Summary
PD-1-ブロッキング抗体とT細胞への結合を評価する簡単なフローサイトメトリーアッセイを開発し、がん患者からの末梢血の滴のみを必要とする。
Abstract
PD-1遮断抗体を含む免疫チェックポイント阻害剤は、様々なタイプの癌における治療結果を有意に改善した。これらの免疫療法の薬理学的有効性は、持続的な血液濃度のために、彼らの注射の中止を超えても延長し、長期的である。ここでは、PD-1遮断抗体ニボルマブおよびペンブロリズマブのT細胞結合状態を評価する簡単なフローサイトメトリーアッセイを開発した。グルコース検査と同様に、このアッセイは末梢血を一滴だけ必要とします。T細胞上での抗体結合の可視化は、抗体血中濃度を測定するよりも信頼性が高い。また、必要に応じて、PD-1-ブロッキング抗体に結合したT細胞上の多くの特徴的な免疫関連マーカーを分析することができます。したがって、これは癌患者におけるPD-1遮断抗体の薬理学的効果を分析するための単純で低侵襲的な戦略です。
Introduction
PD-1-ブロッキング抗体は、非小細胞肺癌(NSCLC)1、2、3、4を含む様々なタイプの癌の治療のための標準的な選択肢となっている。それらは、従来の細胞傷害性化学療法に反応していない癌患者のサブセットにおいて顕著な治療効果を示す。しかし、PD-1遮断抗体を含む免疫チェックポイント阻害剤(ICI)は、免疫関連有害事象(irAE)5と呼ぶ有害事象のユニークで明確なスペクトルを引き起こす可能性がある。irAEは、ほとんどすべての組織に影響を与えることができますが、それらは、消化管、内分泌腺、皮膚、肝臓で最も一般的に観察され、それらは、掻痒、発疹、吐き気、下痢、甲状腺疾患6、7を引き起こす可能性があります。一般に、ほとんどのirAEは、ICIの開始後1〜2ヶ月以内に現れます。しかし、場合によっては、治療開始後1年より遅く、あるいは治療停止後6、7の後に発生する可能性がある。彼らはまた、他の病理から区別することが困難である可能性があり、様々な症状を引き起こします.したがって、irAEを迅速に診断し、適切に治療することは困難です。irAEはすべての組織に影響を及ぼし、その発症は循環免疫細胞、特にPD-1遮断抗体に結合したT細胞によって強く影響されます。したがって、抗体標的T細胞を監視する簡単で低侵襲的な方法は、臨床現場で重要です。
ここでは、ニボルマブやペンブロリズマブを受けたがん患者の末梢全血を一滴用にT細胞に対するPD-1遮断抗体の結合を評価する簡単な方法を開発しました。この手法を用いて、以下の各々をモニターすることができた:1)T細胞に対する抗体結合の持続時間、2)治療用抗体によるT細胞PD-1分子の占有率、および3)T細胞の活性化状態および免疫学的特徴。このメソッドは、以前に報告されたテクニック8の変更です。必要な血液量は、グルコース検査に必要な量とほぼ同じであり、このアプローチは、単核細胞の濃縮やPD-1遮断抗体との共培養を必要としません。我々は、この方法が、末梢血単核細胞(PBMCs)および胸水、心膜滲出液、気管支肺胞洗浄液、脳脊髄液の細胞を含む凍結試料を用いて行われることも確認し、この戦略が多施設研究の文脈で有用である可能性を示唆した。この方法は、irAEの早期診断を容易にし、また、それらの症状を制御し、PD-1阻害剤の後に続く治療を開始するための最適な時間を特定するための適切な免疫抑制治療を決定するのに役立つ可能性があります。
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Protocol
サンプリングは、ルーチン臨床処置中に行った。すべてのヒトサンプルは、ヘルシンキ宣言に従い、また、大阪大学医学部の倫理審査委員会(15383、752)の承認を得て、被験者の同意を得た後に得られた。
1. 全血サンプルの準備と染色
- エチレン・ジアミンテトラ酢酸(EDTA)を含む血液採取管に全血試料を採取する。
注:血液採取は、通常の針または血液ランセットのいずれかを使用して行うことができます。 - 全血サンプル20μLを5 mL丸底ポリスチレンフローサイトメトリーチューブに移します。
注:細胞のチューブへの非特異的結合を減らすために、リン酸緩衝生理食塩血(PBS)の2%ウシ血清(FBS)の1 mLをチューブに加え、サンプルに適用する前に10分間渦でボルテックスする。 - PBSに2%FBSの20 μLを加えます。
- ヒト特異的FcRブロッキング試薬を10μL添加します。よく混ぜ、室温で15分間インキュベートします。
- 500 μLの赤血球リシスバッファーを加えます。よく混ぜ、室温で10分間インキュベートします。
- PBSに2%FBSの4 mLを加え、4°Cで5分間400 x g(1,500 rpm)で細胞をスピンダウンします。吸引によって上清を取り除く。
- ステップ 1.6 で説明した洗浄および吸引プロセスを繰り返します。
- PBSで100 μLの2%FBSで細胞を再懸濁し、それぞれ50μLの2つのチューブに分けます。
- 表面マーカー抗体を追加する (表1)。よく混ぜ、暗闇の中で室温で20分間インキュベートします。
注: T 細胞の免疫状態をプロファイリングする場合、マーカーの数はフロー サイトメトリー マシンの品質に基づいて増加できます。 - ステップ 1.6 で説明したサンプル 2x を洗浄します。
- PBSで2%FBSの200 μLの細胞を再懸濁します。
2. フロー細胞分析
- 流れサイトメーターにチューブを挿入し、基本的に推奨プロトコル9に従って細胞を取得します。
- 10,000 件のイベントをリンパ球ゲートとして記録し (図 1A)、分析用の .fcs ファイルとしてフロー データをエクスポートします。
- 分析ソフトウェアでファイルを開きます。前方散乱(FSC)(A)対側散布(SSC)(A)プロットおよびゲートリンパ球上の細胞を可視化する(図1A)。
- FSC (H) vs. FSC (W) と SSC (H) 対 SSC (W) (図 1B) を使用して単一のセルを選択し、それらを CD3 vs. CD8 または CD3 対 CD4 プロットに表示した後、それぞれ CD8 T セルと CD4 T セルをゲートします (図 1C)。
- ゲート付き細胞を選択し、PD-1対ヒトIgG4プロットに表示した後、アイソタイプ制御に基づいてPD-1-ブロッキング抗体結合CD8およびCD4 T細胞を同定します(図1D)。
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Representative Results
GAT化戦略とフローサイトメトリー分析(図1)は、NSCLC患者末梢血の滴から得られたT細胞へのPD-1遮断抗体結合を検出することができる。PD-1-ブロッキング抗体が投与される前に、ヒトIgG4陽性CD8またはCD4 T細胞は存在しない、およびPD-1発現はPD-1検出抗体(EH12.1)によって確認できる(図2A)。ニボルマブまたはペンブロリズマブ投与後、抗IgG4抗体(HP6025)によってT細胞上でIgG4(ニボルマブ、ペンブロリズマブ)を検出できるのに対し、PD-1検出抗体EH12.1は治療用PD-1抗体がEH12.1結合のためにT細胞上のPD-1を認識しない。これは、PD-1-検出抗体の結合の欠如に基づいて、間接的にPD-1-ブロッキング抗体の治療結合を測定していることを意味します。代表的なデータは、PD-1-ブロッキング抗体の異なる結合状態を示す(図2A)。T細胞上でのニボルマブ及びペンブロリズマブの結合および占有率は、時間10の経過とともに減少し、かつ、二重陽性領域に示される部分結合(PB)があり、最終的に結合の完全な損失(LB)(図2B)。.
図1:末梢血の滴下からT細胞へのPD-1遮断抗体結合を評価する代表的なgating戦略。(A) FSC (A) vs. SSC (A) リンパ球のプロットおよびゲラティング.(B) ダブレットは、FSC (H) 対 FSC (W) および SSC (H) 対 SSC (W) のプロットで主要なセルの周りにゲートを描画することによって除外されます。(C) CD3対CD8プロット(上)およびCD3対CD4プロット(下)およびCD8 T細胞およびCD4 T細胞のgatingをそれぞれ有する。(D) PD-1対ヒトIgG4プロットと、CD8およびCD4 T細胞へのニボルマブ(PD-1遮断抗体)の結合の検出。オレンジ色のドットと黒いドットは、それぞれ抗IgG4抗体およびアイソタイプコントロール染色を示す。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:PD-1-ブロッキング抗体の結合状態の変化を示す代表的なフローサイトメトリー分析。(A)ICI前処理患者血液からのCD8 T細胞におけるPD-1およびヒトIgG4の染色は、フローサイトメトリー(左)によって評価した。前処理された血液の10マイクロリットルをニボルマブの連続希釈で15分間処理し、プロトコルのステップ1.4〜1.10が完了した。完全結合(CB)(赤)、部分結合(PB)(青)、および結合の喪失(LB)(緑)は、示されたゲートによって定義される。(B) CD8 T細胞に結合するPD-1-ブロッキング抗体の状態を、ニボルマブおよびペンブロリズマブを中止したNSCLC患者において、示されるように、フォローアップ時点で分析した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| Pe | BV421 | PE-サイ7 | APC-サイ7 | BV510 | |
| バインディング評価 | イググ4 | CD3 | PD-1 | CD4 | CD8 |
| アイソタイプコントロール | アイソタイプコントロール | CD3 | アイソタイプコントロール | CD4 | CD8 |
表1:フローサイトメトリクス分析に用いられる抗体
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Discussion
本稿では、フローサイトメーターを用いて、ニボルマブ検出10用に開発した末梢血の滴下に由来するT細胞に結合したPD-1遮断抗体を検出する方法を報告する。この手法は非常に簡単で実行しやすいが、正確な結果を得るためには、2つの重要な点に留意すべきである。一つは、PD-1分子を検出するために、ニボルマブおよびペンブロリズマブと競合する適切な抗体を使用すべきである。この問題は、以前の研究11で評価されました。もう一つは、RBCのリシスは、表面染色前に十分に行われるべきである。IgG4陽性クラスターのゲートを決定するために各アッセイにアイソタイプ制御が確立されている限り、周波数は影響を受けません。しかし、このプロトコルでは、RBCリシスが不十分な場合には、リンパ球門におけるT細胞数と各表面マーカーの強度の両方の減少が生じる可能性がある。また、RBCのライシス工程は表面染色前に行わなければならず、それ以外の場合は抗IgG4抗体(HP6025)が正常に機能しない。
この方法の制限は、PD-1-ブロッキング抗体に結合したT細胞の集団が、治療効果およびirAEを担う特定のT細胞クローンを含むということである。しかし、抗体結合集団の中でこれらの特異的クローンの頻度は非常に低い。したがって、特定のマーカー (例えば CD3912など) を使用して特定のターゲットを強化する必要があります。別の制限は、IgG4の蛍光強度が高くない場合もあるため、結合状態(すなわちPBおよびLB)を決定することが困難である。
他の研究は、薬物動態を評価するために血液中の治療PD-1抗体を監視している。ニボルマブまたはペンブロリズマブの血漿濃度を測定することは、血液中のこれらの抗体の残留量が時間とどのように相関するかを決定するために不可欠である。しかし、ニボルマブの濃度はT細胞10への残留結合と完全に相関していないことを以前に報告した。血漿中抗体濃度13の測定と比較して、我々の方法は、T細胞に対する抗−PD−1抗体の残留結合を評価するためにより適切であり得る。蛍光標識ニボルマブ8によるインキュベーションが必要な血液中のニボルマブへのニボルマブ結合をモニタリングする元の方法。このアプローチを簡素化し、分析に必要なアッセイ時間と血液量を大幅に削減することに成功しました。
凍結細胞は、このアッセイを用いて分析することもできるが、この方法は多施設研究に適していることを示唆している。このアプローチの有用性は、PD-1遮断抗体10に結合したT細胞のKi-67のような他の免疫マーカーとの結合状態のモニタリングを組み合わせることによってさらに強化されるであろう。今後の研究では、この方法を単一細胞RNAシーケンシングおよびT細胞受容体シーケンシングと組み合わせて使用し、PD-1遮断抗体に結合し、irAEの原因となるT細胞の特定のサブセットを同定し、特徴付ける必要があります。
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Disclosures
著者たちは開示するものは何もない。
Acknowledgments
日本学術振興会(日本医学会KAKENHI)、日本医療研究開発機構(JP18cm0106335、19cm0106310)のS.K.への助成金による支援を行いました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X RBC Lysis Buffer (Multi-species) | Thermo Fisher Scientific | 00-4300-54 | 50 mL |
| APC/Cyanine7 anti-human CD4 Antibody | BioLegend | 300518 | Clone RPA-T4 |
| BD FACS Canto II Flow Cytometer | BD | ||
| Brilliant Violet 510 anti-human CD8a Antibody | BioLegend | 301048 | Clone RPA-T8 |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | nacalai tesque | 14249-95 | 500 mL |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes | STEMCELL Technologies | 352058 | 5 mL |
| FcR Blocking Reagent, human | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | 2 mL |
| FLOWJO | BD | ||
| Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 12676029 | 500 mL |
| Mouse IgG1 monoclonal - Isotype control | abcam | ab81200 | |
| Mouse monoclonal Anti-Human IgG4 Fc | abcam | ab99825 | Clone HP6025 |
| Pacific Blue Mouse Anti-Human CD3 | BD | 558117 | Clone UCHT1 |
| PE-Cy7 Mouse anti-Human CD279 (PD-1) | BD | 561272 | Clone EH12.1 |
| PE-Cy7 Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD | 557646 |
References
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