Summary

Tümör Histolojisi için Fare Akciğerinin Perfüzyonu ve Enflasyonu

Published: August 06, 2020
doi:

Summary

Bu yöntemin amacı, akciğer tümörü patolojisinin incelenmesi ve akciğere metastazların değerlendirilmesi için fare akciğerlerinin perfüzyonu, enflasyonu ve fiksasyonu için basit ve verimli bir yöntem sunmaktır.

Abstract

Akciğer histolojisini değerlendirme yeteneği akciğer kanseri araştırmaları ve kanser metastazı alanları için kritik öneme sahiptir. Temin edilen dokuların kalitesinden ödün vermeden çalışmalardan hızlı ve verimli bir şekilde nekropsi yapılması da aynı derecede önemlidir. Bu protokolün amacı, aşağı akış histolojik analizi için fare akciğerlerini hızla boğmak, şişirmek ve düzeltmek için bir yöntem sunmaktır. Bu yöntem akciğer enflasyonuna standardize etmez; bu nedenle, herhangi bir özel prosedür veya ekipman gerektirmez ve bunun yerine kalpten perfüzyonu takiben doğrudan trakea yoluyla fiksatif aşılar. Bu, tümör büyüklüğü, histolojisi ve puanlamasının yeterli tahminini sağlar. Bu aynı zamanda akciğer dokusu fiksasyonundan önce donmuş dokunun toplanmasına izin verir. Bu yöntem, akciğerin daha sonra morfometrik niceliğine izin vermediği için sınırlıdır; ancak genetik olarak tasarlanmış fare modelleri (GEMM’ler), singeneik modellerin yanı sıra ksinograft tümör ve metastaz çalışmalarından akciğer tümörü analizi için fazlasıyla yeterlidir.

Introduction

Akciğer onkogenezi ve akciğere kanser metastazının çeşitli fare modelleri, karmaşık GEMM’lerden kanserojen kaynaklı modellere, kanser hücrelerinin intrakardiyak, intratorasik, kuyruk damarı veya akciğer içinde tümör oluşturmak için diğer yöntemlerle enjekte edildiği singeneik ve ksinograft modellerine kadar çeşitli vardır. Tüm bu modeller akciğer histolojisi ve patolojisinin histolojik değerlendirmesi için ortak ihtiyacı paylaşsa. Bu nedenle, fazla kanı çıkarmak için akciğerlere perfüzyon yaparken farelerin nekropsilerini yapmak ve akciğer mimarisini net bir şekilde görselleştirmek için akciğerleri şişirmek ve sabitlemek için sağlam ama hızlı bir yönteme sahip olmak gerekir. Hız, akciğerleri tek bir zaman noktasında düzinelerce fareden toplamak gerekebileceğinden, bu prosedürün kritik bir bileşenidir. Bu yordam fare başına 6 dakikadan daha kısa bir sürede gerçekleştirilebilir.

Bu işlem tümör histolojisini değerlendirmek için fazlasıyla yeterli olmakla birlikte, akciğerlerin stereoloji veya morfometrik ölçümlerini yapmak isteyenler için önerilmez. Bu tür ölçümler, akciğerin mutlak yüzey alanının, mutlak hacminin ve alveolar boyutunun ve1sayısının hesaplanmasında olduğu gibi akciğer enflasyonunun standartlaştırılmasını gerektirir. Bu yöntem bazı görüntüleme yaklaşımları için de en uygun değildir. Örneğin, ex vivo morfometrik analiz için akciğerlerin μCT ile görüntülenmesi, akciğerlerin hava2ile dolu kalmasını gerektirir. Hava alanlarının ve boyutlarının korunması birincil endişe kaynağı olduğunda, akciğerlerin perfüzyon dehidrasyon teknikleri ile düzeltilmesi önerilir3,4. Bu modelin en büyük endişelerinden biri, amfizem çalışmalarında kullanımını azaltarak alveolar duvarların yırtılma potansiyelidir; bununla birlikte, amfizem çalışması için akciğerlerin sabitlenmesi için önerilen prosedür hala oldukça benzerdir, çünkü akciğerlerin sürekli sıvı basıncı altında % 10 formalin intratraseral aşılama (burada açıklanan protokole benzer) veya yerinde fiksasyon5ile sabitlenmesi önerilir.

Burada açıklanan prosedürün avantajı, sürekli sıvı basıncı gerektirmemesi, bunun yerine akciğerleri tamamen genişleyene kadar şişirmesi ve böylece işlem için gereken süreyi azaltmasıdır. Burada açıklanan prosedür, toksikoloji çalışmaları için en iyi akciğer fiksasyon yöntemlerini önermek için bir alt komitenin oluşturulduğu Toksikoloji Patoloji Derneği’nin bir silahlanma armamentariumunun önerdiği yöntemlere yakından benzemektedir. Bu alt komitedeki bilim adamlarının çoğunluğu, akciğerin fiksatif6’dabırakıldığı zaman farklı öneriler olmasına rağmen, akciğerlerin bir şırınna ile intratrakial aşılama ile sabitlenmesini önerdi. Bu nedenle, akciğer şişirme ve fiksasyon çeşitli yöntemler mevcut iken, burada açıklanan yöntem hızlı bir şekilde şişirmek ve downstream tümör histolojik değerlendirme için akciğerleri düzeltmek için en uygun yöntem olarak önerilmiştir.

Protocol

Burada açıklanan tüm yöntemler Birmingham’daki Alabama Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. 1. Deneysel protokol Onaylı bir IACUC yöntemi kullanarak fareyi feda edin. Burada% 5 izofluran ile uyuşturulan bir farenin servikal çıkığı kullandık. Çalışma için uygun bir fare kullanın; Burada, 8 haftalık bir FVB fare kullanıyoruz Cerrahi makas kullanarak, alt karın ortasında 3,5-5 mm yatay bir kesi y…

Representative Results

Yukarıdaki protokol, fare akciğerlerinin hızlı perfüzyonunu, enflasyonuna ve sabitlenmesine izin verir. Aşağıda gösterilen rakamlar her adımın önemini temsil eder. Şekil 1′ de PBS ile perfüzyona uğramış H&E lekeli akciğerler ve perfüzyon adımının atladığı veya akciğerlerin doğru şekilde perfüzyona maruz kalmadığı akciğerler tasvir edilmiştir. Gösterildiği gibi, zayıf perfüzyonlu akciğerlerdeki fazla kan ideal histolojiden daha az oluşturur ve akciğer …

Discussion

Fare akciğerlerinin perfüzyonu, enflasyonu ve fiksasyonu için yukarıda açıklanan prosedür, akciğer tümörü histolojisi ve patoloji analizi için fare akciğerlerinin hızlı ve verimli bir şekilde hazırlanması için idealdir. Prosedür herhangi bir özel ekipman gerektirmez ve fare başına 6 dakikadan daha kısa bir sürede gerçekleştirilebilir. Prosedür, enflasyon veya sabit sıvı basıncı için sabit bir hacim gerektirmez. Bu işlem standart hale getirmediği için akciğerin stereolojik veya morfome…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu yayında bildirilen araştırmalar, Ul1TR003096 (MDE), Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü Akciğer Hastalıkları Eğitim Programı 5T32HL134640 (MLD) ödül numarası altında Ulusal Çeviri Bilimleri İlerleyen Merkez tarafından desteklenmiştir.

Materials

10% buffered formalin Fisher 23-245685
22 G Needle BD 305155
3 mL syringe BD 309656
70% Ethanol Decon 2405
Forceps Harvard Apparatus 72-8595
Heparin Fisher H19
Phosphate Buffered Saline (PBS) Corning 21-030-CV
Surgical scissors Harvard Apparatus 72-8428

References

  1. Hsia, C. C., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R., Structure, A. An official research policy statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: standards for quantitative assessment of lung structure. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181 (4), 394-418 (2010).
  2. Vasilescu, D. M., Knudsen, L., Ochs, M., Weibel, E. R., Hoffman, E. A. Optimized murine lung preparation for detailed structural evaluation via micro-computed tomography. Journal of Applied Physiology. 112 (1), 159-166 (2012).
  3. Blumler, P., Acosta, R. H., Thomas-Semm, A., Reuss, S. Lung fixation for the preservation of air spaces. Experimental Lung Research. 30 (1), 73-82 (2004).
  4. Oldmixon, E. H., Suzuki, S., Butler, J. P., Hoppin, F. G. Perfusion dehydration fixes elastin and preserves lung air-space dimensions. Journal of Applied Physiology. 58 (1), 105-113 (1985).
  5. Braber, S., Verheijden, K. A., Henricks, P. A., Kraneveld, A. D., Folkerts, G. A comparison of fixation methods on lung morphology in a murine model of emphysema. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 299 (6), 843-851 (2010).
  6. Renne, R., et al. Recommendation of optimal method for formalin fixation of rodent lungs in routine toxicology studies. Toxicologic Pathology. 29 (5), 587-589 (2001).
  7. Limjunyawong, N., Mock, J., Mitzner, W. Instillation and Fixation Methods Useful in Mouse Lung Cancer Research. Journal of Visualized Experiments. (102), e52964 (2015).
  8. Lum, H., Mitzner, W. Effects of 10% formalin fixation on fixed lung volume and lung tissue shrinkage. A comparison of eleven laboratory species. American Review of Respiratory Disease. 132 (5), 1078-1083 (1985).
  9. Edmonds, M. D., et al. MicroRNA-31 initiates lung tumorigenesis and promotes mutant KRAS-driven lung cancer. Journal of Clinical Investigation. 126 (1), 349-364 (2016).
  10. Zhao, K., et al. Wogonin suppresses melanoma cell B16-F10 invasion and migration by inhibiting Ras-medicated pathways. PLoS One. 9 (9), 106458 (2014).

Play Video

Cite This Article
Davenport, M. L., Sherrill, T. P., Blackwell, T. S., Edmonds, M. D. Perfusion and Inflation of the Mouse Lung for Tumor Histology. J. Vis. Exp. (162), e60605, doi:10.3791/60605 (2020).

View Video