Summary
Vi utviklet en enkel flow cytometri analyse for å evaluere bindingen av PD-1-blokkerende antistoffer mot T-celler, krever bare en dråpe perifert blod fra kreftpasienter.
Abstract
Immunsjekkpunkthemmere, inkludert PD-1-blokkerende antistoffer, har betydelig forbedret behandlingsutfall i ulike typer kreft. Den farmakologiske effekten av disse immunterapiene er langvarig, og strekker seg selv utover seponeringen av injeksjonene, på grunn av vedvarende blodkonsentrasjoner. Her utviklet vi en enkel flyt cytometri analyse for å evaluere T celle binding status for PD-1-blokkerende antistoffer nivolumab og pembrolizumab. Som en glukosetest krever denne analysen bare en enkelt dråpe perifert blod. Visualisere antistoffbinding på T-celler er mer pålitelig enn å måle antistoffblodkonsentrasjoner. I tillegg kan vi potensielt analysere mange karakteristiske immunrelaterte markører på T-celler bundet til PD-1-blokkerende antistoffer. Dermed er dette en enkel og minimal invasiv strategi for å analysere den farmakologiske effekten av PD-1-blokkerende antistoffer hos kreftpasienter.
Introduction
PD-1-blokkerende antistoffer har blitt standardvalget for behandling av ulike typer kreft, inkludert ikke-småcellet lungekreft (NSCLC)1,2,3,4. De viser en bemerkelsesverdig terapeutisk effekt hos en undergruppe av kreftpasienter som ikke har respondert på konvensjonelle cytotoksiske kjemoterapier. Imidlertid kan immunkontrollpunkthemmere (ICIer), som inkluderer PD-1-blokkerende antistoffer, forårsake et unikt og tydelig spekter av bivirkninger, kalt immunrelaterte bivirkninger (irAV-er)5. Selv om irAE kan påvirke nesten alle vev, de er oftest observert i mage-tarmkanalen, endokrine kjertler, hud, og lever, og de kan forårsake kløe,, kvalme, diaré, og skjoldbrusk lidelser6,7. Generelt vises de fleste irAE er innen 1 til 2 måneder etter initiering av ICIer. Men i noen tilfeller kan de oppstå senere enn 1 år etter begynnelsen av behandlingen eller til og med etter behandlingsopphør6,7. De forårsaker også ulike symptomer som kan være vanskelige å diskriminere fra andre patologier. Dermed kan det være utfordrende å umiddelbart diagnostisere irAE og behandle dem riktig. irAE kan påvirke alle vev, og deres utbrudd er sterkt påvirket av sirkulerende immunceller, spesielt T-celler bundet til PD-1-blokkerende antistoffer. Derfor er en enkel og minimal invasiv metode for å overvåke antistoffmålrettede T-celler viktig i kliniske innstillinger.
Her utviklet vi en enkel metode for å vurdere bindingen av PD-1-blokkerende antistoffer mot T-celler ved hjelp av en dråpe perifert fullblod fra kreftpasienter som fikk nivolumab eller pembrolizumab. Ved hjelp av denne tilnærmingen var vi i stand til å overvåke hvert av følgende: 1) varigheten av antistoffbinding til T-celler, 2) belegget til T-celle PD-1 molekyler ved terapeutiske antistoffer, og 3) aktiveringsstatus og immunologiske egenskaper i T-celler. Denne metoden er en endring av en tidligere rapportert teknikk8. Mengden blod som kreves er nesten den samme som det som trengs for en glukosetest, og tilnærmingen krever ikke enukleær celleberikelse eller co-culturing med PD-1-blokkerende antistoffer. Vi bekreftet at denne metoden også kan utføres ved hjelp av frosne prøver, inkludert perifert blod mononukleære celler (PBMCs) og celler fra pleural effusjon, perikardial effusjon, bronkoalveoor lavage væske, og cerebrospinalvæske, noe som tyder på at denne strategien kan være nyttig i sammenheng med en multisenterstudie. Denne metoden kan lette tidlig diagnose av irAE, og også bidra til å bestemme de riktige immunsuppressive behandlingene for å kontrollere symptomene og identifisere de optimale tidene for å initiere påfølgende behandlinger etter PD-1-hemmere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Prøvetaking ble utført under rutinemessige kliniske prosedyrer. Alle menneskelige prøver ble innhentet etter informert samtykke ble gitt av fagene, i samsvar med Helsingfors erklæringen og med godkjenning av etisk gjennomgang styret av Graduate School of Medicine, Osaka University, Japan (15383 og 752).
1. Hele blodprøveforberedelser og farging
- Samle fullblodprøver i blodinnsamlingsrør som inneholder etylendiamin tetra-eddiksyre (EDTA).
MERK: Blodoppsamling kan utføres ved hjelp av enten en vanlig nål eller en blodlansett. - Overfør 20 μL av hele blodprøver til 5 ml rundbunnspolystyrenstrømningcytometrirør.
MERK: For å redusere ikke-spesifikk binding av celler til rør, legges 1 ml 2% føtal storfeserum (FBS) i fosfatbufret saltvann (PBS) inn i rør og virvles i 10 s før påføring til prøver. - Tilsett 20 μL av 2% FBS i PBS.
- Tilsett 10 μL menneskelig spesifikk FcR blokkering reagens. Bland godt og inkuber i 15 min ved romtemperatur.
- Tilsett 500 μL rødblodslysebuffer. Bland godt og inkuber i 10 min ved romtemperatur.
- Tilsett 4 ml 2% FBS i PBS og spin down celler på 400 x g (1500 rpm) for 5 min ved 4 °C. Fjern supernatant ved aspirasjon.
- Gjenta vaske- og aspirasjonsprosessen som er beskrevet i trinn 1.6.
- Re-suspendere celler i 100 μL av 2% FBS i PBS og dele i to rør på 50 μL hver.
- Legg til overflatemarkør antistoffer (Tabell 1). Bland godt og inkuber i 20 min ved romtemperatur i mørket.
MERK: Ved profilering av T-celleimmunstatus kan antall markører økes basert på strømningskytometrimaskinkvaliteten. - Vask prøver 2x som beskrevet i trinn 1.6.
- Resuspender celler i 200 μL av 2% FBS i PBS.
2. Flow Cytometrisk analyse
- Sett rørene inn i strømningscytometeret og skaffe celler, i utgangspunktet etter den anbefalte protokollen9.
- Ta opp 10 000 hendelser som lymfocytterporten (figur 1A) og eksportflytdata som FCS-filer for analyse.
- Åpne filer i analyseprogramvaren. Visualiser cellene på en forover scatter (FSC) (A) vs. sidescatter (SSC) (A) plott og gate lymfocytter (Figur 1A).
- Etter å ha valgt enkeltceller ved hjelp av FSC (H) vs. FSC (W) og SSC (H) vs. SSC (W) (Figur 1B) og vise dem på en CD3 vs. CD8 eller CD3 vs. CD4 plott, gate CD8 T celler og CD4 T celler, henholdsvis (Figur 1C).
- Etter å ha valgt de inngjerdede cellene og vist dem på et PD-1 vs. humant IgG4-plott, må du identifisere PD-1-blokkerende antistoffbundne CD8- og CD4 T-celler basert på isotypekontroll (Figur 1D).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gating strategi og flyt cytometri analyse (Figur 1) kan oppdage PD-1-blokkereantistoff binding til T-celler hentet fra en dråpe NSCLC pasient perifert blod. Før PD-1-blokkerende antistoff administreres, finnes ingen humane IgG4-positive CD8- eller CD4 T-celler, og PD-1-uttrykk kan bekreftes av et PD-1-detekterende antistoff (EH12.1) (figur 2A). Etter administrering av nivolumab eller pembrolizumab kan IgG4 (nivolumab, pembrolizumab) påvises på T-celler ved anti-IgG4 antistoff (HP6025), mens PD-1-detektereantistoffet EH12.1 ikke gjenkjenner noen PD-1 på T-celler fordi terapeutiske PD-1 antistoffer forstyrrer EH12.1-bindingen. Dette betyr at vi indirekte måler den terapeutiske bindingen av PD-1-blokkerende antistoff basert på mangel på binding av PD-1-detekterende antistoff. Representative data viser de ulike bindingsstatusene til PD-1-blokkerende antistoff (figur 2A). Nivolumab og pembrolizumab binding og belegg av PD-1 på T-celler reduseres over tid10, og det er delvis binding (PB), som er vist i det dobbeltpositive området, og til slutt fullstendig tap av binding (LB) (figur 2B).
Figur 1: Representativ gatingstrategi for å evaluere PD-1-blokkerende antistoffbinding til T-celler fra en dråpe perifert blod. (A) FSC (A) vs. SSC (A) plott og gating av lymfocytter. (B) Dobler er utelukket ved å tegne porter rundt hovedcellepopulasjonen på tomter av FSC (H) vs. FSC (W) og SSC (H) vs. SSC (W). (C) CD3 vs CD8 plott (øvre) og CD3 vs CD4 plott (lavere) og gating av CD8 T-celler og CD4 T celler, henholdsvis. (D) PD-1 vs. menneskelig IgG4 plott og deteksjon av bindingen av nivolumab (en PD-1-blokkerende antistoff) til CD8 og CD4 T celler. Oransje prikker og svarte prikker indikerer henholdsvis anti-IgG4 antistoff og isotype kontrollfarging. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Representativ flytcytometrianalyse som indikerer endringen i bindingsstatus for PD-1-blokkerende antistoffer. (A) Farging av PD-1 og humant IgG4 i CD8 T-celler fra ICI-forhåndsbehandlet pasientblod ble evaluert ved flytcytometri (venstre). Ti mikroliter forhåndsbehandlet blod ble behandlet med seriefortynning av nivolumab i 15 min, og trinn 1,4 til 1,10 i protokollen ble fullført. Fullstendig binding (CB) (rød), delvis binding (PB) (blå) og tap av binding (LB) (grønn) defineres av de angitte portene. (B) Status for PD-1-blokkerende antistoffbinding til CD8 T-celler ble analysert ved oppfølgingstidspunktene, som angitt hos NSCLC-pasienter som seponerte nivolumab og pembrolizumab. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
| Pe | BV421 (andre) | Pe-cy7 (andre) | APC-Cy7 | BV510 (andre) | |
| Bindende evaluering | IgG4 (andre) | CD3 (CD3) | Pd-1 (andre) | CD4 (CD4) | CD8 (CD8) |
| Isotype kontroll | Isotype kontroll | CD3 (CD3) | Isotype kontroll | CD4 (CD4) | CD8 (CD8) |
Tabell 1: Antistoffer som brukes i flow cytometrisk analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne artikkelen rapporterer vi en metode ved hjelp av et strømningscytometer for å oppdage PD-1-blokkerende antistoffer bundet til T-celler avledet fra en dråpe perifert blod, som vi opprinnelig utviklet for nivolumab deteksjon10. Selv om denne teknikken er veldig enkel og enkel å utføre, bør to viktige punkter noteres for å oppnå nøyaktige resultater. Det ene er at for å oppdage PD-1 molekyler, bør et passende antistoff som konkurrerer med nivolumab og pembrolizumab brukes. Dette problemet ble evaluert i en tidligere studie11. Den andre er at RBC lysis skal utføres grundig før overflatefarging. Så lenge en isotypekontroll er etablert for hver analyse for å bestemme porten til den IgG4-positive klyngen, påvirkes frekvensen ikke. Men med denne protokollen, når RBC lysis er utilstrekkelig, kan det være reduksjoner av både T-celletellingen i lymfocytterporten og intensiteten til hver overflatemarkør. I tillegg må RBC-lysistrinnet utføres før overflatefarging, ellers fungerer anti-IgG4 antistoff (HP6025) ikke riktig.
Begrensningen av denne metoden er at populasjonen av T-celler bundet til PD-1-blokkerende antistoffer inkluderer spesifikke T-cellekloner som er ansvarlige for terapeutiske effekter og irAE; Frekvensene til disse spesifikke klonene blant den antistoffbundne befolkningen er imidlertid ganske lave. Derfor må vi fortsatt berike det spesifikke målet ved hjelp av visse markører, for eksempel CD3912. En annen begrensning er at fluorescensintensiteten til IgG4 ikke er høy i noen tilfeller, noe som gjør det vanskelig å bestemme bindingsstatus (dvs. PB og LB).
Andre studier har overvåket terapeutiske PD-1 antistoffer i blodet for å evaluere farmakokinetikk. Måling av plasmakonsentrasjonen av nivolumab eller pembrolizumab er avgjørende for å avgjøre hvordan gjenværende mengde av disse antistoffene i blodet korrelerer med tiden. Vi har imidlertid tidligere rapportert at konsentrasjonen av nivolumab ikke fullt korrelerer med gjenværende binding til T-celler10. Sammenlignet med måling av plasmaantistoffkonsentrasjon13,kan vår metode være mer hensiktsmessig for evaluering av gjenværende binding av anti-PD-1 antistoffer mot T-celler. Den opprinnelige metoden for overvåking av nivolumabbinding til T-celler i blod nødvendig inkubasjon med fluorescensmerket nivolumab8. Vi forenklet denne tilnærmingen og lyktes i å redusere analysetiden betydelig og mengden blod som trengs for analyse.
Frosne celler kan også analyseres ved hjelp av denne analysen, noe som tyder på at denne metoden passer godt for multisenterstudier. Nytten av denne tilnærmingen vil bli ytterligere forbedret ved å kombinere overvåking bindingstatus med andre immunologiske markører, for eksempel Ki-67, av T-celler bundet til PD-1-blokkerende antistoffer10. Fremtidige studier bør bruke vår metode sammen med encellede RNA-sekvensering og T-cellereseptorsekvensering for å prøve å identifisere og karakterisere de spesifikke undersettene av T-celler som er bundet til PD-1-blokkerende antistoffer og er ansvarlige for iraE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd til S.K. fra Japan Society for The Promotion of Science KAKENHI (JP17K16045) og Japan Agency for Medical Research and Development (JP18cm0106335 og 19cm0106310).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X RBC Lysis Buffer (Multi-species) | Thermo Fisher Scientific | 00-4300-54 | 50 mL |
| APC/Cyanine7 anti-human CD4 Antibody | BioLegend | 300518 | Clone RPA-T4 |
| BD FACS Canto II Flow Cytometer | BD | ||
| Brilliant Violet 510 anti-human CD8a Antibody | BioLegend | 301048 | Clone RPA-T8 |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | nacalai tesque | 14249-95 | 500 mL |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes | STEMCELL Technologies | 352058 | 5 mL |
| FcR Blocking Reagent, human | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | 2 mL |
| FLOWJO | BD | ||
| Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 12676029 | 500 mL |
| Mouse IgG1 monoclonal - Isotype control | abcam | ab81200 | |
| Mouse monoclonal Anti-Human IgG4 Fc | abcam | ab99825 | Clone HP6025 |
| Pacific Blue Mouse Anti-Human CD3 | BD | 558117 | Clone UCHT1 |
| PE-Cy7 Mouse anti-Human CD279 (PD-1) | BD | 561272 | Clone EH12.1 |
| PE-Cy7 Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD | 557646 |
References
- Gong, J., Chehrazi-Raffle, A., Reddi, S., Salgia, R. Development of PD-1 and PD-L1 inhibitors as a form of cancer immunotherapy: a comprehensive review of registration trials and future considerations. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 6 (1), 8 (2018).
- Borghaei, H., et al. Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Nonsquamous Non-Small-Cell Lung Cancer. The New England Journal of Medicine. 373 (17), 1627-1639 (2015).
- Brahmer, J., et al. Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Squamous-Cell Non-Small-Cell Lung Cancer. The New England Journal of Medicine. 373 (2), 123-135 (2015).
- Herbst, R. S., et al. Pembrolizumab versus docetaxel for previously treated, PD-L1-positive, advanced non-small-cell lung cancer (KEYNOTE-010): a randomised controlled trial. The Lancet. 387 (10027), 1540-1550 (2016).
- Postow, M. A., Sidlow, R., Hellmann, M. D. Immune-Related Adverse Events Associated with Immune Checkpoint Blockade. The New England Journal of Medicine. 378 (2), 158-168 (2018).
- Weber, J. S., et al. Safety Profile of Nivolumab Monotherapy: A Pooled Analysis of Patients With Advanced Melanoma. Journal of Clinical Oncology. 35 (7), 785-792 (2017).
- Champiat, S., et al. Management of immune checkpoint blockade dysimmune toxicities: a collaborative position paper. Annals of Oncology. 27 (4), 559-574 (2016).
- Brahmer, J. R., et al. Phase I study of single-agent anti-programmed death-1 (MDX-1106) in refractory solid tumors: safety, clinical activity, pharmacodynamics, and immunologic correlates. Journal of Clinical Oncology. 28 (19), 3167-3175 (2010).
- Bommareddy, P. K., Lowe, D. B., Kaufman, H. L., Rabkin, S. D., Saha, D. Multi-parametric flow cytometry staining procedure for analyzing tumor-infiltrating immune cells following oncolytic herpes simplex virus immunotherapy in intracranial glioblastoma. Journal of Biological Methods. 6 (2), 112 (2019).
- Osa, A., et al. Clinical implications of monitoring nivolumab immunokinetics in non-small cell lung cancer patients. JCI Insight. 3 (19), 59125 (2018).
- Zelba, H., et al. Accurate quantification of T-cells expressing PD-1 in patients on anti-PD-1 immunotherapy. Cancer Immunology, Immunotherapy. 67 (12), 1845-1851 (2018).
- Simoni, Y., et al. Bystander CD8(+) T cells are abundant and phenotypically distinct in human tumour infiltrates. Nature. 557 (7706), 575-579 (2018).
- Chiu, H. H., et al. Development of a general method for quantifying IgG-based therapeutic monoclonal antibodies in human plasma using protein G purification coupled with a two internal standard calibration strategy using LC-MS/MS. Analytica Chimica Acta. 1019, 93-102 (2018).
