Dissectie en lipide druppel kleuring van Oenocyten in Drosophila larven
Summary
Gepresenteerd hier zijn gedetailleerde methoden voor de dissectie en lipide druppel kleuring van oenocyten in Drosophila larven met behulp van bodipy 493/503, een lipide druppel-specifieke fluorescerende kleurstof.
Abstract
Lipiden zijn essentieel voor de ontwikkeling van dieren en fysiologische homeostase. Disregulatie van lipide metabolisme resulteert in verschillende ontwikkelingsstoornissen en ziekten, zoals obesitas en vette lever. Meestal, lipiden worden opgeslagen in lipide druppeltjes, welke zijn de multifunctionele lipide opslag organellen in cellen. Lipide druppeltjes variëren in grootte en aantal in verschillende weefsels en onder verschillende omstandigheden. Er is gemeld dat lipide druppeltjes worden strak gecontroleerd door regulering van de biogenese en afbraak. In Drosophila melanogaster, de oenocyte is een belangrijk weefsel voor lipide metabolisme en is onlangs geïdentificeerd als een menselijke lever analoog met betrekking tot lipide mobilisatie in reactie op stress. Echter, de mechanismen die ten grondslag liggen aan de regulering van lipide druppel metabolisme in oenocyten blijven ongrijpbaar. Om dit probleem op te lossen, is het van het grootste belang om een betrouwbare en gevoelige methode te ontwikkelen om de lipide druppel dynamische veranderingen in oenocyten tijdens de ontwikkeling en onder stressvolle omstandigheden direct te visualiseren. Gebruik te maken van de lipofiele BODIPY 493/503, een lipide druppel-specifieke fluorescerende kleurstof, hier beschreven is een gedetailleerd protocol voor de dissectie en daaropvolgende lipide druppel kleuring in de oenocyten van Drosophila larven in reactie op de hongerdood. Dit zorgt voor kwalitatieve analyse van de lipide druppel dynamiek onder verschillende omstandigheden door confocale microscopie. Bovendien kan deze snelle en zeer reproduceerbare methode ook worden gebruikt in genetische schermen voor het indentificeren van nieuwe genetische factoren met betrekking tot het metabolisme van lipide druppel in oenocyten en andere weefsels.
Introduction
Lipiden zijn essentieel voor overleving van de cel. Naast hun traditionele rol als integrale componenten van cellulaire membraansystemen, lipiden spelen ook cruciale functies in de energietoevoer en signalering transductie gedurende de levenscycli van individuele dieren1. Dus, lipide metabolisme moet voldoen aan strenge voorschriften te handhaven van fysiologische hemostase in cellen. Het is bekend dat disregulatie van lipide metabolisme resulteert in verschillende ziekten, zoals diabetes en vette lever. Ondanks het grote belang van lipide metabolisme in diergezondheid, de mechanismen onderliggende lipide metabolisme verordening blijven grotendeels onbekend.
Drosophila wordt al jaren intensief gebruikt sinds professor Thomas H. Morgan begon ze te gebruiken in studies waarbij genetica en andere fundamentele biologische vragen2. In de laatste decennia heeft het opkomende bewijs aangetoond dat Drosophila een uitstekend modelorganisme is in de studie van veel lipide-metabolisme-geassocieerde ziekten, zoals obesitas1,3. Drosophila deelt in het bijzonder sterk gecondengeerde metabole genen met mensen en bezit vergelijkbare relevante weefsels/organen en celtypen voor lipide metabolisme.
Bijvoorbeeld, het vet lichaam van Drosophila, die verantwoordelijk is voor triglyceride opslag, functies analoog aan menselijke vetweefsel. Onlangs, een cluster van gespecialiseerde hepatocyte-achtige cellen (dat wil zeggen, oenocyten), die zijn gemeld dat een functioneel analoog aan de menselijke lever, is aangetoond dat ze betrokken zijn bij vetzuur en koolwaterstof metabolisme in fruitvliegen4,5. Net als bij zoogdieren reageert oenocytes op de honger door de vorming van lipide druppel in zowel larvale als volwassen Drosophilate activeren, resulterend in accumulatie van lipide druppel in oenocyten4,6,7,8. Anatomisch zijn oenocyten nauw verbonden met het basale inwendige oppervlak van de laterale epidermis in clusters van ongeveer zes cellen per buik hemisegment, waardoor het praktisch niet haalbaar is om oenocyte clusters uit de epidermis te isoleren. Zo moeten oenocyten tijdens het dissectie en de kleuring aan de epidermis worden bevestigd.
Lipiden worden opgeslagen in de vorm van lipide druppeltjes, die organellen met enkellaags membranen in cellen9. Lipide druppeltjes bestaan in bijna alle celtypen over verschillende soorten10. Lipide druppel dynamiek, met inbegrip van de grootte en het aantal, verandering in reactie op milieustressoren. Dit wordt beschouwd als een afspiegeling van metabole status in reactie op stress, zoals veroudering en honger van7,8. Daarom is het van groot belang om een haalbare en betrouwbaardere methode te ontwikkelen voor het kwalitatief bepalen van de lipide druppel dynamiek in oenocytes tijdens de ontwikkeling en onder stressvolle omstandigheden. In het bijzonder, in de derde instar larven, bevatten oenocyten weinig of geen detecteerbare lipidedrup pels onder gevoede condities, maar ze bevatten wel talrijke grote lipidedrup pels na voedings deprivatie4. Om de effectiviteit van deze methode te controleren, wordt voorgesteld om lipide druppel kleuring in de oenocyten onder uitgehongerd voorwaarden uit te voeren.
Op dit moment zijn er verschillende lipofiele kleurstoffen beschikbaar voor het verven van lipide druppeltjes, zoals de niet-fluorescerende kleurstoffen Sudan Black en Oil Red O en fluorescerende kleurstoffen Nile Red en BODIPY 493/50311. Soedan zwart en olie rood O worden vaak gebruikt voor weefsel cholesteryl esters en triacylglycerolen en kunnen gemakkelijk worden gedetecteerd door Lichtmicroscopie. Echter, relatief hoge achtergrondkleuring en relatief lage resolutie zijn twee beperkende factoren voor haar toepassingen in kwalitatieve analyse van de dynamiek van lipide druppel. Om de beperkingen van niet-fluorescerende kleurstoffen te overwinnen, worden Nile Red en BODIPY 493/503 gebruikt als ideale substituten voor lipide druppel kleuring. Er is gemeld dat Nijl rood kan ook detecteren sommige niet-veresterd cholesterol, die maakt bodipy 493/503 een specifiekere kleurstof voor cellulaire lipide druppeltjes, tot op zekere hoogte12,13,14.
Bovenal, om te voldoen aan een behoefte aan een snelle en gevoelige analyse van lipide druppeltjes in oenocyten, dit protocol presenteert een haalbare en zeer reproduceerbaar methode van fixatief gebaseerde lipide druppel-specifieke kleuring met behulp van BODIPY 493/503 als de vlek kleurstof. In dit rapport worden oenocyten ontleed, en BODIPY 493/503 wordt gebruikt voor lipide druppel kleuring in de oenocyten, waarbij lipide druppeltjes worden gedetecteerd door confocale microscopie. Het gemak en de betaalbaarheid van deze procedure maken het ideaal voor modificatie en verder gebruik in andere toepassingen, zoals flow cytometrie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Onder de hierboven beschreven, zijn er een aantal kritische stappen in dit protocol, waarbij de ei-legtijd periode een van deze is. Als een lipide-mobiliserende weefsel, de oenocyte is zeer gevoelig voor voeding status6,8. Langdurige Eier-legtijd perioden kunnen resulteren in kraaide larven en verhoogde voedsel concurrentie, wat leidt tot onnauwkeurige resultaten. De 1 h-tijdperiode die in dit protocol wordt gebruikt, stelt de larven in staat om te ontwikkelen zo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door subsidies van de National Natural Science Foundation of China (31671422, 31529004 en 31601112), het 111-project (D18010), het lokale innovatieve en onderzoeksteams project van het Guangdong perl River talents Program (2017BT01S155), en de China postdoctoral Science Foundation (2018M640767).
Materials
| 50 mL centrifuge tube | Corning | 430829 | 50 mL |
| 6 cm Petri dish | Thermo Fisher | 150326 | 6 cm |
| Agar | For fly food | ||
| Aluminum foil | N/A | N/A | Protect smaple from light |
| BODIPY 493/503 | Invitrogen | D3922 | Lipid droplet staining dye |
| Confocal microscope | Leica | Leica TSC SP5 | Confocal imaging |
| Corn syrup | For fly food | ||
| Cornmeal | For fly food | ||
| Coverslip | Citoglas | 10212424C | 20 × 20 mm, 0.13-0.17 thick |
| Dissection pin | N/A | N/A | |
| Dissection plate | N/A | N/A | |
| Filter paper | N/A | N/A | Diameter: 11 cm |
| Fixation buffer | N/A | N/A | 4% Paraformaldehyde (PFA) in 1xPBS |
| Forcep | Dumont | 11252-30 | #5 |
| Incubator | Jiangnan | SPX-380 | For fly culture |
| Microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | 1.5 ml |
| Microscopy slide | Citoglas | 10127105P-G | |
| Mounting medium | VECTASHIELDAntifade Mounting Medium | H-1000 | Antifade mounting medium |
| Nail polish | PanEra | AAPR419 | Seal the coverslip |
| Paintbrush | N/A | N/A | |
| PBS | N/A | N/A | 1xPBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4,1.8 mM KH2PO4, pH 7.4) |
| Rotator | Kylin-Bell Lab Instruments | WH-986 | |
| Scissor | Smartdata Medical | SR81 | Vannas spring scissor |
| Soy flour | For fly food | ||
| Spatula | N/A | N/A | |
| Standard cornmeal food | N/A | N/A | Accoding to Bloomington standard cornmeal food recipe |
| Stereo microscope | Leica | Leica S6E | For tissue dissection |
| Wipe paper | N/A | N/A | |
| Yeast | For fly food | ||
| yw | Kept as lab stock | N/A | Drosophila |
References
- Liu, Z., Huang, X. Lipid metabolism in Drosophila: development and disease. Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 45 (1), 44-50 (2013).
- Cheng, Y., Chen, D. Fruit fly research in China. Journal of Genetics and Genomics. 45 (11), 583-592 (2018).
- Warr, C. G., Shaw, K. H., Azim, A., Piper, M. D. W., Parsons, L. M. Using mouse and Drosophila models to investigate the mechanistic links between diet, obesity, type II diabetes, and cancer. International Journal of Molecular Science. 19 (12), (2018).
- Gutierrez, E., Wiggins, D., Fielding, B., Gould, A. P. Specialized hepatocyte-like cells regulate Drosophila lipid metabolism. Nature. 445 (7125), 275-280 (2007).
- Makki, R., Cinnamon, E., Gould, A. P. The development and functions of oenocytes. Annual Review of Entomology. 59, 405-425 (2014).
- Chatterjee, D., et al. Control of metabolic adaptation to fasting by dILP6-induced insulin signaling in Drosophila oenocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (50), 17959-17964 (2014).
- Yan, Y., et al. HDAC6 suppresses age-dependent ectopic fat accumulation by maintaining the proteostasis of PLIN2 in Drosophila. Developmental Cell. 43 (1), 99-111 (2017).
- Yan, Y., et al. HDAC6 regulates lipid droplet turnover in response to nutrient deprivation via p62-mediated selective autophagy. Journal of Genetics and Genomics. 46 (4), 221-229 (2019).
- Farese, R. V., Walther, T. C. Lipid droplets finally get a little R-E-S-P-E-C-T. Cell. 139 (5), 855-860 (2009).
- Murphy, D. J. The dynamic roles of intracellular lipid droplets: from archaea to mammals. Protoplasma. 249 (3), 541-585 (2012).
- Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods. 68 (1), 105-115 (2014).
- Fowler, S. D., Greenspan, P. Application of Nile red, a fluorescent hydrophobic probe, for the detection of neutral lipid deposits in tissue sections: comparison with oil red O. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33 (8), 833-836 (1985).
- Gocze, P. M., Freeman, D. A. Factors underlying the variability of lipid droplet fluorescence in MA-10 Leydig tumor cells. Cytometry. 17 (2), 151-158 (1994).
- Fam, T. K., Klymchenko, A. S., Collot, M. Recent advances in fluorescent probes for lipid droplets. Materials (Basel). 11 (9), (2018).
- BDSC Standard Cornmeal Medium. Bloomington Drosophila Stock Center Available from: https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html (2019)
- Milon, A., et al. Do estrogens regulate lipid status in testicular steroidogenic Leydig cell?. Acta Histochemica. 121 (5), 611-618 (2019).
- Farmer, B. C., Kluemper, J., Johnson, L. A. Apolipoprotein E4 alters astrocyte fatty acid metabolism and lipid droplet formation. Cells. 8 (2), (2019).
