेशन (81571770, 81771925, 81861128001) ने समर्थन दिया।
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
502 glue | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | AWG97028 | |
Acquizition card | National Instument | PCI-6250 | |
Agarose | Biowest | G-10 | |
Amplifier | A-M system | Model 1800 | |
Atropine | Aladdin Bio-Chem Technology Co., Ltd | A135946-5 | |
Brain Stereotaxic Apparatus | RWD Life Science Co.,Ltd | 68001 | |
Cohan-Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-02 | |
Contact Lenses Solutions | Beijing Dr. Lun Eye Care Products Co., Ltd. | GM17064 | |
Cotton swabs | Henan Guangderun Medical Instruments Co.,Ltd | ||
Fine needle holder | SuZhou Stronger Medical Instruments Co.,Ltd | CZQ1370 | |
Forcep | 66 Vision Tech Co., Ltd. | 53320A | |
Forcep | 66 Vision Tech Co., Ltd. | 53072 | |
Forcep | 66 Vision Tech Co., Ltd. | #5 | |
Heating pad | Stryker | TP 700 T | |
Illuminator | Motic China Group Co., Ltd. | MLC-150C | |
Isoflurane | RWD Life Science Co.,Ltd | R510-22 | |
LCD monitor | Philips (China) Investment Co., Ltd. | 39PHF3251/T3 | |
Microscope | SOPTOP | SZMT1 | |
Noninvasive Vital Signs Monitor | Mouseox | ||
Oil hydraulic micromanipulator | NARISHIGE International Ltd. | PC-5N06022 | |
Petrolatum Eye Gel | Dezhou Yile Disinfection Technology Co., Ltd. | 17C801 | |
Spike2 | Cambridge Electronic Design, Cambridge, UK | Spike2 Version 9 | |
Surgical scissors | 66 Vision Tech Co., Ltd. | 54010 | |
Surgical scissors | 66 Vision Tech Co., Ltd. | 54002 | |
Suture Needle | Ningbo Medical Co.,Ltd | 3/8 arc 2.5*8 | |
Tungsten Electrode | FHC, Inc | L504-01B | |
Xylocaine | Huaqing |
References
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