Summary
Desarrollamos un ensayo de citometría de flujo simple para evaluar la unión de los anticuerpos de bloqueo de PD-1 a los células T, que requieren sólo una gota de sangre periférica de los pacientes con cáncer.
Abstract
Los inhibidores del punto de control inmune, incluidos los anticuerpos que bloquean la DP-1, han mejorado significativamente los resultados del tratamiento en varios tipos de cáncer. La eficacia farmacológica de estas inmunoterapias es de larga duración, extendiéndose incluso más allá de la interrupción de sus inyecciones, debido a las concentraciones persistentes de sangre. Aquí desarrollamos un ensayo de citometría de flujo simple para evaluar el estado de unión a las células T de los anticuerpos de bloqueo de PD-1 nivolumab y pembrolizumab. Al igual que una prueba de glucosa, este ensayo requiere una sola gota de sangre periférica. Visualizar la unión de anticuerpos en los células T es más fiable que medir las concentraciones de anticuerpos en la sangre. Además, si es necesario, podemos analizar potencialmente muchos marcadores distintivos relacionados con el sistema inmunitario en células T enlazadas a anticuerpos de bloqueo PD-1. Por lo tanto, se trata de una estrategia simple y mínimamente invasiva para analizar el efecto farmacológico de los anticuerpos de bloqueo de PD-1 en pacientes con cáncer.
Introduction
Los anticuerpos de bloqueo de PD-1 se han convertido en la opción estándar para el tratamiento de varios tipos de cáncer, incluido el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC)1,2,3,4. Muestran un efecto terapéutico notable en un subconjunto de pacientes con cáncer que no han respondido a las quimioterapias citotóxicas convencionales. Sin embargo, los inhibidores del punto de control inmune (IIC), que incluyen anticuerpos de bloqueo de PD-1, pueden causar un espectro único y distinto de eventos adversos, llamados eventos adversos relacionados con el sistema inmunitario (irAE)5. Aunque las irAEs pueden afectar casi todos los tejidos, se observan más comúnmente en el tracto gastrointestinal, glándulas endocrinas, piel, y el hígado, y pueden causar prurito, erupción cutánea, náuseas, diarrea, y trastornos de la tiroides6,7. En general, la mayoría de las iAE aparecen entre 1 y 2 meses después del inicio de las IIC. Sin embargo, en algunos casos, pueden ocurrir más tarde de 1 año después del inicio del tratamiento o incluso después de la interrupción del tratamiento6,7. También causan varios síntomas que pueden ser difíciles de discriminar de otras patologías. Por lo tanto, puede ser difícil diagnosticar rápidamente irAEs y tratarlos adecuadamente. irAE puede afectar a todos los tejidos, y su aparición está fuertemente influenciada por las células inmunitarias circulantes, especialmente las células T unidas a los anticuerpos de bloqueo de PD-1. Por lo tanto, un método sencillo y mínimamente invasivo para monitorear las células T dirigidas a anticuerpos es importante en entornos clínicos.
Aquí, desarrollamos un método sencillo para evaluar la unión de los anticuerpos pd-1, bloqueando los anticuerpos a las células T utilizando una gota de sangre entera periférica de pacientes con cáncer que recibieron nivolumab o pembrolizumab. Utilizando este enfoque, pudimos monitorear cada uno de los siguientes: 1) la duración de la unión de anticuerpos a las células T, 2) la ocupación de las moléculas DE PD-1 de células T por anticuerpos terapéuticos, y 3) el estado de activación y las características inmunológicas de los células T. Este método es una modificación de una técnica notificada previamente8. La cantidad de sangre requerida es casi la misma que la necesaria para una prueba de glucosa, y el enfoque no requiere enriquecimiento de células mononucleares o co-cultivo con anticuerpos de bloqueo de PD-1. Confirmamos que este método también se puede realizar utilizando muestras congeladas, incluyendo células mononucleares de sangre periférica (PPBM) y células de derrame pleural, derrame pericárdico, líquido de lavado broncoalveolar, y líquido cefalorraquídeo, lo que sugiere que esta estrategia puede ser útil en el contexto de un estudio multicéntrico. Este método puede facilitar el diagnóstico precoz de irAEs, y también ayudar a determinar los tratamientos inmunosupresores adecuados para controlar sus síntomas e identificar los tiempos óptimos para iniciar terapias posteriores después de los inhibidores de la PD-1.
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Protocol
El muestreo se realizó durante los procedimientos clínicos de rutina. Todas las muestras humanas se obtuvieron después de que los sujetos proporcionaran el consentimiento informado, de conformidad con la Declaración de Helsinki y con la aprobación de la junta de revisión ética de la Escuela de Posgrado de Medicina de la Universidad de Osaka, Japón (15383 y 752).
1. Preparación y tinción de muestras de sangre enteras
- Recoger muestras de sangre entera en tubos de recolección de sangre que contienen ácido tetraacético de etileno diamina (EDTA).
NOTA: La recolección de sangre se puede realizar con una aguja normal o una lanceta de sangre. - Transfiera 20 ml de muestras de sangre entera a tubos de citometría de flujo de poliestireno de fondo redondo de 5 ml.
NOTA: Para reducir la unión no específica de las células a los tubos, se añade 1 ml de suero bovino fetal (FBS) al 2% en solución salina tamponada con fosfato (PBS) en tubos y vórtice durante 10 s antes de la aplicación a las muestras. - Añadir 20 sl de 2% FBS en PBS.
- Añadir 10 s de reactivo de bloqueo fcR específico para humanos. Mezclar bien e incubar durante 15 min a temperatura ambiente.
- Añadir 500 l de tampón de lisis de glóbulos rojos. Mezclar bien e incubar durante 10 min a temperatura ambiente.
- Añadir 4 ml de 2% DE FBS en PBS y espírelas a 400 x g (1.500 rpm) durante 5 min a 4 oC. Retire el sobrenadante por aspiración.
- Repita el proceso de lavado y aspiración descrito en el paso 1.6.
- Vuelva a suspender las células en 100 s de 2% FBS en PBS y divídalas en dos tubos de 50 ol cada uno.
- Añadir anticuerpos de marcador de superficie (Tabla 1). Mezclar bien e incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.
NOTA: Al perfilar el estado inmune de los células T, el número de marcadores se puede aumentar en función de la calidad de la máquina de citometría de flujo. - Lave las muestras 2x como se describe en el paso 1.6.
- Resuspenda las células en 200 s de 2% DE FBS en PBS.
2. Análisis citométrico de flujo
- Inserte tubos en el citómetro de flujo y adquiera células, básicamente siguiendo el protocolo recomendado9.
- Registre 10.000 eventos como la puerta de linfocitos(Figura 1A)y exporte datos de flujo como archivos .fcs para su análisis.
- Abra archivos en el software de análisis. Visualice las células en una dispersión hacia adelante (FSC) (A) frente a la dispersión lateral (SSC) (A) gráfica y linfocitos de puerta(Figura 1A).
- Después de seleccionar celdas individuales usando FSC (H) vs FSC (W) y SSC (H) vs SSC (W)(Figura 1B) y mostrándolas en una gráfica CD3 vs CD8 o CD3 vs CD4, engarre las células CD8 T y las células CD4 T, respectivamente (Figura 1C).
- Después de seleccionar las celdas cerradas y mostrarlas en una gráfica de PD-1 frente a IgG4 humana, identifique las células CD8 y CD4 T enlazadas a anticuerpos PD-1 en función del control de isotipos(Figura 1D).
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Representative Results
La estrategia de gating y el análisis de citometría de flujo(Figura 1) pueden detectar la unión de anticuerpos de bloqueo de PD-1 a los glóbulos T obtenidos a partir de una gota de sangre periférica del paciente NSCLC. Antes de administrar el anticuerpo de bloqueo PD-1, no hay células T IGG4 positivas humanas, y la expresión PD-1 puede ser confirmada por un anticuerpo de detección de PD-1 (EH12.1)(Figura 2A). Después de la administración de nivolumab o pembrolizumab, IgG4 (nivolumab, pembrolizumab) se puede detectar en las células T por anticuerpo anti-IgG4 (HP6025), mientras que el anticuerpo de detección DEPD-1 EH12.1 no reconoce ningún PD-1 en las células T porque los anticuerpos terapéuticos PD-1 perturban la unión EH12.1. Esto significa que estamos midiendo indirectamente la unión terapéutica del anticuerpo de bloqueo PD-1 basado en la falta de unión de anticuerpos de detección de PD-1. Los datos representativos muestran los diferentes estados de unión de los anticuerpos de bloqueo PD-1(Figura 2A). La unión de Nivolumab y pembrolizumab y la ocupación de PD-1 en células T disminuyen con el tiempo10,y hay unión parcial (PB), que se muestra en el área de doble positivo, y finalmente la pérdida completa de unión (LB)(Figura 2B).
Figura 1: Estrategia representativa de gating para evaluar la unión de anticuerpos de bloqueo de PD-1 a las células T a partir de una gota de sangre periférica. (A) FSC (A) frente a SSC (A) gráfica y gating de linfocitos. (B) Los dobletes se excluyen dibujando puertas alrededor de la población celular principal en parcelas de FSC (H) frente a FSC (W) y SSC (H) frente a SSC (W). (C) CD3 vs. CD8 plot (superior) y CD3 vs. CD4 plot (inferior) y gating de células CD8 T y CD4 T, respectivamente. (D) PD-1 frente a la gráfica IgG4 humana y detección de la unión de nivolumab (un anticuerpo de bloqueo PD-1) a células T CD8 y CD4. Los puntos naranjas y los puntos negros indican la tinción de anticuerpos anti-IgG4 y control de isotipos, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Análisis representativo de la citometría de flujo que indica el cambio en el estado de unión de los anticuerpos de bloqueo de PD-1. (A) La tinción de PD-1 y de IgG4 humana en células T CD8 de sangre de pacientes pretratadas por ICI se evaluó mediante citometría de flujo (izquierda). Se trataron diez microlitros de sangre pretratada con dilución en serie de nivolumab durante 15 minutos, y se completaron los pasos 1,4 a 1,10 del protocolo. El enlace completo (CB) (rojo), el enlace parcial (PB) (azul) y la pérdida de enlace (LB) (verde) se definen por las puertas indicadas. (B) El estado de la unión de anticuerpos de bloqueo de PD-1 a las células T CD8 se analizó en los puntos de tiempo de seguimiento, como se indica, en pacientes con CPSNuque que interrumpieron nivolumab y pembrolizumab. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Pe | BV421 | PE-Cy7 | APC-Cy7 | BV510 | |
| Evaluación vinculante | IgG4 | CD3 | PD-1 | CD4 | CD8 |
| Control de isotipos | Control de isotipos | CD3 | Control de isotipos | CD4 | CD8 |
Tabla 1: Anticuerpos utilizados en el análisis citométrico de flujo.
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Discussion
En este artículo, informamos de un método utilizando un citómetro de flujo para detectar anticuerpos de bloqueo PD-1 unidos a células T derivados de una gota de sangre periférica, que originalmente desarrollamos para la detección de nivolumab10. Aunque esta técnica es muy simple y fácil de realizar, se deben observar dos puntos importantes para obtener resultados precisos. Una es que para detectar moléculas de PD-1, se debe utilizar un anticuerpo adecuado que compita con nivolumab y pembrolizumab. Esta cuestión se evaluó en un estudio anterior11. La otra es que la lisis RBC debe realizarse a fondo antes de la tinción superficial. Siempre y cuando se establezca un control de isotipo para cada ensayo para determinar la puerta del clúster igG4 positivo, la frecuencia no se ve afectada. Sin embargo, con este protocolo, cuando la lisis RBC es insuficiente puede haber reducciones tanto del recuento de células T en la compuerta del linfocito como de la intensidad de cada marcador de superficie. Además, el paso de lisis RBC debe realizarse antes de la tinción de la superficie, de lo contrario el anticuerpo anti-IgG4 (HP6025) no funciona correctamente.
La limitación de este método es que la población de células T enlazadas a anticuerpos de bloqueo PD-1 incluye clones específicos de células T responsables de los efectos terapéuticos e irAE; sin embargo, las frecuencias de estos clones específicos entre la población ligada a anticuerpos son bastante bajas. Por lo tanto, todavía necesitamos enriquecer el objetivo específico usando ciertos marcadores, por ejemplo CD3912. Otra limitación es que la intensidad de fluorescencia de IgG4 no es alta en algunos casos, lo que dificulta determinar el estado de unión (es decir, PB y LB).
Otros estudios han monitorizado los anticuerpos terapéuticos PD-1 en la sangre para evaluar la farmacocinética. La medición de la concentración plasmática de nivolumab o pembrolizumab es esencial para determinar cómo la cantidad residual de estos anticuerpos en la sangre se correlaciona con el tiempo. Sin embargo, hemos informado previamente que la concentración de nivolumab no se correlaciona completamente con la unión residual a las células T10. En comparación con la medición de la concentración de anticuerpos plasmáticos13, nuestro método puede ser más adecuado para evaluar la unión residual de anticuerpos anti-PD-1 a células T. El método original de monitorización de la unión de nivolumab a las células T en sangre requirió incubación con nivolumab8con etiqueta de fluorescencia. Simplificamos este enfoque y logramos reducir sustancialmente el tiempo de ensayo y la cantidad de sangre necesaria para el análisis.
Las células congeladas también se pueden analizar utilizando este ensayo, lo que sugiere que este método es adecuado para estudios multicéntricos. La utilidad de este enfoque se mejorará aún más mediante la combinación del estado de unión de la supervisión con otros marcadores inmunológicos, como Ki-67, de células T vinculadas a anticuerpos de bloqueo de PD-11. Los estudios futuros deben utilizar nuestro método junto con la secuenciación de ARN de una sola célula y la secuenciación del receptor de células T para tratar de identificar y caracterizar los subconjuntos específicos de células T que están unidos a anticuerpos de bloqueo de PD-1 y son responsables de irAEs.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por subvenciones a S.K. de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia KAKENHI (JP17K16045) y la Agencia Japonesa de Investigación y Desarrollo Médico (JP18cm0106335 y 19cm0106310).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X RBC Lysis Buffer (Multi-species) | Thermo Fisher Scientific | 00-4300-54 | 50 mL |
| APC/Cyanine7 anti-human CD4 Antibody | BioLegend | 300518 | Clone RPA-T4 |
| BD FACS Canto II Flow Cytometer | BD | ||
| Brilliant Violet 510 anti-human CD8a Antibody | BioLegend | 301048 | Clone RPA-T8 |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | nacalai tesque | 14249-95 | 500 mL |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes | STEMCELL Technologies | 352058 | 5 mL |
| FcR Blocking Reagent, human | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | 2 mL |
| FLOWJO | BD | ||
| Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 12676029 | 500 mL |
| Mouse IgG1 monoclonal - Isotype control | abcam | ab81200 | |
| Mouse monoclonal Anti-Human IgG4 Fc | abcam | ab99825 | Clone HP6025 |
| Pacific Blue Mouse Anti-Human CD3 | BD | 558117 | Clone UCHT1 |
| PE-Cy7 Mouse anti-Human CD279 (PD-1) | BD | 561272 | Clone EH12.1 |
| PE-Cy7 Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD | 557646 |
References
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