Summary

Cotocação e gota lipídica manchando de enocitos nas larvas de Drosophila

Published: December 28, 2019
doi:

Summary

Aqui são apresentados métodos detalhados para a dissecação e mancha de gotícula lipídica de estenocitos em larvas de Drosophila usando BODIPY 493/503, um corante fluorescente específico da gotícula lipídica.

Abstract

Os lipídios são essenciais para o desenvolvimento animal e a homeostase fisiológica. A desregulação do metabolismo lipídico resulta em vários defeitos e doenças do desenvolvimento, como obesidade e fígado gorduroso. Normalmente, os lipídios são armazenados em gotículas lipídicas, que são as organelas de armazenamento lipídico multifuncionais nas células. As gotículas lipídicas variam em tamanho e número em diferentes tecidos e diferentes condições. Tem sido relatado que as gotículas lipídicas são rigidamente controladas através da regulação de sua biogênese e degradação. Em Drosophila melanogaster,o enocito é um tecido importante para o metabolismo lipídico e foi recentemente identificado como um análogo de fígado humano sobre a mobilização lipídica em resposta ao estresse. No entanto, os mecanismos subjacentes à regulação do metabolismo das gotículas lipídicas nos enocitos permanecem evasivos. Para resolver este problema, é de extrema importância desenvolver um método confiável e sensível para visualizar diretamente as mudanças dinâmicas de gotículas lipídicas nos enocitos durante o desenvolvimento e em condições estressantes. Aproveitando o LIPophilic BODIPY 493/503, um corante fluorescente específico da gotídea lipídica, descrito aqui é um protocolo detalhado para a dissecação e a mancha lipídica subseqüente na mancha de enocícitos das larvas de Drosophila em resposta à fome. Isso permite a análise qualitativa da dinâmica de gotículas lipídicas várias condições pela microscopia confocal. Além disso, este método rápido e altamente reproduzível também pode ser usado em telas genéticas para identificar novos fatores genéticos envolvendo o metabolismo das gotículas lipídicas em enocitos e outros tecidos.

Introduction

Os lipídios são essenciais para a sobrevivência celular. Além de seu papel tradicional como componentes integrais dos sistemas de membrana celular, os lipídios também desempenham funções cruciais no fornecimento de energia e sinalização transduction ao longo dos ciclos de vida de animais individuais1. Assim, o metabolismo lipídico deve estar em conformidade com regulamentos rigorosos para manter a hemostase fisiológica nas células. Sabe-se que a desregulação do metabolismo lipídico resulta em várias doenças, como diabetes e fígado gorduroso. Apesar da grande importância do metabolismo lipídico na saúde animal, os mecanismos subjacentes à regulação do metabolismo lipídico permanecem em grande parte desconhecidos.

Drosophila tem sido amplamente utilizado há anos desde que o professor Thomas H. Morgan começou a usá-los em estudos envolvendo genética e outras questões biológicas básicas2. Nas últimas décadas, evidências emergentes mostraram que a Drosophila é um excelente organismo modelo no estudo de muitas doenças associadas ao metabolismo lipídico, como a obesidade1,3. Em particular, Drosophila compartilha genes metabólicos altamente conservados com seres humanos e possuem tecidos/órgãos e tipos de células relevantes semelhantes para o metabolismo lipídico.

Por exemplo, o corpo gordo de Drosophila,que é responsável pelo armazenamento de triacylgliceres, funciona análogo ao tecido adiposo humano. Recentemente, um aglomerado de células especializadas hepatocito-like (ou seja, enocitos), que foram relatados para ser um análogo funcional para o fígado humano, têm sido mostrados para estar envolvido em ácidos graxos e metabolismo de hidrocarbonetos em moscas de fruta4,5. Semelhante ao caso em fígados de mamíferos, os enocitos respondem à fome ativando a formação de gotículas lipídicas em Drosophilalarval e adulto, resultando em acúmulo de gotículas lipídicas em enocitos4,6,7,8. Anatomicamente, os enocícitos estão firmemente ligados à superfície interna basana da epiderme lateral em aglomerados de aproximadamente seis células por hemisegmento abdominal, o que o torna impraticável isolar aglomerados de enocitos da epiderme. Assim, os enocitos devem ser anexados à epiderme durante a dissecação e coloração.

Os lipídios são armazenados na forma de gotículas lipídicas, que são organelas com membranas de camada única nas células9. Gotículas lipídicas existem em quase todos os tipos de células em diferentes espécies10. A dinâmica das gotículas lipídicas, incluindo seu tamanho e número, muda em resposta aos estressores ambientais. Isto é considerado como um reflexo do estado metabólico em resposta ao estresse, como envelhecimento e fome7,8. Portanto, é de grande importância desenvolver um método viável e confiável para determinar qualitativamente a dinâmica das gotículas lipídicas em enocitos durante o desenvolvimento e em condições estressantes. Em particular, nas terceiras larvas instaras, os enocitos contêm poucas ou nenhumas gotículas lipídicas detectáveis em condições alimentadas, mas contêm inúmeras gotículas lipídicas grandes após a privação nutricional4. Para verificar a eficácia deste método, sugere-se para realizar a mancha de gotícula lipídica nos enocitos em condições de fome.

Atualmente, vários corantes lipofílicos estão disponíveis para manchas lipídicas, como as corantes não fluorescentes Sudan Black e Oil Red O e corantes fluorescentes Nile Red e BODIPY 493/50311. Sudão Preto e Óleo Vermelho O são comumente usados para estersio de cholesteryl de tecido e triacylglicerols e podem ser facilmente detectados por microscopia de luz. No entanto, a coloração de fundo relativamente alta e a resolução relativamente baixa são dois fatores limitantes para suas aplicações na análise qualitativa da dinâmica das gotículas lipídicas. Para superar as limitações de corantes não fluorescentes, O Vermelho do Nilo e bodipy 493/503 são utilizados como substitutos ideais para a coloração de gotículas lipídicas. Tem sido relatado que o Vermelho do Nilo também pode detectar algum colesterol não-esterified, o que torna BODIPY 493/503 um corantes mais específicos para gotículas lipídicas celulares, até certo ponto12,13,14.

Acima de tudo, para atender à necessidade de uma análise rápida e sensível de gotículas lipídicas em enocitos, este protocolo apresenta um método viável e altamente reproduzível de manchas lipídicas baseadas em fixação usando BODIPY 493/503 como corante de mancha. Neste relatório, os enocitos são dissecados, e BODIPY 493/503 é usado para manchas de gotículas lipídicas nos enocitos, em que gotículas lipídicas são detectadas por microscopia confocal. A facilidade e acessibilidade deste procedimento torná-lo ideal para modificação e uso adicional em outras aplicações, tais como citometria de fluxo.

Protocol

1. Postura de ovo Prepare o alimento padrão da farinha de milho para a postura do ovo.Nota: Para a receita e procedimento de cozimento para o alimento padrão da farinha de milho usado aqui, veja os detalhes previamente publicados15. Prepare pasta de fermento fresco, adicionando 6 mL de água destilada para 4 g de fermento seco ativo em um tubo centrífuga de 50 mL. Use uma espátula para misturar e fazer uma pasta. Faça garrafas de postura de o…

Representative Results

A execução bem-sucedida deste procedimento deve resultar em gotículas lipídicas claras que revelam o número e o tamanho das gotículas lipídicas nos enocitos. A Figura 1A,A’,A” mostra que existem poucas gotículas lipídicas detectáveis (pontos verdes) nos enocitos das larvas normais de alimentação durante diferentes estágios de desenvolvimento. Figura 1B,B’,B” mostra aumento das got?…

Discussion

Entre os descritos acima, há vários passos críticos neste protocolo, com o período de tempo de postura de ovos sendo um desses. Como um tecido de mobilização lipídica, o enocito é altamente sensível ao estado nutricional6,8. Períodos prolongados de tempo de postura de ovos podem resultar em larvas de canto e aumento da concorrência alimentar, levando a resultados imprecisos. O período de tempo de postura de ovos de 1 h usado neste protocolo permite qu…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado por doações da National Natural Science Foundation of China (31671422, 31529004 e 31601112), do Projeto 111 (D18010), do Projeto local de Equipes Inovadoras e de Pesquisa do Programa de Talentos do Rio Guangdong Perl (2017BT01S155) e do Programa local de Equipes Inovadoras e de Pesquisa do Programa de Talentos do Rio Guangdong Perl (2017BT01S155) e do Programa local de Equipes Inovadoras e de Pesquisa do Programa de Talentos do Rio Guangdong Perl (2017BT01S155) e do Programa local de talentos do rio Perl (2017BT01S1555) e do Programa local de talentos do rio Perl (2017BT01S155) e do Programa local de talentos do rio Perl (2017BT01S1555) e do China Postdoctoral Science Foundation (2018M640767).

Materials

50 mL centrifuge tube Corning 430829 50 mL
6 cm Petri dish Thermo Fisher 150326 6 cm
Agar For fly food
Aluminum foil N/A N/A Protect smaple from light
BODIPY 493/503 Invitrogen D3922 Lipid droplet staining dye
Confocal microscope Leica Leica TSC SP5 Confocal imaging
Corn syrup For fly food
Cornmeal For fly food
Coverslip Citoglas 10212424C 20 × 20 mm, 0.13-0.17 thick
Dissection pin N/A N/A
Dissection plate N/A N/A
Filter paper N/A N/A Diameter: 11 cm
Fixation buffer N/A N/A 4% Paraformaldehyde (PFA) in 1xPBS
Forcep Dumont 11252-30 #5
Incubator Jiangnan SPX-380 For fly culture
Microcentrifuge tube Axygen MCT-150-C 1.5 ml
Microscopy slide Citoglas 10127105P-G
Mounting medium VECTASHIELDAntifade Mounting Medium H-1000 Antifade mounting medium
Nail polish PanEra AAPR419 Seal the coverslip
Paintbrush N/A N/A
PBS N/A N/A 1xPBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4,1.8 mM KH2PO4, pH 7.4)
Rotator Kylin-Bell Lab Instruments WH-986
Scissor Smartdata Medical SR81 Vannas spring scissor
Soy flour For fly food
Spatula N/A N/A
Standard cornmeal food N/A N/A Accoding to Bloomington standard cornmeal food recipe
Stereo microscope Leica Leica S6E For tissue dissection
Wipe paper N/A N/A
Yeast For fly food
yw Kept as lab stock N/A Drosophila

References

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Cite This Article
Wei, C., Yan, Y., Miao, X., Jiao, R. Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae. J. Vis. Exp. (154), e60606, doi:10.3791/60606 (2019).

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