Summary
פרוטוקול זה מתאר הערכת התאמה מקיפה של התקנים ליצירת קשר דם באמצעות שתלים נוירונימי לייזר. מודל לולאה של זרימה עם דם האדם טרי, heparinized מוחל כדי לחקות את זרימת הדם. לאחר הפרזיה, סמנים המטולוגיים שונים מנותח ומושווים לערכים שנרכשו ישירות לאחר איסוף הדם להערכת התקנים של המכשירים שנבדקו.
Abstract
השימוש הולך וגובר של מכשירים רפואיים (למשל, שתלי כלי דם, סטנטים, וקטטרים לב) למטרות זמניות או קבועות שנשארות במערכת הדם של הגוף דורש גישה אמינה ופרמטרית שתוצאתה הסיבוכים המטולוגיים האפשריים שנגרמו על ידי התקנים אלה (כלומר, הפעלה והשמדה של רכיבי דם). בדיקות מקיפות של השתלת מבחנה של שתלים ליצירת קשר דם היא הצעד הראשון לקראת הצלחה במימוש vivo. לכן, ניתוח מקיף על פי הארגון הבינלאומי לתקינה 10993-4 (ISO 10993-4) הוא הכרחי לפני היישום הקליני. לולאת הזרימה המוצגת מתארת מודל רגיש לניתוח הביצועים הסטטיים של סטנטים (במקרה זה, נוירונימי) וחשיפת תופעות לוואי. השימוש בדם האנושי הטרי ודגימת דם עדינה הם חיוניים כדי למנוע את ההפעלה של דם. הדם מכיל דרך אבובים heparinized המכיל את הדגימה באמצעות משאבה קנולות בקצב של 150 mL/min ב 37 ° צ' עבור 60 דקות. לפני ואחרי הפרזיה, סמנים המטולוגיים (כלומר, ספירת תאי הדם, המוגלובין, המטוקריט וסמני הפלסטלינה) המציינים את הפעלת הלוקוציטים (פולימלטיות ברורות [PMN]-elastase), טסיות (β-thromboglobulin [β-TG]), מערכת קרישת הדם (תוממבין-אנטיתרומבין III [תאת]), והמפל המשלים (SC5b -9) מנותח לסיכום, אנו מציגים מודל חיוני ואמין עבור בדיקות הומותאימות נרחבת של סטנטים והתקנים אחרים ליצירת קשר דם לפני היישום הקליני.
Introduction
ביישום vivo של שתלים וביואטילים, אשר אינטראקציה עם דם אנושי, דורש אינטנסיבי בדיקות טרום קלינית התמקדות בחקירת סמנים שונים של המערכת המוסטטית. הארגון הבינלאומי לתקינה 10993-4 (ISO 10993-4) מציין את העקרונות המרכזיים להערכת מכשירים ליצירת קשר דם (קרי, סטנטים ושתלי כלי הדם) ורואה בעיצוב ההתקן, בכלי העזר הקליני ובחומרים הדרושים1.
דם אנושי הוא נוזל המכיל חלבונים ותאים שונים פלזמה, כולל לוקיציטים (כדוריות דם לבנות [WBCs]), אריתרופוציטים (כדוריות דם אדומות [RBCs]), וטסיות, אשר לבצע פונקציות מורכבות בגוף האדם2. המגע הישיר של חומרים זרים עם דם יכול לגרום לתופעות לוואי, כגון הפעלה של מערכת החיסון או קרישת הדם, אשר יכול להוביל לדלקת או סיבוכים טרומבוטיים ובעיות חמורות לאחר השרשה3,4,5. לפיכך, באימות מחוץ לגופית מציעה הזדמנות לפני השרשה כדי לזהות ולא לכלול סיבוכים המטולוגיים שעלולים להיגרם על ידי מגע הדם עם משטח זר6.
מודל לולאה של זרימה הציג הוקמה כדי להעריך את ההזרמת ההפרעות של סטנטים נוירוכלי והתקנים דומים על ידי החלת שיעור הזרימה של 150 mL/min ב אבובים (קוטר של 3.2 מ"מ) כדי לחקות את תנאי הזרימה מוחין ו קטרים העורק2,7. מלבד הצורך האופטימלי במודל מתורבת, מקור הדם הוא גורם חשוב בהשגת תוצאות אמינות ולא שינה כאשר מנתחים את התאימות של ביומטריה8. את הדם שנאסף יש להשתמש מיד לאחר הדגימה כדי למנוע שינויים שנגרמו על ידי אחסון ממושך. באופן כללי, אוסף עדין של דם ללא קיפאון באמצעות מחט G 21 יש לבצע כדי למזער את ההפעלה של טסיות ו קרישה מדורגת במהלך ציור דם. יתרה מזאת, הקריטריונים להדרה של תורמים כוללים את אלה המעשנים, בהריון, נמצאים במצב בריאותי גרוע, או שלקחו גלולות למניעת הריון או משככי כאבים במהלך 14 הימים הקודמים.
מחקר זה מתאר מודל בלתי מתורבת עבור בדיקות המוחלות הנרחבות של שתלים סטנט בתנאי זרימה. כאשר השוואת בלתי מצופה של סטנטים מצופים בפירין-הפארין, תוצאות הבדיקות המקיפות הינן משקפות הומותאימות משופרת של סטנטים מצופים בפירין-הפארין9. לעומת זאת, סטנטים בלתי מצופים מגבירים את הפעלת הקרישה, כפי שניתן להדגים באמצעות גידול ב-thombin-אנטיתרומבין III (תאת) ריכוזים ואובדן מספרי טסיות דם בשל הדבקה של טסיות למשטח סטנט. באופן כללי, שילוב מודל התקן התקן זה כמבחן טרום קליני מומלץ לאתר תופעות לוואי על מערכת ההסטטית הנגרמת על ידי המכשיר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הליך דגימת הדם אושר על ידי ועדת האתיקה של הפקולטה לרפואה באוניברסיטת טואבנגן (קוד זיהוי פרוייקט: 270/2010BO1). כל הנושאים שסופקו כתובים, הסכמה מושכלת להכללה לפני השתתפות.
1. הכנת הפארין-Monovettes טעון
- מערבבים את הפארין הבלתי מדוללת (5,000 IU/mL) עם נתרן כלוריד (הארה ב, 0.9%) פתרון ולהכין פתרון עם ריכוז כתוצאה של 15 IU/mL של הפארין.
- הוסף 900 μL של פתרון הפארין מדולל לכל monovette ניטרלי (9 מ ל) כדי לקבל ריכוז הפארין הסופי של 1.5 IU/mL לאחר דגימת דם. הכינו שלושה monovettes לכל תורם בתוספת שלושה מילואים monovettes ואחסנו את monovettes ההפרין שנטען ב -4 ° c עד לדגימת דם.
2. דגימת דם
- קחו את הmonovettes שנטענו מהמקרר 30 דקות לפני דגימת הדם.
- איסוף מדגם דם של 27 מ"ל מכל תורם בריא (n = 5) באמצעות הפנקב לולאת הזרימה. רק להחיל חוסם עורקים חלקה כדי למנוע הפעלה מוקדמת של טסיות ואת המפל קרישת הדם.
- לאסוף דגימות דם בשלושה monovettes המכיל 900 μL של פתרון הפארין (1.5 IU/mL) והבריכה כל שלושת monovettes במיכל פלסטיק אחד כדי להבטיח כי כל הרכיבים מופצים באופן שווה.
- העבר ישירות דם heparinized לתוך שלושה monovettes שונים המכיל את EDTA (1.2 mL), ציטראט (1.4 mL), או תערובת של ציטראט, theפסקו, אדנוזין, ו dipyridamole (CTAD, 2.7 mL) כדי לאסוף ערכים בסיסיים. המשך בדגימות כמתואר בסעיפים 5-8.
הערה: כדי להבטיח התנהגות קרישה שאינה מושפעת, התורמים צריכים להימנע מצריכת תרופות משפיעות (למשל, חומצה אצטילסליצילית, naproxen, ו carbenicillin) בתוך 14 הימים האחרונים, כמו גם גלולות למניעת הריון ועישון.
3. הכנת לולאת הזרימה
- חותכים שלושה צינורות פוליוויניל כלוריד מצופה הפארין עם אורך של 75 ס מ וקוטר פנימי של 3.2 מ"מ. טען את הצינורות עם שתלים נוירונימי לייזר לחתוך עם או בלי הציפוי הפירין-הפארין. זכור להשאיר אמבטיה אחת. לא מתבטלת כפקד
- מניחים קצה אחד של הצינור במאגר מלא 0.9% הנאל, לחבר את הצינורות לראש המשאבה, ולהכניס את הקצה השני לתוך גליל מדידה.
- כוונן את ההגדרות של המשאבה הפריסטטית כדי להשיג קצב זרימה של 150 mL/min באמצעות טיימר בעת בדיקת רמת המילוי בצילינדר המדידה.
4. ביצועי בדיקות הומותאימות
- השתמש במזרק 12 מ ל כדי למלא את הצינורות בדם. תן 6 מ ל זרימת הדם בצורה חלקה לתוך כל צינור המכיל מדגם או בקרה ללא טעינה.
- טופס מעגל ולסגור את הצינורות בחוזקה באמצעות 0.5 ס מ אורך של צינורות חיבור סיליקון. מניחים את הצינורות באמבט מים של 37 ° c ומתחילים את הפרפיוז עבור 60 דקות.
5. ניתוח ספירת הדם השלמה
- לשים 1.2 mL של דם לאחר הדגימה (בסיס) או אחרי זלוף לתוך monovette המכיל edta ובזהירות להפוך את הצינור 5x.
- להכניס את הmonovette לתוך מנתח הדם ולבצע ניתוח ספירת דם עבור כל דוגמה. לאחר מכן, מודלת את הmonovettes על הקרח במשך 15-60 דקות אחרי ספירת הדם לניתוח נוסף, כמתואר בסעיף 7.
6. אוסף פלזמה ציטראט
- מלאו את הmonovettes המכיל ציטראט עם 1.4 מ ל של דם (שצויר טרי או אחרי מחזור הדם) והיפוך בזהירות 5x.
- צנטריפוגה את הצינורות עבור 18 דקות ב 1,800 x g בטמפרטורת החדר (RT). Aliquot 3 250 μL דוגמיות של שבר פלזמה לתוך 1.5 mL התגובה צינורות להקפיא את דגימות פלזמה בחנקן נוזלי. אחסן אותם ב-20 ° צ' עד לניתוח.
7. אוסף של פלזמה EDTA
- מודלת את הmonovettes על הקרח במשך 15 עד 60 דקות אחרי מדידת ספירת הדם. לאחר מכן, צנטריפוגה את הצינורות במשך 20 דקות ב 2,500 x ו -4 ° c.
- Aliquot 3 250 μL דוגמיות של שבר פלזמה לתוך 1.5 mL התגובה צינורות לאחר צנטריפוגה ולהקפיא את הצינורות בחנקן נוזלי. אחסן אותם ב-80 ° צ' עד לניתוח.
8. אוסף של פלזמה CTAD
- ממלאים את הmonovettes המכיל את התערובת CTAD עם 2.7 mL של דם (מצויר טרי או אחרי דגירה) ובזהירות להפוך 5x. לאחר מכן, הmonovettes בקרח במשך 15-60 דקות. לאחר מכן, צנטריפוגה את הצינורות במשך 20 דקות ב 2,500 x ו -4 ° c.
- העברה 700 μL של השבר פלזמה האמצעית לתוך צינור התגובה 1.5 mL וצנטריפוגה את צינורות התגובה מלא 20 דקות ב 2,500 x g ו 4 ° c.
- Aliquot 2 100 μL דגימות של השבר האמצעי לתוך שפופרות תגובה של 1.5 mL לאחר צנטריפוגה ולהקפיא את הצינורות בחנקן נוזלי. אחסן אותם ב-20 ° צ' עד לניתוח.
הערה: האוסף של פלזמה EDTA ופלזמה CTAD ניתן לבצע יחד משום שתנאי ההפעלה זהים.
9. מדידת האדם תאת מתוך פלזמה ציטראט
- הפשרת הפלזמה הציטראט באמבט מים של 37 ° c.
- השתמש בערכה הקשורה לאנזימים המקושרים באמצעות האנזים (אליסה) בהתאם להוראות היצרן. לשחזר את תקני פלזמה ושליטה ולדלל את הפתרון כביסה, אנטי אדם-תאת peroxidase (POD)-נוגדן מצובן, ואת פתרון כרומוגן. השאירו את כל הריאגנטים ואת לוחית microtiter ב-RT (15-25 ° c) עבור 30 דקות לפני תחילת הבדיקה.
- Pipet 50 μL של מאגר לדוגמה לתוך כל טוב של צלחת microtiter ולהוסיף 50 μL של מאגר לדוגמה (ריק), תקן פלזמה, בקרת פלזמה, ומדגם פלזמה בלתי מדולל בכפילויות לצלחת הבאר. אטום את הצלחת ואת הדגירה ב 37 ° c עבור 15 דקות עם טלטול עדין. ואז, לשטוף את צלחת 3x עם 300 μL של הפתרון כביסה.
- הוסף 100 μL של הנוגדן לאדם-מצוב. אטום את הצלחת ואת הדגירה ב 37 ° c עבור 15 דקות עם טלטול עדין. ואז, לשטוף את צלחת 3x עם 300 μL של הפתרון כביסה.
- הוסף 100 μL של פתרון כרומוgen טרי מוכן לכל טוב. אטום את הצלחת ואת הדגירה ב RT עבור 30 דקות.
- הסר את הסרט חותם ולהוסיף 100 μL של פתרון להפסיק כל טוב. קרא את הדחיסות האופטית (OD) עם פומטר ב-490-500 ננומטר. התאם את נתוני העקומה הסטנדרטיים כקו מגמה וחשב את ריכוז הדגימות.
10. מדידת PMN-אלסטסה מפלסמה ציטראט
- הפשרת הפלזמה הציטראט באמבט מים ב-37 ° c.
- השתמש במערכת הפולימורבית (PMN)-מערכת אליסה בהתאם להוראות היצרן: לשחזר את השליטה PMN-elastase ואת תקן PMN-elastase כדי להכין עיקול סטנדרטי באמצעות מאגר הדילול של הערכה.
- דלל את פתרון הכביסה בהתאם לתיאור היצרן. להשאיר את כל הריאגנטים ואת לוחית microtiter ב-RT עבור 30 דקות לפני תחילת הבדיקה. דלל את דגימות הפלסמה הציטראט ל1:100 עם מאגר הדילול.
- הוסף 100 μL של מאגר המדגם (ריק), PMN-elastase רגיל (15.6-1000 ng/mL), PMN-elastase שולטת (ריכוזים גבוהים ונמוכים), ודגימות פלזמה מדולל בכפילויות לצלחת הבאר. לאטום את הצלחת ואת הדגירה ב RT עבור 60 דקות עם טלטול עדין. לאחר מכן, לשטוף את הצלחת 4x עם 300 μL של הפתרון כביסה.
- הוסף 150 μL של נוגדן מצובן האנזים כל טוב. לאטום את הצלחת ואת הדגירה ב RT עבור 60 דקות עם טלטול עדין. לאחר מכן, לשטוף את הצלחת 4x עם 300 μL של הפתרון כביסה.
- להוסיף 200 μL של 3, 3 ', 5, 5 '-טטרמתיל בנזיל (TMB)-פתרון המצע לכל טוב. לאטום את הצלחת ואת הדגירה ב RT במשך 20 דקות בחושך. לאחר מכן, הסר את סרט החותם והוסף 50 μL של פתרון העצירה לכל באר.
- קרא את ה-OD עם פומטר ב 450 ננומטר עם קריאה לעיון ב 630 nm. התאם את נתוני העקומה הסטנדרטיים כקו מגמה וחשב את ריכוז הדגימות.
11. מדידה של קומפלקס משלים מסוף (TCC) מ-EDTA פלזמה
- הפשרת פלזמה EDTA באמבט מים ב 37 ° c, ולאחסן על הקרח לאחר הפשרה.
- השתמש בערכה המשלים SC5b-9 אליסה על פי הוראות היצרן: לדלל את הפתרון כביסה כמתואר בפרוטוקול של היצרן. להשאיר את כל הריאגנטים ואת לוחית microtiter ב-RT עבור 30 דקות לפני תחילת הבדיקה. לדלל את דגימות פלזמה EDTA כדי 1:10 עם מאגר הדילול של הערכה.
- הוסף 300 μL של פתרון כביסה לכל באר כדי לחלק מחדש את פני השטח ומייבשים לאחר 2 דקות. הוסף 100 μL של מאגר לדוגמה (ריק), SC5b-9 תקנים, SC5b-9 שולטת (ריכוזים גבוהים ונמוכים), ואת דגימות פלזמה מדולל בכפילויות לצלחת הבאר.
- לאטום את הצלחת ואת הדגירה ב RT עבור 60 דקות. הבא, לשטוף את צלחת 5x עם 300 μL של הפתרון כביסה.
- הוסף 50 μL של נוגדן מצובן האנזים כל טוב. אטום את הצלחת ואת הדגירה ב RT עבור 30 דקות. לאחר מכן, לשטוף את צלחת 5x עם 300 μL של הפתרון כביסה.
- הוסף 100 μL של פתרון TMB-מצע לכל טוב. אטום את הצלחת ואת הדגירה ב RT עבור 15 דקות בחושך.
- הסר את סרט החותם והוסף 100 μL של פתרון העצירה לכל באר. קרא את ה-OD עם פומטר בשעה 450 nm. התאם את נתוני העקומה הסטנדרטיים כקו מגמה וחשב את ריכוז הדגימות.
12. מדידה של β-thromboglobulin מ-CTAD פלזמה
- הפשרת פלזמה CTAD באמבט מים ב-37 ° c.
- השתמש בערכת ה-β-thromboglobulin (β-TG) בהתאם להוראות היצרן: לשחזר את השליטה β-TG ואת תקן הβ-TG ולדלל את פתרון הכביסה באמצעות H2O מזוקקים. בנייה מקדימה את הנוגדן פוד באמצעות מאגר פוספט סיפק. להשאיר את כל הריאגנטים ואת לוחית microtiter ב-RT עבור 30 דקות לפני תחילת הבדיקה.
- הכן את עקומת התקן ואת הפקד על פי הוראות היצרן עם מאגר פוספט סיפק. דלל את דגימות הפלסמה. של ה1:21
- הוסף 200 μL של מאגר הפוספט (ריק), תקני β-TG, פקדי β-TG (ריכוזים גבוהים ונמוכים) ודגימות פלסמה מדולדלות בכפילויות לצלחת הבאר. חותם את הצלחת ואת הדגירה ב RT עבור 60 דקות. לאחר מכן, לשטוף את צלחת 5x עם 300 μL של הפתרון כביסה.
- הוסף 200 μL של נוגדן מצובן האנזים כל טוב. חותם את הצלחת ואת הדגירה ב RT עבור 60 דקות. לאחר מכן, לשטוף את צלחת 5x עם 300 μL של הפתרון כביסה.
- הוסף 200 μL של פתרון TMB-מצע לכל טוב. אטום את הצלחת ואת הדגירה ב RT עבור 5 דקות בחושך. הסר את הסרט חותם ולהפסיק את התגובה על ידי הוספת 50 μL של חומצה גופרתית 1 M (H2SO4) לכל טוב.
- השאירו את הצלחת עבור 15-60 דקות, ואז לקרוא את ה-OD עם פומטר ב 450 ננומטר. התאם את נתוני העקומה הסטנדרטיים כקו מגמה וחשב את ריכוז הדגימות.
13. הכנה לדוגמא לסריקת מיקרוסקופ אלקטרוני
- להסיר את השתל מהצינור באמצעות מלקחיים ולשטוף את השתל בקצרה על ידי טבילה אותו לתוך 0.9% הפתרון 3x.
- חנות בתמיסה גלוטרלדהיד (2% גלוטאלדהיד בתמיסת מלח באגירה (PBS-מאגר ללא Ca2 +/Mg2 +]) לילה ב 4 ° c.
- בשלב הבא, השתלת השתלים ב-PBS-מאגר עבור 10 דקות. הפחתת דגימות על ידי הדגירה של אתנול עם ריכוז גובר עבור 10 דקות כל אחד: 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 96%, ו 100%. אחסן את הדגימות היובשות ב-100% אתנול עד לניתוח נוסף.
- לבצע ייבוש נקודה קריטית בהתאם להוראות המכשיר הייבוש או הספרות10 בדיוק לפני סריקת מיקרוסקופ אלקטרוני (SEM).
14. סריקת מיקרוסקופ אלקטרוני
- חברו את השתלים יבשים למנשא מדגם למיקרוסקופ הסריקה והצמידו את הדגימות עם הזהב פלדיום.
- הציגו את השתלים האלה. לתוך תא הדגימה צלם תמונות ב-100-, 500-, 1,000-ו-2,500-הגדלה של האזורים עם המשטח המייצג והדבקה בתא.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מסוכם בקצרה, דם שלם של האדם נאסף ב הרין טעונים monovettes אז במאגר ומשמש כדי להעריך את רמות הבסיסית של ספירת תאים, כמו גם סמני תאימות פלמטיות.
לאחר מכן, הצינורות המכילים את דגימות השתל נוירונימי היה מלא, והדם היה מוכן עבור 60 דקות ב 150 mL/min ו-37 ° צ' באמצעות משאבה פריסטלטית. שוב, מספר התאים נותח בכל הקבוצות, ודגימות הפלזמה הוכנו לניתוח של אליסה (איור 1). הכמת של תאי הדם והפרמטרים של הדם, כגון המוגלובין והמטוקריט, בוצע ישירות לאחר איסוף הדם, כמו גם לאחר זלוף במודל לולאה של זרימת עבור כל סוגי המדגם והשליטה. לא זוהו שינויים בנוגע למספר ה-WBCs (איור 2א), rbcs (איור 2ב') או הערכים המטקריט (איור 2ג). עם זאת, ירידה ברמות המוגלובין זוהה לאחר הדגירה של דם במודל לולאה הזרימה בהשוואה לערכים הבסיסיים, אשר היה בשל הפרזיה של דם במערכת לולאה הזרימה (איור 2ד). בנוסף, ירידה במספרי טסיות נצפתה עקב הפרזיה דם. יתר על כן, השפעה זו הוגדלה כאשר סטנט בלתי מצופה היה נוכח אבובים, המציין את הדבקה של טסיות כדי ביומטריה. עם זאת, הוכח בבירור כי אובדן טסיות היה גבוה יותר באופן משמעותי כאשר סטנט לא מצופה היה מודבטים עם דם, בניגוד סטנט הפארין-הפרין מצופה (איור 2E).
שינויים פוטנציאליים של סמנים פלזמה המטקולוגי נחקרו גם בקבוצות הבדיקה לאחר הפרזיה ולעומת הערכים הבסיסיים של הדם שצויר טרי. ריכוז מורכב תאת, אשר משקף את מצב ההפעלה של מערכת קרישת הדם, הוגדלה במקצת עקב הפרזיה דם (איור 3א). בקבוצת סטנט מתכת חשופים, עם זאת, עלייה משמעותית ב-תאת זוהה, המציין הפעלה עמוקה של מערכת קרישת הדם. סטנט הפירין-הפארין-מצופה מנעו את הפעלת מערכת קרישת הדם, מכיוון שאין עלייה בשיטת ה-תאת.
הפרזיה הובילה להפעלה מוגברת של המפל המשלים, שנקבע על ידי מדידת SC5b-9 (איור 3ב). עם זאת, הדגירה עם סטנטים לא מצופים או פירין-הפארין-מצופים לא הגדילו עוד יותר את הריכוז SC5b-9. תוצאות דומות התקבלו בעת ניתוח ההפעלה של נויטרופילים גרנולוציטים באמצעות כימות של ריכוזי PMN-elastase (איור 3ג).
הדמיה של משטח סטנט בוצעה באמצעות SEM. הבדלים ברורים בין שתי קבוצות סטנט זוהו לאחר הדגירה דם. בעוד על פני סטנט בלתי מצופה רשת צפופה של תאי דם וחלבונים היה נוכח, לא הדבקה של חלבונים או תאים זוהה על פני השטח של סטנט הפהפרין מצופה (איור 4).
איור 1: סקירה סכמטית של הערכת ההטיות של סטנטים במודל לולאת זרימה מבוססת היטב. דם טרי שלם כולו נאסף מתורמים בריאים צינורות דם המכילים הפארין עבור אנטי קרישה. עבור כל תורם, צינור ריק, כמו גם צינורות מראש עם החומר לדוגמה מתמלאים לאחר מכן בדם טרי, מודבטים בלולאה בקצב של 150 mL/min ב 37 ° צ' עבור 60 min. בנוסף, דגימות פלזמה מוכנים דם שצויר טרי כדי להשיג את הערכים הבסיסיים של כל תורם. לאחר הדגירה, דגימות פלזמה מתוך הבדיקה אבובים, עם ובלי חומרים לדוגמה, מוכנים ונותחו באמצעות אליסה ספציפית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: ניתוח סוגים שונים של תאים ופרמטרים דם לפני ואחרי דגירה של שתלים סטנט שונים במודל לולאה הזרימה. קביעת כדוריות הדם הלבנות (א), תאי דם אדומים (ב), המטוקריט (C), המוגלובין (D), וטסיות (E) בוצעו. הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM (n = 5, p * < 0.5, p * * * < 0.001). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: קביעת טסית דם או סמנים הפעלה המערכת החיסונית לפני ואחרי דגירה עם שתלים נוירוכלי. סמנים עבור (A) הפעלה של קרישת דם (תאת), (ב) מערכת המשלים (SC5b-9), ו (ג) נויטרופילים (pmn-elastase) היו כמותית באמצעות אליסה. הניתוח בוצע על דגימות פלזמה שנרכשו מדם מצויר טרי או דם מודבטים עם סטנטים שונים במודל לולאת הזרימה. הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM (n = 5, p * < 0.5). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: סריקת דם בניתוח מיקרוסקופי של סטנטים לאחר דגירה. צבירת חלבונים דם פלזמה וטסיות על חומר סטנט בלתי מצופה נצפתה. לעומת זאת, חומרי סטנט עם ציפוי פירין-הפארין לא הפגינו הדבקה של תאים או רכיבי דם אחרים על פני השטח (הגדלה של 500-, 1,000-, ו-2,500-קיפול). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול המוצג מתאר שיטה מקיפה ואמינה לבדיקת תאימות בדיקות דם שתלים בהתאם ISO 10993-4 במודל זרימת הטיה החיקוי של זרימת הדם האנושית. מחקר זה מבוסס על בדיקות של שתלים נוירוכלי לייזר לחתוך, אבל ניתן לבצע עם מגוון רחב של דגימות. התוצאות מראות ששיטה זו מאפשרת ניתוח נרחב של פרמטרים שונים כגון ספירת תאי הדם, השכיחות של מספר סמני הפיכת תאימות, והדמיה מיקרוסקופית של משטח המכשיר לאחר מגע דם. על-ידי שימוש בפרוטוקול זה, ניתן לזהות הבדלים פוטנציאליים בנוגע לתאימות של התקנים שונים.
חלופה להערכת מחוץ לתחום ה, מורכבת מבדיקות בעלי חיים vivo, המשויכת למספר חסרונות, כגון השתנות ועיוות של השפעות הקשורות למכשיר בשל השפעות קצרות הטווח המכריע של פגיעה ברקמות6.
עבור בדיקות הפרעות חוץ גופית, שלושה סוגים של מודלים זמינים: (1) הדגירה מודלים דם, (2) מודלים הדגירה של דם נסער, ו (3) להטות מודלים זרימה. המודל הסטטי מספק שיטה פשוטה ומהירה כדי לקבוע thrombogenicity על-ידי דגירה של המכשיר ישירות עם דם, אבל זה רק מוביל תוצאות בסיסי לגבי הומותאימות11. כדי להתגבר על החסרונות העיקריים של מודלים סטטיים (כלומר, שקיעה של כדוריות הדם ואת משטח יצירת האוויר הגדול), מודל הדגירה של הדם ניתן להשתמש, שבו חדר בדיקה המכיל את השתלים הוא מלא דם מודלים על פלטפורמת נדנדה12. עם זאת, סוגי מודל אלה עדיין נחותים בהשוואה למודלים הקיימים של זרימת ההטיה, כגון לולאת הזרימה המוצגת כאן. המודל של המודלים האלה הוא זרימת דם אנושית של כלי הדם ניתן לחקות; לפיכך, תיאור קרוב של האינטראקציה האמיתית בין השתל ותאי הדם ניתן להציג13. בנוסף למודל לולאה של הזרימה, מודלים כגון לולאת צ'נדלר או מספר תאי זרימה מסוימים קיימים14,15,16.
לולאת צ'נדלר היא מערכת שפופרת סגורה המלאה באופן חלקי באוויר ומהודק לתוך מכשיר מסתובב, וכתוצאה מכך זרימת הדם דרך אבובים17. במערכת לולאת הזרימה הנוכחית, הצינורית מלאה בדם, והזרימה נכפית באמצעות משאבה פריסטלטית. בעת שימוש במודל לולאה צ'נדלר, המפעילים את הפנים שני החסרונות העיקריים בשל הדרישה של כולל אוויר לתוך אבובים הבדיקה. ראשית, ידוע כי האינטראקציה המתמדת של הדם והאוויר מפעילה את הצבירה של לוקיציטים וטסיות, כמו גם חלבון הדנטורציה18,19. שנית, שיעור מחזור הדם מוגבל, כי האוויר תמיד נשאר בנקודה הגבוהה ביותר של לולאה20.
החסרונות האלה ניתן להתגבר בעת שימוש במערכת לולאה זרימה. מכיוון שלא קיים ממשק נוזלי אוויר במערכת, לא מתרחשת הפעלת טסיות דם. כך, המודל יש רקע נמוך עבור אירועים טרומבוטיים כך ריכוז נמוך של קרישה, בדרך כלל 1 IU/mL או 1.5 IU/mL של הפארין, מספיק כדי למנוע קרישה, גם אם שיעורי זרימה גבוהה מוחלים6. משאבה מתכווננת שיעור זרימת דם וקוטר צינור בחירה חופשית לאפשר למפעיל לחקות את התנאים הפיזיולוגיים של וריד או עורק, אשר מתאים השתל להיבדק, ולהשיג תוצאות בדיקה רלוונטיות21. עם זאת, יתרון זה הוא באותו זמן מגבלה, בשל הלחץ המכני להחיל את הדם דרך המשאבה, ואת ההרס של אריתרופוציטים (כלומר, המוליזיס) עשוי להתרחש2. זה הנובעים נזק דם פנימי מפחית את רגישות השיטה מעכבת חשיפה ממושכת לדם21. עם זאת, מספר מחקרים הוכיחו את השימוש האפקטיבי במודל לולאה של זרימה להערכת הומותאימות22,23,24.
עם זאת, הפער העיקרי בין כל דגמי החוץ ומנגנוני הvivo כולל את האנדותל החסר, המבטא ציטוקינים, רכיבים אנטי-טרומבוטיים ומולקולות הדבקה; לכן, מרכיב זה ממלא תפקיד מכריע באינטראקציה של השתל ובמחזור הדם25. לסיכום, מודל לולאת הזרימה הוא מתכוונן, יעיל, אמין, וחסכוני כדי להעריך את התאימות של שתלים לפני שימוש קליני.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
על הביצועים של סריקת מיקרוסקופ אלקטרוני, אנו מודים לארנסט שוויצר מתוך סעיף של מדעי החומרים הרפואיים והטכנולוגיה של בית החולים האוניברסיטאי טואבינגן. המחקר נתמך על ידי משרד החינוך, הנוער והספורט של CR בתוך התוכנית הלאומית הסביבתית השנייה (פרויקט BIOCEV-FAR LQ1604) ועל ידי קרן המדע הצ פרויקט מס ' 18-01163S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| aqua ad iniectabilia | Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany | 1088813 | |
| beta-TG ELISA | Diagnostica Stago, Duesseldorf, Germany | 00950 | |
| Centrifuge Rotana 460 R | Andreas Hettich, Tuttlingen, Germany | - | |
| Citrat monovettes (1.4 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 6,16,68,001 | |
| CTAD monovettes (2.7 mL) | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 367562 | |
| EDTA monovettes (1.2 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 6,16,62,001 | |
| Ethanol p.A. (1000 mL) | AppliChem, Darmstadt, Germany | 1,31,08,61,611 | |
| Glutaraldehyde (25 % in water) | SERVA Electrophoresis, Heidelberg, Germany | 23114.01 | |
| Heparin coating for tubes | Ension, Pittsburgh, USA | - | |
| Heparin-Natrium (25.000 IE/ 5 mL) | LEO Pharma, Neu-Isenburg, Germany | PZN 15261203 | |
| Multiplate Reader Mithras LB 940 | Berthold, Bad Wildbad, Germany | - | |
| NaCl 0,9% | Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany | 1312813 | |
| Neutral monovettes (9 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 2,10,63,001 | |
| PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 70011044 | |
| Peristaltic pump ISM444B | Cole Parmer, Wertheim, Germany | 3475 | |
| Pipette (100 µL) | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 3124000075 | |
| Pipette (1000 µL) | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 3123000063 | |
| Plastic container (100 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 7,55,62,300 | |
| PMN-Elastase ELISA | Demeditec Diagnostics, Kiel Germany | DEH3311 | |
| Polyvinyl chloride tube | Saint-Gobain Performance Plastics Inc., Courbevoie France | - | |
| Reaction Tubes (1.5 mL) | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 30123328 | |
| neurovascular laser-cut implants | Acandis GmbH, Pforzheim | 01-0011x | |
| SC5b-9 ELISA | TECOmedical, Buende, Germany | A029 | |
| Scanning electron microscope | Cambridge Instruments, Cambridge, UK | - | |
| Sealing tape (96 well plate) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 15036 | |
| Syringe 10/12 mL Norm-Ject | Henke-Sass-Wolf, Tuttlingen, Germany | 10080010 | |
| TAT micro kit | Siemens Healthcare, Marburg, Germany | OWMG15 | |
| Waterbath Type 1083 | Gesellschaft für Labortechnik, Burgwedel, Germany | - |
References
- ISO. Biological evaluation of medical devices. , ISO 10993-4 (2002).
- Weber, M., et al. Blood-Contacting Biomaterials: In Vitro Evaluation of the Hemocompatibility. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 99 (2018).
- Li, Y., Boraschi, D. Endotoxin contamination: a key element in the interpretation of nanosafety studies. Nanomedicine (Lond). 11 (3), 269-287 (2016).
- Cattaneo, G., et al. In vitro investigation of chemical properties and biocompatibility of neurovascular braided implants. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 30 (6), 67 (2019).
- Stang, K., et al. Hemocompatibility testing according to ISO 10993-4: discrimination between pyrogen- and device-induced hemostatic activation. Materials Science and Engineering: C Materials for Biological Applications. 42, 422-428 (2014).
- van Oeveren, W. Obstacles in haemocompatibility testing. Scientifica (Cairo). , 392584 (2013).
- Engels, G. E., Blok, S. L., van Oeveren, W. In vitro blood flow model with physiological wall shear stress for hemocompatibility testing-An example of coronary stent testing. Biointerphases. 11 (3), 031004 (2016).
- Blok, S. L., Engels, G. E., van Oeveren, W. In vitro hemocompatibility testing: The importance of fresh blood. Biointerphases. 11 (2), 029802 (2016).
- Kaplan, O., et al. Low-thrombogenic fibrin-heparin coating promotes in vitro endothelialization. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 105 (11), 2995-3005 (2017).
- JoVE. SEM Imaging of Biological Samples. , Available from: https://www.jove.com/science-education/10492/sem-imaging-of-biological-samples (2019).
- Mohan, C. C., Chennazhi, K. P., Menon, D. In vitro hemocompatibility and vascular endothelial cell functionality on titania nanostructures under static and dynamic conditions for improved coronary stenting applications. Acta Biomaterialia. 9 (12), 9568-9577 (2013).
- Streller, U., Sperling, C., Hubner, J., Hanke, R., Werner, C. Design and evaluation of novel blood incubation systems for in vitro hemocompatibility assessment of planar solid surfaces. The Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 66 (1), 379-390 (2003).
- Sanak, M., Jakieła, B., Węgrzyn, W. Assessment of hemocompatibility of materials with arterial blood flow by platelet functional tests. Bulletin of the Polish Academy of Sciences: Technical Sciences. 58 (2), 317-322 (2010).
- Krajewski, S., et al. Hemocompatibility evaluation of different silver nanoparticle concentrations employing a modified Chandler-loop in vitro assay on human blood. Acta Biomaterialia. 9 (7), 7460-7468 (2013).
- Podias, A., Groth, T., Missirlis, Y. The effect of shear rate on the adhesion/activation of human platelets in flow through a closed-loop polymeric tubular system. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 6 (5), 399-410 (1994).
- Van Kruchten, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Measurement of whole blood thrombus formation using parallel-plate flow chambers-a practical guide. Platelets. 23 (3), 229-242 (2012).
- Müller, M., Krolitzki, B., Glasmacher, B. Dynamic in vitro hemocompatibility testing-improving the signal to noise ratio. Biomedical Engineering/Biomedizinische Technik. 57, SI-1 Track-D 549-552 (2012).
- Ritz-Timme, S., Eckelt, N., Schmidtke, E., Thomsen, H. Genesis and diagnostic value of leukocyte and platelet accumulations around "air bubbles" in blood after venous air embolism. International Journal of Legal Medicine. 111 (1), 22-26 (1998).
- Miller, R., et al. Characterisation of the initial period of protein adsorption by dynamic surface tension measurements using different drop techniques. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 131 (1), 225-230 (1998).
- van Oeveren, W., Tielliu, I. F., de Hart, J. Comparison of modified chandler, roller pump, and ball valve circulation models for in vitro testing in high blood flow conditions: application in thrombogenicity testing of different materials for vascular applications. International Journal of Biomaterials. , 673163 (2012).
- Krajewski, S., et al. Preclinical evaluation of the thrombogenicity and endothelialization of bare metal and surface-coated neurovascular stents. AJNR American Journal of Neuroradiology. 36 (1), 133-139 (2015).
- Monnink, S. H., et al. Silicon-carbide coated coronary stents have low platelet and leukocyte adhesion during platelet activation. Journal of Investigative Medicine. 47 (6), 304-310 (1999).
- Amoroso, G., van Boven, A. J., Volkers, C., Crijns, H. J., van Oeveren, W. Multilink stent promotes less platelet and leukocyte adhesion than a traditional stainless steel stent: an in vitro experimental study. Journal of Investigative Medicine. 49 (3), 265-272 (2001).
- Mulvihill, J., Crost, T., Renaux, J. L., Cazenave, J. P. Evaluation of haemodialysis membrane biocompatibility by parallel assessment in an ex vivo model in healthy volunteers. Nephrology Dialysis Transplantation. 12 (9), 1968-1973 (1997).
- Nordling, S., Nilsson, B., Magnusson, P. U. A novel in vitro model for studying the interactions between human whole blood and endothelium. Journal of Visualized Experiments. (93), e52112 (2014).
