Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Het verkrijgen van hoogwaardige transcriptoomgegevens van graanzaden door middel van een gewijzigde methode voor genexpressieprofilering

Published: May 21, 2020 doi: 10.3791/60602
Automatic Translation
1, 2, 3, 2
1Department of Chemistry and Biotechnology, Swinburne University of Technology, 2Department of Molecular Genetics, Heterosis Research Group, Leibniz Institute of Plant Genetics and Crop Plant Research (IPK), 3Grain Quality and Nutrition Center, Applied Functional Genomics Cluster, International Rice Research Institute

ERRATUM NOTICE

Summary

Een methode voor transcriptome profilering van granen wordt gepresenteerd. De op microarray gebaseerde genexpressieprofilering begint met de isolatie van hoogwaardig totaal RNA uit granen en gaat verder met de generatie van cDNA. Na cRNA-etikettering en microarray hybridisatie worden aanbevelingen gedaan voor signaaldetectie en kwaliteitscontrole.

Abstract

De karakterisering van genexpressie is afhankelijk van RNA kwaliteit. Bij het ontkiemen, ontwikkelen en rijpen van granen wordt de extractie van hoogwaardig RNA vaak belemmerd door een hoog zetmeel- en suikergehalte. Deze verbindingen kunnen zowel de opbrengst als de kwaliteit van het geëxtraheerde totale RNA verminderen. De verslechtering van de kwantiteit en de kwaliteit van het totale RNA kan vervolgens een aanzienlijke invloed hebben op de downstream-transcriptomische analyses, die mogelijk niet nauwkeurig de ruimtelijke en/of temporele variatie in het genexpressieprofiel van de geteste monsters weerspiegelen. In dit protocol beschrijven we een geoptimaliseerde methode voor de extractie van totaal RNA met voldoende kwantiteit en kwaliteit om te worden gebruikt voor de hele transcriptoomanalyse van granen. De beschreven methode is geschikt voor verschillende downstream toepassingen die worden gebruikt voor transcriptieprofilering van ontwikkelende, ontkiemende en rijpe granen. De methode van transcriptome profilering met behulp van een microarray platform wordt getoond. Deze methode is speciaal ontworpen voor genexpressie profilering van granen met beschreven genoomsequenties. De gedetailleerde procedure van microarray handling tot de uiteindelijke kwaliteitscontrole wordt beschreven. Dit omvat cDNA-synthese, cRNA-etikettering, microarray-hybridisatie, diascanning, functieextractie en validatie van gegevenskwaliteit. De gegevens gegenereerd door deze methode kan worden gebruikt om het transcriptoom van granen te karakteriseren tijdens de kieming, in verschillende stadia van de ontwikkeling van granen, of op verschillende biotische of abiotische stress voorwaarden. De hier gepresenteerde resultaten illustreren hoogwaardige transcriptiegegevens die vatbaar zijn voor downstream bio-informaticaanalyses, zoals de bepaling van differentieel uitgedrukte genen (DEG's), karakterisering van genregulerende netwerken en het uitvoeren van transcriptome-brede associatiestudie (TWAS).

Introduction

Het transcriptoom vertegenwoordigt de volledige set ribonucleic zuur (RNA) transcripties uitgedrukt door het genoom van een organisme op een bepaald moment en in het bijzonder milieu- en groeiomstandigheden. Elke cel heeft zijn individuele transcriptoom, die zijn huidige fysiologische en metabolische toestand weerspiegelt. Een verzameling cellen afkomstig van een soortgelijk weefsel of orgaan wordt gebruikt in een typische transcriptome studie, maar single-cell en ruimtelijk opgelost transcriptomics worden steeds populairder1. Transcriptomische analyses beginnen met de extractie van het totale RNA uit een geselecteerd weefsel op een bepaald tijdstip, en in gedefinieerde groeiomstandigheden. Daartoe bevelen wij het gebruik aan van een nieuw ontwikkelde methode voor de extractie van totaal RNA uit monsters met een hoog zetmeel- of suikergehalte, zoals granen2. De vergelijking van transcriptomen tussen verschillende monsters resulteert in de identificatie van RNA moleculen met verschillende overvloed. Deze RNA moleculen worden beschouwd als differentieel uitgedrukte genen (DEG's). De overvloed aan transcripties afgeleid van specifieke markergenen kan vervolgens worden gebruikt om de ontwikkelingsstatus te schatten of de reactie van een organisme op omgevingsschommelingen te bepalen. Genen zonder detecteerbare veranderingen in hun transcript overvloed over de ontwikkelingstijd punten in studie worden vaak gebruikt als referentie of huishouding genen.

Het RNA wordt meestal gedetecteerd en gekwantificeerd door verschillende methoden, zoals Noordelijke blotting en kwantitatieve omgekeerde transcriptase polymerase kettingreactie (qRT-PCR), maar de huidige high-throughput transcriptomics methoden zijn sterk afhankelijk van nucleïnezuur hybridisatie met behulp van microarray technologie evenals RNA sequencing (RNA-Seq). RNA-Seq is erg populair op dit moment, omdat het biedt verschillende voordelen voor hoge doorvoer transcriptomic toepassingen zoals elders beoordeeld3,4. Hoewel een oudere technologie, genexpressie profilering met behulp van microarray chips wordt nog steeds op grote schaal gebruikt omdat het een meer gevestigde technologie, die minder van een achtergrond in de bio-informatica vereist. Vergeleken met RNA-Seq zijn de datasets gegenereerd uit microarray experimenten kleiner en gemakkelijker te analyseren. Bovendien is het kosteneffectiever, vooral als het gaat om grote steekproefnummers. In ons laboratorium gebruiken we routinematig transcriptieanalyses met behulp van de microarray-technologie om de rol te bepalen van centrale regelgevende hubs die de moleculaire netwerken en trajecten regelen die betrokken zijn bij de groei, ontwikkeling en stofwisseling van graankorrels5,6,7,8,9. We gebruiken het ook routinematig voor het uitvoeren van genoombrede genexpressieprofileringsstudies om een mechanistisch inzicht te krijgen in de reactie van granen op abiotische spanningen10, evenals bij het uitvoeren van transcriptome-brede associatie (TWAS) en linkagemappingstudies om genen te identificeren die verantwoordelijk zijn voor de kwaliteit van granen en voeding11,12. Andere groepen hebben ook gebruik gemaakt van de microarray technologie in het verstrekken van ontwikkeling-specifieke genexpressie atlas in gerst13, rijst14,15,16, sorghum17, en tarwe18.

Het doel van deze publicatie is om een korte tekstuele samenvatting en een gedetailleerde visuele beschrijving van de methode die we momenteel gebruiken in ons laboratorium voor de transcriptie profilering van granen met behulp van een Agilent microarray platform. Houd er rekening mee dat andere microarray-platforms beschikbaar zijn, maar niet in deze methode worden behandeld. We beginnen het protocol met een gedetailleerde beschrijving van RNA-extractie uit het ontwikkelen of ontkiemen van granen. Op basis van onze ervaring, het verkrijgen van een hoge kwaliteit en hoge kwantiteit transcriptome vatbaar voor downstream transcriptomic analyses is vaak de bottleneck bij het gebruik van graanzaad weefsels. We hebben verschillende commercieel beschikbare RNA-extractiekits geprobeerd, maar geen enkele heeft bevredigende resultaten opgeleverd. Daarom ontwikkelden we een chemisch extractieprotocol om een ruw RNA-extract te verkrijgen dat vervolgens wordt onderworpen aan kolomzuivering met behulp van een commercieel beschikbare kit. Met behulp van deze methode, we routinematig en reproduceerd verkrijgen van hoge kwaliteit RNA2 (Figuur 1), die kan worden gebruikt voor verschillende downstream-toepassingen om een transcriptome profiel te genereren.

Protocol

1. Totale RNA-extractie en -zuivering

LET OP: Werk altijd onder de rookkap, omdat deze methode het gebruik van schadelijke vluchtige organische oplosmiddelen omvat. Verwarm een microfugebuis nucleasevrij water voor in een warmteblok van 50 °C voordat met het experiment wordt begonnen. Dit nuclease-vrij water zal worden gebruikt om het totale RNA uit de spinkolom in stap 1.8 te ontlopen.

  1. Vermalen de monsters, elk met ten minste drie biologische repliceert, in een fijn poeder met behulp van een gesteriliseerde mortel en stamper die worden voorgekoeld in vloeibare stikstof.
    1. Schep de poedermonsters met een kleine metalen spatel gedoopt in vloeibare stikstof en plaats de poedermonsters in 2,0 mL nucleasevrije microfugebuizen, ook voorgedompeld in vloeibare stikstof. Bewaar de monsters onmiddellijk in de vriezer met ultralage temperatuur (-80 °C) tot de dag die is toegewezen voor batchRNA-extractie (STOP POINT).
      LET OP: Zaadmonsters kunnen worden gemalen tot fijn poeder met of zonder dehusking. Voor rijst malen we de monsters routinematig zonder te dehusking omdat de schil silica bevat dat kan helpen tijdens het slijpproces.
      LET OP: Deze stap moet snel en onder strikt cryogene omstandigheden worden gedaan. Een optie voor automatisering is het malen van de monsters met behulp van een cryogene balmolen om RNA afbraak en verslechtering van de kwaliteit te minimaliseren.
  2. Verkrijg een ruw RNA-extract met behulp van ongeveer 200 mg van het oorspronkelijke poedermonster. Voeg elk monster individueel toe aan een nucleasevrije microfugebuis met 750 μL RNA Extraction Buffer (100 mM Tris, pH 8.0, 150 mM LiCl, 50 mM EDTA, 1,5% SDS, 1,5% 2-mercaptoethanol) en 500 μL fenol:chloroform:isoamyl (25:24:1).
    1. Meng alle monsters op hetzelfde moment voor 5 min bij kamertemperatuur met behulp van een multi-tube vortex mixer ingesteld op hoge snelheid. Houd alle buizen onmiddellijk twee min op ijs.
      LET OP: Werk altijd in de rookkap, vooral voor alle stappen met fenol, chloroform en andere organische oplosmiddelen. Idealiter gebruik maken van een brede rookkap die plaats biedt aan een benchtop centrifuge, vortex mixer, multi-tube vortex mixer, en multi-tube roterende mixer.
  3. Scheid het ruwe RNA-extract uit het puin door centrifugering op 14.000 x g gedurende 10 min. Doe alle centrifugatiestappen in dezelfde instellingen voor deze sectie.
    1. Breng ongeveer 800 μL supernatant over op een nieuwe 2,0 mL microfugebuis met 400 μL van 1,2 M NaCl en 700 μL isopropanol. Meng de oplossing voorzichtig door inversie 5x.
    2. Stort het RNA neer door gedurende ten minste 1 uur (of 's nachts) te broeden in een gewone (-20 °C) of ultralage temperatuurvriezer (-80 °C).
      STOP of PAUZE punt: bewaar de monsters in de reguliere -20 °C vriezer te pauzeren voor een paar uur. Voor 's nachts of een langer stoppunt, bewaar de monsters in ultralage temperatuur vriezer (-80 °C).
  4. Verkrijg een ruwe RNA pellet door centrifugering op 18.800 x g gedurende 15 min. Na het weggooien van de supernatant, zuiver de ruwe RNA pellet door kolom zuivering met behulp van een Mini Kit (Tabel van materialen).
    1. Los de pellet op in vers bereide 450 μL RLT Buffer (voeg voor gebruik 100 μL β-mercaptoethanol per 100 mL RLT-buffer toe, dagelijks vers bereid). Verbeter de ontbinding van alle pellets door het mengen van alle buizen op kamertemperatuur in een multi-tube vortex mixer voor ten minste 5 min.
  5. Zuiver de opgeloste RNA pellet door de paarse mini spin kolom met een 2 mL collectie buis. Centrifugeer bij kamertemperatuur gedurende 1 min op 9.000 x g en gooi de paarse mini-spinkolom weg.
    1. Voeg 0,5 volume absolute ethanol (~225 μL) toe aan het gerooide lysaat in de 2 mL-inzamelbuis. Meng de oplossing met dezelfde plastic tip door het op en neer paien een paar keer.
  6. Verzamel het gezuiverde RNA door de oplossing onmiddellijk over te zetten naar een roze mini spinkolom met een 2 mL collectiebuis. Centrifugeer bij 9.000 x g voor 15 s om het RNA te verzamelen op het silicamembraan van de roze min spinkolom. Gooi de stroom door en was het RNA met 350 μL buffer RW1 door centrifugering bij 9.000 x g voor 15 s.
  7. Verwijder contaminatie genomic DNA door 80 μL verdunde DNase 1 (50 μL bevroren DNase-voorraad + 350 μL RDD met behulp van de DNase-set) direct op het membraan toe te voegen en te verteren door bij kamertemperatuur minstens 15 min (PAUZEPUNT) uit te broeden.
    1. Was de DNase 1 af door 350 μL RW1 toe te voegen en bij 9.000 x g te draaien voor 15 s. Herhaal twee keer, maar was deze keer met 500 μL buffer RPE. Breng over op een nieuwe 2 mL-inzamelbuis en draai op 9.000 x g gedurende 2 min om te drogen.
  8. Breng de gedroogde draaikolom over op een nieuwe nucleasevrije inzamelbuis van 1,5 mL. Begin het elutieproces voor het gezuiverde RNA-extract door 50 μL nucleasevrij water toe te voegen (voorwarm bij 50 °C) en 3 min uit te broeden bij 50 °C hitteblok.
    1. Na incubatie, los het totale RNA-extract uit door te centrifugeren bij 9.000 x g gedurende 1 min. Plaats onmiddellijk alle monsters op ijs.
  9. Bepaal de hoeveelheid en de kwaliteit van het totale RNA-extract door de juiste verdunningen (meestal 1:10) in Nanodrop en BioAnalyzer uit te voeren met behulp van hun respectieve fabrikantprotocollen. RNA-extracten moeten ten minste een RIN-waarde van 8,0 hebben en een concentratie van 50 ng/μL. Figuur 1 toont een typisch resultaat voor RNA-extracten verkregen uit gerstblad en zaden.
    STOPPUNT: Bewaar de monsters in -80 °C tot gebruik.

2. cDNA-synthese gevolgd door cRNA-transcriptie en etikettering

OPMERKING: Deze stap is geschikt voor het gelijktijdig verwerken van 24 monsters. Er wordt gesuggereerd dat de hele stap continu wordt uitgevoerd in een dag, maar optionele stop- en pauzepunten worden geïdentificeerd. Zorg ervoor dat u drie microfugebuiswarmteblokken voorverwarmt bij 80 °C, 65 °C en 37 °C voordat u met de onderstaande stappen begint. Deze temperatuurinstellingen worden gewijzigd zoals aangegeven in de onderstaande stappen. Zo wordt het warmteblok van 37 °C ingesteld op 40 °C nadat de Spike Mix is voorbereid (of als het al eerder is voorbereid). Bereid eenkleurige Spike Mix, T7 Promoter Mix en cDNA master mix met behulp van de Low Input Quick Amp Gene Expression Labeling Kit (zie Tabel van materialen)op basis van de instructies van de fabrikant. Dit preparaat is afhankelijk van de hoeveelheid beginnende RNA-extracten, die meestal variëren van 10 tot 200 ng voor totaal RNA of 5 ng voor PolyA RNA. We gebruiken routinematig 50 ng totaal RNA als uitgangsmateriaal voor microarray hybridisatie2 en voor de methode die hieronder zal worden beschreven. Bij het voorbereiden van een master mix voor 24 monsters, voeg 2 extra reacties om rekening te houden met pipettervariaties. Gebruik in deze stap altijd nucleasevrije microfugebuizen en nucleasevrij water.

  1. Als gevolg van hoge opbrengst, meestal verdunnen het RNA-extract 100-voudige te passen binnen de 50-100 ng bereik. Op basis van de RNA kwantificeringsresultaten in stap 1.9, maak een 1:100 verdunning door 1 μL gezuiverd RNA-extract toe te voegen aan 99 μL nucleasevrij water in een 1,5 mL microfugebuis. Bepaal de werkelijke concentratie van deze verdunning met behulp van een Nanodrop.
    1. Maak een tweede verdunning van elk totaal RNA monster in 1,5 mL microfuge buis om 50 ng van het totale RNA te maken in een eindvolume van 1,5 μL. Houd alle monsters op ijs. Houd alle monsters op ijs. Houd alle monsters op ijs. Houd alle monsters op ijs.
  2. Bereid de Spike Mix voor op basis van de instructies van de fabrikant. Deze stap wordt ook samengevat in Püffeld et al. 20192. Gebruik hiervoor een 37 °C warmteblok. Bewaar de eerste en tweede verdunning van de eenkleurige spike mix positieve controles in een ultralage temperatuur vriezer (-80 °C) en ga alleen door acht herhaalde vries / dooi cycli.
    1. Bereid de derde en vierde verdunning dagelijks vers. Ontdooi en bewaar de derde en vierde verdunning van spike mix op ijs voor gebruik.
      OPMERKING: Zet de temperatuur van het warmteblok van 37 °C om in 40 °C wanneer de Spike Mix was voorbereid (of als het eerder was voorbereid).
  3. Bereid de T7 Promoter Mix voor en bewaar op ijs voordat je het gebruikt. Voor 24 monsters volstaat het volgende:
    20,8 μL T7 promotor primer
    + 26,0 μL nucleasevrij water
    = 46,8 μL van het totale volume T7 Promoter Mix
  4. Voeg 1,8 μL T7 Promoter Primer Mix (Stap 2.3) toe aan elke microfugebuis met 1,5 μL rna-monster van 50 ng uit stap 2.1. Meng de componenten goed door meerdere keren te pipetteren. Denatureer de RNA template-primer mix door 10 min in 65 °C warmteblok te uitbroeden. Plaats de microfugebuizen onmiddellijk op ijs ter voorbereiding op de volgende stap.
  5. Terwijl u de template-primermix (stap 2.4) de 5x First Strand Buffer op 80 °C voorminstens 4 min depoeert. Table of Materials Het volgende is voldoende voor 24 reacties:
    52,0 μL voorverwarmde 5x First Strand Buffer (stap 2.5)
    + 26,0 μL van 0,1 M DTT
    + 13,0 μL van 10 mM dNTP-mix
    + 31,2 μL RNase Block Mix
    = 122,2 μL van het totale volume cDNA synthese Master Mix
    1. Ontdooi elk onderdeel op ijs. Meng elk onderdeel door zachte pipetteer. Houd de Master Mix op kamertemperatuur voor gebruik.
      LET OP: De RNase Block Mix moet na gebruik onmiddellijk weer in de vriezer van -20 °C worden geplaatst.
  6. Verwijder de RNA template-primer mix op ijs (stap 2.4) en centrifugeer kort bij kamertemperatuur om alle inhoud naar beneden te draaien naar de bodem van de microfugebuis. Deel 4,7 μL van de cDNA Master Mix (Stap 2.5) aan elke buis, meng zorgvuldig door op en neer te pipetteren. Het totale volume wanneer alle componenten worden toegevoegd, moet 8,0 μL bedragen.
    1. Synthetiseer het cDNA gedurende 2 uur in 40 °C warmteblok. Verschuif tijdens de incubatietijd van 2 uur de temperatuur van het 65 °C-warmteblok naar 70 °C ter voorbereiding op warmteinactivatie (stap 2.7).
      OPTIONEEL PAUZEPUNT: Bewaar de monsters 's nachts op -80 °C. Het experiment kan de volgende dag na warmteinactivatie worden voortgezet (stap 2.7).
  7. Incubeer elke buis in 70 °C warmteblok gedurende 15 min om de RNase Block Mix te verwarmen. Breng de buizen onmiddellijk op ijs en incubeer gedurende ten minste 5 min.
  8. Terwijl de monsters 5 min op ijs staan (stap 2.7), bereid je snel de Transcriptie Master Mix voor. Alle componenten kunnen worden gecombineerd bij kamertemperatuur, maar ontdooien componenten op ijs. Voor 24 monsters volstaat het volgende:
    19,5 μL nucleasevrij water
    + 83,2 μL van 5x Transcriptiebuffer
    + 15,6 μL van 0,1 M DTT
    + 26,0 μL NTP-mix
    + 5,5 μL T7 RNA Polymerase Blend
    + 6,2 μL Cyanine 3-CTP (Cy3)
    = 156,0 μL van het totale volume Transcriptie Master Mix
    LET OP: De T7 RNA Polymerase Blend moet in de vriezer van -20 °C worden bewaard en direct na gebruik worden teruggeplaatst. Bovendien is Cy3 lichtgevoelig. Daarom moet het mengen (stap 2.9) en het uitdelen (stap 2.10) worden gedaan in omstandigheden met weinig licht. Hiervoor schakelen we meestal het licht direct boven de labbank uit.
  9. Als de buizen werden onderworpen aan abrupte verwarming en koeling (Stap 2.7), kort spin de inhoud van elk monster met behulp van een microcentrifuge om alle vloeistof te verzamelen aan de onderkant van elke microfuge buis. Voeg 6 μL Transcriptie Master Mix (Stap 2.8) toe door voorzichtig op en neer te paien. Het totale volume van deze reactie moet in dit stadium 16 μL zijn. Incubeer de buizen bij 40 °C gedurende 2 uur om het CRNA met Cy3-label te genereren.
    OPTIONEEL STOPPUNT: De buizen kunnen na transcriptie bij -80 °C worden opgeslagen.
  10. Terwijl u het cRNA genereert (stap 2.9), stelt u de temperatuur van het warmteblok in op 55 °C. Voeg ten minste één microfugebuis nucleasevrij water toe aan het warmteblok. Dit nuclease-vrij water zal worden gebruikt voor de onteigening van gezuiverd cRNA.
  11. Na cRNA transcriptie en etikettering, zuiver de gelabelde cRNA met behulp van een RNeasy Mini Kit zoals beschreven in stap 3.

3. cRNA-zuivering

  1. Zuiver het etiket cRNA met behulp van een RNeasy Mini Kit (zie Materiaaltafel). Bereid de buffers voor op basis van de instructies van de fabrikant. Buffer RPE wordt bijvoorbeeld in geconcentreerde vorm in de kit geleverd. Voeg voor gebruik 4 volumes moleculaire biologie graad absolute ethanol (96-100%).
  2. Voeg 84 μL nucleasevrij water toe aan elk monster om het totale volume aan te passen op 100 μL. Voeg vervolgens 350 μL Buffer RLT en 250 μL absolute ethanol toe aan elke buis. Meng grondig door te pipetteren.
  3. Breng 700 μL van elk mengsel over op een mini-spinkolom met een 2 mL-inzamelbuis. Verzamel het etiket cRNA op het membraan door centrifugering bij 4 °C gedurende 30 s bij 7.534 x g. Gooi de doorstroomvloeistof weg.
  4. Was elk monster in 500 μL buffer RPE. Centrifugeer en gooi doorstroom zoals in de vorige stap. Herhaal deze stap eenmaal en ga vervolgens naar de volgende stap.
  5. Breng de mini-spinkolom over in een nieuwe collectiebuis. Droog de monsters door centrifugering zoals in stap 3.3.
  6. Breng de mini spin kolom in een nuclease-vrije 1,5 mL microfuge buis die wordt geleverd met de kit. Elute elk geëtiketteerd cRNA monster door 30 μL nuclease-vrij water (voorverwarmd bij 55 °C) direct in het membraanfilter te voegen. Verbeter de ontwenning door te broeden in een warmteblok van 55 °C gedurende 60 s.
  7. Verzamel het etiket cRNA door centrifugering bij kamertemperatuur gedurende 30 s bij 7.535 x g. Gooi de draaikolom weg en sluit elke microfugebuis. Plaats elke buis onmiddellijk op ijs.
    OPTIONEEL STOPPUNT: De monsters kunnen na de elutie bij -80 °C worden opgeslagen.
  8. Kwantificeer het cRNA met Nanodrop met behulp van de microarray-functie. Stel het monster in op RNA-40. Verkrijg de volgende waarden en record in een spreadsheet: cyanine 3 kleurstof concentratie (pmol/μL), RNA absorptieverhouding (260 nm/280 nm) en cRNA concentratie (ng/μL).
    STOPPUNT: Bewaar de cRNA-monsters onmiddellijk op -80 °C na het lezen.
  9. Bereken de cRNA-opbrengst en de specifieke activiteit zoals beschreven in Püffeld et al. 20192.

4. Microarray hybridisatie en scanning

LET OP: Deze stap duurt slechts 3-4 uur en dus hybridisatie van 24 monsters kan worden gestart na de lunch. Eén operator kan comfortabel tot 4 dia's (32 monsters) uitvoeren. De ochtend van de volgende dag wordt toegewezen voor het wassen en scannen van microarray dia's. Extra runs kunnen dan worden uitgevoerd in de middag van de tweede dag. Deze stap wordt herhaald totdat alle monsters zijn gehybridiseerd en gescand. Het wordt ten zeerste aanbevolen om kleurvrije, poedervrije latex handschoenen te gebruiken voor het hanteren en verwerken van de dia's om ervoor te zorgen dat de monsters niet besmet zijn met gekleurde pigmenten die de microarray-analyses kunnen verstoren. Afgezien van commercieel beschikbare microarrays, zijn de volgende aangepaste arrays ontworpen door onze groep en beschikbaar voor bestelling bij Agilent: Order Code 028827 for Barley (Hordeumvulgare), 054269 for Rice (Oryzasativa subs. Japonica), 054270 for Rice (Oryzasativa subs. Indica) en 048923 for Wheat (Triticumaestivum).

  1. Microarray-hybridisatie uitvoeren met behulp van de Gene Expression Hybridization Kit (zie Tabel met materialen). Bereid 10x Blocking Agent voor volgens de specificatie van de fabrikant2. Aliquot de 10x Blocking Agent in 200 μL porties en bewaar bij -20 °C tot gebruik. Elke aliquot is genoeg voor maximaal 40 hybridisaties en is stabiel tot 2 maanden.
  2. Op de dag toegewezen voor microarray hybridisatie, ontdooi en ei een 200 μL aliquot van 10x Blocking Agent op ijs. Verwarm bovendien de hybridisatieoven voor op 65 °C en verwarm een warmteblok voor op 60 °C voor gebruik tijdens cRNA-fragmentatie.
  3. Bereid de fragmentatiemix voor elk monster zoals beschreven door de fabrikant2. In ons lab gebruiken we routinematig 600 ng lineair versterkte Cy3-gelabelde cRNA voor hybridisatie in een 8-pack microarray. In dit geval geeft de onderstaande lijst een overzicht van de componenten van de fragmentatiemix per monster:
    600 ng lineair versterkte cRNA, cyanine 3-label
    + 5 μL van 10x Blocking Agent
    Pas het volume aan op 24 μL met nucleasevrij water
    + 1 μL van 25x Fragmentatiebuffer
    = 25 μL van het totale volume Fragmentatie Mix
    1. Meng monsters voorzichtig met behulp van een vortex mixer. Draai alle monsters kort met behulp van een microcentrifuge.
  4. Incubeer alle monsters in het 60 °C warmteblok gedurende precies 30 min. Koel onmiddellijk elke buis op ijs gedurende één min en ga dan snel naar de volgende stap.
  5. Om de fragmentatiereactie volledig te stoppen, voegt u 2x GEx Hybridization Buffer HI-RPM toe aan elke buis. Meng voorzichtig door op en neer te paien, waarbij u er goed voor zorgt dat u geen bubbels introduceert tijdens het mengen. We gebruiken routinematig 25 μL Hybridisatiebuffer om de fragmentatiereactie voor het 8-pack microarray-formaat te stoppen.
  6. Centrifugeer alle buizen gedurende 1 min bij 15.750 x g bij omgevingstemperatuur. Plaats snel alle buizen op ijs en laad elk monster zo snel mogelijk.
  7. Voor het verlaten van het lab voor de 17 uur 's nachts incubatie, de voorbereiding van de hybridisatie assemblage2 zoals beschreven in de video.
    1. KRITISCHE STAP: Breng elke hybridisatie mix en afzien langzaam in het midden van elke pakking goed, observeren grote zorg niet om eventuele bellen te introduceren tijdens het verstrekken. We gebruiken routinematig 44 μL hybridisatiemix voor het 8-pack microarray formaat. Plaats ook 44 μL van 1x Hybridisatie buffer in ongebruikte putten.
    2. Plaats de microarray slide onmiddellijk met de juiste oriëntatie op de gasflesschuif. Dit moet zeer zorgvuldig worden gedaan om geen vloeistof te morsen. Sluit de hybridisatieassemblage stevig en draai deze om te controleren of er geen permanente luchtbellen zijn geïntroduceerd. Alle bellen moeten bewegen binnen de pakking schuif.
  8. Plaats de hybridisatiekamermontage in de hybridisatieovenrotator. Als u de 2x GEx Hybridisatiebuffer gebruikt, stelt u de rotatiesnelheid in op 10 rpm en hybridiseert u precies 17 uur op 65 °C.
  9. Was gehybridiseerde microarrays met behulp van de Gene Expression Wash Buffer Kit (zie Tabel met materialen). Bereid de Gen Expression Wash Buffers 1 en 2 op basis van de instructies van de fabrikant2. Voeg 2 mL van 10% Triton X-102 toe aan beide buffers (puur optioneel maar sterk aanbevolen om de incidentie van microarray wash artefacten te verminderen)2.
  10. Bereid drie waskamersamenstellingen voor, zoals beschreven in de vorige publicatie2. Details van elke waskamer wordt hieronder weergegeven(tabel 1).
  11. Aliquot 500 mL wash buffer 1 in een 1 L reagens fles en laat bij omgevingstemperatuur. Bereid een extra 1 L reagensfles en etiket met "Wash Buffer 1 Reuse" om de wasbuffer uit de eerste kamer te bewaren. Bovendien, aliquot 500 mL wash buffer 2 in een reagensfles en 's nachts ineenbroeden in een waterbad van 37 °C.
    LET OP: Verlaat het lab niet zonder de stappen 4.9 tot en met 4.11 voor te bereiden. Ze zijn nodig voor de wasstappen de volgende dag.
  12. Bereid de volgende dag de wasbuffers zoals beschreven in tabel 2 voor. Vul elk gerecht tot drie vierde van hun overeenkomstige buffer. Elke wasbuffer is goed voor maximaal 4-5 glijbanen.
  13. Na precies 17 uur hybridisatie, krijgen een hybridisatie kamer en demonteren op het lab bank bekleed met pluisvrij papier zoals beschreven in de vorige publicatie2.
    1. KRITISCHE STAP: Breng de microarray sandwich naar schotel 1. Zorg ervoor dat de microarray-streepjescode schuin naar boven gericht is en voorkom dat u de hele dia in de buffer onderdompelt. Behandel elke microarray-dia vanaf de uiteinden en raak de actieve kant van de dia niet aan.
    2. Scheid de twee glazen platen met behulp van een tang2. Laat de pakking zachtjes in de bodem van schotel 1 vallen, terwijl u er tegelijkertijd voor zorgt dat de microarray-dia stevig wordt vastgehouden voor de volgende stap.
  14. KRITISCHE STAP: Til de microarray langzaam zijwaarts en onmiddellijk over te dragen in de microarray rack in Schotel 2, zoals beschreven in de vorige publicatie2. Het is van cruciaal belang dat de microarray dia's minimaal worden blootgesteld aan lucht.
    1. Herhaal de stappen 4.13 en 4.14 totdat de acht dia's in het rek zitten. Verdeel de microarray-dia's gelijkmatig over het rek. Deze stap kan worden gedaan door een operator zonder hulp voor maximaal 4 dia's. Bevestig de rekhouder en breng de gehele Dish 2 setup over op de eerste magnetische roerganger. Roer zachtjes voor precies 1 min.
  15. Onder het roeren gedurende 1 min (stap 4.14) breng schotel 3 van de mini 37 °C incubator en plaats op de top van de tweede magnetische roerganger. Plaats De Wasbuffer 2 (vanaf het waterbad van 37 °C) voorzichtig op schaal 3. Vermijd bellenvorming tijdens het gieten.
    1. Na 1 min roeren is gedaan (Stap 4.14), voorzichtig en langzaam til de schuifrek van Schotel 2 en over te dragen aan schotel 3. Verwijder de rekhouder en roer precies 1 min.
  16. Til langzaam en voorzichtig het schuifrek van schotel 3 op. Zorg ervoor dat u de vorming van bufferdruppelsvermijdt 2. Droog de zijkanten van elke dia door zachtjes aan te raken op pluisvrij papier. Plaats elke vlekgedroogde dia in een diavak en herhaal stap 4.16 totdat alle microarray-dia's zich in het diavak bevinden. Droog gedurende ongeveer 15 min.
    OPTIONEEL STOPPUNT
  17. Plaats elke microarray-dia in een diahouder, zodat de streepjescode naar boven wordt gericht.
    OPMERKING: De ozonniveaus in de microarray-ruimte moeten 50 ppb (100 μg/m3)of minder zijn. Dit is puur optioneel, maar wordt ten zeerste aanbevolen: gebruik een Ozone Barrier Slide Cover om ozon-geïnduceerde afbraak van cyanine kleurstoffen te voorkomen.
  18. Plaats de geassembleerde schuifhouders in de scancarrousel. Laad de monsters achter elkaar, op basis van het streepjescodenummer. Scan de dia's onmiddellijk met behulp van een microarrayscanner (zie Materiaaltabel),zoals beschreven in de vorige publicatie2.
  19. Na de run, onderwerp de gegevens aan functie extractie en QC validatie, zoals beschreven in de vorige publicatie2.

Representative Results

Deze methode is geoptimaliseerd voor de winning van graanzaadmonsters die aanzienlijke hoeveelheden besmetzetmeel of -suikers bevatten. Het is ontworpen om totaal RNA te extraheren uit 24 zaadmonsters per dag. Het moet continu worden uitgevoerd in een dag, maar optionele stop-en pauzepunten worden geïdentificeerd in het hele protocol. Als alternatief kan de lezer gebruik maken van hun voorkeur RNA extractie kits of handmatige chemische extractie methode. Echter, op basis van onze eerdere ervaring, commercieel beschikbare plant RNA extractie kits zijn niet geschikt voor zaden als gevolg van aanzienlijke hoeveelheden zetmeel, eiwitten, suiker en / of lipide besmetting. In de beschreven methode wordt een chemische extractie van ruw RNA gevolgd door kolomzuivering met behulp van een commerciële RNA-extractiekit. Dit biedt meestal RNA met een hogere kwaliteit en opbrengst. Figuur 1 toont het resultaat van een BioAnalyzer-run om de kwaliteit van RNA-extractie te testen met behulp van de hier beschreven methode. De resultaten worden gepresenteerd voor gerstblad (monsters 1 en 2 met monsters van een laag zetmeelgehalte) en gerstzaden (monsters 3 en 4 die monsters met een hoog zetmeelgehalte weergeven). De RNA-integriteit (RIN) waarde voor alle monsters is 10.

Figuur 1 toont een representatieve gel van het gezuiverde RNA-extract, waarbij de kwaliteit werd getest met behulp van een Bioanalyzer. Monsters 1 en 2 zijn typische resultaten voor monsters met een laag zetmeelgehalte, zoals gerstbladeren, waarbij extra rRNA-banden van chloroplasten zichtbaar zijn. De monsters 3 en 4 zijn representatieve resultaten voor monsters met een hoog zetmeelgehalte, zoals gerstzaden, met 18S en 28S rRNA. Houd er rekening mee dat er geen geautomatiseerde RIN-waarde kan worden berekend voor groene plantenweefsels, zoals bladmonsters, als gevolg van chloroplastrRNA. Echter, de integriteit en hoge kwaliteit kan visueel worden vastgesteld door de afwezigheid van degradatieproducten, die meestal verschijnt als een laag moleculair uitstrijkje. De RIN-waarde voor monsters van zetmeelzaden met hoog zetmeel, zoals gerstzaden, is doorgaans 10 volgens het protocol dat in dit document wordt beschreven.

Daarnaast presenteren we hier ook een representatieve gegevens van een tijdcursus experiment van twee elite gerst inteelt lijnen (Sofiara en Victoriana) gebruikt voor de analyse van moutkwaliteit19. Tijdens het moutproces wordt zetmeel omgezet in suiker. Daarom vertegenwoordigen de monsters weefsels met verschillende verhoudingen zetmeel en suikergehalte. Aangezien het industriële moutproces vergelijkbaar is met het kiemproces, werden de transcripties van twee gerstlijnen, die verschillen in hun moutkwaliteit, geanalyseerd. RNAs werden geëxtraheerd uit ontkiemende zaden op 2, 24, 48, 72, 120, 144 en 196 uur na imbibition in biologische drievoud. De RNA voorbereiding en hybridisatie van de aangepaste gerst microarray chip werden uitgevoerd zoals hierboven beschreven. Figuur 2 geeft het genormaliseerde raster aan dat is afgelezen uit de microarray-hybridisatie die wordt gegeven in het rapport kwaliteitscontrole (QC)(figuur 3) en het histogramplot voor gedetecteerde signalen. Het raster geeft het voorbeeld van afgeleide signalen uit elke hoek van de chip, inclusief achtergrond- en spike-in uitleespunten die worden gebruikt voor kalibratie. Het histogram geeft de afwijking aan van detecteerbare stippen met respectievelijke signaalintensiteiten. Een succesvolle hybridisatie geeft een brede Gaussische curve met slechts kleine uitschieters zoals weergegeven in de figuur. Mislukte hybridisaties kunnen resulteren in een sterke verschuiving naar de ene kant ("groene monsters").

Ten slotte wordt een representatief resultaat van de aanvaardbare waarden weergegeven in kolom 4 van figuur 3. Om de betrouwbaarheid van de uitgevoerde experimenten aan te geven, worden de resultaten verder geëvalueerd met behulp van de GeneSpring-software. De verzamelde gegevens worden gepresenteerd als hoofdcomponentanalyse (PCA). De PCA integreert de waarden van geselecteerde stippen (genen) als vector. Het aantal geëvalueerde stippen dat wordt gebruikt kan variëren van enkele honderden tot de gehele chip en is afhankelijk van de gebruikte software. Elke chip (monster) resulteert in één waarde (vector) die het resultaat is van de geïntegreerde signaalintensiteiten voor de geanalyseerde stippen. Daarom geeft de relatieve positie in de grafiek (PCA) de gelijkenis van de monsters met elkaar aan. Hoe dichter de monsters zijn, hoe meer op elkaar lijken. Technische replica's moeten dichter bij elkaar liggen dan biologische, en biologische replicaties van een monster moeten dichter bij elkaar clusteren dan monsters uit verschillende tijdspunten, weefsels of omstandigheden.

Figure 1
Figuur 1: Electroforese file run samenvatting verkregen na het controleren van de kwaliteit van RNA met Bioanalyzer. Monsters 1 en 2 zijn gerstbladweefsel zoals aangegeven door extra ribosomale banden van chloroplasten. Monsters 3 en 4 zijn gerstzaadweefsel met 18S en 28S rRNA-banden getoond. Een RIN-factor wordt niet altijd berekend voor groene weefsels zoals blad, maar volgens de gel is de kwaliteit van RNA zeer goed. De RIN-waarde voor de monsters 3 en 4 is 10. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: QC Rapport van succesvolle gerst microarray hybridisatie. A + geeft gedetecteerde signalen op het net aan vanuit alle hoeken van de chip. Het histogram toont het aantal signalen gecategoriseerd op basis van signaalintensiteit (fluorescentie) als logaritme na achtergrondaftrekking. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Samenvatting van de kwaliteitscontrole (QC) na hybridisatie en scanning. De waarden voor de gehybridiseerde dia worden weergegeven in kolom 2 (waarde) en het bereik van acceptabele waarden wordt weergegeven in kolom 4. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Waskamervergadering Inhoud en label Purpose
Schotel 1 Leeg, laat op labbank tot de volgende dag Vul met Wash Buffer 1 de volgende dag, gebruikt om de microarray dia's demonteren
Schotel 2 Voeg een microarray schuifrek en een kleine magnetische roerstaaf toe; label met "Wash Buffer 1", laat op labbank tot de volgende dag Wordt gebruikt om de microarray-dia's de volgende dag te wassen met Wash Buffer 1
Schotel 3 Voeg een kleine magnetische roerstaaf toe, label met "Wash Buffer 2" en plaats in een 37 °C mini incubator. Wordt gebruikt om de microarray glijbanen te wassen met Wash Buffer 2 de volgende dag in de 37 °C mini incubator

Tabel 1: Bereiding van de waskamersamenstellingen.

Stappen Schotel Buffer wassen Temperatuur Tijd
Demontage 1 1 Ambient Zo snel mogelijk
(Stap 4.13)
Eerste wasbeurt 2 1 Ambient 1 min
(Stap 4.14)
Tweede wasbeurt 3 2 37 °C 1 min
(Stap 4.15)

Tabel 2: Incubatietemperatuur en tijd voor waskamersamenstellingen.

Discussion

De beschreven methode levert zeer reproduceerbare resultaten voor hoogwaardige EN hoogwaardige RNA-extracten (figuur 1). Op basis van onze ervaring raden we drie biologische repliceert aan voor één genotype, stadium of voorwaarde voor analyse. Om statistisch zinvolle verschillen te kunnen detecteren, moet de algemene overvloed aan mRNA worden overwogen. Houd er echter rekening mee dat een beginbedrag van 200 mg weefselmonsters vereist is in drievoud voor de RNA-extractiestap. Voor experimenten met een beperkte hoeveelheid monsters, zoals genetisch gemodificeerde plantaardige materialen, is deze methode dus mogelijk niet geschikt.

Tijdens microarray hybridisatie zijn de volgende stappen het meest kritisch: (1) het laden van de monsters naar de pakkingdia (stap 4.7) en (2) het wassen van de arrays na hybridisatie (stappen 4.13 en 4.14). Monster laden moet zeer zorgvuldig worden gedaan om te voorkomen dat bellen vorming en vloeistof morsen. Voorzichtigheid is geboden bij het aanbrengen van de microarray slide op de pakking schuif met de geladen monsters: de DNA-kant (met gevlekte sondes) moet naar beneden worden gericht om hybridisatie mogelijk te maken. Voor het wassen van de microarrays is de tweede wasstap bijzonder kritisch: hier moet het verwijderen van de dia's uit wasbuffer 2 heel langzaam worden uitgevoerd (10 s) om bufferartefacten op de dia's te voorkomen, wat kan interfereren met het verzamelen en analyseren van gegevens.

Om resultaten te ontvangen van het hybridisatie-experiment dat in aanmerking komt voor downstream bioinformatica-analyse, moet men een aantal belangrijke criteria volgen. Het QC-rapport, dat wordt gegenereerd na de uitvoering van het protocol hierboven, geeft een goed idee van wat moet worden verbeterd en welke gegevens zich in een bruikbare staat bevinden (figuur 3). De eerste ontvangen informatie is het gevisualiseerde raster (figuur 2). Hier kan men direct zien of alle gebieden voor de fluorescentie read-out goed zijn uitgelijnd. Als er een visueel detecteerbare verschuiving is, zal dit van invloed zijn op alle andere waarden (achtergrond, signaalintensiteit, enz.) en kan het uitlezen van deze chip niet worden gebruikt. Op het overzicht (Ruimtelijke Verdeling van alle Uitschieters) kan men gemakkelijk elke verontreiniging (bijvoorbeeld stof of haar) herkennen, die de uitkomst beïnvloedde. Vuil kan worden verwijderd door zachtjes blazen en opnieuw scannen van de chip. Het histogram van signaalplot zoals hierboven vermeld moet resulteren in een brede Gauss-vormige curve, met slechts kleine uitschieters (Figuur 2). Afhankelijk van het geanalyseerde weefsel (Figuur 1), kan deze curve er anders uitzien en kan verschijnen om twee pieken te hebben, of een overheersende piek met een schouder. Dit heeft geen invloed op de kwaliteit van de gegevens. Alleen een sterk verschoven piek, of hoge signalen aan de randen wijzen op problemen, zoals "groene monsters" (te hoge fluorescentie-intensiteit), die niet kunnen worden verwijderd door wassen en moet worden gemeld aan de chipfabrikant. Ook moet de "Ruimtelijke verdeling grafiek voor mediane signalen" variëren rond een gemeenschappelijke waarde. Dit moet in het bereik tussen 40 en 100, afhankelijk van de algemene intensiteit uitlezing van de geanalyseerde chip. Een andere belangrijke kwaliteitscontrole is de evaluatie van de piek in gegevens: De log-grafiek voor de piek in signalen moet resulteren in een lineaire en regelmatige lijn. Ten slotte geeft de tabel van "evaluatiestatistieken" een goed en betrouwbaar beeld van de ontvangen resultaten. Hier biedt de fabrikant een reeks waarden die kunnen worden geclassificeerd als Uitstekend, Goed en Evalueren (Figuur 3). Volgens onze ervaring kunnen sommige waarden niet altijd voor alle chips worden toegepast. Voor aangepaste chips voor rijst was de "nonControl-waarde" vaak buiten bereik, maar heeft dit geen aanzienlijke invloed op de verdere gegevensverwerking. Bovendien kan het bereik voor "NegControl" worden uitgebreid, op basis van weefsel, organisme en algemene output van de Chip tot <80. Het bereik voor evaluatie voor waarde E1 med CV kan worden uitgebreid tot <9, in plaats van <8 volgens onze ervaring. Hierna is een goede evaluatie van alle chip uitleesgegevens mogelijk. In het algemeen moet men altijd in gedachten houden dat onafhankelijke biologische repliceert altijd het meest betrouwbare resultaat geven.

Het voordeel van deze techniek ten opzichte van andere methoden ligt in het feit dat het een kosteneffectieve, hoge doorvoermethode voor transcriptieprofilering vertegenwoordigt. Bovendien is de downstream data-analysepijplijn eenvoudiger en meer ingeburgerd. Ondanks voordelen zijn er bepaalde beperkingen van deze techniek, zoals het aantal genen dat kan worden geanalyseerd. De microarray kan alleen vergemakkelijken de analyse van genen eerder gespot sondes op de array. Daarom is deze techniek alleen van toepassing op plantensoorten met gesequenced genoom en volledig geannoteerde genen. We stellen ons voor dat de op microarray gebaseerde transcripties zeer nuttig en relevant zullen blijven, niet alleen voor genexpressieprofilering, maar ook voor andere downstream bio-informaticapijplijnen zoals analyses van genregulerende netwerken en transcriptome-brede associatiestudie.

Disclosures

De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen.

Acknowledgments

Dit werk is ondersteund in het kader van het CGIAR thematisch gebied Global Rice Agri-Food System CRP, RICE, Stress-Tolerant Rice for Africa and South Asia (STRASA) Phase III, en IZN (Interdisciplinary Centre for Crop Plant Research, Halle (Saale), Duitsland. Wij danken Mandy Püffeld voor haar uitstekende technische bijstand en Dr. Isabel Maria Mora-Ramirez voor het delen van informatie en ervaring met de tarwechip. Wij danken Dr. Rhonda Meyer (RG Heterosis, IPK Gatersleben, Duitsland) voor commentaar en het kritisch lezen van het manuscript.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ß-mercaptoethanol Roth 4227.3 Add 300 ul to 20 mL RNA Extraction Buffer immediately prior to use
Bioanalyzer 2100 Agilent Technologies To determine quality and quantity of RNA extract
Crushed ice maker Various brands To keep samples on ice during sample processing
Dewar flask Various brands Used as liquid nitrogen container
Ethanol, absolute Roth 9065.1
Gene Expression Hybridization Kit Agilent Technologies 5188-5242 Kit components:
2X Hi-RPM Hybridization Buffer
25X Fragmentation Buffer
10X Gene Expression Blocking Agent
Gene Expression Wash buffer Kit Agilent Technologies 5188-5325 Kit components:
Gene Expression Wash Buffer 1
Gene Expression Wash Buffer 2
Triton X-102
Heat block Various brands It is recommended to have at least one heat block for 1.5 ml tubes and another one for 2.0 ml tubes
Hybridization oven Agilent G2545A Stainless-steel oven designed for microarray hybridization From Sheldon Manufacturing, used to hybridize the sample in microarray overnight.
Hybridization gasket slide kit Agilent G2534-60014
iQAir air cleaner To ensure that the experiment is conducted in low-ozone area
Isopropanol Roth 9866.5
Lint-free paper, Kimwipes Kimberly-Clark Professional KC34155
Low Input Quick Amp Labeling Kit Agilent Technologies 5190-2305 Kit components:
T7 Primer
5x First Strand Buffer
0.1M DTT
10 mM dNTP Mix
AffinityScript RNAse Block Mix
5x Transcription Buffer
NTP Mix
T7 RNA Polymerase Blend
Nuclease-free water
Cyanine 3-CTP
Metal spatula, small Ensure that the small metal spatula can fit in the microfuge tubes to ensure easy scooping of samples.
Microarray scanner Agilent Technologies Agilent SureScan or Agilent C microarray scanner are recommended
Microfuge tubes, nuclease-free Various brands 2.0 mL and 1.5 mL volume
Microcentrifuge Eppendorf 5810 R It is recommended to have at least one ambient and cold temperature microfuge with rotors that can hold 24 each of 1.5 ml and 2.0 ml microfuge tubes
Mini incubator Labnet I5110-230V Any small incubator will do.
Mortar and pestle Any small ceramic or marble mortar and pestle that can withstand cryogenic grinding using liquid nitrogen.
NaCl Sigma-Aldrich S7653-1KG
Nanodrop 1000 Peqlab / Thermofisher
Nuclease-free water Biozym 351900302
One-Color RNA Spike-In Kit Agilent 5188-5282 Kit components:
One color RNA Spike-Mix
Dilution Buffer
Ozone barrier slide cover kit Agilent G2505-60550 Optional but highly recommended
PCR tube, 0.2 mL, RNase-free Stratagene Z376426
Phenol:chloroform:isoamyl mixture (25:24:1) Roth A156.2
Pipette tips, nuclease free, filter tips Various brands To accommodate 2, 20, 20, 100, 200 and 1000 ul volumes
Pipettor set Various brands For 2, 20, 20, 100, 200 and 1000 ul volumes
RNA Extraction Buffer 10 mM Tri-HCl pH 8.0
150 mM LiCl
50 mM EDTA
1.5% EDTA
15 ul/mL β-mercaptoethanol		 We routinely use Roth or Sigma chemicals; Add β-mercaptoethanol fresh daily
RNase-free DNase set Qiagen 79254
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104 Kit components:
RNeasy mini spin column (pink)
1.5 ml collection tubes
2 ml collection tubes
Buffer RLT
Buffer RW
Buffer RPE
Nuclease-free water
RNeasy Plant Mini Kit Qiagen 74904 Kit components:
RNeasy mini spin column (pink)
QIAshredder spin column (purple)
1.5 ml collection tubes
2 ml collection tubes
Buffer RLT
Buffer RLC
Buffer RW1
Buffer RPE
Nuclease-free water
Slide holders for DNA microarray scanner Agilent G2505-60525
Slide staining dish with removable rack DWK Life Sciences 900200 Fisher Scientific 08-812 We recommend DWK Life Sciences Wheaton™ Glass 20-Slide Staining Dish with Removable Rack (Complete with dish, cover, and glass slide rack)
Sodium chloride Roth P029.1
Ultralow temperature freezer Various brand Capable of storing sample at -80 °C
Vortex mixer Various brands At least one for single tube vortex-mixer and another one for that can vortex-mix multiple tubes

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, X., et al. Three-dimensional intact-tissue sequencing of single-cell transcriptional states. Science. 361 (6400), (2018).
  2. Püffeld, M., Seiler, C., Kuhlmann, M., Sreenivasulu, N., Butardo, V. M. Analysis of Developing Rice Grain Transcriptome Using the Agilent Microarray Platform. Methods in Molecular Biology. 1892, 277-300 (2019).
  3. Martin, L., Fei, Z., Giovannoni, J., Rose, J. Catalyzing plant science research with RNA-seq. Frontiers in Plant Science. 4 (66), (2013).
  4. Hrdlickova, R., Toloue, M., Tian, B. RNA-Seq methods for transcriptome analysis. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 8 (1), (2017).
  5. Radchuk, V. V., et al. Spatiotemporal profiling of starch biosynthesis and degradation in the developing barley grain. Plant Physiology. 150 (1), 190-204 (2009).
  6. Sreenivasulu, N. Systems biology of seeds: deciphering the molecular mechanisms of seed storage, dormancy and onset of germination. Plant Cell Reports. 36 (5), 633-635 (2017).
  7. Sreenivasulu, N., Wobus, U. Seed-development programs: a systems biology-based comparison between dicots and monocots. Annual Review of Plant Biology. 64, 189-217 (2013).
  8. Butardo, V. M. Jr, et al. Systems Genetics Identifies a Novel Regulatory Domain of Amylose Synthesis. Plant Physiology. 173 (1), 887-906 (2017).
  9. de Guzman, M. K., et al. Investigating glycemic potential of rice by unraveling compositional variations in mature grain and starch mobilization patterns during seed germination. Scientific Reports. 7 (1), 5854 (2017).
  10. Sreenivasulu, N., Sunkar, R., Wobus, U., Strickert, M. Array platforms and bioinformatics tools for the analysis of plant transcriptome in response to abiotic stress. Methods in Molecular Biology. 639, 71-93 (2010).
  11. Anacleto, R., et al. Integrating a genome-wide association study with a large-scale transcriptome analysis to predict genetic regions influencing the glycaemic index and texture in rice. Plant Biotechnology Journal. , (2018).
  12. Pietsch, C., Sreenivasulu, N., Wobus, U., Roder, M. S. Linkage mapping of putative regulator genes of barley grain development characterized by expression profiling. BMC Plant Biology. 9, 4 (2009).
  13. Druka, A., et al. An atlas of gene expression from seed to seed through barley development. Functional & Integrative Genomics. 6 (3), 202-211 (2006).
  14. Fujita, M., et al. Rice Expression Atlas In Reproductive Development. Plant and Cell Physiology. 51 (12), 2060-2081 (2010).
  15. Wang, L., et al. A dynamic gene expression atlas covering the entire life cycle of rice. The Plant Journal. 61 (5), 752-766 (2010).
  16. Yamakawa, H., Hakata, M. Atlas of rice grain filling-related metabolism under high temperature: Joint analysis of metabolome and transcriptome demonstrated inhibition of starch accumulation and induction of amino acid accumulation. Plant and Cell Physiology. 51 (5), 795-809 (2010).
  17. Shakoor, N., et al. A Sorghum bicolor expression atlas reveals dynamic genotype-specific expression profiles for vegetative tissues of grain, sweet and bioenergy sorghums. BMC Plant Biology. 14, 35 (2014).
  18. Yu, Y. L., et al. Transcriptome analysis reveals key differentially expressed genes involved in wheat grain development. Crop Journal. 4 (2), 92-106 (2016).
  19. Kochevenko, A., et al. Identification of QTL hot spots for malting quality in two elite breeding lines with distinct tolerance to abiotic stress. BMC Plant Biology. 18 (1), 106 (2018).

Tags

Biochemie Nummer 159 cDNA synthese cRNA etikettering microarray nucleïnezuur hybridisatie totale RNA extractie transcriptome

Erratum

Formal Correction: Erratum: Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling
Posted by JoVE Editors on 06/26/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling. Two author names were updated.

The names were corrected from:

Christianne Seiler
Nese Sreeenivasulu

to:

Christiane Seiler
Nese Sreenivasulu

Het verkrijgen van hoogwaardige transcriptoomgegevens van graanzaden door middel van een gewijzigde methode voor genexpressieprofilering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Butardo Jr., V. M., Seiler, C.,… More

Butardo Jr., V. M., Seiler, C., Sreenivasulu, N., Kuhlmann, M. Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling. J. Vis. Exp. (159), e60602, doi:10.3791/60602 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter