Summary
Aqui são apresentados métodos detalhados para a dissecação e mancha de gotícula lipídica de estenocitos em larvas de Drosophila usando BODIPY 493/503, um corante fluorescente específico da gotícula lipídica.
Abstract
Os lipídios são essenciais para o desenvolvimento animal e a homeostase fisiológica. A desregulação do metabolismo lipídico resulta em vários defeitos e doenças do desenvolvimento, como obesidade e fígado gorduroso. Normalmente, os lipídios são armazenados em gotículas lipídicas, que são as organelas de armazenamento lipídico multifuncionais nas células. As gotículas lipídicas variam em tamanho e número em diferentes tecidos e diferentes condições. Tem sido relatado que as gotículas lipídicas são rigidamente controladas através da regulação de sua biogênese e degradação. Em Drosophila melanogaster,o enocito é um tecido importante para o metabolismo lipídico e foi recentemente identificado como um análogo de fígado humano sobre a mobilização lipídica em resposta ao estresse. No entanto, os mecanismos subjacentes à regulação do metabolismo das gotículas lipídicas nos enocitos permanecem evasivos. Para resolver este problema, é de extrema importância desenvolver um método confiável e sensível para visualizar diretamente as mudanças dinâmicas de gotículas lipídicas nos enocitos durante o desenvolvimento e em condições estressantes. Aproveitando o LIPophilic BODIPY 493/503, um corante fluorescente específico da gotídea lipídica, descrito aqui é um protocolo detalhado para a dissecação e a mancha lipídica subseqüente na mancha de enocícitos das larvas de Drosophila em resposta à fome. Isso permite a análise qualitativa da dinâmica de gotículas lipídicas várias condições pela microscopia confocal. Além disso, este método rápido e altamente reproduzível também pode ser usado em telas genéticas para identificar novos fatores genéticos envolvendo o metabolismo das gotículas lipídicas em enocitos e outros tecidos.
Introduction
Os lipídios são essenciais para a sobrevivência celular. Além de seu papel tradicional como componentes integrais dos sistemas de membrana celular, os lipídios também desempenham funções cruciais no fornecimento de energia e sinalização transduction ao longo dos ciclos de vida de animais individuais1. Assim, o metabolismo lipídico deve estar em conformidade com regulamentos rigorosos para manter a hemostase fisiológica nas células. Sabe-se que a desregulação do metabolismo lipídico resulta em várias doenças, como diabetes e fígado gorduroso. Apesar da grande importância do metabolismo lipídico na saúde animal, os mecanismos subjacentes à regulação do metabolismo lipídico permanecem em grande parte desconhecidos.
Drosophila tem sido amplamente utilizado há anos desde que o professor Thomas H. Morgan começou a usá-los em estudos envolvendo genética e outras questões biológicas básicas2. Nas últimas décadas, evidências emergentes mostraram que a Drosophila é um excelente organismo modelo no estudo de muitas doenças associadas ao metabolismo lipídico, como a obesidade1,3. Em particular, Drosophila compartilha genes metabólicos altamente conservados com seres humanos e possuem tecidos/órgãos e tipos de células relevantes semelhantes para o metabolismo lipídico.
Por exemplo, o corpo gordo de Drosophila,que é responsável pelo armazenamento de triacylgliceres, funciona análogo ao tecido adiposo humano. Recentemente, um aglomerado de células especializadas hepatocito-like (ou seja, enocitos), que foram relatados para ser um análogo funcional para o fígado humano, têm sido mostrados para estar envolvido em ácidos graxos e metabolismo de hidrocarbonetos em moscas de fruta4,5. Semelhante ao caso em fígados de mamíferos, os enocitos respondem à fome ativando a formação de gotículas lipídicas em Drosophilalarval e adulto, resultando em acúmulo de gotículas lipídicas em enocitos4,6,7,8. Anatomicamente, os enocícitos estão firmemente ligados à superfície interna basana da epiderme lateral em aglomerados de aproximadamente seis células por hemisegmento abdominal, o que o torna impraticável isolar aglomerados de enocitos da epiderme. Assim, os enocitos devem ser anexados à epiderme durante a dissecação e coloração.
Os lipídios são armazenados na forma de gotículas lipídicas, que são organelas com membranas de camada única nas células9. Gotículas lipídicas existem em quase todos os tipos de células em diferentes espécies10. A dinâmica das gotículas lipídicas, incluindo seu tamanho e número, muda em resposta aos estressores ambientais. Isto é considerado como um reflexo do estado metabólico em resposta ao estresse, como envelhecimento e fome7,8. Portanto, é de grande importância desenvolver um método viável e confiável para determinar qualitativamente a dinâmica das gotículas lipídicas em enocitos durante o desenvolvimento e em condições estressantes. Em particular, nas terceiras larvas instaras, os enocitos contêm poucas ou nenhumas gotículas lipídicas detectáveis em condições alimentadas, mas contêm inúmeras gotículas lipídicas grandes após a privação nutricional4. Para verificar a eficácia deste método, sugere-se para realizar a mancha de gotícula lipídica nos enocitos em condições de fome.
Atualmente, vários corantes lipofílicos estão disponíveis para manchas lipídicas, como as corantes não fluorescentes Sudan Black e Oil Red O e corantes fluorescentes Nile Red e BODIPY 493/50311. Sudão Preto e Óleo Vermelho O são comumente usados para estersio de cholesteryl de tecido e triacylglicerols e podem ser facilmente detectados por microscopia de luz. No entanto, a coloração de fundo relativamente alta e a resolução relativamente baixa são dois fatores limitantes para suas aplicações na análise qualitativa da dinâmica das gotículas lipídicas. Para superar as limitações de corantes não fluorescentes, O Vermelho do Nilo e bodipy 493/503 são utilizados como substitutos ideais para a coloração de gotículas lipídicas. Tem sido relatado que o Vermelho do Nilo também pode detectar algum colesterol não-esterified, o que torna BODIPY 493/503 um corantes mais específicos para gotículas lipídicas celulares, até certo ponto12,13,14.
Acima de tudo, para atender à necessidade de uma análise rápida e sensível de gotículas lipídicas em enocitos, este protocolo apresenta um método viável e altamente reproduzível de manchas lipídicas baseadas em fixação usando BODIPY 493/503 como corante de mancha. Neste relatório, os enocitos são dissecados, e BODIPY 493/503 é usado para manchas de gotículas lipídicas nos enocitos, em que gotículas lipídicas são detectadas por microscopia confocal. A facilidade e acessibilidade deste procedimento torná-lo ideal para modificação e uso adicional em outras aplicações, tais como citometria de fluxo.
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Protocol
1. Postura de ovo
- Prepare o alimento padrão da farinha de milho para a postura do ovo.
Nota: Para a receita e procedimento de cozimento para o alimento padrão da farinha de milho usado aqui, veja os detalhes previamente publicados15. - Prepare pasta de fermento fresco, adicionando 6 mL de água destilada para 4 g de fermento seco ativo em um tubo centrífuga de 50 mL. Use uma espátula para misturar e fazer uma pasta.
- Faça garrafas de postura de ovos, enchendo o alimento da farinha de milho nas garrafas e espalhe aproximadamente 1 g de pasta de fermento na superfície da comida de farinha de milho com uma espátula.
- Coloque as moscas dos genótipos desejados em uma garrafa de postura de ovos e coloque-a em uma incubadora com uma temperatura constante de 25 °C e umidade de 60%.
Nota: As cruzes ideais consistem geralmente em 150 moscas virgens e pelo menos em 75 machos. Manter moscas no escuro, colocando uma caixa à prova de luz sobre as garrafas de postura de ovos irá aumentar a taxa de reprodução. - Antes da coleta de ovos, deixe as moscas colocarovos por 1 h para permitir a remoção de todos os ovos velhos que permanecem armazenados nos ovidutos femininos.
- Deixe as moscas colocar ovos em uma nova garrafa de postura de ovos por 1 h e remover os adultos da garrafa.
Nota: Controle o tempo de postura de ovos para minimizar a faixa de desenvolvimento, a fim de obter larvas dentro de um estágio de desenvolvimento precisamente controlado. - Permita que os ovos se desenvolvam por 84 h na terceira larva instar na incubadora a 25 °C com um ciclo claro/escuro de 12 h/12 h.
2. Tratamento de fome para as larvas
Nota: Como mencionado acima, nas terceiras larvas instaras, há poucas ou nenhumagotícula lipídica detectável nos enocitos em condições normais de alimentação, mas numerosas gotículas lipídicas grandes podem ser induzidas nos enocitos condições de estresse, como a fome. Para verificar ainda mais este método, é necessário pré-tratar essas larvas para induzir a biogênese de gotídas lipídicas em enocitos. Aqui, um curso de tempo de fome de 12 h, 24 h e 36 h foi escolhido como o paradigma. Em particular, um curto período de fome (por exemplo, 3 h) é suficiente para induzir gotículas lipídicas detectáveis em enocitos. A duração da fome pode variar de acordo com metas e configurações experimentais específicas.
- Faça câmaras para tratamentos de fome e controle.
- Para câmaras de tratamento de fome: coloque um papel de filtro de tamanho adequado em uma placa de Petri de 6 cm e pipeta 1 mL de PBS no papel de filtro.
- Para câmaras de tratamento de controle: coloque 5 mL de alimentos padrão bloomington farinha de milho na placa de Petri.
- Use uma espátula para desenterrar suavemente a camada superior de alimentos contendo larvas que ainda estão cavando nos alimentos e transferi-los para uma placa de Petri cheia de 5 mL de PBS. Mexa delicadamente as larvas em PBS para remover toda a contaminação do alimento das larvas e para fazê-la tão limpa como possível.
- Use um pincel pequeno para coletar 40 terceiras larvas instar do mesmo tamanho aproximado. Classificá-los aleatoriamente em uma câmara de fome ou controle, com 20 larvas cada.
- Coloque as câmaras na incubadora a 25 °C com 60% de umidade e permita o desenvolvimento de 12 h, 24 h e 36 h de tratamento.
Nota: Para as larvas na câmara de fome, adicione 1 mL de PBS a cada 12 h para evitar a desidratação das larvas.
3. Dissecação de Enocitos
- Use um pincel pequeno para escolher larvas da idade apropriada (12 h, 24 h, ou 36 h após o tratamento), a seguir transferi-los em um prato novo de Petri enchido com os 5 mL de PBS gelado para lavar.
Nota: Repita o passo 2.2 ao lidar com larvas em uma câmara de controle para remover qualquer contaminação alimentar. - Encha uma placa de dissecação com PBS gelada e use fórceps para transferir suavemente larvas para a placa de dissecação. Coloque a placa de dissecação um microscópio estéreo para a etapa seguinte dissecação.
Nota: A temperatura gelada ajudará a retardar os movimentos das larvas e facilitar a dissecação. - Vire as larvas do lado ventral para cima e lado dorsal para baixo e gentilmente mantenha no lugar usando fórceps. Fixe as larvas na placa de dissecação, colocando um pino de dissecação, embora a faringe na extremidade anterior e outro pino através do spiracle na extremidade posterior.
Nota: O lado dorsal é mais facilmente identificado pela presença dos troncos dorsais da traqueia. - Use a tesoura de mola de Vannas para incisar (longitudinalmente) através da epiderme do anterior à extremidade posterior.
- Retire o tecido interno da epiderme usando fórceps.
Nota: Cuidado deve ser tomado ao remover os ramos traqueais para evitar danos aos enocitos, que são localizados na superfície interna da epiderme. - Com fórceps, recuperar os pinos de dissecação e transferir a epiderme em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL cheio de PBS no gelo.
- Continue a dissecar outras larvas após o procedimento descrito acima.
4. Mancha de gota lipídicas
- Incubar a epiderme dissecada no buffer de fixaçãopor 30 min à temperatura ambiente (RT) em um rotador.
Nota: O buffer de fixação contém paraformaldeído de 4% (PFA) na PBS. - Retire o tampão de fixação, seguido por uma lavagem rápida. Para realizar uma lavagem rápida, adicione 1 mL de PBS em RT no tubo após a remoção de PFA, resuspende delicadamente os tecidos, e descarte o PBS.
CUIDADO: O amortecedor de fixação contém PFA, que é prejudicial à saúde humana. É importante descartar adequadamente o buffer de fixação como resíduos perigosos. - Lave as amostras 3x para 5 min cada um com PBS para lavar para fora todo o resíduo possível de PFA.
- Incubar a epiderme com BODIPY 493/503 (1 μg/mL; ver Tabela de Materiais) por 30 min no RT em um rotador.
Nota: A partir deste passo em diante, envolva o tubo de microcentrífuga com um pedaço de folha de alumínio para proteger as amostras da luz e minimizar o possível clareamento fotográfico. - Retire a solução de coloração BODIPY 493/503 e lave as amostras 3x por 10 min cada com PBS para remover completamente corantes residuais.
5. Montagem e imagem
- Coloque 6 μL de montagem média em uma lâmina de microscópio limpo.
Nota: O meio de montagem é usado para um tempo de detecção mais longo com base em suas propriedades antifade. - Use fórceps para pegar uma epiderme e remover suavemente o PBS residual com uma limpeza.
- Coloque a epiderme no meio de montagem e ajuste sua orientação para que sua superfície interna contendo os enocitos esteja na parte inferior e sua superfície externa esteja no topo.
- Gentilmente colocar um coverslip sobre a epiderme.
Nota: Remova todo o meio extra da montagem que escapa do coverslip com uma limpeza, se necessário. Para facilitar a imagem, empurre delicadamente para baixo no coverslip com fórceps de modo que ao observar a corrediça através do microscópio, o conjunto do enocyte possa facilmente ser imaged em um único plano. Alternativamente, é praticável cortar a epiderme em duas semi-epiderme através da linha do meio para evitar o rolamento-acima da epiderme inteira ao montar os tecidos. - Aplique esmalte claro em torno das bordas do coverslip para selar.
- Coloque os slides em uma caixa de amostra à prova de luz e deixe o esmalte secar no RT, que pode levar 5-10 min.
- Prosseguir com a análise microscópica. Tire imagens usando um microscópio confocal (ampliação de 63x com configurações otimizadas de filtro GFP ou FITC, excitação = 488 nm, emissão = 503 nm) para adquirir sinais limpos e sensíveis com fundo minimizado.
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Representative Results
A execução bem-sucedida deste procedimento deve resultar em gotículas lipídicas claras que revelam o número e o tamanho das gotículas lipídicas nos enocitos. A Figura 1A,A',A'' mostra que existem poucas gotículas lipídicas detectáveis (pontos verdes) nos enocitos das larvas normais de alimentação durante diferentes estágios de desenvolvimento. Figura 1B,B',B'' mostra aumento das gotículas lipídicas (pontos verdes) quantidade nos enocitos em resposta a 12 h (B), 24 h (B'), e 36 h (B'') períodos de fome. Note-se que, após 96 h, as larvas alimentadas (A) pareciam mostrar algum acúmulo de gotículas lipídicas nos enocitos, o que pode ter sido devido às suas taxas de crescimento rápido. Os pesquisadores devem prestar maior atenção ao lidar com as larvas durante esta fase.
Figura 1: Imagens representativas de manchas de gotículas lipídicas. As imagens são mostradas ao longo do tempo de desenvolvimento e fome nos enocitos das larvas de Drosophila usando BODIPY 493/503. (A,A',A'') Manchas de gotículas lipídicas (pontos verdes) de imagens representativas de aglomerados de enocitos em larvas alimentadas. (B,B',B'') Manchas de gotículas lipídicas (pontos verdes) em imagens representativas de aglomerados de enocitos após 12 h (B), 24 h (B'), e 36 h (B'') períodos de fome, a partir de larvas com uma idade de 84 h. Todas as imagens foram tiradas na mesma ampliação. Barra de escala = 20 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior deste número.
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Discussion
Entre os descritos acima, há vários passos críticos neste protocolo, com o período de tempo de postura de ovos sendo um desses. Como um tecido de mobilização lipídica, o enocito é altamente sensível ao estado nutricional6,8. Períodos prolongados de tempo de postura de ovos podem resultar em larvas de canto e aumento da concorrência alimentar, levando a resultados imprecisos. O período de tempo de postura de ovos de 1 h usado neste protocolo permite que as larvas se desenvolvam sem competição nutricional. Um número muito maior de larvas que podem resultar de períodos de tempo mais longos de postura de ovos também pode afetar as quantidades e padrões de gotículas lipídicas (por exemplo, tamanho, número e morfologia) em enocitos.
Além disso, períodos prolongados de tempo de postura de ovos também resultam em uma população larval com uma grande variação de estágios de desenvolvimento. Neste contexto, os pesquisadores devem ter cuidado ao usar mutantes que afetam o desenvolvimento embrionário ou larval, uma vez que sua influência sobre os padrões de gotículas lipídicas pode ser influenciada por efeitos secundários de defeitos de desenvolvimento. O procedimento do curso de tempo sugere que as gotículas lipídicas raramente são detectáveis nos enocitos da condição alimentada durante o desenvolvimento de larvas instar instar instar instar iniciais (84 h) até larvas instar instar instar tardias (120 h). Além disso, ao contrário da pigmentação âmbar de enocitos em adultos, os enocitos larvais sãoincolores 5. Assim, o aumento da atenção deve ser dada durante a dissecção de enocitos para evitar danos potenciais aos enocitos, especialmente ao remover os tecidos circundantes (ou seja, ramos traqueais). Além disso, as gotículas lipídicas são organelas de membrana de camada única, que são sensíveis a detergentes como tritão X-1009. Assim, é importante garantir que os amortecedores utilizados neste protocolo não contenham detergentes.
Como mencionado acima, existem vários corantes usados para determinar a quantidade de gotículas lipídicas e mudanças de padrão em Drosophila e outras espécies. Entre estes, BODIPY 493/503 pode ser mais adequado para manchas lipídicas específicas em comparação com outras corantes fluorescentes (por exemplo, Nilo Vermelho) ou não fluorescentes (por exemplo, Oil Red O); embora, mais novos e corantes avançados estão sendo desenvolvidos. Por exemplo, LipidSpot 488 e seus derivados são uma série de corantes fluorescentes recém-desenvolvidos com manchas de fundo mínimas de membranas celulares e outras organelas. Eles permitem a coloração rápida de gotículas lipídicas em células vivas e fixas, sem passo de lavagem necessário16,17. Uma limitação deste protocolo de coloração de gotículas lipídicas é que ele não é ideal para medir quantitativamente as reservas de gordura nas células, mesmo que funcione bem para avaliação qualitativa do tamanho, número e morfologia das gotículas lipídicas.
Além da mancha de gotícula lipídica em enocitos, este método também pode ser aplicado a outros tecidos em larvas (ou seja, músculo, corpo gordo e tecido intestinal) com pequenas modificações durante a dissecção de tecidos e seção7. Além disso, este método também funciona bem para a mancha de gotícula lipídicas de tecidos adultos7. Uma versão modificada deste método pode ser estendida a aplicações mais amplas em combinação com a coloração imunohistoquímica com anticorpos. Neste caso, os tecidos fixos devem ser permeados com saponina (0,1% para 30 min em RT) em vez de detergentes tradicionais antes de incubar com anticorpos, o que facilita o cruzamento de anticorpos através de membranas plasmáticas e manutenção da integridade da membrana de gotícula lipídica8.
Em resumo, este protocolo fornece um método viável para os pesquisadores investigarem se certas manipulações genéticas ou ambientais causam alterações qualitativas nas quantidades e padrões de gotículas lipídicas (ou seja, tamanho, número e morfologia) sem a necessidade de operações difíceis e equipamentos e materiais caros.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse a serem divulgados.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por doações da National Natural Science Foundation of China (31671422, 31529004 e 31601112), do Projeto 111 (D18010), do Projeto local de Equipes Inovadoras e de Pesquisa do Programa de Talentos do Rio Guangdong Perl (2017BT01S155) e do Programa local de Equipes Inovadoras e de Pesquisa do Programa de Talentos do Rio Guangdong Perl (2017BT01S155) e do Programa local de Equipes Inovadoras e de Pesquisa do Programa de Talentos do Rio Guangdong Perl (2017BT01S155) e do Programa local de talentos do rio Perl (2017BT01S1555) e do Programa local de talentos do rio Perl (2017BT01S155) e do Programa local de talentos do rio Perl (2017BT01S1555) e do China Postdoctoral Science Foundation (2018M640767).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | 430829 | 50 mL |
| 6 cm Petri dish | Thermo Fisher | 150326 | 6 cm |
| Agar | For fly food | ||
| Aluminum foil | N/A | N/A | Protect smaple from light |
| BODIPY 493/503 | Invitrogen | D3922 | Lipid droplet staining dye |
| Confocal microscope | Leica | Leica TSC SP5 | Confocal imaging |
| Corn syrup | For fly food | ||
| Cornmeal | For fly food | ||
| Coverslip | Citoglas | 10212424C | 20 × 20 mm, 0.13-0.17 thick |
| Dissection pin | N/A | N/A | |
| Dissection plate | N/A | N/A | |
| Filter paper | N/A | N/A | Diameter: 11 cm |
| Fixation buffer | N/A | N/A | 4% Paraformaldehyde (PFA) in 1x PBS |
| Forcep | Dumont | 11252-30 | #5 |
| Incubator | Jiangnan | SPX-380 | For fly culture |
| Microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | 1.5 mL |
| Microscopy slide | Citoglas | 10127105P-G | |
| Mounting medium | VECTASHIELDAntifade Mounting Medium | H-1000 | Antifade mounting medium |
| Nail polish | PanEra | AAPR419 | Seal the coverslip |
| Paintbrush | N/A | N/A | |
| PBS | N/A | N/A | 1x PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4,1.8 mM KH2PO4, pH 7.4) |
| Rotator | Kylin-Bell Lab Instruments | WH-986 | |
| Scissor | Smartdata Medical | SR81 | Vannas spring scissor |
| Soy flour | For fly food | ||
| Spatula | N/A | N/A | |
| Standard cornmeal food | N/A | N/A | Accoding to Bloomington standard cornmeal food recipe |
| Stereo microscope | Leica | Leica S6E | For tissue dissection |
| Wipe paper | N/A | N/A | |
| Yeast | For fly food | ||
| yw | Kept as lab stock | N/A | Drosophila |
References
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