Summary
Мы разработали простой анализ цитометрии потока для оценки связывания PD-1-блокирующих антител к Т-клеткам, требуя только капли периферической крови от онкологических больных.
Abstract
Ингибиторы иммунных контрольных точек, в том числе PD-1-блокирующие антитела, значительно улучшили результаты лечения при различных видах рака. Фармакологическая эффективность этих иммунотерапевтических препаратов является длительной, простирающейся даже после прекращения их инъекций, из-за постоянной концентрации крови. Здесь мы разработали простой анализ цитометрии потока для оценки Т-клеточного связывающего статуса PD-1-блокирующих антител ниволумаба и пембролизумаба. Как тест глюкозы, этот анализ требует только одну каплю периферической крови. Визуализация связывания антител на Т-клетках надежнее, чем измерение концентраций в крови антител. Кроме того, при необходимости, мы можем потенциально проанализировать многие отличительные иммунных маркеров на Т-клеток, связанных с PD-1-блокирующих антител. Таким образом, это простая и минимально инвазивная стратегия для анализа фармакологического эффекта PD-1-блокирование антител у онкологических больных.
Introduction
PD-1-блокирующие антитела стали стандартным выбором для лечения различных видов рака, в том числе немелкоклеточного рака легких (NSCLC)1,2,3,4. Они показывают замечательный терапевтический эффект в подмножестве больных раком, которые не ответили на обычные цитотоксические химиотерапии. Тем не менее, ингибиторы иммунной контрольной точки (ИКИ), которые включают PD-1-блокирующие антитела, может вызвать уникальный и четкий спектр побочных явлений, называемых иммунных побочных явлений (irAEs)5. Хотя irAEs может повлиять почти на все ткани, они чаще всего наблюдаются в желудочно-кишечном тракте, эндокринных желез, кожи и печени, и они могут вызвать зуд, сыпь, тошнота, диарея, и расстройства щитовидной железы6,7. В целом, большинство irAEs появляются в течение 1 до 2 месяцев после начала ИКИ. Однако в некоторых случаях они могут возникнуть позднее, чем через 1 год после начала лечения или даже после прекращения лечения6,7. Они также вызывают различные симптомы, которые могут быть трудно дискриминировать от других патологий. Таким образом, это может быть сложной задачей для оперативной диагностики irAEs и лечить их надлежащим образом. irAEs может повлиять на все ткани, и их начало сильно зависит от циркулирующих иммунных клеток, особенно Т-клеток, связанных с PD-1-блокирующих антител. Таким образом, простой и минимально инвазивный метод для мониторинга антител целевых Т-клеток имеет важное значение в клинических условиях.
Здесь мы разработали простой метод оценки связывания PD-1-блокирующих антител к Т-клеткам с помощью капли периферической цельной крови от онкологических больных, которые получали ниволумаб или пембролизумаб. Используя этот подход, мы смогли контролировать каждый из следующих: 1) продолжительность связывания антител к Т-клеткам, 2) заполняемость т-клеток PD-1 молекул терапевтических антител, и 3) состояние активации и иммунологические особенности Т-клеток. Этот метод является модификацией ранее сообщалось техники8. Количество крови требуется почти так же, как и необходимо для теста глюкозы, и подход не требует моноядерного обогащения клеток или со-культивирования с PD-1-блокирующих антител. Мы подтвердили, что этот метод также может быть выполнен с использованием замороженных образцов, в том числе периферических моноядерных клеток крови (PBMCs) и клеток из плеврального выпота, перикардиального выпота, бронхоальвеолярной жидкости для лаважа и спинномозговой жидкости, предполагая, что эта стратегия может быть полезна в контексте многоцентрового исследования. Этот метод может облегчить раннюю диагностику irAEs, а также помочь определить соответствующие иммуносупрессивные методы лечения для контроля их симптомов и определить оптимальное время для начала последующей терапии после ингибиторов PD-1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Выборка проводилась во время обычных клинических процедур. Все образцы человека были получены после получения информированного согласия субъектами в соответствии с Хельсинкской декларацией и с одобрения совета по этике Высшей школы медицины, Университета Осаки, Япония (15383 и 752).
1. Подготовка образца крови и окрашивание
- Сбор образцов всей крови в трубки для сбора крови, содержащие этилен диамин тетра-ацетической кислоты (ЭДТА).
ПРИМЕЧАНИЕ: Сбор крови может быть выполнен с помощью обычной иглы или крови ланцет. - Передача 20 Зл образцов цельной крови в 5 мл круглого дна полистирола потока цитометрии труб.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для уменьшения неспецифической связывания клеток к трубам, 1 мл 2% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS) в фосфат буферном сольнике (PBS) добавляется в трубки и вихрей в течение 10 с до нанесения на образцы. - Добавьте 20 зл 2% FBS в PBS.
- Добавьте 10 злителк реагента для блокирования fcR для конкретных людей. Хорошо перемешать и инкубировать в течение 15 минут при комнатной температуре.
- Добавьте 500 л буфера лиза из красных кровяных телец. Хорошо перемешайте и инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре.
- Добавьте 4 мл 2% FBS в PBS и вращайте вниз клетки при 400 х г (1500 об/мин) в течение 5 минут при 4 градусах Цельсия. Удалите супернатант по аспирации.
- Повторите процесс мытья и аспирации, описанный в шаге 1.6.
- Повторно приостановить клетки в 100 Л л 2% FBS в PBS и разделить на две трубки по 50 л каждый.
- Добавить поверхностный маркер антител(Таблица 1). Хорошо перемешайте и инкубировать в течение 20 минут при комнатной температуре в темноте.
ПРИМЕЧАНИЕ: При профилировании иммунного статуса Т-клеток, количество маркеров может быть увеличено на основе качества цитометрии цитометрии потока. - Вымойте образцы 2x, как описано в шаге 1.6.
- Повторное отемки клеток в 200 л 2% FBS в PBS.
2. Циклометрический анализ потока
- Вставьте трубки в цитометр потока и приобретете клетки, в основном следуя рекомендуемому протоколу9.
- Запись 10000 событий, как лимфоцитов ворота (Рисунок 1А) и данные о потоке экспорта, как файлы .fcs для анализа.
- Откройте файлы в программном обеспечении для анализа. Визуализация клеток на переднем рассеянии (FSC) (A) против бокового рассеяния (SSC) (A) участка и лимфоцитов ворот(рисунок 1A).
- После выбора одиночных ячеек с использованием FSC (H) против FSC (W) и SSC (W)(рисунок 1B)и отображения их на CD3 против CD8 или CD3 против cd4 сюжета, ворота CD8 T-клеток и CD4 T-клеток, соответственно(рисунок 1C).
- После выбора закрытых ячеек и отображения их на PD-1 против человека IgG4 участок, определить PD-1-блокирование антител связаны CD8 и CD4 Т-клетки на основе контроля изотипа(Рисунок 1D).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Стратегия gating и анализ цитометрии потока(Рисунок 1) может обнаружить PD-1-блокирующий связывание антител к Т-клеткам, полученным от капли периферической крови пациента NSCLC. Перед PD-1-блокирующий антитела вводят, нет человека IgG4-положительных CD8 или CD4 Т-клетки присутствуют, и PD-1 выражение может быть подтверждено PD-1-обнаружение антитела (EH12.1) (Рисунок 2A). После введения ниволумаба или пембролизумаба, IgG4 (ниволумаб, пембролизумаб) может быть обнаружен на Т-клетках анти-IgG4 антитела (HP6025) в то время как PD-1-обнаружение антитела EH12.1 не распознает каких-либо PD-1 на Т-клеток, потому что терапевтические PD-1 антитела нарушают EH12.1. Это означает, что мы косвенно измерения терапевтического связывания PD-1-блокирующий антитела на основе отсутствия связывания PD-1-обнаружение антитела. Данные представителя показывают различные обязательные статусы PD-1-блокирующего антитела(рисунок 2A). Nivolumab и pembrolizumab связывания и заполняемости PD-1 на Т-клеток уменьшается с течением времени10, и есть частичная связывание (PB), который показан в двойной положительной области, и, наконец, полная потеря связывания (LB) (Рисунок 2B).
Рисунок 1: Представитель gating стратегии для оценки PD-1-блокирование антител связывания Т-клеток от капли периферической крови. (A)FSC (A) против SSC (A) сюжет и gating лимфоцитов. (B) Даблты исключаются путем рисования ворот вокруг основной популяции клеток на участках FSC (H) против FSC (W) и SSC (H) против SSC (W). (C) CD3 против CD8 сюжет (верхний) и CD3 против CD4 сюжет (нижний) и gating CD8 Т-клеток и CD4 Т-клеток, соответственно. (D) PD-1 против человека IgG4 сюжет и обнаружение связывания ниволумаб (PD-1-блокирующие антитела) на CD8 и CD4 Т-клеток. Оранжевые точки и черные точки указывают на анти-IgG4 антитела и изотип управления окрашивания, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Представитель ный анализ цитометрии потока, указывающий на изменение связывающего статуса антител PD-1. (A) Окрашивание PD-1 и человека IgG4 в CD8 Т-клеток из ICI-предварительно обработанной крови пациента была оценена цитометрии потока (слева). Десять микролитров предварительно обработанной крови лечили серийным разбавлением ниволумаба в течение 15 мин, и шаги от 1,4 до 1,10 протокола были выполнены. Полное связывание (CB) (красный), частичная привязка (PB) (синий) и потеря связывания (LB) (зеленый) определяются указанными воротами. (B) Состояние PD-1-блокирующий связывания антител cd8 Т был проанализирован в последующие точки времени, как указано, в NSCLC пациентов, которые прекратили ниволумаб и пембролизумаб. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Pe | BV421 | PE-Cy7 | APC-Cy7 | BV510 | |
| Обязательная оценка | IgG4 | CD3 | PD-1 | CD4 | CD8 |
| Контроль изотипа | Контроль изотипа | CD3 | Контроль изотипа | CD4 | CD8 |
Таблица 1: Антитела, используемые в цитометрическом анализе потока.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой статье мы сообщаем метод с помощью цитометра потока для обнаружения PD-1-блокирующих антител, связанных с Т-клетками, полученными из капли периферической крови, которую мы первоначально разработали для обнаружения ниволумаба10. Хотя этот метод очень прост и прост в выполнении, следует отметить два важных момента для получения точных результатов. Один из них заключается в том, что для обнаружения молекул PD-1 следует использовать соответствующее антитело, которое конкурирует с ниволумабом и пембролизумабом. Этот вопрос был оценен в предыдущем исследовании11. Другой заключается в том, что лиза РБК должна быть выполнена тщательно перед окрашиванием поверхности. До тех пор, пока для каждого ассса устанавливается контроль изоттипа для определения врат кластера IgG4, частота не влияет. Однако при таком протоколе, когда лисис РБК недостаточен, в лимфоцитах могут быть уменьшены как количество Т-клеток, так и интенсивность каждого поверхностного маркера. Кроме того, шаг лиза РБК должен быть выполнен до окрашивания поверхности, в противном случае анти-IgG4 антитела (HP6025) не функционирует должным образом.
Ограничение этого метода заключается в том, что популяция Т-клеток, связанных с PD-1-блокирующими антителами, включает специфические клоны Т-клеток, отвечающие за терапевтическое воздействие и irAEs; однако частоты этих специфических клонов среди популяции, связанной с антителами, довольно низки. Таким образом, нам все еще нужно обогатить конкретную цель с помощью определенных маркеров, например CD3912. Другим ограничением является то, что интенсивность флуоресценции IgG4 не является высокой в некоторых случаях, что затрудняет определение связывающего статуса (т.е. ПБ и LB).
Другие исследования отслеживали терапевтические антитела PD-1 в крови для оценки фармакокинетики. Измерение концентрации плазмы ниволумаба или пембролизумаба имеет важное значение для определения того, как остаточное количество этих антител в крови коррелирует со временем. Однако мы ранее сообщали, что концентрация ниволумаба не полностью коррелирует с остаточным связыванием с Т-клетками10. По сравнению с измерением концентрации плазменных антител13,наш метод может быть более подходящим для оценки остаточного связывания анти-PD-1 антител к Т-клеткам. Оригинальный метод мониторинга ниволумаба, связывающегося с Т-клетками в крови, требовал инкубации с флуоресценцией с маркировкой ниволумаб8. Мы упростили этот подход и добились существенного сокращения времени анализа и количества крови, необходимого для анализа.
Замороженные клетки также могут быть проанализированы с помощью этого анализа, предполагая, что этот метод хорошо подходит для многоцентровых исследований. Полезность этого подхода будет еще больше повышена за счет объединения мониторинга связывающего статуса с другими иммунологическими маркерами, такими как Ki-67, Т-клеток, привязанных к PD-1-блокирующим антителам10. Будущие исследования должны использовать наш метод в сочетании с одноклеточной РНК секвенирования и Т-клеточных рецепторов секвенирования, чтобы попытаться определить и охарактеризовать конкретные подмножества Т-клеток, которые связаны с PD-1-блокирующих антител и несут ответственность за irAEs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами С.К. от Японского общества содействия науке KAKENHI (JP17K16045) и Японского агентства медицинских исследований и разработок (JP18cm0106335 и 19cm0106310).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X RBC Lysis Buffer (Multi-species) | Thermo Fisher Scientific | 00-4300-54 | 50 mL |
| APC/Cyanine7 anti-human CD4 Antibody | BioLegend | 300518 | Clone RPA-T4 |
| BD FACS Canto II Flow Cytometer | BD | ||
| Brilliant Violet 510 anti-human CD8a Antibody | BioLegend | 301048 | Clone RPA-T8 |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | nacalai tesque | 14249-95 | 500 mL |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes | STEMCELL Technologies | 352058 | 5 mL |
| FcR Blocking Reagent, human | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | 2 mL |
| FLOWJO | BD | ||
| Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 12676029 | 500 mL |
| Mouse IgG1 monoclonal - Isotype control | abcam | ab81200 | |
| Mouse monoclonal Anti-Human IgG4 Fc | abcam | ab99825 | Clone HP6025 |
| Pacific Blue Mouse Anti-Human CD3 | BD | 558117 | Clone UCHT1 |
| PE-Cy7 Mouse anti-Human CD279 (PD-1) | BD | 561272 | Clone EH12.1 |
| PE-Cy7 Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD | 557646 |
References
- Gong, J., Chehrazi-Raffle, A., Reddi, S., Salgia, R. Development of PD-1 and PD-L1 inhibitors as a form of cancer immunotherapy: a comprehensive review of registration trials and future considerations. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 6 (1), 8 (2018).
- Borghaei, H., et al. Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Nonsquamous Non-Small-Cell Lung Cancer. The New England Journal of Medicine. 373 (17), 1627-1639 (2015).
- Brahmer, J., et al. Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Squamous-Cell Non-Small-Cell Lung Cancer. The New England Journal of Medicine. 373 (2), 123-135 (2015).
- Herbst, R. S., et al. Pembrolizumab versus docetaxel for previously treated, PD-L1-positive, advanced non-small-cell lung cancer (KEYNOTE-010): a randomised controlled trial. The Lancet. 387 (10027), 1540-1550 (2016).
- Postow, M. A., Sidlow, R., Hellmann, M. D. Immune-Related Adverse Events Associated with Immune Checkpoint Blockade. The New England Journal of Medicine. 378 (2), 158-168 (2018).
- Weber, J. S., et al. Safety Profile of Nivolumab Monotherapy: A Pooled Analysis of Patients With Advanced Melanoma. Journal of Clinical Oncology. 35 (7), 785-792 (2017).
- Champiat, S., et al. Management of immune checkpoint blockade dysimmune toxicities: a collaborative position paper. Annals of Oncology. 27 (4), 559-574 (2016).
- Brahmer, J. R., et al. Phase I study of single-agent anti-programmed death-1 (MDX-1106) in refractory solid tumors: safety, clinical activity, pharmacodynamics, and immunologic correlates. Journal of Clinical Oncology. 28 (19), 3167-3175 (2010).
- Bommareddy, P. K., Lowe, D. B., Kaufman, H. L., Rabkin, S. D., Saha, D. Multi-parametric flow cytometry staining procedure for analyzing tumor-infiltrating immune cells following oncolytic herpes simplex virus immunotherapy in intracranial glioblastoma. Journal of Biological Methods. 6 (2), 112 (2019).
- Osa, A., et al. Clinical implications of monitoring nivolumab immunokinetics in non-small cell lung cancer patients. JCI Insight. 3 (19), 59125 (2018).
- Zelba, H., et al. Accurate quantification of T-cells expressing PD-1 in patients on anti-PD-1 immunotherapy. Cancer Immunology, Immunotherapy. 67 (12), 1845-1851 (2018).
- Simoni, Y., et al. Bystander CD8(+) T cells are abundant and phenotypically distinct in human tumour infiltrates. Nature. 557 (7706), 575-579 (2018).
- Chiu, H. H., et al. Development of a general method for quantifying IgG-based therapeutic monoclonal antibodies in human plasma using protein G purification coupled with a two internal standard calibration strategy using LC-MS/MS. Analytica Chimica Acta. 1019, 93-102 (2018).
