Summary
우리는 암 환자에게서 말초 혈액의 단지 한 방울을 요구하는 T 세포에 PD-1-차단 항체의 결합을 평가하기 위한 간단한 유동 세포 분석분석서를 개발했습니다.
Abstract
PD-1-차단 항체를 포함한 면역 체크포인트 억제제는 다양한 유형의 암에서 치료 결과를 크게 개선했습니다. 이 면역 요법의 약리학적 인 효능은 오래 지속되며 지속적인 혈중 농도로 인해 주사 중단을 넘어서도 연장됩니다. 여기서 우리는 PD-1-차단 항체 니볼루맙 및 펨브롤리주맙의 T 세포 결합 상태를 평가하기 위한 간단한 유동 세포 분석기를 개발했다. 포도당 검사같이, 이 분석실험은 말초 혈액의 단지 1 방울을 요구합니다. T 세포에 결합하는 항체를 시각화하는 것은 항체 혈중 농도를 측정하는 것보다 더 신뢰할 수 있습니다. 추가적으로, 필요한 경우에, 우리는 잠재적으로 PD-1-차단 항체에 묶인 T 세포에 많은 특유한 면역 관련 마커를 분석할 수 있습니다. 따라서, 이것은 암 환자에서 PD-1-차단 항체의 약리효과를 분석하기 위한 간단하고 최소침습적인 전략이다.
Introduction
PD-1-차단 항체는 비소세포 폐암(NSCLC)1,2,3,4를포함하는 다양한 유형의 암치료를 위한 표준 선택이 되고 있다. 그(것)들은 전통적인 세포 독성 화학요법에 반응하지 않은 암 환자의 부분 집합에 있는 현저한 치료 효력을 보여줍니다. 그러나, PD-1-차단 항체를 포함하는 면역 체크포인트 억제제(ICIs)는, 면역 관련 부작용(irAEs)이라고 불리는 특이적 스펙트럼의 독특하고 뚜렷한 스펙트럼을 유발할 수있다 5. irAEs는 거의 모든 조직에 영향을 미칠 수 있지만, 그들은 가장 일반적으로 위장관에서 관찰, 내분비 땀샘, 피부, 간, 그들은 소양증을 일으킬 수 있습니다, 발진, 구역질, 설사, 및 갑상선 질환6,7. 일반적으로 대부분의 iAEs는 ICI가 발생한 후 1~2개월 이내에 나타납니다. 그러나, 어떤 경우에는, 그(것)들은 처리의 시작 후에 1 년 이상 또는 처리중단후에6,7후에 생길 수 있습니다 . 그(것)들은 또한 그밖 병리에서 구별하기 어려울 지도 모르다 각종 현상을 일으키는 원인이 됩니다. 따라서 iAE를 신속하게 진단하고 적절하게 치료하는 것이 어려울 수 있습니다. irAEs는 모든 조직에 영향을 미칠 수 있고, 그들의 개시는 강하게 PD-1-차단 항체에 묶인 면역 세포, 특히 T 세포를 순환에 의해 영향을 받습니다. 따라서 항체 표적 T 세포를 모니터링하는 간단하고 최소 침습적인 방법은 임상 설정에서 중요하다.
여기에서, 우리는 니볼루맙 또는 펨브롤리주맙을 수신한 암 환자에게서 말초 전혈의 한 방울을 사용하여 T 세포에 PD-1-차단 항체의 결합을 평가하는 간단한 방법을 개발했습니다. 이러한 접근법을 사용하여, 우리는 1) T 세포에 결합하는 항체의 지속 시간, 2) 치료 항체에 의한 T 세포 PD-1 분자의 점유, 3) T 세포의 활성화 상태 및 면역학적 특징을 각각 모니터링할 수 있었다. 이 방법은 이전에 보고된 기술8의수정입니다. 필요한 혈액의 양은 포도당 검사에 필요한 것과 거의 동일하며, 접근법은 단핵 세포 농축 또는 PD-1-차단 항체와의 공동 배양을 필요로 하지 않는다. 우리는 이 방법이 또한 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 흉막 삼출액, 심낭 삼출액, 기관지 정맥 세척액 및 뇌척수액에서 세포를 포함하여 동결 된 샘플을 사용하여 수행 될 수 있음을 확인, 이 전략은 다센터 연구의 맥락에서 유용 할 수 있음을 시사. 이 방법은 iAEs의 조기 진단을 용이하게 할 수 있고, 또한 그들의 증상을 통제하고 PD-1 억제제 후에 후속 치료를 개시하기 위한 최적의 시간을 식별하는 적절한 면역 억제 치료를 결정하는 데 도움이 될 수 있다.
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Protocol
샘플링은 일상적인 임상 절차 동안 수행되었다. 모든 인간 샘플은 헬싱키 선언에 따라, 일본 오사카 대학(15383 및 752)의 윤리검토위원회의 승인을 받아 피험자가 제공한 동의를 얻은 후 얻어졌습니다.
1. 전혈 샘플 준비 및 염색
- 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)을 포함하는 혈액 수집 튜브로 전체 혈액 샘플을 수집합니다.
참고: 혈액 수집은 일반 바늘 이나 혈액 랜싯을 사용 하 여 수행할 수 있습니다. - 전혈 샘플 20 μL을 5 mL 바닥 폴리스티렌 유동 세포 분석 튜브로 옮김.
참고 : 튜브에 대한 세포의 비 특이적 결합을 줄이기 위해 인산염 완충 식염수 (PBS)에서 2 % 태아 소 혈청 (FBS)의 1 mL을 튜브에 첨가하고 샘플에 적용하기 전에 10 s 동안 소용돌이를 제거합니다. - PBS에 2% FBS의 20 μL을 추가합니다.
- 10 μL의 인간 전용 FcR 차단 시약을 추가합니다. 잘 섞어서 실온에서 15분 동안 배양합니다.
- 적혈구 리시스 완충액 500 μL을 추가합니다. 잘 섞어서 실온에서 10분 동안 배양합니다.
- PBS에 2% FBS 의 4 mL을 추가하고 4 °C에서 5 분 동안 400 x g (1,500 rpm)에서 세포를 스핀 다운하십시오. 포부로 상급을 제거하십시오.
- 1.6단계에서 설명한 세척 및 흡인 과정을 반복한다.
- PBS에서 2% FBS의 100 μL에서 세포를 다시 중단하고 각각 50 μL의 2개의 튜브로 나눕니다.
- 표면 마커 항체를 추가합니다(표1). 잘 섞어서 어둠 속에서 실온에서 20 분 동안 배양하십시오.
참고: T 세포 면역 상태를 프로파일링할 때, 마커의 수는 유세포 측정 기계 품질에 기초하여 증가될 수 있다. - 1.6단계에서 설명한 대로 샘플을 2x 세척합니다.
- PBS에서 2% FBS의 200 μL에서 세포를 다시 중단합니다.
2. 유동 세포 측정 분석
- 유세포계에 튜브를 삽입하고 기본적으로 권장 프로토콜9에따라 세포를 획득합니다.
- 10,000개의 이벤트를 림프구 게이트(그림1A)로기록하고 분석을 위해 .fcs 파일로 흐름 데이터를 내보냅니다.
- 분석 소프트웨어에서 파일을 엽니다. 전방 산란(FSC) (A) 대 측면 산란(SSC) (A) 플롯 및 게이트 림프구(도1A)에서세포를 시각화한다.
- FSC (H) 대 FSC (H) 및 SSC (H) 대 SSC(W) (그림 1B)를사용하여 단일 셀을 선택하고 CD3 대 CD8 또는 CD3 대 CD4 플롯에 표시한 후, CD8 T 셀 및 CD4 T 셀을 각각 게이트(그림 1C).
- 게이트 된 세포를 선택하고 PD-1 대 인간 IgG4 플롯에 표시 한 후, PD-1-차단 항체 바인딩 CD8 및 CD4 T 세포를 이소타입 제어에 기초하여 식별합니다(그림 1D).
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Representative Results
게이팅 전략 및 유세포분석분석(도1)은NSCLC 환자 말초 혈액의 한 방울로부터 수득된 T 세포에 결합하는 PD-1-차단 항체를 검출할 수 있다. PD-1-차단 항체가 투여되기 전에, 인간 IgG4 양성 CD8 또는 CD4 T 세포가 존재하지 않으며, PD-1-검출 항체(EH12.1)에 의해 PD-1 발현이 확인될 수있다(그림 2A). 니볼루맙 또는 펨브롤리주맙 투여 후, IgG4(니볼루맙, 펨브롤리주맙)는 항IgG4 항체(HP6025)에 의해 T 세포에서 검출될 수 있는 반면, PD-1 검출 항체 EH12.1은 치료적 PD-1 항체가 EH12.1 결합을 방해하기 때문에 T 세포상에서 어떤 PD-1도 인식하지 못한다. 이것은 우리가 간접적으로 PD-1-검출 항체의 결합의 부족에 근거를 둔 PD-1-차단 항체의 치료 결합을 측정하고 있다는 것을 의미합니다. 대표적인 데이터는 PD-1-차단 항체의 상이한 결합 상태를 나타내고있다(도 2A). 니볼루맙 및 펨브롤리주맙의 결합 및 T 세포상에서의 PD-1의 점유율은 시간이 지남에 따라감소10,및 이중 양성 영역에 도시된 부분 결합(PB)이 있고, 최종적으로 완전한 결합(LB)의 손실이있다(도 2B).
도 1: 대표적인 게이팅 전략은 말초 혈액 의 한 방울로부터 T 세포에 결합하는 항체를 PD-1-차단하는 것을 평가한다. (A)FSC (A) 대 SSC (A) 플롯 및 림프구의 게이팅. (B)더블릿은 FSC(H) 대 FSC(W) 및 SSC(H) 대 SSC(W)의 플롯에서 주 셀 모집단 주위의 게이트를 그리는 것으로 제외됩니다. (C)CD3 대 CD8 플롯(위쪽) 및 CD3 대 CD4 플롯(아래) 및 CD8 T 셀 및 CD4 T 셀의 게이팅이 각각. (D)PD-1 대 인간 IgG4 플롯 및 CD8 및 CD4 T 세포에 니볼루맙(PD-1-차단 항체)의 결합의 검출. 주황색 점과 검은 점은 각각 항 IgG4 항체 및 이소타입 조절 염색을 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: PD-1-차단 항체의 결합 상태의 변화를 나타내는 대표적인 유세포분석. (a)ICI 전처리 환자로부터 CD8 T 세포에서 PD-1 및 인간 IgG4의 염색을 유세포분석(왼쪽)으로 평가하였다. 전처리된 혈액의 10마이크로리터를 15분 동안 니볼루맙의 직렬 희석으로 처리하였고, 프로토콜의 1.4 내지 1.10단계를 완료하였다. 완전 결합(CB)(적색), 부분 결합(PB) (파란색) 및 결합 손실(LB)(녹색)은 표시된 게이트에 의해 정의됩니다. (b)CD8 T 세포에 결합하는 PD-1-차단 항체의 상태는 지시된 바와 같이, 니볼루맙 및 펨브롤리주맙을 중단한 NSCLC 환자에서 후속 시점에서 분석하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| Pe | BV421 | PE-Cy7 | APC-Cy7 | BV510 | |
| 구속력 평가 | IgG4 | CD3 | PD-1 | CD4 | CD8 |
| 아이소타입 제어 | 아이소타입 제어 | CD3 | 아이소타입 제어 | CD4 | CD8 |
표 1: 유세포 분석에서 사용되는 항체.
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Discussion
이 기사에서는, 우리는 우리가 원래 nivolumab 검출을 위해 개발한 말초 혈액의 한 방울에서 파생된 T 세포에 결합된 PD-1-차단 항체를 검출하기 위하여 유세포계를 이용한 방법을 보고합니다10. 이 기술은 매우 간단하고 수행하기 쉽지만 정확한 결과를 얻으려면 두 가지 중요한 사항을 주목해야합니다. 하나는 PD-1 분자를 검출하기 위해 니볼루맙 및 펨브롤리주맙과 경쟁하는 적절한 항체를 사용해야 한다는 것입니다. 이 문제는 이전 연구11에서평가되었다. 다른 하나는 표면 염색 전에 RBC 라시스를 철저히 수행해야한다는 것입니다. IgG4 양성 클러스터의 게이트를 결정하기 위해 각 분석에 대해 이소형 제어가 확립되는 한, 주파수는 영향을 받지 않습니다. 그러나, 이 프로토콜을 사용하면 RBC 라시스가 불충분할 때 림프구 게이트에서 T 세포 수와 각 표면 마커의 강도의 감소가 있을 수 있다. 또한, RBC 용해 단계는 표면 염색 전에 수행되어야 하며, 그렇지 않으면 안티-IgG4 항체(HP6025)가 제대로 작동하지 않는다.
이 방법의 한계는 PD-1-차단 항체에 결합된 T 세포의 집단이 치료 효과 및 irAEs에 책임 있는 특정 T 세포 클론을 포함한다는 것입니다; 그러나, 항체 결합 인구 중 이들 특정 클론의 주파수는 매우 낮다. 따라서 CD3912와같은 특정 마커를 사용하여 특정 대상을 보강해야 합니다. 또 다른 제한은 IgG4의 형광 강도가 어떤 경우에는 높지 않아 결합 상태(즉, PB 및 LB)를 결정하기 어렵게 만든다는 것입니다.
다른 연구는 약물 동력학을 평가하기 위해 혈액내 치료 PD-1 항체를 모니터링하였다. 니볼루맙 또는 펨브롤리주맙의 혈장 농도를 측정하는 것은 혈액내 이러한 항체의 잔류량이 시간과 어떻게 상관되는지를 결정하는 데 필수적입니다. 그러나, 우리는 이전에 니볼루맙의 농도가 T세포(10)에잔류 결합과 완전히 상관관계가 없다고 보고하였다. 혈장 항체농도(13)의측정과 비교하여, 우리의 방법은 T 세포에 대한 항-PD-1 항체의 잔류 결합을 평가하는 데 더 적합할 수 있다. 혈액에서 T 세포에 결합하는 니볼루맙을 모니터링하는 원래의 방법은 형광 표지된 니볼루맙8. 우리는 이 접근을 단순화하고 분석 시간 및 분석에 필요한 혈액의 양을 실질적으로 감소시키는 것을 성공했습니다.
냉동 세포는 또한 이 분석법을 사용하여 분석될 수 있습니다, 이 방법은 다중 센터 연구 결과에 적합하다는 것을 건의합니다. 이러한 접근법의 유용성은 PD-1-차단항체(10)에결합된 T 세포의 Ki-67과 같은 다른 면역학적 마커와 모니터링 결합 상태를 결합함으로써 더욱 향상될 것이다. 미래 연구는 PD-1-차단 항체에 결합하고 irAEs에 책임 있는 T 세포의 특정 부세트를 확인하고 특성화하는 것을 시도하기 위하여 단세포 RNA 순서 및 T 세포 수용체 순서와 함께 우리의 방법을 이용해야 합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 작품은 일본과학진흥회(JP17K16045)와 일본의학연구개발원(JP18cm0106335, 19cm0106310)의 보조금을 지원받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X RBC Lysis Buffer (Multi-species) | Thermo Fisher Scientific | 00-4300-54 | 50 mL |
| APC/Cyanine7 anti-human CD4 Antibody | BioLegend | 300518 | Clone RPA-T4 |
| BD FACS Canto II Flow Cytometer | BD | ||
| Brilliant Violet 510 anti-human CD8a Antibody | BioLegend | 301048 | Clone RPA-T8 |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | nacalai tesque | 14249-95 | 500 mL |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes | STEMCELL Technologies | 352058 | 5 mL |
| FcR Blocking Reagent, human | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | 2 mL |
| FLOWJO | BD | ||
| Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 12676029 | 500 mL |
| Mouse IgG1 monoclonal - Isotype control | abcam | ab81200 | |
| Mouse monoclonal Anti-Human IgG4 Fc | abcam | ab99825 | Clone HP6025 |
| Pacific Blue Mouse Anti-Human CD3 | BD | 558117 | Clone UCHT1 |
| PE-Cy7 Mouse anti-Human CD279 (PD-1) | BD | 561272 | Clone EH12.1 |
| PE-Cy7 Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD | 557646 |
References
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