Summary
يصف هذا البروتوكول تقييمًا شاملًا للتوافق المنقم لأجهزة ملامسة الدم باستخدام غرسات الأعصاب الوعائية المقطوعة بالليزر. يتم تطبيق نموذج حلقة التدفق مع الدم البشري الطازج ة المندفعة لمحاكاة تدفق الدم. بعد التروية ، يتم تحليل مختلف علامات الدم ومقارنتها بالقيم المكتسبة مباشرة بعد جمع الدم لتقييم توافق الخلايا الدموية للأجهزة المختبرة.
Abstract
يتطلب الاستخدام المتزايد للأجهزة الطبية (مثل الطعوم الوعائية والدعامات والقسطرة القلبية) لأغراض مؤقتة أو دائمة تبقى في الدورة الدموية في الجسم اتباع نهج موثوق به ومتعدد البارامترية الذي يقيم المضاعفات الدموية المحتملة التي تسببها هذه الأجهزة (أي تنشيط وتدمير مكونات الدم). اختبار شامل في المختبر الانحلال يلامس الدم يزرع هو الخطوة الأولى نحو النجاح في تنفيذ vivo. ولذلك، فإن التحليل الشامل وفقا للمنظمة الدولية للتوحيد القياسي 10993-4 (ISO 10993-4) إلزامي قبل التطبيق السريري. تصف حلقة التدفق المقدمة نموذجًا حساسًا لتحليل الأداء المنخر للدعامات (في هذه الحالة ، الأعصاب الوعائية) وتكشف عن الآثار الضارة. استخدام الدم البشري الطازج الكامل وأخذ عينات الدم لطيف ضرورية لتجنب PREACTIVATION من الدم. يتم غرس الدم من خلال أنابيب مُهَمَلة تحتوي على عينة الاختبار باستخدام مضخة معتمية بمعدل 150 مل/دقيقة عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. قبل وبعد التروية ، وعلامات الدم (أي ، عدد خلايا الدم, الهيموغلوبين, الهيماتوكريت, وعلامات البلازما) تشير إلى تنشيط الكريات البيض (متعدد الأشكال النووية [PMN]-elastase), الصفائح الدموية (α-تجلطة الجلجلوبولين [α-TG]), يتم تحليل نظام التخثر (thombin-antithrombin III [TAT]), وسلسلة مكملة (SC5b-9). في الختام، نقدم نموذجًا أساسيًا وموثوقًا به لاختبار توافق الإنتماؤس الواسع النطاق للدعامات وغيرها من أجهزة ملامسة الدم قبل التطبيق السريري.
Introduction
يتطلب تطبيق الغرسات والمواد الحيوية في الجسم الحي ، والتي تتفاعل مع دم الإنسان ، إجراء اختبارات مكثفة قبل السريرية مع التركيز على التحقيق في علامات مختلفة من نظام الهيموستاتيكي. تحدد المنظمة الدولية للتوحيد القياسي 10993-4 (ISO 10993-4) المبادئ المركزية لتقييم أجهزة الاتصال بالدم (أي الدعامات والطعوم الوعائية) وتنظر في تصميم الجهاز والمنفعة السريرية والمواد اللازمة1.
الدم البشري هو السائل الذي يحتوي على مختلف بروتينات البلازما والخلايا، بما في ذلك الكريات البيض (خلايا الدم البيضاء [WBCs])، كريات الدم الحمراء (خلايا الدم الحمراء [RBCs])، والصفائح الدموية، والتي تقوم بمهام معقدة في جسم الإنسان2. يمكن أن يسبب الاتصال المباشر للمواد الأجنبية بالدم آثارًا ضارة ، مثل تنشيط الجهاز المناعي أو التخثر ، مما قد يؤدي إلى التهاب أو مضاعفات تجلط ومشكلات خطيرة بعد الزرع3و4و5. لذلك، في المختبر الانيتمية القابلة للتحقق يوفر فرصة قبل زرع للكشف عن واستبعاد أي مضاعفات الدم التي يمكن أن تحدث عند اتصال الدم مع سطح أجنبي6.
تم إنشاء نموذج حلقة التدفق المقدم لتقييم توافق الدعامات العصبية الوعائية والأجهزة المماثلة من خلال تطبيق معدل تدفق 150 مل / دقيقة في الأنابيب (قطرها 3.2 مم) لمحاكاة ظروف التدفق الدماغي وأقطار الشرايين2،7. إلى جانب الحاجة إلى نموذج مثالي في المختبر ، فإن مصدر الدم هو عامل مهم في الحصول على نتائج موثوقة وغير متغيرة عند تحليل توافق الدم في المادة الحيوية8. يجب استخدام الدم الذي تم جمعه مباشرة بعد أخذ العينات لمنع التغيرات الناجمة عن التخزين لفترات طويلة. بشكل عام ، يجب إجراء مجموعة لطيفة من الدم دون توقف باستخدام إبرة 21 G لتقليل التنشيط المسبق للصفائح الدموية وسلسلة التخثر أثناء رسم الدم. وعلاوة على ذلك، تشمل معايير استبعاد المانحين المدخنين، أو الحوامل، أو الذين هم في حالة صحية سيئة، أو تناولوا وسائل منع الحمل الفموية أو مسكنات الألم خلال الأيام الأربعة عشر السابقة.
تصف هذه الدراسة نموذج المختبر لاختبار توافق الأنسجة واسعة النطاق من يزرع الدعامات تحت ظروف التدفق. عند مقارنة غير المصقول إلى الدعامات الفيبرين-الهيبارين المغلفة، نتائج اختبارات توافق الهيموالتوافق الشامل تعكس تحسين توافق الهيموالتوافق من الدعامات المغلفة الفيبرين-الهيبارين9. في المقابل ، تحفز الدعامات غير المغلفة تنشيط سلسلة التخثر ، كما يتضح من زيادة تركيزات thombin-antithrombin III (TAT) وفقدان أعداد الصفائح الدموية بسبب التصاق الصفائح الدموية بسطح الدعامة. بشكل عام ، يوصى بدمج نموذج التوافق المناهي هذا كاختبار قبل السريري للكشف عن أي آثار ضارة على النظام الانموستاتيكي التي يسببها الجهاز.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على إجراء أخذ عينات الدم من قبل لجنة الأخلاقيات في كلية الطب في جامعة توبينغن (رمز تحديد المشروع: 270/2010BO1). وقدمت جميع المواضيع موافقة خطية ومستنيرة على الإدراج قبل المشاركة.
1. إعداد الهيبارين محملة مونوفيت
- اخلط الهيبارين غير المخفف (5000 وحدة دولية/مل) مع كلوريد الصوديوم (NaCl، 0.9%) حل وإعداد حل مع تركيز الناتج من 15 وحدة دولية / مل من الهيبارين.
- أضف 900 ميكرولتر من محلول الهيبارين المخفف إلى كل مونوفيت محايدة (9 مل) للحصول على تركيز الهيبارين النهائي من 1.5 وحدة دولية / مل بعد أخذ عينات الدم. إعداد ثلاث مونوفيت لكل متبرع بالإضافة إلى ثلاث مونوفيت احتياطي وتخزين مونوفيت محملة بالهيبارين عند 4 درجات مئوية حتى أخذ عينات الدم.
2. أخذ عينات الدم
- خذ الفيت الأحادية المحملة بالهيبارين من الثلاجة 30 دقيقة قبل أخذ عينات الدم.
- جمع عينة دم 27 مل من كل متبرع صحي (n = 5) عن طريق ثقب فينيكلل لحلقة التدفق. فقط تطبيق tourniquet على نحو سلس لتجنب التنشيط المبكر للصفائح الدموية وتتالي تخثر الدم.
- جمع عينات الدم في ثلاث صناديق أحادية تحتوي على 900 ميكرولتر من محلول الهيبارين (1.5 وحدة دولية/مل) وتجميع جميع المونوفيت الثلاثة في حاوية بلاستيكية واحدة لضمان توزيع جميع المكونات بالتساوي.
- نقل الدم الهيبارينالي المجمع مباشرة إلى ثلاث فيتات أحادية مختلفة تحتوي إما على EDTA (1.2 مل) أو سيترات (1.4 مل) أو خليط من السيترات والثيوفيلين والأدينوسين وdipyridamole (CTAD، 2.7 مل) لجمع قيم خط الأساس. المضي قدما ً في العينات كما هو موضح في الأقسام 5-8.
ملاحظة: لضمان سلوك التخثر غير المتأثر، يجب على المتبرعين تجنب تناول الأدوية المؤثرة على الهيوسيتيس (على سبيل المثال، حمض الأسيتيل الساليسيليك، والنابروكسين، والكاربنيسيلين) خلال الأيام الـ 14 الماضية، وكذلك وسائل منع الحمل عن طريق الفم والتدخين.
3. إعداد حلقة التدفق
- قطع ثلاثة أنابيب كلوريد البولي فينيل المغلفة بالهيبارين بطول 75 سم وقطر داخلي 3.2 مم. تحميل الأنابيب مع يزرع الليزر العصبية مع أو بدون طلاء الفيبرين والهيبارين. تذكر أن تترك حوض واحد تفريغها كعنصر تحكم.
- ضع أحد طرفي الأنبوب في خزان مملوء بنسبة 0.9٪ من الـ NaCl، وقم بتوصيل الأنابيب برأس المضخة، وأدخل الطرف الآخر في أسطوانة قياس.
- ضبط إعدادات المضخة المعتمة لتحقيق معدل تدفق 150 مل / دقيقة باستخدام جهاز ضبط الوقت أثناء التحقق من مستوى التعبئة في اسطوانة القياس.
4. أداء اختبار توافق الهيمو
- استخدم حقنة 12 مل لملء الأنابيب بالدم. اسمحوا 6 مل من تدفق الدم بسلاسة في كل أنبوب يحتوي على عينة أو تفريغ ها.
- تشكيل دائرة وإغلاق الأنابيب بإحكام باستخدام طول 0.5 سم من أنابيب اتصال السيليكون. ضع الأنابيب في حمام مائي 37 درجة مئوية وابدأ التروية لمدة 60 دقيقة.
5. تحليل تعداد الدم كله
- وضع 1.2 مل من الدم بعد أخذ العينات (خط الأساس) أو بعد التروية في مونوفيت تحتوي على EDTA وعكس بعناية أنبوب 5x.
- أدخل المونوفيت في محلل الدم وأجرى تحليل ًا لعدد الدم لكل عينة. ثم، احتضان المونوفيت على الجليد لمدة 15-60 دقيقة بعد قياس عدد الدم لمزيد من التحليل، كما هو موضح في القسم 7.
6. مجموعة من البلازما السيرات
- ملء مونوفيت التي تحتوي على السيلتات مع 1.4 مل من الدم (رسمها حديثا أو بعد الدورة الدموية) وعكس بعناية 5x.
- الطرد المركزي الأنابيب لمدة 18 دقيقة في 1800 × ز في درجة حرارة الغرفة (RT). Aliquot ثلاث عينات 250 ميكرولتر من كسر البلازما في أنابيب التفاعل 1.5 مل وتجميد عينات البلازما في النيتروجين السائل. تخزينها في -20 درجة مئوية حتى التحليل.
7. مجموعة من البلازما EDTA
- احتضان المونوفيت على الجليد لمدة 15-60 دقيقة بعد قياس عدد الدم. ثم، الطرد المركزي الأنابيب لمدة 20 دقيقة في 2500 × ز و 4 درجة مئوية.
- Aliquot ثلاث عينات 250 ميكرولتر من كسر البلازما في أنابيب التفاعل 1.5 مل بعد الطرد المركزي وتجميد الأنابيب في النيتروجين السائل. تخزينها في -80 درجة مئوية حتى التحليل.
8. مجموعة من البلازما CTAD
- ملء مونوفيت التي تحتوي على خليط CTAD مع 2.7 مل من الدم (المسحوبة حديثا أو بعد الحضانة) وعكس بعناية 5x. بعد ذلك، احتضان الفيتفيدات الأحادية على الجليد لمدة 15−60 دقيقة. ثم، الطرد المركزي الأنابيب لمدة 20 دقيقة في 2500 × ز و 4 درجة مئوية.
- نقل 700 ميكرولتر من كسر البلازما الأوسط إلى أنبوب تفاعل 1.5 مل والطرد المركزي أنابيب التفاعل المملوءة لمدة 20 دقيقة عند 2500 × ز و 4 درجات مئوية.
- Aliquot اثنين من 100 ميكرولتر عينات من الكسر الأوسط في 1.5 مل أنابيب التفاعل بعد الطرد المركزي وتجميد الأنابيب في النيتروجين السائل. تخزينها في -20 درجة مئوية حتى التحليل.
ملاحظة: يمكن إجراء مجموعة من البلازما EDTA والبلازما CTAD معا لأن ظروف التشغيل هي نفسها.
9. قياس TAT الإنسان من البلازما السيتور
- إذابة البلازما السيلتر في حمام مائي من 37 درجة مئوية.
- استخدم مجموعة أدوات الفحص المناعي (ELISA) المرتبطة بإنزيم TAT وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. إعادة بناء معايير البلازما والسيطرة عليها ويخفف من محلول الغسيل، المضادة للانسان-TAT بيروكسيديز (POD)-الأجسام المضادة المترافقة، ومحلول الكروموجين. اترك جميع الكواشف ولوحة الميكروبات في RT (15-25 درجة مئوية) لمدة 30 دقيقة قبل بدء الاختبار.
- Pipet 50 μL من المخزن المؤقت عينة في كل بئر من لوحة microtiter وإضافة 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت العينة (فارغة)، معيار البلازما، والسيطرة البلازما، وعينة البلازما غير مخففة في التكرارات إلى لوحة جيدة. ختم لوحة واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة مع اهتزاز لطيف. ثم، غسل لوحة 3x مع 300 ميكرولتر من محلول الغسيل.
- أضف 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة المضادة المضادة للإنسان-TAT إلى كل بئر. ختم لوحة واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة مع اهتزاز لطيف. ثم، غسل لوحة 3x مع 300 ميكرولتر من محلول الغسيل.
- أضف 100 ميكرولتر من محلول الكروموجين الطازج إلى كل بئر. ختم لوحة واحتضان في RT لمدة 30 دقيقة.
- إزالة فيلم الختم وإضافة 100 ميكرولتر من حل وقف لكل بئر. اقرأ الكثافة البصرية (OD) مع مقياس ضوئي عند 490−500 نانومتر. تناسب بيانات منحنى القياسية كخط الاتجاه وحساب تركيز العينات.
10. قياس PMN-elastase من البلازما السيرات
- إذابة البلازما السيلتر في حمام مائي عند 37 درجة مئوية.
- استخدام متعدد الأشكال النووية (PMN)-elastase ELISA عدة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة: إعادة بناء التحكم PMN-elastase ومعيار PMN-elastase لإعداد منحنى قياسي باستخدام العازلة تخفيف عدة.
- تمييع محلول الغسيل وفقًا لوصف الشركة المصنعة. اترك جميع الكواشف ولوحة الميكروبات في RT لمدة 30 دقيقة قبل بدء الاختبار. تمييع عينات البلازما الـ"سيرات" إلى 1:100 مع العازلة المخففة.
- أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للعينة (فارغ)، والمنحنى القياسي PMN-elastase (15.6-1000 نانوغرام/مل)، وضوابط PMN-elastase (تركيزات عالية ومنخفضة)، وعينات البلازما المخففة في التكرارات إلى لوحة البئر. ختم لوحة واحتضان في RT لمدة 60 دقيقة مع اهتزاز لطيف. بعد ذلك، اغسل يلوحة 4x مع 300 ميكرولتر من محلول الغسيل.
- أضف 150 ميكرولتر من الأجسام المضادة المترافقة بالإنزيم إلى كل بئر. ختم لوحة واحتضان في RT لمدة 60 دقيقة مع اهتزاز لطيف. بعد ذلك، اغسل يلوحة 4x مع 300 ميكرولتر من محلول الغسيل.
- إضافة 200 ميكرولتر من 3,3', 5,5'-tetramethylbenzidin (TMB)-الركيزة الحل لكل بئر. ختم لوحة واحتضان في RT لمدة 20 دقيقة في الظلام. ثم قم بإزالة فيلم الختم وإضافة 50 ميكرولتر من محلول الإيقاف إلى كل بئر.
- قراءة OD مع photometer في 450 نانومتر مع قراءة مرجعية في 630 نانومتر. تناسب بيانات منحنى القياسية كخط الاتجاه وحساب تركيز العينات.
11. قياس مجمع تكملة المحطة الطرفية (TCC) من البلازما EDTA
- قم بإذابة بلازما EDTA في حمام مائي عند درجة حرارة 37 درجة مئوية، وتخزينها على الجليد بعد إذابة الجليد.
- استخدام مجموعة السلسلة التعاقبية Supplement SC5b-9 ELISA وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة: تمييع محلول الغسيل كما هو موضح في بروتوكول الشركة المصنعة. اترك جميع الكواشف ولوحة الميكروبات في RT لمدة 30 دقيقة قبل بدء الاختبار. تمييع عينات البلازما EDTA إلى 1:10 مع المخزن المؤقت للتخفيف في المجموعة.
- إضافة 300 ميكرولتر من محلول الغسيل إلى كل بئر لإعادة ترطيب السطح وتذوق بعد 2 دقيقة. أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للعينة (فارغ) ، معايير SC5b-9 ، عناصر التحكم SC5b-9 (تركيزات عالية ومنخفضة) ، وعينات البلازما المخففة في التكرارات إلى لوحة البئر.
- ختم لوحة واحتضان في RT لمدة 60 دقيقة. بعد ذلك، اغسل اللوحة 5x مع 300 ميكرولتر من محلول الغسيل.
- أضف 50 ميكرولتر من الأجسام المضادة المترافقة بالإنزيم إلى كل بئر. ختم لوحة واحتضان في RT لمدة 30 دقيقة. ثم، غسل لوحة 5x مع 300 ميكرولتر من محلول الغسيل.
- أضف 100 ميكرولتر من محلول الركيزة TMB إلى كل بئر. ختم لوحة واحتضان في RT لمدة 15 دقيقة في الظلام.
- إزالة فيلم الختم وإضافة 100 ميكرولتر من حل التوقف إلى كل بئر. قراءة OD مع مقياس ضوئي في 450 نانومتر. تناسب بيانات منحنى القياسية كخط الاتجاه وحساب تركيز العينات.
12. قياس α-thromboglobulin من البلازما CTAD
- إذابة البلازما CTAD في حمام مائي في 37 درجة مئوية.
- استخدام مجموعة Α-thromboglobulin (α-TG) ELISA وفقا لتعليمات الشركة المصنعة: إعادة بناء التحكم في α-TG ومعيار α-TG وتمييع محلول الغسيل باستخدام المقطر H2O. إعادة بناء الأجسام المضادة POD-مترافق باستخدام المخزن المؤقت الفوسفات المقدمة. اترك جميع الكواشف ولوحة الميكروبات في RT لمدة 30 دقيقة قبل بدء الاختبار.
- إعداد منحنى القياسية والتحكم وفقا لتعليمات الشركة المصنعة مع المخزن المؤقت الفوسفات المقدمة. تمييع عينات البلازما CTAD إلى 1:21.
- أضف 200 ميكرولتر من حاجز الفوسفات (فارغ)، ومعايير α-TG، وضوابط α-TG (تركيزات عالية ومنخفضة)، وعينات البلازما المخففة في التكرارات إلى لوحة البئر. ختم لوحة واحتضان في RT لمدة 60 دقيقة. بعد ذلك، وغسل لوحة 5x مع 300 ميكرولتر من محلول الغسيل.
- أضف 200 ميكرولتر من الأجسام المضادة المترافقة بالإنزيم إلى كل بئر. ختم لوحة واحتضان في RT لمدة 60 دقيقة. بعد ذلك، وغسل لوحة 5x مع 300 ميكرولتر من محلول الغسيل.
- أضف 200 ميكرولتر من محلول الركيزة TMB إلى كل بئر. ختم لوحة واحتضان في RT لمدة 5 دقيقة في الظلام. إزالة فيلم الختم ووقف رد الفعل عن طريق إضافة 50 ميكرولتر من 1 M حمض الكبريتيك (H2SO4)إلى كل بئر.
- اترك اللوحة لمدة 15-60 دقيقة، ثم اقرأ الـ OD مع مقياس ضوئي عند 450 نانومتر. تناسب بيانات منحنى القياسية كخط الاتجاه وحساب تركيز العينات.
13. إعداد عينة لمسح المجهر الإلكترون
- إزالة زرع من الأنبوب باستخدام ملقط وشطف الزرع لفترة وجيزة عن طريق غمس ه في 0.9٪ NaCl حل 3x.
- تخزين في محلول الجلوتارالدهيد (2٪ الجلوتارالدهيد في محلول مال يُحفظ بالفوسفات [PBS-buffer بدون Ca2+/Mg+ 2])بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية.
- بعد ذلك، احتضان يزرع في PBS-المخزن المؤقت لمدة 10 دقيقة. تجفيف العينات عن طريق احتضان في الإيثانول مع زيادة التركيز لمدة 10 دقيقة لكل منهما: 40٪، 50٪، 60٪، 70٪، 80٪، 90٪، 96٪، و 100٪. تخزين عينات المجففة في الإيثانول 100٪ حتى مزيد من التحليل.
- قم بتجفيف النقاط الحرجة وفقًا لتعليمات جهاز التجفيف أو الأدب10 قبل المسح المجهري الإلكتروني (SEM).
14. مسح المجهر الإلكترون
- إرفاق يزرع المجففة إلى حامل عينة لمجهر المسح الضوئي ولصق العينات مع البلاديوم الذهب.
- إدخال يزرع البرش في غرفة العينة. التقاط الصور في 100-، 500-، 1،000-و 2،500 أضعاف التكبير من المناطق مع سطح تمثيلي والتصاق الخلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ملخصا بإيجاز، تم جمع الدم البشري كله في مونوفيت محملة بالهيبارين ثم تم تجميعها واستخدامها لتقييم مستويات خط الأساس لعدد الخلايا، فضلا عن علامات التوافق الانحلالي البلازمي.
وفي وقت لاحق، تم ملء الأنابيب التي تحتوي على عينات زرع الأعصاب الوعائية، وتم تخثر الدم لمدة 60 دقيقة عند 150 مل/دقيقة و37 درجة مئوية باستخدام مضخة تمعية. مرة أخرى ، تم تحليل عدد الخلايا في جميع المجموعات ، وتم إعداد عينات البلازما لتحليل ELISA(الشكل 1). تم إجراء القياس الكمي لخلايا الدم ومعلمات الدم ، مثل الهيموغلوبين والهيماتوكريت ، مباشرة بعد جمع الدم وكذلك بعد الترويق في نموذج حلقة التدفق لجميع أنواع العينات والتحكم. لم يتم الكشف عن أية تغييرات فيما يتعلق بعدد WBCs(الشكل 2A)أو RBCs(الشكل 2B)أو قيم الهيماتوكريت(الشكل 2C). ومع ذلك ، تم الكشف عن انخفاض في مستويات الهيموغلوبين بعد حضانة الدم في نموذج حلقة التدفق بالمقارنة مع القيم الأساسية ، والتي كانت بسبب تدفق الدم في نظام حلقة التدفق(الشكل 2D). وبالإضافة إلى ذلك، لوحظ انخفاض في أعداد الصفائح الدموية بسبب تروية الدم. وعلاوة على ذلك، تمت زيادة هذا التأثير عندما كانت هناك دعامة غير مغلفة في الأنابيب، مما يشير إلى التصاق الصفائح الدموية بالمادة الحيوية. ومع ذلك ، فقد ثبت بوضوح أن فقدان الصفائح الدموية كان أعلى بكثير عندما تم احتضان الدعامة غير المصقولة بالدم ، بدلاً من الدعامة المغلفة بالفيبرين - الهيبارين (الشكل 2E).
كما تم التحقيق في التعديلات المحتملة لعلامات البلازما الدموية في مجموعات الاختبار بعد التروية ومقارنتها بالقيم الأساسية للدم المسحوب حديثًا. وقد زاد تركيز TAT المركب، الذي يعكس حالة تنشيط نظام التخثر، بشكل معتدل بسبب الترويع الدموي(الشكل 3A). في مجموعة الدعامات المعدنية العارية ، ومع ذلك ، تم الكشف عن زيادة كبيرة في TAT ، مما يشير إلى تنشيط عميق لنظام التخثر. الدعامة المغلفة بالفيبرين-هيبارين منعت تفعيل نظام التخثر، حيث لم يتم تحديد أي زيادة في TAT.
أدى التروية إلى زيادة تنشيط السلسلة التعاقبية المكملة ، والتي تم تحديدها من خلال قياس SC5b-9(الشكل 3B). ومع ذلك، فإن الحضانة مع الدعامات غير المغلفة أو الفيبرين-الهيبارين المغلفة لم تزيد من تركيز SC5b-9. تم الحصول على نتائج مماثلة عند تحليل تنشيط الحبيبات العدلات من خلال القياس الكمي لتركيزات PMN-elastase(الشكل 3C).
تم تنفيذ تصور سطح الدعامة باستخدام SEM. تم اكتشاف اختلافات واضحة بين مجموعتي الدعامات بعد حضانة الدم. بينما على سطح الدعامة غير المغلفة كانت هناك شبكة كثيفة من خلايا الدم والبروتينات ، لم يتم اكتشاف التصاق البروتينات أو الخلايا على سطح الدعامة المغلفة بالفيبرين - الهيبارين (الشكل 4).
الشكل 1: نظرة عامة تخطيطية لتقييم توافق الدعامات في نموذج حلقة تدفق راسخة. يتم جمع الدم البشري كله الطازج من المتبرعين الأصحاء في أنابيب الدم التي تحتوي على الهيبارين لمكافحة التخثر. وبالنسبة لكل متبرع، يتم بعد ذلك ملء أنبوب فارغ وكذلك أنابيب محملة مسبقًا بمواد العينة بدم طازج واحتضانها في حلقة التدفق بمعدل 150 مل/دقيقة عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة، بالإضافة إلى ذلك، يتم إعداد عينات البلازما من الدم المسحوب حديثًا للحصول على القيم الأساسية لكل متبرع. بعد الحضانة ، يتم إعداد عينات البلازما من أنابيب الاختبار ، مع وبدون مواد العينة ، وتحليلها باستخدام ELISA محددة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تحليل أنواع الخلايا المختلفة ومعلمات الدم قبل وبعد حضانة غرسات الدعامات المختلفة في نموذج حلقة التدفق. تم تنفيذ تحديد خلايا الدم البيضاء(A)وخلايا الدم الحمراء(B)والهيماتوكريت(C)والهيموغلوبين(D)والصفائح الدموية(E). يتم عرض البيانات كمتوسط ± SEM (n = 5، p* < 0.5، p*** < 0.001). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تحديد علامات تنشيط الصفائح الدموية أو الجهاز المناعي قبل وبعد الحضانة مع زراعة الأوعية الدموية العصبية. علامات(أ)تفعيل تخثر الدم (TAT)،(B)نظام مكمل (SC5b-9)، و(C)العدلات (PMN-elastase) تم قياسها كميا باستخدام ELISA. تم إجراء التحليل على عينات البلازما المكتسبة من الدم المسحوب حديثًا أو الدم المحتضن بدعامات مختلفة في نموذج حلقة التدفق. يتم عرض البيانات كمتوسط ± SEM (n = 5، p* < 0.5). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: مسح الإلكترونيات التحليل المجهري للدعامات بعد الحضانة بالدم. ولوحظ تجميع بروتينات بلازما الدم والصفائح الدموية على مواد الدعامات غير المغلفة. بالمقارنة، لم تظهر المواد الدعامات مع طلاء الفيبرين-الهيبارين التصاق الخلايا أو مكونات الدم الأخرى على السطح (تكبير 500-، 1،000-، و 2،500 أضعاف). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يصف البروتوكول المقدم طريقة شاملة وموثوقة لاختبار توافق الدم للغرسات التي تلامس الدم وفقًا لمعيار ISO 10993-4 في نموذج تدفق القص الذي يقلد تدفق الدم البشري. وتستند هذه الدراسة على اختبار يزرع بالليزر والأوعية الدموية العصبية ولكن يمكن أن يتم ذلك مع مجموعة متنوعة من العينات. وتبين النتائج أن هذه الطريقة تمكن من إجراء تحليل واسع النطاق لمختلف البارامترات مثل عدد خلايا الدم، وانتشار العديد من علامات التوافق المنافي، والتصور المجهري لسطح الجهاز بعد ملامسة الدم. باستخدام هذا البروتوكول، يمكن الكشف عن الاختلافات المحتملة فيما يتعلق بالتوافق المنافي للأجهزة المختلفة.
بديل لتقييم توافق الانحلال في المختبر يتكون من اختبار الحيوانات في الجسم الحي ، والذي يرتبط بعدة عيوب ، مثل زيادة التباين وتشويه الآثار المتعلقة بالجهاز بسبب الآثار الساحقة قصيرة الأجل لإصابة الأنسجة6.
بالنسبة لاختبار توافق الإنكانفي في المختبر، تتوفر ثلاثة أنواع من النماذج: (1) نماذج حضانة الدم الثابتة، (2) نماذج حضانة الدم المهتاجة، و(3) نماذج تدفق القص. يوفر النموذج الساكن طريقة بسيطة وسريعة لتحديد التجلط عن طريق احتضان الجهاز مباشرة بالدم ، ولكنه لا يؤدي إلا إلى نتائج بدائية فيما يتعلق بالتوافق المنقم11. للتغلب على العيوب الرئيسية للنماذج الثابتة (أي ترسيب خلايا الدم والسطح الكبير الذي يتلامس مع الهواء) ، يمكن استخدام نموذج احتضان الدم المهيج ، حيث تمتلئ غرفة الاختبار التي تحتوي على الغرسات بالدم واحتضانها على منصة هزازة12. ومع ذلك، لا تزال أنواع النماذج هذه أقل شأناً مقارنة بنماذج تدفق القص الموجودة، مثل حلقة التدفق المعروضة هنا. جوهر هذه النماذج هو أن تدفق الدم البشري الوعائي يمكن تقليده. وهكذا ، يمكن عرض تصوير وثيق للتفاعل الحقيقي بين الزرع وخلايا الدم13. بالإضافة إلى نموذج حلقة التدفق ، والنماذج مثل حلقة تشاندلر أو عدة غرفة تدفق مُتَلَقوجودة موجودة14،15،16.
حلقة تشاندلر هو نظام أنبوب مغلق التي يتم تعبئة جزئيا مع الهواء وفرضت في جهاز الدورية، مما أدى إلى الدورة الدموية من خلال أنابيب17. في نظام حلقة التدفق الحالي ، يتم تعبئة الأنبوب بالكامل بالدم ، ويتم فرض التدفق باستخدام مضخة تمعجية. عند استخدام نموذج حلقة تشاندلر, المشغلين تواجه اثنين من العيوب الرئيسية بسبب شرط إدراج الهواء في أنابيب الاختبار. أولا ، من المعروف أن التفاعل المستمر للدم والهواء يؤدي إلى تجميع الكريات البيض والصفائح الدموية وكذلك تسخ البروتين18،19. ثانيا ، معدل الدورة الدموية محدودة ، لأن الهواء يبقى دائما في أعلى نقطة من حلقة20.
يمكن التغلب على هذه العيوب عند استخدام نظام حلقة التدفق. نظرًا لعدم وجود واجهة سائلة هوائية في النظام ، لا يحدث تنشيط للصفائح الدموية. وهكذا ، فإن النموذج لديه خلفية منخفضة للأحداث التجلطية بحيث يكون تركيز منخفض من مضادات التخثر ، عادة 1 وحدة دولية / مل أو 1.5 وحدة دولية / مل من الهيبارين ، يكفي لمنع التخثر ، حتى لو تم تطبيق معدلات تدفق عالية6. يسمح معدل تدفق الدم القابل للتعديل الذي تنظمه المضخة وقطر الأنبوب القابل للاختيار بحرية للمشغل بمحاكاة الظروف الفسيولوجية للوووين أو الشريان ، والتي تتوافق مع الغرسة التي سيتم اختبارها ، وتحقيق نتائج الاختبار ذات الصلة21. ومع ذلك ، فإن هذه الميزة هي في الوقت نفسه قيود ، بسبب الإجهاد الميكانيكي المطبق على الدم من خلال المضخة ، وقد يحدث تدمير كريات الدم الحمراء (أي انانطاب الدم)2. هذا الضرر الدم الجوهرية الناشئة يقلل من حساسية الأسلوب ويعوق التعرض لفترات طويلة للدم21. ومع ذلك ، أظهرت العديد من الدراسات الاستخدام الفعال لنموذج حلقة التدفق لتقييم توافق المنافية22،23،24.
ومع ذلك ، فإن الفجوة الرئيسية بين جميع النماذج المختبرية وآليات الجسم الحي تشمل البطانة المفقودة ، التي تعبر عن السيتوكينات ، والمكونات المضادة للتجلط ، وجزيئات الالتصاق ؛ لذلك ، يلعب هذا المكون دورًا حاسمًا في تفاعل الزرع وتعميم الدم25. في الختام ، فإن نموذج حلقة التدفق قابل للتعديل وكفاءة وموثوق ة وفعالة من حيث التكلفة لتقييم توافق الغرسات قبل الاستخدام السريري.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
لأداء المجهر الإلكتروني المسح الضوئي، ونحن نشكر ارنست Schweizer من قسم علوم وتكنولوجيا المواد الطبية من مستشفى جامعة Tuebingen. وقد تم دعم البحث من قبل وزارة التعليم والشباب والرياضة في CR في إطار البرنامج الوطني للاستدامة الثاني (مشروع BIOCEV-FAR LQ1604) ومشروع مؤسسة العلوم التشيكية رقم 18-01163S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| aqua ad iniectabilia | Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany | 1088813 | |
| beta-TG ELISA | Diagnostica Stago, Duesseldorf, Germany | 00950 | |
| Centrifuge Rotana 460 R | Andreas Hettich, Tuttlingen, Germany | - | |
| Citrat monovettes (1.4 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 6,16,68,001 | |
| CTAD monovettes (2.7 mL) | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 367562 | |
| EDTA monovettes (1.2 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 6,16,62,001 | |
| Ethanol p.A. (1000 mL) | AppliChem, Darmstadt, Germany | 1,31,08,61,611 | |
| Glutaraldehyde (25 % in water) | SERVA Electrophoresis, Heidelberg, Germany | 23114.01 | |
| Heparin coating for tubes | Ension, Pittsburgh, USA | - | |
| Heparin-Natrium (25.000 IE/ 5 mL) | LEO Pharma, Neu-Isenburg, Germany | PZN 15261203 | |
| Multiplate Reader Mithras LB 940 | Berthold, Bad Wildbad, Germany | - | |
| NaCl 0,9% | Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany | 1312813 | |
| Neutral monovettes (9 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 2,10,63,001 | |
| PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 70011044 | |
| Peristaltic pump ISM444B | Cole Parmer, Wertheim, Germany | 3475 | |
| Pipette (100 µL) | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 3124000075 | |
| Pipette (1000 µL) | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 3123000063 | |
| Plastic container (100 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 7,55,62,300 | |
| PMN-Elastase ELISA | Demeditec Diagnostics, Kiel Germany | DEH3311 | |
| Polyvinyl chloride tube | Saint-Gobain Performance Plastics Inc., Courbevoie France | - | |
| Reaction Tubes (1.5 mL) | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 30123328 | |
| neurovascular laser-cut implants | Acandis GmbH, Pforzheim | 01-0011x | |
| SC5b-9 ELISA | TECOmedical, Buende, Germany | A029 | |
| Scanning electron microscope | Cambridge Instruments, Cambridge, UK | - | |
| Sealing tape (96 well plate) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 15036 | |
| Syringe 10/12 mL Norm-Ject | Henke-Sass-Wolf, Tuttlingen, Germany | 10080010 | |
| TAT micro kit | Siemens Healthcare, Marburg, Germany | OWMG15 | |
| Waterbath Type 1083 | Gesellschaft für Labortechnik, Burgwedel, Germany | - |
References
- ISO. Biological evaluation of medical devices. , ISO 10993-4 (2002).
- Weber, M., et al. Blood-Contacting Biomaterials: In Vitro Evaluation of the Hemocompatibility. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 99 (2018).
- Li, Y., Boraschi, D. Endotoxin contamination: a key element in the interpretation of nanosafety studies. Nanomedicine (Lond). 11 (3), 269-287 (2016).
- Cattaneo, G., et al. In vitro investigation of chemical properties and biocompatibility of neurovascular braided implants. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 30 (6), 67 (2019).
- Stang, K., et al. Hemocompatibility testing according to ISO 10993-4: discrimination between pyrogen- and device-induced hemostatic activation. Materials Science and Engineering: C Materials for Biological Applications. 42, 422-428 (2014).
- van Oeveren, W. Obstacles in haemocompatibility testing. Scientifica (Cairo). , 392584 (2013).
- Engels, G. E., Blok, S. L., van Oeveren, W. In vitro blood flow model with physiological wall shear stress for hemocompatibility testing-An example of coronary stent testing. Biointerphases. 11 (3), 031004 (2016).
- Blok, S. L., Engels, G. E., van Oeveren, W. In vitro hemocompatibility testing: The importance of fresh blood. Biointerphases. 11 (2), 029802 (2016).
- Kaplan, O., et al. Low-thrombogenic fibrin-heparin coating promotes in vitro endothelialization. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 105 (11), 2995-3005 (2017).
- JoVE. SEM Imaging of Biological Samples. , Available from: https://www.jove.com/science-education/10492/sem-imaging-of-biological-samples (2019).
- Mohan, C. C., Chennazhi, K. P., Menon, D. In vitro hemocompatibility and vascular endothelial cell functionality on titania nanostructures under static and dynamic conditions for improved coronary stenting applications. Acta Biomaterialia. 9 (12), 9568-9577 (2013).
- Streller, U., Sperling, C., Hubner, J., Hanke, R., Werner, C. Design and evaluation of novel blood incubation systems for in vitro hemocompatibility assessment of planar solid surfaces. The Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 66 (1), 379-390 (2003).
- Sanak, M., Jakieła, B., Węgrzyn, W. Assessment of hemocompatibility of materials with arterial blood flow by platelet functional tests. Bulletin of the Polish Academy of Sciences: Technical Sciences. 58 (2), 317-322 (2010).
- Krajewski, S., et al. Hemocompatibility evaluation of different silver nanoparticle concentrations employing a modified Chandler-loop in vitro assay on human blood. Acta Biomaterialia. 9 (7), 7460-7468 (2013).
- Podias, A., Groth, T., Missirlis, Y. The effect of shear rate on the adhesion/activation of human platelets in flow through a closed-loop polymeric tubular system. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 6 (5), 399-410 (1994).
- Van Kruchten, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Measurement of whole blood thrombus formation using parallel-plate flow chambers-a practical guide. Platelets. 23 (3), 229-242 (2012).
- Müller, M., Krolitzki, B., Glasmacher, B. Dynamic in vitro hemocompatibility testing-improving the signal to noise ratio. Biomedical Engineering/Biomedizinische Technik. 57, SI-1 Track-D 549-552 (2012).
- Ritz-Timme, S., Eckelt, N., Schmidtke, E., Thomsen, H. Genesis and diagnostic value of leukocyte and platelet accumulations around "air bubbles" in blood after venous air embolism. International Journal of Legal Medicine. 111 (1), 22-26 (1998).
- Miller, R., et al. Characterisation of the initial period of protein adsorption by dynamic surface tension measurements using different drop techniques. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 131 (1), 225-230 (1998).
- van Oeveren, W., Tielliu, I. F., de Hart, J. Comparison of modified chandler, roller pump, and ball valve circulation models for in vitro testing in high blood flow conditions: application in thrombogenicity testing of different materials for vascular applications. International Journal of Biomaterials. , 673163 (2012).
- Krajewski, S., et al. Preclinical evaluation of the thrombogenicity and endothelialization of bare metal and surface-coated neurovascular stents. AJNR American Journal of Neuroradiology. 36 (1), 133-139 (2015).
- Monnink, S. H., et al. Silicon-carbide coated coronary stents have low platelet and leukocyte adhesion during platelet activation. Journal of Investigative Medicine. 47 (6), 304-310 (1999).
- Amoroso, G., van Boven, A. J., Volkers, C., Crijns, H. J., van Oeveren, W. Multilink stent promotes less platelet and leukocyte adhesion than a traditional stainless steel stent: an in vitro experimental study. Journal of Investigative Medicine. 49 (3), 265-272 (2001).
- Mulvihill, J., Crost, T., Renaux, J. L., Cazenave, J. P. Evaluation of haemodialysis membrane biocompatibility by parallel assessment in an ex vivo model in healthy volunteers. Nephrology Dialysis Transplantation. 12 (9), 1968-1973 (1997).
- Nordling, S., Nilsson, B., Magnusson, P. U. A novel in vitro model for studying the interactions between human whole blood and endothelium. Journal of Visualized Experiments. (93), e52112 (2014).
