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Biochemistry

Beschaffung hochwertiger Transkriptomdaten von Getreidesamen durch eine modifizierte Methode zur Genexpressionsprofilierung

Published: May 21, 2020 doi: 10.3791/60602
Automatic Translation
1, 2, 3, 2
1Department of Chemistry and Biotechnology, Swinburne University of Technology, 2Department of Molecular Genetics, Heterosis Research Group, Leibniz Institute of Plant Genetics and Crop Plant Research (IPK), 3Grain Quality and Nutrition Center, Applied Functional Genomics Cluster, International Rice Research Institute

ERRATUM NOTICE

Summary

Es wird eine Methode zur Transkription von Getreideprofilen vorgestellt. Das mikroarraybasierte Genexpressionsprofiling beginnt mit der Isolierung hochwertiger Gesamt-RNA aus Getreidekörnern und setzt sich mit der Generierung von cDNA fort. Nach cRNA-Kennzeichnung und Mikroarray-Hybridisierung werden Empfehlungen zur Signalerkennung und Qualitätskontrolle gegeben.

Abstract

Die Charakterisierung der Genexpression hängt von der RNA-Qualität ab. Bei keimenden, entwickelnden und reifen Getreidesamen wird die Extraktion hochwertiger RNA oft durch hohen Stärke- und Zuckergehalt behindert. Diese Verbindungen können sowohl die Ausbeute als auch die Qualität der extrahierten Gesamt-RNA reduzieren. Die Verschlechterung der Quantität und Qualität der gesamten RNA kann sich in der Folge signifikant auf die nachgeschalteten transkriptomischen Analysen auswirken, die möglicherweise nicht genau die räumliche und/oder zeitliche Variation im Genexpressionsprofil der getesteten Proben widerspiegeln. In diesem Protokoll beschreiben wir eine optimierte Methode zur Extraktion von RNA insgesamt mit ausreichender Quantität und Qualität, die für die gesamte Transkriptomanalyse von Getreidekörnern verwendet werden kann. Das beschriebene Verfahren eignet sich für mehrere nachgelagerte Anwendungen, die für die transkriptomische Profilierung von Entwicklungs-, Keim- und reifen Getreidesamen verwendet werden. Die Methode der Transkriptom-Profilierung mit einer Microarray-Plattform wird gezeigt. Diese Methode wurde speziell für die Genexpressionsprofilierung von Getreide mit beschriebenen Genomsequenzen entwickelt. Das detaillierte Verfahren von der Mikroarray-Handhabung bis zur abschließenden Qualitätskontrolle wird beschrieben. Dazu gehören cDNA-Synthese, cRNA-Kennzeichnung, Mikroarray-Hybridisierung, Dia-Scanning, Feature-Extraktion und Datenqualitätsvalidierung. Die mit dieser Methode erzeugten Daten können verwendet werden, um das Transkriptom von Getreide während der Keimung, in verschiedenen Stadien der Kornentwicklung oder unter verschiedenen biotischen oder abiotischen Stressbedingungen zu charakterisieren. Die hier vorgestellten Ergebnisse veranschaulichen hochwertige Transkriptomdaten, die für nachgelagerte Bioinformatik-Analysen zugänglich sind, wie die Bestimmung von differenziell exprimierten Genen (DEGs), die Charakterisierung von Genregulierungsnetzen und die Durchführung einer Transkriptom-weiten Assoziationsstudie (TWAS).

Introduction

Das Transkriptom stellt den vollständigen Satz von Ribonukleinsäure-Transkripten (RNA) dar, die durch das Genom eines Organismus zu einem bestimmten Zeitpunkt und insbesondere umwelt- und Wachstumsbedingungen exprimiert werden. Jede Zelle hat ihr individuelles Transkriptom, das ihren aktuellen physiologischen und metabolischen Zustand widerspiegelt. Eine Sammlung von Zellen, die aus einem ähnlichen Gewebe oder Organ abgeleitet werden, wird in einer typischen Transkriptom-Studie verwendet, aber einzellige und räumlich aufgelöste Transkriptomik wird immer beliebter1. Transkriptomische Analysen beginnen mit der Extraktion der gesamten RNA aus einem ausgewählten Gewebe zu einem bestimmten Zeitpunkt und unter definierten Wachstumsbedingungen. Zu diesem Zweck empfehlen wir die Verwendung einer neu entwickelten Methode zur Extraktion von RNA insgesamt aus Proben mit hohem Stärke- oder Zuckergehalt, wie z. B. Getreidesamen2. Der Vergleich von Transkriptomen zwischen verschiedenen Proben führt zur Identifizierung von RNA-Molekülen mit unterschiedlicher Häufigkeit. Diese RNA-Moleküle werden als differenziell exprimierte Gene (DEGs) betrachtet. Die Fülle von Transkripten, die aus bestimmten Markergenen abgeleitet werden, kann dann verwendet werden, um den Entwicklungsstatus abzuschätzen oder die Reaktion eines Organismus auf Umweltschwankungen zu bestimmen. Gene ohne nachweisbare Veränderungen in ihrer Transkriptionüberfluss über die entwicklungsfähigen Zeitpunkte zu studieren werden oft als Referenz oder Housekeeping-Gene verwendet.

Die RNA wird in der Regel durch verschiedene Methoden nachgewiesen und quantifiziert, wie Z.B. Northern Blotting und quantitative Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR), aber aktuelle Hochdurchsatz-Transkriptomik-Methoden basieren stark auf der Nukleinsäure-Hybridisierung mittels Mikroarray-Technologie sowie DER RNA-Sequenzierung (RNA-Seq). RNA-Seq ist derzeit sehr beliebt, da es mehrere Vorteile für transkriptomische Anwendungen mit hohem Durchsatz bietet, wie an anderer Stelle überprüft3,4. Obwohl eine ältere Technologie, Genexpression Profiling mit Mikroarray-Chips ist immer noch weit verbreitet, weil es eine etablierte Technologie ist, die weniger Hintergrund in der Bioinformatik erfordert. Im Vergleich zu RNA-Seq sind die aus Mikroarray-Experimenten generierten Datensätze kleiner und leichter zu analysieren. Darüber hinaus ist es kostengünstiger, vor allem, wenn es um große Stichprobenzahlen geht. In unserem Labor verwenden wir routinemäßig transkriptomische Analysen mit der Mikroarray-Technologie, um die Rolle zentraler regulatorischer Knotenpunkte zu bestimmen, die die molekularen Netzwerke und Pfade steuern, die am Wachstum, der Entwicklung und dem Stoffwechsel von Getreidekörnern5,6,7,8,9beteiligt sind. Wir verwenden es auch routinemäßig zur Durchführung genomweiter Genexpressions-Profiling-Studien, um ein mechanistisches Verständnis der Reaktion von Getreidekörnern auf abiotische Belastungen zu erhalten10, sowie in der Durchführung von Transkriptom-weiten Assoziations- (TWAS) und Linkage-Mapping-Studien, um Gene zu identifizieren, die für Getreidekornqualität und Ernährung verantwortlich sind11,12. Andere Gruppen haben auch die Mikroarray-Technologie bei der Bereitstellung entwicklungsspezifischer Genexpressionsatlas in Gerste13, Reis14,15,16, Sorghum17und Weizen18verwendet.

Der Zweck dieser Veröffentlichung ist es, eine kurze Textzusammenfassung und eine detaillierte visuelle Beschreibung der Methode zu liefern, die wir derzeit in unserem Labor für die transkriptomische Profilierung von Getreidekörnern mit einer Agilent-Mikroarray-Plattform anwenden. Bitte beachten Sie, dass andere Microarray-Plattformen verfügbar sind, aber nicht von dieser Methode abgedeckt werden. Wir beginnen das Protokoll mit einer detaillierten Beschreibung der RNA-Extraktion aus der Entwicklung oder Keimung von Getreidesamen. Basierend auf unserer Erfahrung ist die Erlangung eines qualitativ hochwertigen und hochmengenreichen Transkriptoms, das für nachgelagerte transkriptomische Analysen zugänglich ist, oft der Engpass bei der Verwendung von Getreidesaatgutgeweben. Wir haben mehrere kommerziell erhältliche RNA-Extraktionskits ausprobiert, aber keines hat zufriedenstellende Ergebnisse geliefert. Daher haben wir ein chemisches Extraktionsprotokoll entwickelt, um einen rohen RNA-Extrakt zu erhalten, der dann mit einem handelsüblichen Kit einer Spaltenreinigung unterzogen wird. Mit dieser Methode erhalten wir routinemäßig und reproduzierbar hochwertige RNA2 (Abbildung 1), die für verschiedene nachgeschaltete Anwendungen verwendet werden kann, um ein Transkriptomprofil zu erzeugen.

Protocol

1. Gesamte RNA-Extraktion und -Reinigung

HINWEIS: Arbeiten Sie immer unter der Dunstabzugshaube, da diese Methode die Verwendung von schädlichen flüchtigen organischen Lösungsmitteln beinhaltet. Vor Beginn des Experiments wird ein Mikrofugenrohr aus nukleasefreiem Wasser in einem 50 °C-Wärmeblock vorwärmen. Dieses nukleasefreie Wasser wird verwendet, um die gesamte RNA aus der Spinspalte in Schritt 1.8 zu löschen.

  1. Die Proben mit jeweils mindestens drei biologischen Nachbildungen werden getrennt zu einem feinen Pulver gemahlen, wobei ein sterilisierter Mörtel und Stößel verwendet werden, die in flüssigem Stickstoff vorgekühlt sind.
    1. Scoop die pulverförmigen Proben mit einem kleinen Metallspachtel in flüssigen Stickstoff getaucht und legen Sie die pulverförmigen Proben in 2,0 ml Nuklease-freie Mikrofuge-Rohre, auch in flüssigen Stickstoff vorgetaucht. Bewahren Sie die Proben sofort im Ultratieftemperatur-Gefrierschrank (-80 °C) bis zum Tag auf, der für die Batch-RNA-Extraktion (STOP POINT) zugeordnet ist.
      HINWEIS: Samenproben können mit oder ohne Entschärfung zu feinem Pulver gemahlen werden. Bei Reis mahlen wir die Proben routinemäßig, ohne zu entwirn, da die Schale Kieselsäure enthält, die während des Schleifprozesses helfen kann.
      VORSICHT: Dieser Schritt muss schnell und unter streng kryogenen Bedingungen durchgeführt werden. Eine Möglichkeit für die Automatisierung besteht darin, die Proben mit einer kryogenen Kugelmühle zu schleifen, um den Abbau der RNA und die Qualitätsverschlechterung zu minimieren.
  2. Erhalten Sie einen rohen RNA-Extrakt mit ca. 200 mg der ursprünglichen pulverförmigen Probe. Jede Probe einzeln in ein nukleasefreies Mikrofugenrohr geben, das 750 l RNA-Extraktionspuffer (100 mM Tris, pH 8,0, 150 mM LiCl, 50 mM EDTA, 1,5% SDS, 1,5% 2-Mercaptoethanol) und 500 l Phenol:Chloroform:Isoamyl (25:24:1) enthält.
    1. Mischen Sie alle Proben gleichzeitig für 5 min bei Raumtemperatur mit einem Multi-Rohr Wirbelmischer mit hoher Geschwindigkeit eingestellt. Halten Sie sofort alle Rohre auf Eis für zwei min.
      VORSICHT: Arbeiten Sie immer in der Dunstabzugshaube, insbesondere für alle Schritte mit Phenol, Chloroform und anderen organischen Lösungsmitteln. Verwenden Sie idealerweise eine breite Dunstabzugshaube, die eine Tischzentrifuge, einen Wirbelmischer, einen Mehrrohrwirbelmischer und einen Mehrrohr-Drehmischer aufnehmen kann.
  3. Trennen Sie den rohen RNA-Extrakt aus den Trümmern durch Zentrifugation bei 14.000 x g für 10 min. Machen Sie alle Zentrifugationsschritte in den gleichen Einstellungen für diesen Abschnitt.
    1. Übertragen Sie ca. 800 l Überstand in ein neues 2,0 ml Mikrofugenrohr, das 400 l 1,2 m NaCl und 700 l Isopropanol enthält. Mischen Sie die Lösung sanft durch Inversion 5x.
    2. Niederschlagen Sie die RNA durch Inkubation in einem regulären (-20 °C) oder Ultratieftemperatur-Gefrierschrank (-80 °C), für mindestens 1 h (oder über Nacht).
      STOP oder PAUSE Punkt: Halten Sie einfach die Proben in regelmäßigen -20 °C Gefrierschrank für ein paar Stunden pausieren. Für Übernachtungen oder einen längeren Haltepunkt die Proben im Gefrierschrank mit ultraniedriger Temperatur (-80 °C) aufbewahren.
  4. Erhalten Sie ein rohes RNA-Pellet durch Zentrifugation bei 18.800 x g für 15 min. Nach dem Wegwerfen des Überstandes, reinigen Sie das rohe RNA-Pellet durch Säulenreinigung mit einem Mini-Kit (Tabelle der Materialien).
    1. Lösen Sie das Pellet in frisch zubereiteten 450 l RLT-Puffer (vor der Verwendung 100 l Mercaptoethanol pro 100 ml RLT-Puffer hinzufügen, täglich frisch zubereitet). Verbessern Sie die Auflösung aller Pellets, indem Sie alle Rohre bei Raumtemperatur in einem Mehrrohrwirbelmischer für mindestens 5 min mischen.
  5. Reinigen Sie das gelöste RNA-Pellet, indem Sie die violette Mini-Spin-Säule mit einem 2 ml-Sammelrohr passieren. Zentrifugieren Sie bei Raumtemperatur 1 min bei 9.000 x g und entsorgen Sie die violette Mini-Spin-Säule.
    1. Fügen Sie dem geclearten Lysat im 2-ml-Sammelrohr 0,5 Volumen absolutes Ethanol (ca. 225 l) hinzu. Mischen Sie die Lösung mit der gleichen Kunststoffspitze, indem Sie ein paar Mal nach oben und unten pfeifen.
  6. Sammeln Sie die gereinigte RNA, indem Sie die Lösung sofort auf eine rosa Mini-Spin-Säule mit einem 2 ml-Sammelrohr übertragen. Zentrifuge bei 9.000 x g für 15 s, um die RNA auf die Kieselsäuremembran der rosa min Spin-Säule zu sammeln. Entsorgen Sie den Durchfluss und waschen Sie die RNA mit 350 l Puffer RW1 durch Zentrifugierung bei 9.000 x g für 15 s.
  7. Entfernen Sie die kontaminierende genomische DNA, indem Sie 80 l verdünnte DNase 1 (50 l gefrorenen DNase-Bestand + 350 l RDD mit dem DNase-Set) direkt auf die Membran und verdauen, indem Sie bei Raumtemperatur mindestens 15 min (PAUSE POINT) inkubieren.
    1. Waschen Sie die DNase 1 ab, indem Sie 350 l RW1 hinzufügen und bei 9.000 x g für 15 s abdrehen. Zweimal wiederholen, aber dieses Mal mit 500 l Puffer-RPE waschen. Auf ein neues 2 ml Sammelrohr übertragen und bei 9.000 x g für 2 min zum Trocknen drehen.
  8. Die getrocknete Spinsäule in ein neues 1,5 ml nukleasefreies Sammelrohr geben. Beginnen Sie den Elutionsprozess für den gereinigten RNA-Extrakt, indem Sie 50 l nukleasefreies Wasser (bei 50 °C vorgewärmt) und 3 min bei 50 °C Wärmeblock inkubieren.
    1. Nach der Inkubation den gesamten RNA-Extrakt durch Zentrifugieren bei 9.000 x g für 1 min. Sofort alle Proben auf Eis legen.
  9. Bestimmen Sie die Menge und Qualität des gesamten RNA-Extrakts, indem Sie entsprechende Verdünnungen (in der Regel 1:10) in Nanodrop und BioAnalyzer mit ihren jeweiligen Herstellerprotokollen ausführen. RNA-Extrakte sollten mindestens einen RIN-Wert von 8,0 und eine Konzentration von 50 ng/L haben. Abbildung 1 zeigt ein typisches Ergebnis für RNA-Extrakte aus Gerstenblatt und Samen.
    STOP POINT: Bewahren Sie die Proben in -80 °C bis zur Verwendung auf.

2. cDNA-Synthese gefolgt von cRNA-Transkription und -Kennzeichnung

HINWEIS: Dieser Schritt eignet sich für die gleichzeitige Verarbeitung von 24 Proben. Es wird vorgeschlagen, dass der gesamte Schritt kontinuierlich an einem Tag durchgeführt wird, aber optionale Stopp- und Pausenpunkte identifiziert werden. Achten Sie darauf, drei Mikrofugenrohr-Wärmeblöcke bei 80 °C, 65 °C und 37 °C vorzuwärmen, bevor Sie mit den folgenden Schritten beginnten. Diese Temperatureinstellungen werden wie in den folgenden Schritten angegeben geändert. So wird der 37 °C-Wärmeblock nach der Vorbereitung des Spike Mix auf 40 °C eingestellt (oder wenn er bereits vorbereitet wurde). Bereiten Sie einfarbigespike Mix, T7 Promoter Mix und cDNA Master Mix mit dem Low Input Quick Amp Gene Expression Labeling Kit (siehe Tabelle der Materialien) basierend auf den Anweisungen des Herstellers vor. Diese Zubereitung ist abhängig von der Menge an beginnenden RNA-Extrakten, die in der Regel zwischen 10 und 200 ng für die gesamte RNA oder 5 ng für PolyA-RNA reichen. Wir verwenden routinemäßig 50 ng Gesamt-RNA als Ausgangsmaterial für die Mikroarray-Hybridisierung2 und für die unten beschriebene Methode. Bei der Vorbereitung eines Master-Mix für 24 Proben, fügen Sie 2 zusätzliche Reaktionen, um für Pipettiervariationen zu berücksichtigen. Verwenden Sie in diesem Schritt immer nukleasefreie Mikrofugenrohre und nukleasefreies Wasser.

  1. Aufgrund der hohen Ausbeute verdünnen Sie den RNA-Extrakt in der Regel 100-fach, um in den 50-100 ng Bereich zu passen. Basierend auf den RNA-Quantifizierungsergebnissen in Schritt 1.9, machen Sie eine 1:100 Verdünnung, indem Sie 1 l gereinigten RNA-Extrakt zu 99 l nukleasefreies Wasser in einem 1,5 ml Mikrofugenrohr hinzufügen. Bestimmen Sie die tatsächliche Konzentration dieser Verdünnung mit einem Nanodrop.
    1. Machen Sie eine zweite Verdünnung jeder gesamten RNA-Probe in 1,5 ml Mikrofugenröhre, um 50 ng der gesamten RNA in einem Endvolumen von 1,5 l zu machen. Halten Sie alle Proben auf Eis.
  2. Bereiten Sie den Spike Mix basierend auf den Anweisungen des Herstellers vor. Dieser Schritt ist auch in Püffeld et al. 20192zusammengefasst. Verwenden Sie dafür einen 37 °C-Wärmeblock. Bewahren Sie die erste und zweite Verdünnung der einfarbigen Spike-Mix-Positivsteuerung in einem Gefrierschrank mit ultraniedriger Temperatur (-80 °C) auf und durchlaufen Sie nur acht wiederholte Gefrier-/Tauzyklen.
    1. Bereiten Sie die dritte und vierte Verdünnung täglich frisch vor. Die dritte und vierte Verdünnung der Spikemischung vor Gebrauch auf Eis auftauen und lagern.
      HINWEIS: Konvertieren Sie die Temperatur des 37 °C-Wärmeblocks auf 40 °C, wenn der Spike Mix vorbereitet wurde (oder wenn er zuvor vorbereitet wurde).
  3. Bereiten Sie den T7 Promoter Mix vor und lagern Sie ihn vor der Verwendung auf Eis. Für 24 Proben reicht Folgendes aus:
    20,8 L T7-Promoter-Primer
    + 26,0 l nukleasefreies Wasser
    = 46,8 l Gesamtvolumen T7 Promoter Mix
  4. Fügen Sie in jedes Mikrofugenrohr, das 1,5 l 50 ng RNA-Probe aus Schritt 2.1 enthält, 1,8 l T7 Promoter Primer Mix (Schritt 2.3) hinzu. Mischen Sie die Komponenten richtig, indem Sie mehrmals Pipetten. Denaturieren Sie die RNA-Schablonen-Primer-Mischung durch Inkubieren in 65 °C-Wärmeblock für 10 min. Legen Sie die Mikrofugenröhren sofort auf Eis, um sich auf den nächsten Schritt vorzubereiten.
  5. Während der Entkernung des Template-Primer-Mix (Schritt 2.4) den 5x First Strand Buffer bei 80 °C für mindestens 4 min vorwärmen. Bereiten Sie den cDNA-Synthese-Master-Mix aus dem Low Input Quick Amp Labelling Kit (siehe Tabelle der Materialien)auf der Grundlage der Herstelleranweisungen schnell vor. Für 24 Reaktionen ist Folgendes ausreichend:
    52,0 l vorgewärmter 5x Erster Strangpuffer (Schritt 2,5)
    + 26,0 l von 0,1 M DTT
    + 13,0 l von 10 mM dNTP-Mischung
    + 31,2 l RNase Block Mix
    = 122,2 l Gesamtvolumen cDNA-Synthese Master Mix
    1. Jede Komponente auf Eis auftauen. Mischen Sie jede Komponente durch sanftes Pipettieren. Halten Sie den Master Mix vor der Verwendung bei Raumtemperatur.
      VORSICHT: Der RNase Block Mix sollte nach Gebrauch sofort wieder in den -20 °C Gefrierschrank gestellt werden.
  6. Entfernen Sie die RNA-Schablonengrundierung auf Eis (Schritt 2.4) und zentrifugieren Sie kurz bei Raumtemperatur, um den gesamten Inhalt auf den Boden des Mikrofugenrohrs zu drehen. Geben Sie 4,7 l des cDNA Master Mix (Schritt 2.5) auf jedes Rohr, sorgfältig durch Pipettieren nach oben und unten mischen. Das Gesamtvolumen, wenn alle Komponenten hinzugefügt werden, sollte 8,0 l betragen.
    1. Synthetisieren Sie die cDNA für 2 h in 40 °C Wärmeblock. Verschieben Sie während der 2 h Inkubation die Temperatur des 65 °C-Wärmeblocks auf 70 °C in Vorbereitung auf die Wärmeinaktivierung (Schritt 2.7).
      OPTIONALPAUSE POINT: Lagern Sie die Proben über Nacht bei -80 °C. Das Experiment kann am nächsten Tag nach der Wärmeinaktivierung fortgesetzt werden (Schritt 2.7).
  7. Inkubieren Sie jedes Rohr in 70 °C Hitzeblock für 15 min, um den RNase Block Mix zu wärmen. Die Rohre sofort auf Eis geben und mindestens 5 min inkubieren.
  8. Während die Proben 5 min auf Eis liegen (Schritt 2.7), bereiten Sie schnell den Transkriptions-Master-Mix vor. Alle Komponenten können bei Raumtemperatur kombiniert werden, tauen aber Komponenten auf Eis. Für 24 Proben reicht Folgendes aus:
    19,5 l nukleasefreies Wasser
    + 83,2 l 5x Transkriptionspuffer
    + 15,6 l von 0,1 M DTT
    + 26,0 l NTP-Mix
    + 5,5 l T7 RNA Polymerase Blend
    + 6,2 l Cyanin 3-CTP (Cy3)
    = 156,0 l Gesamtvolumen Transkriptionsmaster Mix
    VORSICHT: Die T7 RNA Polymerase Blend sollte im Gefrierschrank von -20 °C aufbewahrt und sofort nach Gebrauch wieder platziert werden. Darüber hinaus ist Cy3 lichtempfindlich. Daher sollten Das Mischen (Schritt 2.9) und die Abgabe (Schritt 2.10) bei schlechten Lichtverhältnissen erfolgen. Dazu schalten wir in der Regel jedes Licht direkt über der Laborbank aus.
  9. Da die Rohre einer abrupten Erwärmung und Kühlung unterzogen wurden (Schritt 2.7), drehen Sie den Inhalt jeder Probe mit einer Mikrozentrifuge kurz herunter, um die gesamte Flüssigkeit am Boden jedes Mikrofugenrohrs zu sammeln. Fügen Sie 6 L Transkriptions-Master-Mix (Schritt 2.8) hinzu, indem Sie sanft nach oben und unten pipetieren. Das Gesamtvolumen dieser Reaktion sollte in diesem Stadium 16 l betragen. Inkubieren Sie die Rohre bei 40 °C für 2 h, um die Cy3-markierte cRNA zu erzeugen.
    OPTIONAL STOP POINT: Die Rohre können nach der Transkription bei -80 °C gelagert werden.
  10. Stellen Sie bei der Erzeugung der cRNA (Schritt 2.9) die Temperatur des Wärmeblocks auf 55 °C ein. Fügen Sie mindestens ein Mikrofugenrohr nukleasefreies Wasser in den Wärmeblock ein. Dieses nukleasefreie Wasser wird zur Elution von gereinigter cRNA verwendet.
  11. Nach cRNA-Transkription und Etikettierung reinigen Sie die beschriftete cRNA mit einem RNeasy Mini Kit gemäß Schritt 3.

3. cRNA-Reinigung

  1. Reinigen Sie die beschriftete cRNA mit einem RNeasy Mini Kit (siehe Materialtabelle). Bereiten Sie die Puffer basierend auf den Anweisungen des Herstellers vor. Zum Beispiel wird Buffer RPE im Kit in konzentrierter Form geliefert. Vor der Verwendung fügen Sie 4 Bände molekularbiologisches absolutes Ethanol (96-100%) hinzu.
  2. Fügen Sie jeder Probe 84 l nukleasefreies Wasser hinzu, um das Gesamtvolumen auf 100 l einzustellen. Dann fügen Sie 350 l Puffer RLT und 250 l absolutes Ethanol in jede Röhre. Durch Pipettieren gründlich mischen.
  3. Übertragen Sie 700 l jedes Gemischs auf eine Mini-Spin-Säule mit einem 2 ml-Sammelrohr. Sammeln Sie die beschriftete cRNA durch Zentrifugation bei 4 °C bei 4 °C bei 7.534 x gauf die Membran. Entsorgen Sie die durchlaufende Flüssigkeit.
  4. Waschen Sie jede Probe in 500 l Puffer-RPE. Zentrifugieren und Durchwerfen wie im vorherigen Schritt. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal, und fahren Sie dann mit dem nächsten Schritt fort.
  5. Übertragen Sie die Mini-Spin-Spalte in ein neues Sammelrohr. Trocknen Sie die Proben durch Zentrifugation wie in Schritt 3.3.
  6. Übertragen Sie die Mini-Spin-Säule in ein nukleasefreies 1,5 ml Mikrofugenrohr, das mit dem Kit geliefert wird. Elute jede markierte cRNA-Probe durch Zugabe von 30 l nukleasefreiem Wasser (vorgewärmt bei 55 °C) direkt in den Membranfilter. Verbessern Sie die Elution durch Inkubation in 55 °C Hitzeblock für 60 s.
  7. Sammeln Sie die beschriftete cRNA durch Zentrifugation bei Raumtemperatur für 30 s bei 7.535 x g. Entsorgen Sie die Spinspalte und schließen Sie jedes Mikrofugenrohr. Legen Sie jede Röhre sofort auf Eis.
    OPTIONAL STOP POINT: Die Proben können nach der Elution bei -80 °C gelagert werden.
  8. Quantifizieren Sie die cRNA mit Nanodrop mit der Microarray-Funktion. Stellen Sie die Probe auf RNA-40 ein. Erhalten Sie die folgenden Werte und erfassen Sie in einer Tabelle: Cyanin-3-Farbkonzentration (pmol/L), RNA-Absorptionsverhältnis (260 nm/280 nm) und cRNA-Konzentration (ng/L).
    STOP POINT: Bewahren Sie die cRNA-Proben nach dem Lesen sofort bei -80 °C auf.
  9. Berechnen Sie die cRNA-Ausbeute und die spezifische Aktivität, wie in Püffeld et al. 20192beschrieben.

4. Mikroarray-Hybridisierung und Scannen

HINWEIS: Dieser Schritt dauert nur 3-4 h und daher kann die Hybridisierung von 24 Proben nach dem Mittagessen gestartet werden. Ein Bediener kann bequem bis zu 4 Dias (32 Samples) laufen lassen. Der Morgen des folgenden Tages ist für das Waschen und Scannen von Mikroarray-Dias vorgesehen. Weitere Läufe können dann am Nachmittag des zweiten Tages durchgeführt werden. Dieser Schritt wird wiederholt, bis alle Proben hybridisiert und gescannt werden. Es wird dringend empfohlen, farbfreie, pulverfreie Latexhandschuhe für die Handhabung und Verarbeitung der Dias zu verwenden, um sicherzustellen, dass die Proben nicht mit farbigen Pigmenten kontaminiert sind, die die Mikroarray-Analysen stören können. Abgesehen von handelsüblichen Mikroarrays, werden die folgenden benutzerdefinierten Arrays von unserer Gruppe entworfen und sind bei Agilent bestellbar: Bestellcode 028827 für Gerste (Hordeumvulgare), 054269 für Reis (Oryzasativa subs. Japonica), 054270 für Reis (Oryzasativa subs. Indica) und 048923 für Weizen (Triticumaestivum).

  1. Mikroarray-Hybridisierung mit dem Gene Expression Hybridization Kit durchführen (siehe Materialtabelle). Bereiten Sie 10x Blocking Agent gemäß Herstellerspezifikation2vor. Aliquot den 10x Blocking Agent in 200 L Portionen und lagern Sie bei -20 °C bis zur Verwendung. Jedes Aliquot reicht für bis zu 40 Hybridisierungen und ist stabil bis zu 2 Monate.
  2. An dem Tag, der für die Mikroarray-Hybridisierung vorgesehen ist, tauen Sie einen 200-L-Aliquot von 10x Blocking Agent auf Eis auf. Darüber hinaus den Hybridisierungsofen auf 65 °C vorwärmen und einen Wärmeblock auf 60 °C für den Einsatz während der cRNA-Fragmentierung vorwärmen.
  3. Bereiten Sie den Fragmentierungsmix für jedes Beispiel vor, wie vom Hersteller2beschrieben. In unserem Labor verwenden wir routinemäßig 600 ng linear verstärkte Cy3-markierte cRNA zur Hybridisierung in einem 8-Pack-Mikroarray. In diesem Fall fasst die folgende Liste die Komponenten des Fragmentierungsmixes pro Beispiel zusammen:
    600 ng linear verstärkte cRNA, Cyanin 3-markiert
    + 5 l von 10x Blockiermittel
    Anpassung der Lautstärke auf 24 l mit nukleasefreiem Wasser
    + 1 L des 25-fachen Fragmentierungspuffers
    = 25 l gesamtvolumenfragmentierungsmix
    1. Mischen Sie Proben vorsichtig mit einem Wirbelmischer. Drehen Sie alle Proben kurz mit einer Mikrozentrifuge.
  4. Alle Proben im 60 °C-Wärmeblock genau 30 min inkubieren. Jede Röhre sofort für eine Min auf Eis abkühlen und dann schnell zum nächsten Schritt übergehen.
  5. Um die Fragmentierungsreaktion vollständig zu stoppen, fügen Sie 2x GEx Hybridization Buffer HI-RPM zu jedem Rohr hinzu. Mischen Sie sanft durch Pipettieren nach oben und unten, mit großer Sorgfalt, um keine Blasen während des Mischens einzuführen. Wir verwenden routinemäßig 25 L Hybridisierungspuffer, um die Fragmentierungsreaktion für das 8-Pack-Mikroarray-Format zu stoppen.
  6. Zentrifugieren Sie alle Rohre für 1 min bei 15.750 x g bei Umgebungsraumtemperatur. Legen Sie schnell alle Rohre auf Eis und laden Sie jede Probe so schnell wie möglich.
  7. Bevor Sie das Labor für die 17 h nachtübernachtende Inkubation verlassen, bereiten Sie die Hybridisierungsassembly2 wie im Video beschrieben vor.
    1. KRITISCHER SCHRITT: Übertragen Sie jeden Hybridisierungsmix und geben Sie langsam in der Mitte jeder Dichtung gut, beobachten große Sorgfalt, keine Blasen während der Abgabe einzuführen. Für das 8-Pack-Mikroarray-Format verwenden wir routinemäßig 44 L Hybridisierungsmischung. Platzieren Sie auch 44 l 1x Hybridisierungspuffer in ungenutzten Brunnen.
    2. Setzen Sie den Mikroarrayschlitten mit korrekter Ausrichtung sofort auf die Dichtungsrutsche. Dies muss sehr sorgfältig erfolgen, um keine Flüssigkeit zu verschütten. Schließen Sie die Hybridisierungsbaugruppe fest, und drehen Sie sie, um zu überprüfen, ob keine permanenten Luftblasen eingeführt wurden. Alle Blasen sollten sich innerhalb der Dichtungsrutsche bewegen.
  8. Setzen Sie die Hybridisierungskammerbaugruppe in den Hybridisierungsofenrotator. Wenn Sie den 2x GEx Hybridization Buffer verwenden, stellen Sie die Drehzahl auf 10 Umdrehungen pro Minute ein und hybridisieren Sie sie bei 65 °C für genau 17 h.
  9. Waschen Sie hybridisierte Mikroarrays mit dem Gene Expression Wash Buffer Kit (siehe Materialtabelle). Bereiten Sie die Gene Expression Wash Buffers 1 und 2 basierend auf den Anweisungen des Herstellersvor 2. Fügen Sie 2 ml von 10% Triton X-102 zu beiden Puffern hinzu (rein optional, aber sehr zu empfehlen, um die Inzidenz von Mikroarray-Waschartefakten zu reduzieren)2.
  10. Bereiten Sie drei Waschkammerbaugruppen vor, wie in der vorherigen Publikation2beschrieben. Einzelheiten zu jeder Waschkammer sind unten aufgeführt (Tabelle 1).
  11. Aliquot 500 ml Waschpuffer 1 in einer 1 L Reagenzflasche und bei Umgebungsraumtemperatur verlassen. Bereiten Sie eine zusätzliche 1 L Reagenzflasche und Etikett mit "Wash Buffer 1 Reuse" vor, um den Waschpuffer aus der ersten Kammer zu speichern. Zusätzlich 500 ml Waschpuffer 2 in einer Reagenzflasche und in einem 37 °C Wasserbad über Nacht inkubieren.
    HINWEIS: Verlassen Sie das Labor nicht, ohne die Schritte 4.9 bis 4.11 vorzubereiten. Sie sind für die Waschschritte am nächsten Tag notwendig.
  12. Bereiten Sie am nächsten Tag die Waschpuffer wie in Tabelle 2beschrieben vor. Füllen Sie jedes Gericht auf drei Viertel ihres entsprechenden Puffers. Jeder Waschpuffer ist gut für bis zu 4-5 Dias.
  13. Nach genau 17 h Hybridisierung eine Hybridisierungskammer erhalten und auf der mit fusselfreiem Papier ausgekleideten Laborbank zerlegen, wie in der vorherigen Publikation2beschrieben.
    1. KRITISCHER SCHRITT: Übertragen Sie das Microarray-Sandwich auf Schale 1. Stellen Sie sicher, dass der Microarray-Barcode in einer schrägen Position nach oben gerichtet ist, und vermeiden Sie, dass der gesamte Schlitten in den Puffer getaucht wird. Behandeln Sie jedes Mikroarray-Dia von ihren Enden und vermeiden Sie es, die aktive Seite des Dias zu berühren.
    2. Trennen Sie die beiden Glasgleitetmiteine2. Lassen Sie die Dichtung sanft in den Boden von Schale 1 gleiten und sorgen Sie gleichzeitig dafür, dass der Mikroarray-Schlitten für den nächsten Schritt fest gehalten wird.
  14. KRITISCHER SCHRITT: Heben Sie die Microarray-Glühanlagen langsam seitlich an und übertragen Sie sofort in das Mikroarray-Rack in Dish 2, wie in der vorherigen Publikation2beschrieben. Es ist wichtig, dass die Mikroarray-Dias minimal luftbelichtet sind.
    1. Wiederholen Sie die Schritte 4.13 und 4.14, bis sich die acht Folien im Rack befinden. Verteilen Sie die Mikroarray-Dias gleichmäßig entlang des Racks. Dieser Schritt kann von einem Operator ohne Unterstützung für bis zu 4 Folien durchgeführt werden. Befestigen Sie den Rackhalter und übertragen Sie das gesamte Dish 2-Setup auf den ersten Magnetrührer. Genau 1 min vorsichtig umrühren.
  15. Unter Rühren für 1 min (Schritt 4.14) Teller 3 vom Mini 37 °C Inkubator übertragen und auf den zweiten Magnetrührer legen. Wash Buffer 2 (aus dem 37 °C Wasserbad) vorsichtig auf Schale 3 legen. Vermeiden Sie Blasenbildung beim Gießen.
    1. Nach 1 min wird gerührt (Schritt 4.14), sanft und langsam das Schiebegestell von Schale 2 heben und auf Schale 3 übertragen. Entfernen Sie den Rackhalter und rühren Sie genau 1 min.
  16. Heben Sie das Schiebegestell von Dish 3 langsam und sanft an. Achten Sie darauf, die Bildung von Puffertröpfchen zu vermeiden2. Trocknen Sie die Seiten jeder Rutsche, indem Sie sanft auf fusselfreies Papier berühren. Platzieren Sie jede fleckgetrocknete Folie in einer Schiebebox und wiederholen Sie Schritt 4.16, bis sich alle Mikroarray-Folien in der Schiebebox befinden. Ca. 15 min trocken.
    OPTIONALER STOPPPUNKT
  17. Platzieren Sie jede Mikroarray-Folie in einem Schiebehalter, um sicherzustellen, dass der Barcode nach oben gerichtet ist.
    HINWEIS: Die Ozonwerte im Mikroarrayraum sollten 50 ppb (100 g/m3) oder weniger betragen. Dies ist rein optional, wird aber dringend empfohlen: Verwenden Sie eine Ozonbarriere-Slide-Abdeckung, um einen ozoninduzierten Abbau von Cyaninfarbstoffen zu vermeiden.
  18. Legen Sie die montierten Diahalter in das Scankarussell. Laden Sie die Proben nacheinander, basierend auf der Barcodenummer. Scannen Sie die Dias sofort mit einem Mikroarray-Scanner (siehe Materialtabelle), wie in der vorherigen Publikation2beschrieben.
  19. Nach dem Durchlauf die Daten der Feature-Extraktion und QC-Validierung unterwerfen, wie in der vorherigen Publikation2beschrieben.

Representative Results

Diese Methode ist für die Extraktion von Getreidesamenproben mit erheblichen Mengen an kontaminierender Stärke oder Zucker optimiert. Es wurde entwickelt, um die gesamte RNA aus 24 Samenproben pro Tag zu extrahieren. Es sollte kontinuierlich an einem Tag durchgeführt werden, aber optionale Stopp- und Pausenpunkte werden im gesamten Protokoll identifiziert. Alternativ kann der Leser seine bevorzugten RNA-Extraktionskits oder manuelle chemische Extraktionsverfahren verwenden. Aufgrund unserer bisherigen Erfahrungen sind kommerziell erhältliche pflanzentaugliche RNA-Extraktionskits jedoch aufgrund erheblicher Mengen an Stärke, Proteinen, Zucker und/oder Lipidkontamination nicht für Samen geeignet. Bei der beschriebenen Methode folgt auf eine chemische Extraktion von RoherRNA die Säulenreinigung mit einem kommerziellen RNA-Extraktionskit. Dies bietet in der Regel RNA mit höherer Qualität und Ausbeute. Abbildung 1 zeigt das Ergebnis eines BioAnalyzer-Laufs, um die Qualität der RNA-Extraktion mit der hier beschriebenen Methode zu testen. Die Ergebnisse werden für Gerstenblätter (Proben 1 und 2 mit niedrigem Stärkegehalt) und Gerstensamen (Proben 3 und 4 mit hohem Stärkegehalt) dargestellt. Der RNA-Integritätswert (RIN) für alle Proben beträgt 10.

Abbildung 1 zeigt ein repräsentatives Gel des gereinigten RNA-Extrakts, bei dem die Qualität mit einem Bioanalyzer getestet wurde. Die Proben 1 und 2 sind typische Ergebnisse für Proben mit niedrigem Stärkegehalt wie Gerstenblätter, bei denen zusätzliche rRNA-Bänder aus Chloroplasten erkennbar sind. Die Proben 3 und 4 sind repräsentative Ergebnisse für Proben mit hohem Stärkegehalt wie Gerstensamen, die 18S und 28S rRNA zeigen. Bitte beachten Sie, dass für grüne Pflanzengewebe wie Blattproben aufgrund von Chloroplasten rRNA kein automatisierter RIN-Wert berechnet werden kann. Die Integrität und hohe Qualität kann jedoch visuell durch das Fehlen von Abbauprodukten festgestellt werden, die typischerweise als niedermolekularer Abstrich erscheinen. Der RIN-Wert für Proben mit hoher Stärke, wie z. B. Gerstensamen, beträgt in der Regel 10, indem das in diesem Dokument beschriebene Protokoll verwendet wird.

Darüber hinaus präsentieren wir hier auch eine repräsentative Daten eines Zeitverlaufsexperiments von zwei Elite-Gersten-Inzuchtlinien (Sofiara und Victoriana), die für die Analyse der Mälzereiqualität19verwendet werden. Während des Mälzereiprozesses wird Stärke in Zucker umgewandelt. Daher stellen die Proben Gewebe mit unterschiedlichen Anteilen an Stärke und Zuckergehalt dar. Da der industrielle Mälzereiprozess dem Keimungsprozess ähnelt, wurden die Transkriptome von zwei Gerstenlinien analysiert, die sich in ihrer Mälzereiqualität unterscheiden. RNAs wurden aus keimenden Samen bei 2, 24, 48, 72, 120, 144 und 196 h nach Imbibition in biologischen Triplicaten extrahiert. Die RNA-Vorbereitung und Hybridisierung zum kundenspezifischen Gersten-Mikroarray-Chip wurde wie oben beschrieben durchgeführt. Abbildung 2 zeigt das normalisierte Raster, das aus der Mikroarray-Hybridisierung im Bericht zur Qualitätskontrolle (QC)(Abbildung 3) und dem Histogrammdiagramm für erkannte Signale ausgelesen wird. Das Raster gibt das Beispiel für abgeleitete Signale aus jeder Ecke des Chips, einschließlich Hintergrund und Spike-in-Auslesepunkte, die für die Kalibrierung verwendet werden. Das Histogramm zeigt die Abweichung von nachweisbaren Punkten mit den jeweiligen Signalintensitäten an. Eine erfolgreiche Hybridisierung ergibt eine breite Gaußsche Kurve mit nur kleinen Ausreißern, wie in der Abbildung dargestellt. Gescheiterte Hybridisierungen können zu einer starken Verschiebung hin zu einer Seite ("grüne Monster") führen.

Schließlich ist in Spalte 4 von Abbildung 3ein repräsentatives Ergebnis der akzeptablen Werte dargestellt. Um die Zuverlässigkeit der durchgeführten Experimente anzuzeigen, werden die Ergebnisse mit der GeneSpring-Software weiter ausgewertet. Die gesammelten Daten werden als Hauptkomponentenanalyse (PCA) dargestellt. Das PCA integriert die Werte ausgewählter Punkte (Gene) als Vektor. Die Anzahl der ausgewerteten Punkte, die verwendet werden, kann von mehreren hundert bis zum gesamten Chip variieren und ist abhängig von der verwendeten Software. Jeder Chip (Probe) ergibt einen Wert (Vektor), der sich aus den integrierten Signalintensitäten für die analysierten Punkte ergibt. Daher zeigt die relative Position im Diagramm (PCA) die Ähnlichkeit der Proben zueinander an. Je näher die Proben sind, desto ähnlicher sind sie. Technische Replikationen sollten enger beieinander liegen als biologische, und biologische Replikationen einer Probe sollten sich enger zusammenschließen als Proben aus verschiedenen Zeitpunkten, Geweben oder Bedingungen.

Figure 1
Abbildung 1: Elektrophorese-Dateilaufzusammenfassung, die nach Überprüfung der Qualität der RNA mit Bioanalyzer erhalten wurde. Die Proben 1 und 2 sind Gerstenblattgewebe, wie durch zusätzliche ribosomale Bänder aus Chloroplasten angezeigt. Die Proben 3 und 4 sind Gerstensamengewebe mit 18S- und 28S-rRNA-Bändern. Ein RIN-Faktor wird nicht immer für grüne Gewebe wie Blatt berechnet, aber nach dem Gel ist die Qualität der RNA sehr gut. Der RIN-Wert für die Proben 3 und 4 ist 10. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: QC-Bericht über erfolgreiche Gersten-Mikroarray-Hybridisierung. A + zeigt erkannte Signale auf dem Gitter aus allen Ecken des Chips an. Das Histogramm zeigt die Anzahl der Signale, die nach Signalintensität (Fluoreszenz) als Logarithmus nach Hintergrundsubtraktion kategorisiert sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Zusammenfassung der Qualitätskontrolle (QC) nach Hybridisierung und Scannen. Die Werte für die hybridisierte Folie sind in Spalte 2 (Wert) angegeben und der Bereich der akzeptablen Werte wird in Spalte 4 angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Wash Chamber Assembly Inhalt und Etikett Zweck
Schale 1 Leer, auf der Laborbank bis zum nächsten Tag verlassen Füllen Sie mit Waschpuffer 1 am nächsten Tag, verwendet, um die Mikroarray-Dias zu zerlegen
Schale 2 Fügen Sie ein Microarray-Schiebegestell und eine kleine magnetische Rührstange hinzu; Etikett mit "Wash Buffer 1", auf der Laborbank bis zum nächsten Tag Wird verwendet, um die Mikroarray-Dias mit Wash Buffer 1 am nächsten Tag zu waschen
Schale 3 Fügen Sie einen kleinen magnetischen Rührstab hinzu, beschriften Sie mit "Wash Buffer 2" und legen Sie ihn in einen 37 °C Mini-Inkubator. Wird verwendet, um die Mikroarray-Dias mit Wash Buffer 2 am nächsten Tag im 37 °C Mini-Inkubator zu waschen

Tabelle 1: Vorbereitung der Waschkammer-Baugruppen.

Schritte Gericht Waschpuffer Temperatur Zeit
Demontage 1 1 Ambient So schnell wie möglich
(Schritt 4.13)
Erste Wäsche 2 1 Ambient 1 Min.
(Schritt 4.14)
Zweite Wäsche 3 2 37 °C 1 Min.
(Schritt 4.15)

Tabelle 2: Inkubationstemperatur und -zeit für Waschkammerbaugruppen.

Discussion

Die beschriebene Methode liefert hochreproduzierbare Ergebnisse für ertragreiche und hochwertige RNA-Extrakte (Abbildung 1). Basierend auf unserer Erfahrung empfehlen wir drei biologische Repliken für einen Genotyp, eine Stufe oder eine Bedingung für die Analyse. Um statistisch bedeutsame Unterschiede erkennen zu können, muss die allgemeine Häufigkeit von mRNA berücksichtigt werden. Bitte beachten Sie jedoch, dass eine Ausgangsmenge von 200 mg Gewebeproben in Triplicaten für den RNA-Extraktionsschritt erforderlich ist. Daher ist diese Methode für Experimente, die eine begrenzte Menge an Proben wie genetisch veränderte Pflanzenmaterialien enthalten, möglicherweise nicht geeignet.

Bei der Mikroarray-Hybridisierung sind die folgenden Schritte am wichtigsten: (1) Das Laden der Proben auf den Dichtungsschlitten (Schritt 4.7) und (2) Waschen der Arrays nach der Hybridisierung (Schritte 4.13 und 4.14). Die Probenbelastung muss sehr sorgfältig durchgeführt werden, um Blasenbildung und Flüssigkeitsaustritt zu vermeiden. Vorsicht ist geboten, wenn der Mikroarrayschlitten auf den Dichtungsschlitten gelegt wird, der die geladenen Proben enthält: Die DNA-Seite (mit gefleckten Sonden) sollte nach unten gerichtet sein, um eine Hybridisierung zu ermöglichen. Für das Waschen der Mikroarrays ist der zweite Waschschritt besonders wichtig: Hier muss das Entfernen der Dias aus Waschpuffer 2 sehr langsam (10 s) durchgeführt werden, um Pufferartefakte auf den Dias zu vermeiden, die die Datenerfassung und -analysen stören können.

Um Ergebnisse aus dem Hybridisierungsexperiment zu erhalten, die für eine abstreamische Bioinformatik-Analyse in Frage kommen, sollte man ein paar wichtige Kriterien befolgen. Der QC-Bericht, der nach der Ausführung des obigen Protokolls generiert wird, gibt eine gute Vorstellung davon, was verbessert werden sollte und welche Daten sich in einem verwendbaren Zustand befinden (Abbildung 3). Die erste erhaltene Information ist das visualisierte Raster (Abbildung 2). Hier kann man direkt sehen, ob alle Bereiche für das Fluoreszenzauslesen richtig ausgerichtet sind. Wenn es eine visuell erkennbare Verschiebung gibt, beeinflusst dies alle anderen Werte (Hintergrund, Signalintensität usw.) und das Auslesen dieses Chips kann nicht verwendet werden. Auf der Übersicht (Räumliche Verteilung aller Ausreißer) kann man leicht Verunreinigungen (z.B. Staub oder Haare) erkennen, die das Ergebnis beeinflusst haben. Schmutz kann durch sanftes Blasen und erneutes Scannen des Chips entfernt werden. Das oben erwähnte Histogramm der Signaldiagramme sollte zu einer breiten Gauß-förmigen Kurve mit nur geringfügigen Ausreißern führen (Abbildung 2). Je nach analysiertem Gewebe(Abbildung 1)kann diese Kurve unterschiedlich aussehen und zwei Spitzen oder einen vorherrschenden Peak mit einer Schulter aufweisen. Diequalität der Daten wird dadurch nicht beeinflusst. Nur ein stark verschobener Peak oder hohe Signale an den Rändern weisen auf Probleme hin, wie z. B. "grüne Monster" (zu hohe Fluoreszenzintensitäten), die nicht durch Waschen entfernt werden können und dem Chiphersteller gemeldet werden sollten. Außerdem sollte das "Spatial Distribution Graph for Median Signals" um einen gemeinsamen Wert herum variieren. Dies sollte im Bereich zwischen 40 und 100 liegen, abhängig von der allgemeinen Intensitätsauslesung des analysierten Chips. Eine weitere wichtige Qualitätskontrolle ist die Auswertung der Datenspitze: Der Loggraph für die Signalspitze sollte zu einer linearen und regulären Linie führen. Schließlich gibt die Tabelle der "Evaluierungsmetriken" einen guten und zuverlässigen Überblick über die erhaltenen Ergebnisse. Hier stellt der Hersteller eine Reihe von Werten zur Verfügung, die als Ausgezeichnet, Gut und Bewerten klassifiziert werden können (Abbildung 3). Nach unserer Erfahrung können einige der Werte nicht immer für alle Chips angewendet werden. Bei kundenspezifischen Reischips lag der "NonControl-Wert" häufig aneben, hat aber keinen wesentlichen Einfluss auf die weitere Datenverarbeitung. Darüber hinaus könnte der Bereich für "NegControl" auf der Grundlage von Gewebe, Organismus und allgemeiner Leistung des Chips auf <80 erweitert werden. Der Bereich für die Auswertung für den Wert E1 med CV kann nach unserer Erfahrung auf <9 statt auf <8 erweitert werden. Danach ist eine ordnungsgemäße Auswertung aller ausgelesenen Chipdaten möglich. Im Allgemeinen sollte man immer im Hinterkopf behalten, dass unabhängige biologische Repliken immer das zuverlässigste Ergebnis ergeben.

Der Vorteil dieser Technik im Vergleich zu anderen Methoden liegt in der Tatsache, dass sie eine kostengünstige, hochdurchsatzbasierte Methode für die Transkriptionsprofilierung darstellt. Darüber hinaus ist die nachgelagerte Datenanalyse-Pipeline einfacher und etablierter. Trotz Der Vorteile gibt es gewisse Einschränkungen dieser Technik, wie z. B. die Anzahl der Gene, die analysiert werden können. Das Mikroarray kann nur die Analyse von Genen erleichtern, die zuvor auf dem Array gesichtet wurden. Daher ist diese Technik nur auf Pflanzenarten mit sequenzierten Genomen und vollständig benoteten Genen anwendbar. Wir gehen davon aus, dass die mikroarraybasierte Transkriptomik weiterhin sehr nützlich und relevant sein wird, nicht nur für das Profiling von Genexpression, sondern auch für andere nachgelagerte Bioinformatik-Pipelines wie Gen-Regulierungsnetzwerkanalysen und Transkriptom-weite Assoziationsstudien.

Disclosures

Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde im Rahmen des CGIAR-Themenbereichs Global Rice Agri-Food System CRP, RICE, Stress-Tolerant Rice for Africa and South Asia (STRASA) Phase III und IZN (Interdisciplinary Centre for Crop Plant Research, Halle (Saale), Deutschland, unterstützt. Wir danken Mandy Püffeld für ihre hervorragende technische Unterstützung und Dr. Isabel Maria Mora-Ramirez für den Austausch von Informationen und Erfahrungen mit dem Weizenchip. Wir danken Dr. Rhonda Meyer (RG Heterosis, IPK Gatersleben, Deutschland) für die Kommentare und die kritische Lektüre des Manuskripts.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ß-mercaptoethanol Roth 4227.3 Add 300 ul to 20 mL RNA Extraction Buffer immediately prior to use
Bioanalyzer 2100 Agilent Technologies To determine quality and quantity of RNA extract
Crushed ice maker Various brands To keep samples on ice during sample processing
Dewar flask Various brands Used as liquid nitrogen container
Ethanol, absolute Roth 9065.1
Gene Expression Hybridization Kit Agilent Technologies 5188-5242 Kit components:
2X Hi-RPM Hybridization Buffer
25X Fragmentation Buffer
10X Gene Expression Blocking Agent
Gene Expression Wash buffer Kit Agilent Technologies 5188-5325 Kit components:
Gene Expression Wash Buffer 1
Gene Expression Wash Buffer 2
Triton X-102
Heat block Various brands It is recommended to have at least one heat block for 1.5 ml tubes and another one for 2.0 ml tubes
Hybridization oven Agilent G2545A Stainless-steel oven designed for microarray hybridization From Sheldon Manufacturing, used to hybridize the sample in microarray overnight.
Hybridization gasket slide kit Agilent G2534-60014
iQAir air cleaner To ensure that the experiment is conducted in low-ozone area
Isopropanol Roth 9866.5
Lint-free paper, Kimwipes Kimberly-Clark Professional KC34155
Low Input Quick Amp Labeling Kit Agilent Technologies 5190-2305 Kit components:
T7 Primer
5x First Strand Buffer
0.1M DTT
10 mM dNTP Mix
AffinityScript RNAse Block Mix
5x Transcription Buffer
NTP Mix
T7 RNA Polymerase Blend
Nuclease-free water
Cyanine 3-CTP
Metal spatula, small Ensure that the small metal spatula can fit in the microfuge tubes to ensure easy scooping of samples.
Microarray scanner Agilent Technologies Agilent SureScan or Agilent C microarray scanner are recommended
Microfuge tubes, nuclease-free Various brands 2.0 mL and 1.5 mL volume
Microcentrifuge Eppendorf 5810 R It is recommended to have at least one ambient and cold temperature microfuge with rotors that can hold 24 each of 1.5 ml and 2.0 ml microfuge tubes
Mini incubator Labnet I5110-230V Any small incubator will do.
Mortar and pestle Any small ceramic or marble mortar and pestle that can withstand cryogenic grinding using liquid nitrogen.
NaCl Sigma-Aldrich S7653-1KG
Nanodrop 1000 Peqlab / Thermofisher
Nuclease-free water Biozym 351900302
One-Color RNA Spike-In Kit Agilent 5188-5282 Kit components:
One color RNA Spike-Mix
Dilution Buffer
Ozone barrier slide cover kit Agilent G2505-60550 Optional but highly recommended
PCR tube, 0.2 mL, RNase-free Stratagene Z376426
Phenol:chloroform:isoamyl mixture (25:24:1) Roth A156.2
Pipette tips, nuclease free, filter tips Various brands To accommodate 2, 20, 20, 100, 200 and 1000 ul volumes
Pipettor set Various brands For 2, 20, 20, 100, 200 and 1000 ul volumes
RNA Extraction Buffer 10 mM Tri-HCl pH 8.0
150 mM LiCl
50 mM EDTA
1.5% EDTA
15 ul/mL β-mercaptoethanol		 We routinely use Roth or Sigma chemicals; Add β-mercaptoethanol fresh daily
RNase-free DNase set Qiagen 79254
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104 Kit components:
RNeasy mini spin column (pink)
1.5 ml collection tubes
2 ml collection tubes
Buffer RLT
Buffer RW
Buffer RPE
Nuclease-free water
RNeasy Plant Mini Kit Qiagen 74904 Kit components:
RNeasy mini spin column (pink)
QIAshredder spin column (purple)
1.5 ml collection tubes
2 ml collection tubes
Buffer RLT
Buffer RLC
Buffer RW1
Buffer RPE
Nuclease-free water
Slide holders for DNA microarray scanner Agilent G2505-60525
Slide staining dish with removable rack DWK Life Sciences 900200 Fisher Scientific 08-812 We recommend DWK Life Sciences Wheaton™ Glass 20-Slide Staining Dish with Removable Rack (Complete with dish, cover, and glass slide rack)
Sodium chloride Roth P029.1
Ultralow temperature freezer Various brand Capable of storing sample at -80 °C
Vortex mixer Various brands At least one for single tube vortex-mixer and another one for that can vortex-mix multiple tubes

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References

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Tags

Biochemie Ausgabe 159 cDNA-Synthese cRNA-Kennzeichnung Mikroarray Nukleinsäure-Hybridisierung gesamte RNA-Extraktion Transkriptom

Erratum

Formal Correction: Erratum: Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling
Posted by JoVE Editors on 06/26/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling. Two author names were updated.

The names were corrected from:

Christianne Seiler
Nese Sreeenivasulu

to:

Christiane Seiler
Nese Sreenivasulu

Beschaffung hochwertiger Transkriptomdaten von Getreidesamen durch eine modifizierte Methode zur Genexpressionsprofilierung
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Butardo Jr., V. M., Seiler, C.,… More

Butardo Jr., V. M., Seiler, C., Sreenivasulu, N., Kuhlmann, M. Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling. J. Vis. Exp. (159), e60602, doi:10.3791/60602 (2020).

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