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मानव रक्त प्रवाह की नकल करने वाले फ्लो लूप मॉडल में रक्त-संपर्क प्रत्यारोपण का हीमोकॉम्पिटीशन परीक्षण

Published: March 5, 2020 doi: 10.3791/60610
Automatic Translation
1, 2,3, 4, 4, 4, 1, 1, 1, 1
1Department of Thoracic, Cardiac and Vascular Surgery, University Hospital Tuebingen, 2Acandis GmbH, 3Institute of Biomedical Engineering, University of Stuttgart, 4Institute of Macromolecular Chemistry, Academy of Sciences of the Czech Republic

Summary

यह प्रोटोकॉल लेजर-कट न्यूरोवैस्कुलर प्रत्यारोपण का उपयोग करके रक्त-संपर्क उपकरणों के व्यापक हीमोकॉम्पिटीशन मूल्यांकन का वर्णन करता है। रक्त प्रवाह की नकल करने के लिए ताजा, हेपरिनीकृत मानव रक्त के साथ एक प्रवाह लूप मॉडल लागू किया जाता है। परफ्यूजन के बाद, विभिन्न हेमेटोलॉजिक मार्कर का विश्लेषण किया जाता है और परीक्षण किए गए उपकरणों के हीमोकॉम्पिटीशन मूल्यांकन के लिए रक्त संग्रह के बाद सीधे प्राप्त मूल्यों की तुलना में।

Abstract

शरीर के संचार प्रणाली में रहने वाले अस्थायी या स्थायी उद्देश्यों के लिए चिकित्सा उपकरणों (जैसे, संवहनी ग्राफ्ट, स्टेंट और कार्डियक कैथेटर) का बढ़ता उपयोग एक विश्वसनीय और बहुपारेय दृष्टिकोण की मांग करता है जो इन उपकरणों (यानी, रक्त घटकों की सक्रियता और विनाश) के कारण संभावित हेमेटोलॉजिक जटिलताओं का मूल्यांकन करता है। रक्त से संपर्क प्रत्यारोपण के व्यापक इन विट्रो हीमोकॉम्पिटीबिलिटी परीक्षण वीवो कार्यान्वयन में सफल होने की दिशा में पहला कदम है। इसलिए, अंतर्राष्ट्रीय मानकीकरण संगठन 10993-4 (आईएसओ 10993-4) के अनुसार व्यापक विश्लेषण नैदानिक आवेदन से पहले अनिवार्य है। प्रस्तुत प्रवाह लूप स्टेंट (इस मामले में, न्यूरोवैस्कुलर) के हीमोस्टैटिक प्रदर्शन का विश्लेषण करने और प्रतिकूल प्रभावों को प्रकट करने के लिए एक संवेदनशील मॉडल का वर्णन करता है। रक्त के पूर्वसक्रियता से बचने के लिए ताजा मानव पूरे रक्त और कोमल रक्त नमूने का उपयोग आवश्यक है। रक्त को 60 मीटर के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 150 मीटर प्रति वर्ष/मीन की दर से पेरिस्टेलिटिक पंप का उपयोग करके परीक्षण के नमूने वाले हेपरिनाइज्ड ट्यूबिंग के माध्यम से व्याप्त किया जाता है। परफ्यूजन से पहले और बाद में, हेमेटोलॉजिक मार्कर (यानी, रक्त कोशिका गणना, हीमोग्लोबिन, हेमेटोक्रिट, और प्लामेटिक मार्कर) ल्यूकोसाइट्स (पॉलीमॉर्फोन्यूक्लियर [पीएमएन]-इलास्टेस्टेस), प्लेटलेट्स (-थ्रोम्बोग्लोबुलिन [ए-टीजी]), जमावट प्रणाली (थॉम्बिन-एंटीथ्रोम्बिन III [TAT]), और पूरक कैस्केड (SC5b-9) का विश्लेषण किया जाता है। निष्कर्ष में, हम नैदानिक आवेदन से पहले स्टेंट और अन्य रक्त संपर्क उपकरणों के व्यापक हीमोकॉम्पिटीशन परीक्षण के लिए एक आवश्यक और विश्वसनीय मॉडल पेश करते हैं।

Introduction

प्रत्यारोपण और जैव सामग्री के वीवो आवेदन में, जो मानव रक्त के साथ बातचीत करते हैं, को हीमोस्टैटिक सिस्टम के विभिन्न मार्कर की जांच पर ध्यान केंद्रित करते हुए तीव्र प्रीक्लिनिकल परीक्षण की आवश्यकता होती है। मानकीकरण के लिए अंतर्राष्ट्रीय संगठन 10993-4 (आईएसओ 10993-4) रक्त संपर्क उपकरणों (यानी, स्टेंट और संवहनी ग्राफ्ट) के मूल्यांकन के लिए केंद्रीय सिद्धांतों को निर्दिष्ट करता है और डिवाइस डिजाइन, नैदानिक उपयोगिता और 1 कीजरूरतसामग्री पर विचार करता है।

मानव रक्त एक तरल पदार्थ है जिसमें विभिन्न प्लाज्मा प्रोटीन और कोशिकाएं होती हैं, जिनमें ल्यूकोसाइट्स (सफेद रक्त कोशिकाएं [डब्ल्यूबीसी]), एरिथ्रोसाइट्स (लाल रक्त कोशिकाएं [आरबीसी]), और प्लेटलेट्स शामिल हैं, जो मानव शरीर2में जटिल कार्यों को अंजाम देते हैं। रक्त के साथ विदेशी सामग्रियों का सीधा संपर्क प्रतिकूल प्रभाव पैदा कर सकता है, जैसे प्रतिरक्षा या जमावट प्रणाली की सक्रियता, जो3,4,5प्रत्यारोपण के बाद सूजन या थ्रोम्बोटिक जटिलताओं और गंभीर मुद्दों का कारण बन सकती है। इसलिएइन विट्रो हीमोकॉम्पेबिलिटी सत्यापन प्रत्यारोपण से पहले किसी भी हेमेटोलॉजिक जटिलताओं का पता लगाने और उन्हें बाहर करने का अवसर प्रदान करता है जो रक्त के संपर्क में विदेशी सतह6के साथ प्रेरित हो सकती है ।

प्रस्तुत प्रवाह लूप मॉडल की स्थापना न्यूरोवैस्कुलर स्टेंट और इसी तरह के उपकरणों की हीमोकॉम्पिटीशन का आकलन करने के लिए की गई थी, जिसमें सेरेब्रल प्रवाह की स्थिति और धमनी व्यास2,7की नकल करने के लिए ट्यूबिंग (3.2 मिमी का व्यास) में 150 मीटर/मिन की प्रवाह दर लागू करके की गई थी। एक इष्टतम इन विट्रो मॉडल की आवश्यकता के अलावा, बायोमटेरियल8की हीमोकॉम्पिटी का विश्लेषण करते समय रक्त का स्रोत विश्वसनीय और अनछुए परिणाम प्राप्त करने में एक महत्वपूर्ण कारक है। लंबे समय तक भंडारण के कारण होने वाले परिवर्तनों को रोकने के लिए नमूने के तुरंत बाद एकत्र रक्त का उपयोग किया जाना चाहिए। सामान्य तौर पर, रक्त ड्राइंग के दौरान प्लेटलेट्स और जमावट झरना के प्रीएक्टिवेशन को कम करने के लिए 21 जी सुई का उपयोग करके स्टेसिस के बिना रक्त का एक सौम्य संग्रह किया जाना चाहिए। इसके अलावा, दाता बहिष्कार मापदंड जो धूम्रपान करते हैं, गर्भवती हैं, स्वास्थ्य की एक गरीब स्थिति में हैं, या पिछले 14 दिनों के दौरान मौखिक गर्भ निरोधकों या दर्द निवारक ले लिया है शामिल हैं ।

यह अध्ययन प्रवाह की स्थिति में स्टेंट प्रत्यारोपण के व्यापक हीमोकॉम्पिटीबिलिटी परीक्षण के लिए एक इन विट्रो मॉडल का वर्णन करता है। फिब्रिन-हेपरिन-लेपित स्टेंट से अनकोटेड की तुलना करते समय, व्यापक हीमोकॉम्पेबिलिटी परीक्षणों के परिणाम फिब्रिन-हेपरिन-लेपित स्टेंट9की बेहतर हीमोकॉम्पिटीज को दर्शाते हैं। इसके विपरीत, अनकोटेड स्टेंट जमावट झरना की सक्रियता को प्रेरित करते हैं, जैसा कि थॉम्बिन-एंटीथ्रोबिन III (TAT) सांद्रता में वृद्धि और स्टेंट सतह पर प्लेटलेट्स के आसंजन के कारण रक्त प्लेटलेट नंबरों की हानि से प्रदर्शित होता है। कुल मिलाकर, डिवाइस के कारण होने वाले हीमोस्टैटिक सिस्टम पर किसी भी प्रतिकूल प्रभाव का पता लगाने के लिए प्रीक्लिनिकल परीक्षण के रूप में इस हीमोकॉम्पिटीशन मॉडल को एकीकृत करने की सिफारिश की जाती है।

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Protocol

रक्त नमूना प्रक्रिया Tuebingen विश्वविद्यालय में चिकित्सा संकाय की नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था (परियोजना पहचान कोड: 270/2010BO1) । सभी विषयों में भागीदारी से पहले शामिल करने के लिए लिखित, सूचित सहमति प्रदान की गई ।

1. हेपरिन-लोडेड मोनोवेट की तैयारी

  1. सोडियम क्लोराइड (नैसीएल, 0.9%) के साथ अपतला हेपरिन (5,000 आईयू/एमएल) मिलाएं समाधान और हेपरिन के 15 आईयू/एमएल के परिणामस्वरूप एकाग्रता के साथ एक समाधान तैयार करते हैं ।
  2. रक्त नमूने के बाद 1.5 आईयू/एमएल की अंतिम हेपरिन एकाग्रता प्राप्त करने के लिए प्रत्येक तटस्थ मोनोवेट (9 मिलील) के लिए पतला हेपरिन समाधान के 900 माइक्रोन जोड़ें। प्रति डोनर तीन मोनोवेट तैयार करें साथ ही तीन रिजर्व मोनोवेट करें और ब्लड सैंपलिंग तक हेपरिन लोडेड मोनोवेट को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

2. ब्लड सैंपलिंग

  1. रक्त नमूने से पहले रेफ्रिजरेटर 30 मिन से हेपरिन लोडेड मोनोवेट लें।
  2. प्रवाह पाश के लिए वेरिपंक्चर द्वारा प्रत्येक स्वस्थ दाता (एन = 5) से 27 मिलील रक्त नमूना लीजिए। प्लेटलेट्स और रक्त थक्के झरना के समय से पहले सक्रियन से बचने के लिए केवल एक चिकनी टूनीकेट लागू करें।
  3. हेपरिन समाधान (1.5 आईयू/एमएल) के 900 माइक्रोन युक्त तीन मोनोवेट में रक्त के नमूने एकत्र करें और यह सुनिश्चित करने के लिए कि सभी घटक समान रूप से वितरित किए जाएं, एक प्लास्टिक कंटेनर में सभी तीन मोनोवेट पूल करें।
  4. सीधे पूल किए गए हेपरिनीकृत रक्त को तीन अलग-अलग मोनोवेट में स्थानांतरित करें जिनमें या तो ईटीए (1.2 मिली), साइटरेट (1.4 मिली), या बेसलाइन मूल्यों को इकट्ठा करने के लिए सिट्रेट, थियोफिलिन, एडेनोसाइन और डिप्रिडामोल (सीटाएडी, 2.7 मिली) का मिश्रण होता है। धारा 5−8 में वर्णित नमूनों के साथ आगे बढ़ें।
    नोट: अप्रभावित थक्के व्यवहार की गारंटी के लिए, दानदाताओं को पिछले 14 दिनों के भीतर हेमोस्टेसिस-प्रभावित दवाओं (जैसे, एसीटिल्सलिसलिक एसिड, नेप्रोसेन और कार्बेनिकलिन) के सेवन से बचना चाहिए, साथ ही मौखिक गर्भ निरोधकों और धूम्रपान।

3. फ्लो लूप की तैयारी

  1. 75 सेमी की लंबाई और 3.2 मिमी के आंतरिक व्यास के साथ तीन हेपरिन-लेपित पॉलीविनाइल क्लोराइड ट्यूब काटें। ट्यूबों को न्यूरोवैस्कुलर लेजर-कट प्रत्यारोपण के साथ या बिना फिब्रिन-हेपरिन कोटिंग के साथ लोड करें। एक टब एक नियंत्रण के रूप में उतारा छोड़ने के लिए याद रखें ।
  2. 0.9% नैल से भरे जलाशय में ट्यूब का एक सिर रखें, ट्यूबिंग को पंप हेड से कनेक्ट करें, और दूसरे छोर को मापने वाले सिलेंडर में डालें।
  3. मापने वाले सिलेंडर में भरने के स्तर की जांच करते समय टाइमर का उपयोग करके 150 मीटर/मिन की प्रवाह दर प्राप्त करने के लिए पेरिस्टेलिटिक पंप की सेटिंग्स को समायोजित करें।

4. हीमोकॉम्पिटीशन टेस्टिंग का प्रदर्शन

  1. नलियों को खून से भरने के लिए 12 मिलीएल सिरिंज का इस्तेमाल करें। रक्त के 6 mL एक नमूना या अनलोड नियंत्रण युक्त प्रत्येक ट्यूब में सुचारू रूप से प्रवाह करते हैं ।
  2. एक सर्किट बनाएं और सिलिकॉन कनेक्शन ट्यूबिंग की 0.5 सेमी लंबाई का उपयोग करके ट्यूबों को कसकर बंद करें। ट्यूबों को 37 डिग्री सेल्सियस के पानी के स्नान में रखें और 60 मिन के लिए परफ्यूजन शुरू करें।

5. पूरे रक्त गिनती विश्लेषण

  1. नमूना (बेसलाइन) के बाद या ईटीए युक्त मोनोवेट में छिद्रण के बाद रक्त का 1.2 मिलील डालें और ट्यूब 5x को ध्यान से उलट दें।
  2. मोनोवेट को ब्लड एनालाइजर में डालें और हर नमूने के लिए ब्लड काउंट एनालिसिस करें। फिर, धारा 7 में वर्णित, आगे विश्लेषण के लिए रक्त गिनती माप के बाद 15−60 0 0 0 00 मीटर के लिए बर्फ पर मोनोवेट इनक्यूबेट करें।

6. सिट्रेट प्लाज्मा का संग्रह

  1. 1.4 मीटर रक्त (हौसले से तैयार या परिसंचरण के बाद) और ध्यान से उलटा 5x के साथ सिट्रेट युक्त मोनोवेट भरें।
  2. कमरे के तापमान (आरटी) पर 18 00 x ग्राम पर 18 न्यूनतम के लिए ट्यूबों को अपकेंद्रित करें। अलीकोट प्लाज्मा अंश के तीन 250 माइक्रोन नमूने 1.5 मिलीग्राम प्रतिक्रिया ट्यूबों में और तरल नाइट्रोजन में प्लाज्मा के नमूनों को फ्रीज करते हैं। विश्लेषण तक उन्हें -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

7. ईटीए प्लाज्मा का संग्रह

  1. रक्त गणना माप के बाद 15−60 मीटर के लिए बर्फ पर मोनोवेट इनक्यूबेट करें। इसके बाद 20 मिन के लिए ट्यूबों को 2,500 एक्स जी और 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित करें।
  2. अलीकोट प्लाज्मा अंश के तीन 250 माइक्रोन नमूने केंद्रीकरण के बाद 1.5 मिलीग्राम प्रतिक्रिया ट्यूबों में और तरल नाइट्रोजन में ट्यूबों फ्रीज। विश्लेषण तक उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

8. सीटीएडी प्लाज्मा का संग्रह

  1. सीटीएडी मिश्रण वाले मोनोवेट को 2.7 मीटर रक्त (हौसले से तैयार या ऊष्मायन के बाद) और सावधानीपूर्वक उलटा 5x के साथ भरें। बाद में, बर्फ पर मोनोवेट को 15−60 0 0 0 00 मीटर के लिए इनक्यूबेट करें। इसके बाद 20 मिन के लिए ट्यूबों को 2,500 एक्स जी और 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित करें।
  2. मध्य प्लाज्मा अंश के 700 माइक्रोन को 1.5 मिलीग्राम प्रतिक्रिया ट्यूब में स्थानांतरित करें और 2,500 x ग्राम और 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए भरे हुए प्रतिक्रिया ट्यूबों को अपकेंद्रित करें।
  3. अलीकोट मध्य अंश के दो 100 माइक्रोन नमूने सेंट्रलाइज्ड के बाद 1.5 मिलीग्राम रिएक्शन ट्यूब में बदल जाते हैं और तरल नाइट्रोजन में ट्यूबों को फ्रीज कर देते हैं। विश्लेषण तक उन्हें -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: EDTA प्लाज्मा और CTAD प्लाज्मा का संग्रह एक साथ किया जा सकता है क्योंकि ऑपरेटिंग शर्तों एक ही हैं ।

9. सिट्रेट प्लाज्मा से मानव TAT की माप

  1. 37 डिग्री सेल्सियस के पानी के स्नान में सिट्रेट प्लाज्मा गल।
  2. निर्माता के निर्देशों के अनुसार टैट एंजाइम से जुड़े इम्यूनोसोरबेंट परख (एलिसा) किट का उपयोग करें। प्लाज्मा मानकों और नियंत्रण का पुनर्निर्माण करें और धुलाई समाधान, एंटी-ह्यूमन-टैट पेरोक्सीसे (पीओडी) - संयुग्मित एंटीबॉडी और क्रोमोजन समाधान को पतला करें। टेस्ट शुरू करने से पहले 30 मिन के लिए सभी रिएजेंट्स और माइक्रोटिटर प्लेट को आरटी (15−25 डिग्री सेल्सियस) पर छोड़ दें।
  3. माइक्रोटिटर प्लेट के प्रत्येक कुएं में नमूना बफर का पिपेट 50 माइक्रोन और नमूना बफर (खाली), प्लाज्मा मानक, प्लाज्मा नियंत्रण, और अच्छी प्लेट में डुप्लिकेट में बिना पतला प्लाज्मा नमूना के 50 माइक्रोन जोड़ें। थाली को सील करें और कोमल झटकों के साथ 15 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। इसके बाद प्लेट 3x को वॉशिंग सॉल्यूशन के 300 माइक्रोन से धो लें।
  4. प्रत्येक अच्छी तरह से POD-conjugated विरोधी मानव TAT एंटीबॉडी के 100 μL जोड़ें। थाली को सील करें और कोमल झटकों के साथ 15 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। इसके बाद प्लेट 3x को वॉशिंग सॉल्यूशन के 300 माइक्रोन से धो लें।
  5. प्रत्येक अच्छी तरह से हौसले से तैयार गुणसूत्र समाधान के 100 μL जोड़ें। 30 मिन के लिए आरटी पर प्लेट और इनक्यूबेट सील करें।
  6. सील फिल्म निकालें और प्रत्येक अच्छी तरह से बंद समाधान के 100 μL जोड़ें। 490−500 एनएम पर फोटोमीटर के साथ ऑप्टिकल डेंसिटी (ओडी) पढ़ें। मानक वक्र डेटा को ट्रेंड लाइन के रूप में फिट करें और नमूनों की एकाग्रता की गणना करें।

10. सिट्रेट प्लाज्मा से पीएमएन-इलास्टीज़ का मापन

  1. 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में सिट्रेट प्लाज्मा गल।
  2. निर्माता के निर्देशों के अनुसार पॉलीमॉर्फोन्यूक्लियर (पीएमएन) - इलास्टेस एलिसा किट का उपयोग करें: किट के कमजोर पड़ने वाले बफर का उपयोग करके एक मानक वक्र तैयार करने के लिए पीएमएन-इलास्टीज़ नियंत्रण और पीएमएन-इलास्टे मानक का पुनर्निर्माण करें।
  3. निर्माता के विवरण के अनुसार वाशिंग समाधान को पतला करें। परीक्षण शुरू करने से पहले 30 मिन के लिए आरटी पर सभी अभिकर्मकों और माइक्रोटिटर प्लेट को छोड़ दें। सीट्रेट प्लाज्मा के नमूनों को कमजोर पड़ने वाले बफर के साथ 1:100 तक पतला करें।
  4. नमूना बफर (खाली), पीएमएन-इलास्टीज़ मानक वक्र (15.6−1,000 एनजी/एमसीएल), पीएमएन-इलास्टीज़ नियंत्रण (उच्च और निम्न सांद्रता), और डुप्लिकेट में पतला प्लाज्मा नमूने अच्छी प्लेट में 100 माइक्रोन जोड़ें। कोमल मिलाते हुए के साथ ६० मेंस के लिए आरटी पर थाली और इनक्यूबेट सील । बाद में, प्लेट 4x को धोने के समाधान के 300 माइक्रोन के साथ धोलें।
  5. प्रत्येक अच्छी तरह से एंजाइम-संयुग्मित एंटीबॉडी के 150 माइक्रोन जोड़ें। कोमल मिलाते हुए के साथ ६० मेंस के लिए आरटी पर थाली और इनक्यूबेट सील । बाद में, प्लेट 4x को धोने के समाधान के 300 माइक्रोन के साथ धोलें।
  6. प्रत्येक कुएं के लिए 3,3,5,5,5'-tetramethylbenzin (TMB) सब्सट्रेट समाधान के 200 माइक्रोन जोड़ें। अंधेरे में 20 मिन के लिए आरटी पर प्लेट और इनक्यूबेट सील करें। फिर, सील फिल्म को हटा दें और प्रत्येक कुएं में स्टॉप समाधान के 50 माइक्रोन जोड़ें।
  7. 630 एनएम पर एक संदर्भ पढ़ने के साथ 450 एनएम पर एक फोटोमीटर के साथ ओडी पढ़ें। मानक वक्र डेटा को ट्रेंड लाइन के रूप में फिट करें और नमूनों की एकाग्रता की गणना करें।

11. ईटीए प्लाज्मा से टर्मिनल पूरक परिसर (टीसीसी) का मापन

  1. 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में EDTA प्लाज्मा गल, और defrosting के बाद बर्फ पर स्टोर।
  2. निर्माता के निर्देशों के अनुसार पूरक झरना SC5b-9 एलिसा किट का उपयोग करें: निर्माता के प्रोटोकॉल में वर्णित धुलाई समाधान को पतला करें। परीक्षण शुरू करने से पहले 30 मिन के लिए आरटी पर सभी अभिकर्मकों और माइक्रोटिटर प्लेट को छोड़ दें। किट के कमजोर पड़ने बफर के साथ 1:10 के लिए EDTA प्लाज्मा नमूनों को पतला करें।
  3. 2 मिन के बाद सतह और एस्पिरेट को फिर से हाइड्रेट करने के लिए प्रत्येक कुएं में धोने के समाधान के 300 माइक्रोन जोड़ें। नमूना बफर (खाली), SC5b-9 मानकों, SC5b-9 नियंत्रण (उच्च और कम सांद्रता), और अच्छी प्लेट के लिए डुप्लिकेट में पतला प्लाज्मा नमूने के 100 μL जोड़ें।
  4. 60 मिन के लिए आरटी पर प्लेट और इनक्यूबेट सील करें। इसके बाद, प्लेट 5x को धोने के समाधान के 300 माइक्रोन के साथ धोलें।
  5. प्रत्येक अच्छी तरह से एंजाइम-conjugated एंटीबॉडी के 50 μL जोड़ें। 30 मिन के लिए आरटी पर प्लेट और इनक्यूबेट सील करें। इसके बाद प्लेट 5x को वॉशिंग सॉल्यूशन के 300 माइक्रोन से धो लें।
  6. प्रत्येक अच्छी तरह से टीएमबी-सब्सट्रेट समाधान के 100 माइक्रोन जोड़ें। अंधेरे में 15 मिन के लिए आरटी पर प्लेट और इनक्यूबेट सील करें।
  7. सील फिल्म निकालें और प्रत्येक अच्छी तरह से बंद समाधान के 100 μL जोड़ें। 450 एनएम पर एक फोटोमीटर के साथ ओडी पढ़ें। मानक वक्र डेटा को ट्रेंड लाइन के रूप में फिट करें और नमूनों की एकाग्रता की गणना करें।

12. सीटीएडी प्लाज्मा से थ्रोम्बोग्लोबोलिन का मापन

  1. 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में सीटीएडी प्लाज्मा गल।
  2. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एट्रोम्बोग्लोबुलिन (टीजी) एलिसा किट का उपयोग करें: प्रदान किए गए फॉस्फेट बफर का उपयोगकरके पॉड-कॉन्जुगेटेड एंटीबॉडी का पुनर्निर्माण करें। परीक्षण शुरू करने से पहले 30 मिन के लिए आरटी पर सभी अभिकर्मकों और माइक्रोटिटर प्लेट को छोड़ दें।
  3. प्रदान की फॉस्फेट बफर के साथ निर्माता के निर्देशों के अनुसार मानक वक्र और नियंत्रण तैयार करें। 1:21 के लिए CTAD प्लाज्मा नमूनों पतला ।
  4. फॉस्फेट बफर (खाली), टीजी मानकों, टीजी नियंत्रण (उच्च और निम्न सांद्रता) के 200 माइक्रोन जोड़ें, और अच्छी प्लेट में डुप्लिकेट में पतला प्लाज्मा नमूने डालें। प्लेट सील और 60 00 के लिए आर टी पर इनक्यूबेट. बाद में, धोने के समाधान के 300 μL के साथ प्लेट 5x धोने.
  5. प्रत्येक अच्छी तरह से एंजाइम-conjugated एंटीबॉडी के 200 μL जोड़ें। प्लेट सील और 60 00 के लिए आर टी पर इनक्यूबेट. बाद में, धोने के समाधान के 300 μL के साथ प्लेट 5x धोने.
  6. प्रत्येक अच्छी तरह से टीएमबी-सब्सट्रेट समाधान के 200 माइक्रोन जोड़ें। अंधेरे में 5 मिन के लिए आरटी पर प्लेट और इनक्यूबेट सील करें। सील फिल्म निकालें और प्रत्येक अच्छी तरह से 1 एम सल्फ्यूरिक एसिड (एच2एसओ4)के 50 माइक्रोन जोड़कर प्रतिक्रिया को रोकें।
  7. 15−60 0 00 00 के लिए प्लेट छोड़ दें, फिर 450 एनएम पर फोटोमीटर के साथ ओडी पढ़ें। मानक वक्र डेटा को ट्रेंड लाइन के रूप में फिट करें और नमूनों की एकाग्रता की गणना करें।

13. इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग के लिए नमूना तैयारी

  1. संदंश का उपयोग करट्यूब से प्रत्यारोपण निकालें और इसे 0.9% NaCl समाधान 3x में डुबोकर संक्षेप में प्रत्यारोपण कुल्ला।
  2. ग्लूटाराल्डिहाइड समाधान (फॉस्फेट-बफर्ड लवण [सीए2 +/एमजी2 +]]के बिना पीबीएस-बफर में 2% ग्लूटाराल्डिहाइड 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर स्टोर करें।
  3. इसके बाद, पीबीएस-बफर में 10 टिन के लिए प्रत्यारोपण को इनक्यूबेट करें। 10 मिन के लिए एकाग्रता बढ़ाने के साथ इथेनॉल में इनक्यूबेटिंग करके नमूनों को निर्जलित करें: 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 96%, और 100%। निर्जलित नमूनों को आगे के विश्लेषण तक 100% इथेनॉल में स्टोर करें।
  4. इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसईएम) स्कैन करने से ठीक पहले सुखाने वाले उपकरण या साहित्य10 के निर्देशों के अनुसार महत्वपूर्ण बिंदु सुखाने का प्रदर्शन करें।

14. स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी

  1. स्कैनिंग माइक्रोस्कोप के लिए एक नमूना वाहक के लिए सूखे प्रत्यारोपण संलग्न और सोने पैलेडियम के साथ नमूनों स्पंदन ।
  2. नमूना कक्ष में स्पंदित प्रत्यारोपण परिचय। प्रतिनिधि सतह और सेल आसंजन के साथ क्षेत्रों के 100-, 500-, 1,000 और 2,500 गुना आवर्धन में तस्वीरें लें।

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Representative Results

संक्षेप में, मानव पूरे रक्त हेपरिन-लोडेड मोनोवेट में एकत्र किया गया था, फिर कोशिका गिनती के बेसलाइन स्तर के साथ-साथ प्लामेटिक हीमोकॉम्पिटी मार्कर का मूल्यांकन करने के लिए उपयोग किया जाता था।

बाद में न्यूरोवैस्कुलर इंप्लांट के नमूने युक्त ट्यूबिंग भरी गई और पेरिटैलिटिक पंप का उपयोग करके 150 मीटर/मिन और 37 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिन के लिए रक्त का उपयोग किया गया। फिर, सभी समूहों में कोशिकाओं की संख्या का विश्लेषण किया गया था, और प्लाज्मा नमूने एलिसा विश्लेषण(चित्रा 1)के लिए तैयार किए गए थे। रक्त कोशिकाओं और रक्त मापदंडों, जैसे हीमोग्लोबिन और हेमेटोक्रिट का परिमाणीकरण रक्त संग्रह के साथ-साथ सभी नमूना प्रकारों और नियंत्रण के लिए प्रवाह लूप मॉडल में परफ्यूजन के बाद सीधे किया गया था। डब्ल्यूबीसी(चित्रा 2ए),आरबीसी(चित्रा 2बी),या हेमेटोक्रिट मूल्यों(चित्रा 2सी)की संख्या के बारे में कोई परिवर्तन नहीं पाया गया। हालांकि, बेसलाइन मूल्यों की तुलना में फ्लो लूप मॉडल में रक्त के ऊष्मायन के बाद हीमोग्लोबिन के स्तर में कमी का पता चला, जो फ्लो लूप सिस्टम(चित्रा 2डी)में रक्त के परफ्यूजन के कारण था। इसके अलावा ब्लड परफ्यूजन के कारण प्लेटलेट नंबरों में कमी देखी गई। इसके अलावा, यह प्रभाव तब बढ़ा या जब ट्यूबिंग में एक अनकोटेड स्टेंट मौजूद था, जो बायोमटेरियल के लिए प्लेटलेट्स के आसंजन का संकेत देता था। फिर भी, यह स्पष्ट रूप से प्रदर्शित किया गया था कि प्लेटलेट्स का नुकसान काफी अधिक था जब अनकोटेड स्टेंट रक्त के साथ इनक्यूबेटेड था, जैसा कि फिब्रिन-हेपरिन-लेपित स्टेंट(चित्रा 2ई)का विरोध किया गया था।

हेमेटोलॉजिक प्लाज्मा मार्कर के संभावित परिवर्तनों की भी जांच परीक्षण समूहों में परफ्यूजन के बाद और हौसले से तैयार रक्त के आधारभूत मूल्यों की तुलना में की गई थी। टैट जटिल एकाग्रता, जो जमावट प्रणाली की सक्रियता की स्थिति को दर्शाती है, रक्त परफ्यूजन(चित्रा 3ए)के कारण हल्का बढ़ गया था। नंगे धातु स्टेंट समूह में, हालांकि, टैट में एक महत्वपूर्ण वृद्धि का पता चला, जमावट प्रणाली की एक गहरी सक्रियता का संकेत है । फिब्रिन-हेपरिन-कोटेड स्टेंट ने जमावट प्रणाली की सक्रियता को रोका, क्योंकि एटमें कोई वृद्धि निर्धारित नहीं की गई थी।

परफ्यूजन ने पूरक झरना की सक्रियता में वृद्धि की, जो SC5b-9(चित्रा 3बी)को मापने के द्वारा निर्धारित किया गया था। हालांकि, अनकोटेड या फिब्रिन-हेपरिन-कोटेड स्टेंट के साथ इन्क्यूबेशन ने SC5b-9 एकाग्रता को और नहीं बढ़ाया। पीएमएन-इलास्टीज़ सांद्रता(चित्रा 3सी)के मात्राकरण के माध्यम से न्यूट्रोफिल ग्रैनुलोसाइट्स की सक्रियता का विश्लेषण करते समय इसी तरह के परिणाम प्राप्त किए गए थे।

एसईएम का उपयोग करके स्टेंट की सतह का दृश्य किया गया था। रक्त के ऊष्मायन के बाद दोनों स्टेंट समूहों के बीच स्पष्ट मतभेद ों का पता चला। जबकि अनकोटेड स्टेंट की सतह पर रक्त कोशिकाओं और प्रोटीन का एक घना नेटवर्क मौजूद था, प्रोटीन या कोशिकाओं का कोई आसंजन फिब्रिन-हेपरिन-लेपित स्टेंट(चित्रा 4)की सतह पर नहीं पाया गया था।

Figure 1
चित्रा 1: एक अच्छी तरह से स्थापित प्रवाह पाश मॉडल में स्टेंट के हीमोकॉम्पिटीशन मूल्यांकन का योजनाबद्ध सिंहावलोकन। ताजा मानव पूरा रक्त रक्त ट्यूबों में स्वस्थ दाताओं से एकत्र किया जाता है जिसमें एंटीकोगुलेशन के लिए हेपरिन होता है। प्रत्येक दाता के लिए, एक खाली ट्यूब के साथ-साथ नमूना सामग्री के साथ प्रीलोडेड ट्यूबों को बाद में ताजा रक्त से भरा जाता है और प्रवाह लूप में 60 वर्ष के लिए 37 डिग्री सेल्सियस की दर से 150 मीटर/मिन में इनक्यूबेटेड किया जाता है। इसके अतिरिक्त, प्रत्येक दाता के आधारभूत मूल्यों को प्राप्त करने के लिए ताजा तैयार रक्त से प्लाज्मा नमूने तैयार किए जाते हैं। ऊष्मायन के बाद, परीक्षण ट्यूबिंग से प्लाज्मा नमूने, नमूना सामग्री के साथ और बिना, एक विशिष्ट एलिसा का उपयोग करके तैयार और विश्लेषण किए जाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: प्रवाह लूप मॉडल में विभिन्न स्टेंट प्रत्यारोपण के ऊष्मायन से पहले और बाद में विभिन्न सेल प्रकार ों और रक्त मापदंडों का विश्लेषण। सफेद रक्त कोशिकाओं(ए),लाल रक्त कोशिकाओं(बी),हेमेटोक्रिट(सी),हीमोग्लोबिन(डी),और प्लेटलेट्स(ई)का निर्धारण किया गया था। डेटा को मतलब ± एसईएम (एन = 5, पी * एंड एलटी; 0.5, पी *** और एलटी; 0.001) के रूप में प्रदर्शित किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: न्यूरोवैस्कुलर प्रत्यारोपण के साथ ऊष्मायन से पहले और बाद में प्लेटलेट या प्रतिरक्षा प्रणाली सक्रियण मार्कर का निर्धारण। रक्त जमावट (TAT),(बी)पूरक प्रणाली (SC5b-9) के(ए)सक्रियण के लिए मार्कर, और(सी)न्यूट्रोफिल (पीएमएन-इलास्टीज) को एलिसा का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। विश्लेषण प्लाज्मा नमूनों पर किया गया था हौसले से तैयार रक्त या रक्त प्रवाह पाश मॉडल में विभिन्न स्टेंट के साथ इनक्यूबेटेड से प्राप्त की । डेटा मतलब ± एसईएम (एन = 5, पी * और एलटी; 0.5) के रूप में प्रदर्शित किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: रक्त के साथ ऊष्मायन के बाद स्टेंट के इलेक्ट्रॉन सूक्ष्म विश्लेषण स्कैनिंग। अनकोटेड स्टेंट मटेरियल पर ब्लड प्लाज्मा प्रोटीन और प्लेटलेट्स का एकत्रीकरण देखा गया। इसकी तुलना में, फिब्रिन-हेपरिन कोटिंग के साथ स्टेंट सामग्रियों ने सतह पर कोशिकाओं या अन्य रक्त घटकों के आसंजन को प्रदर्शित नहीं किया (500-, 1,000-, और 2,500 गुना का आवर्धन)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

प्रस्तुत प्रोटोकॉल मानव रक्त प्रवाह की नकल करने वाले कतरनी प्रवाह मॉडल में आईएसओ 10993-4 के अनुसार रक्त-संपर्क प्रत्यारोपण के हीमोकॉम्पिटीशन परीक्षण के लिए एक व्यापक और विश्वसनीय विधि का वर्णन करता है। यह अध्ययन लेजर-कट न्यूरोवैस्कुलर प्रत्यारोपण के परीक्षण पर आधारित है लेकिन विभिन्न नमूनों के साथ किया जा सकता है। परिणाम प्रदर्शित करते हैं कि यह विधि रक्त कोशिका गिनती, कई हीमोकॉम्पिटीशन मार्कर की व्यापकता और रक्त संपर्क के बाद डिवाइस की सतह के सूक्ष्म दृश्य जैसे विभिन्न मापदंडों के व्यापक विश्लेषण को सक्षम बनाती है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, विभिन्न उपकरणों की हीमोकॉम्पिटी के बारे में संभावित मतभेदों का पता लगाया जा सकता है।

इन विट्रो हीमोकॉम्पेबिलिटी मूल्यांकन के लिए एक विकल्प वीवो पशु परीक्षण में होता है, जो ऊतक चोट6के भारी अल्पकालिक प्रभावों के कारण उच्च परिवर्तनशीलता और डिवाइस से संबंधित प्रभावों को विकृत करने जैसे कई नुकसानों से जुड़ा हुआ है।

इन विट्रो हीमोकॉम्पिटीशन परीक्षण के लिए, तीन प्रकार के मॉडल उपलब्ध हैं: (1) स्थिर रक्त ऊष्मायन मॉडल, (2) उत्तेजित रक्त ऊष्मायन मॉडल, और (3) कतरनी प्रवाह मॉडल। स्थिर मॉडल सीधे रक्त के साथ डिवाइस को इनक्यूबेटकरके द्वारा थ्रोम्बोजेनिकिटी निर्धारित करने के लिए एक सरल और तीव्र विधि प्रदान करता है, लेकिन यह केवल हीमोकॉम्पिटी11के बारे में प्रारंभिक परिणाम की ओर जाता है। स्थिर मॉडल (यानी, रक्त कोशिकाओं की तलछट और बड़ी हवा से संपर्क सतह) के मुख्य नुकसान को दूर करने के लिए, आंदोलनकारी रक्त ऊष्मायन मॉडल का उपयोग किया जा सकता है, जिसमें प्रत्यारोपण युक्त एक परीक्षण कक्ष रक्त से भरा होता है और एक कमाल के मंच12पर इनक्यूबेटेड होता है। हालांकि, ये मॉडल प्रकार अभी भी मौजूदा कतरनी प्रवाह मॉडल की तुलना में कमतर हैं, जैसे कि यहां प्रस्तुत प्रवाह लूप। इन मॉडलों का मर्म यह है कि संवहनी मानव रक्त प्रवाह की नकल की जा सकती है; इस प्रकार, प्रत्यारोपण और रक्त कोशिकाओं के बीच असली बातचीत का एक करीबी चित्रण13प्रदर्शित किया जा सकता है . फ्लो लूप मॉडल के अलावा, चांडलर लूप या कई पर्फ्यूज्ड फ्लो चैंबर जैसे मॉडल14,15,16मौजूद हैं।

चांडलर लूप एक बंद ट्यूब सिस्टम है जो आंशिक रूप से हवा से भरा हुआ है और घूर्णन उपकरण में दबा या जाता है, जिसके परिणामस्वरूप ट्यूबिंग17के माध्यम से रक्त परिसंचरण होता है। वर्तमान प्रवाह लूप सिस्टम में, ट्यूब पूरी तरह से रक्त से भर जाता है, और एक पेरिटैटिक पंप का उपयोग करके प्रवाह को मजबूर किया जाता है। चांडलर लूप मॉडल का उपयोग करते समय, ऑपरेटरों को परीक्षण ट्यूबिंग में हवा सहित की आवश्यकता के कारण दो प्रमुख नुकसान का सामना करना पड़ता है। सबसे पहले, यह ज्ञात है कि रक्त और हवा की निरंतर बातचीत ल्यूकोसाइट्स और प्लेटलेट्स के एकत्रीकरण के साथ-साथ प्रोटीन डेनेटेशन18,19को ट्रिगर करती है। दूसरा, रक्त परिसंचरण दर सीमित है, क्योंकि हवा हमेशा लूप20के उच्चतम बिंदु पर रहती है।

फ्लो लूप सिस्टम का उपयोग करते समय इन कमियों को दूर किया जा सकता है। चूंकि सिस्टम में कोई एयर-लिक्विड इंटरफेस मौजूद नहीं है, इसलिए प्लेटलेट एक्टिवेशन नहीं होता है। इस प्रकार, मॉडल थ्रोम्बोटिक घटनाओं के लिए एक कम पृष्ठभूमि है ताकि एंटीकोगुलेंट की कम एकाग्रता, आमतौर पर 1 IU/mL या १.५ IU/mL heparin, थक्के को रोकने के लिए पर्याप्त है, भले ही उच्च प्रवाहदर6लागू कर रहे हैं । समायोज्य पंप-विनियमित रक्त प्रवाह दर और स्वतंत्र रूप से चयनित ट्यूब व्यास ऑपरेटर को नस या धमनी की शारीरिक स्थितियों की नकल करने की अनुमति देता है, जो परीक्षण किए जाने वाले प्रत्यारोपण के अनुरूप है, और प्रासंगिक परीक्षण परिणाम21प्राप्त करता है। हालांकि, यह लाभ एक ही समय में एक सीमा है, पंप के माध्यम से रक्त पर लागू यांत्रिक तनाव के कारण, और एरिथ्रोसाइट्स (यानी, हीमोलिसिस) का विनाश2हो सकता है। यह उत्पन्न होने वाली आंतरिक रक्त क्षति विधि संवेदनशीलता को कम करती है औररक्त 21के लंबे समय तक संपर्क में आती है । फिर भी, कई अध्ययनों ने हीमोकॉम्पिटीबिलिटी मूल्यांकन22,23,24के लिए फ्लो लूप मॉडल के प्रभावी उपयोग का प्रदर्शन किया है।

हालांकि, सभी इन विट्रो मॉडल और वीवो तंत्र के बीच मुख्य अंतर में लापता एंडोथेलियम शामिल है, जो साइटोकिन्स, एंटी थ्रोम्बोटिक घटकों और आसंजन अणुओं को व्यक्त करता है; इसलिए, इस घटक प्रत्यारोपण और रक्त25परिसंचारी की बातचीत में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है . निष्कर्ष में, प्रवाह लूप मॉडल नैदानिक उपयोग से पहले प्रत्यारोपण की हीमोकॉम्पिटी का आकलन करने के लिए समायोज्य, कुशल, विश्वसनीय और लागत प्रभावी है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के प्रदर्शन के लिए, हम विश्वविद्यालय अस्पताल Tuebingen के चिकित्सा सामग्री विज्ञान और प्रौद्योगिकी के खंड से अर्नेस्ट श्वाइज़र का शुक्रिया अदा करते हैं । इस शोध को राष्ट्रीय स्थिरता कार्यक्रम II (परियोजना BIOCEV-FAR LQ1604) के भीतर सीआर के शिक्षा, युवा और खेल मंत्रालय द्वारा और चेक साइंस फाउंडेशन परियोजना संख्या 18-01163S द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
aqua ad iniectabilia Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany 1088813
beta-TG ELISA Diagnostica Stago, Duesseldorf, Germany 00950
Centrifuge Rotana 460 R Andreas Hettich, Tuttlingen, Germany -
Citrat monovettes (1.4 mL) Sarstedt, Nümbrecht, Germany 6,16,68,001
CTAD monovettes (2.7 mL) BD Biosciences, Heidelberg, Germany 367562
EDTA monovettes (1.2 mL) Sarstedt, Nümbrecht, Germany 6,16,62,001
Ethanol p.A. (1000 mL) AppliChem, Darmstadt, Germany 1,31,08,61,611
Glutaraldehyde (25 % in water) SERVA Electrophoresis, Heidelberg, Germany 23114.01
Heparin coating for tubes Ension, Pittsburgh, USA -
Heparin-Natrium (25.000 IE/ 5 mL) LEO Pharma, Neu-Isenburg, Germany PZN 15261203
Multiplate Reader Mithras LB 940 Berthold, Bad Wildbad, Germany -
NaCl 0,9% Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany 1312813
Neutral monovettes (9 mL) Sarstedt, Nümbrecht, Germany 2,10,63,001
PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+) Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany 70011044
Peristaltic pump ISM444B Cole Parmer, Wertheim, Germany 3475
Pipette (100 µL) Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany 3124000075
Pipette (1000 µL) Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany 3123000063
Plastic container (100 mL) Sarstedt, Nümbrecht, Germany 7,55,62,300
PMN-Elastase ELISA Demeditec Diagnostics, Kiel Germany DEH3311
Polyvinyl chloride tube Saint-Gobain Performance Plastics Inc., Courbevoie France -
Reaction Tubes (1.5 mL) Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany 30123328
neurovascular laser-cut implants Acandis GmbH, Pforzheim 01-0011x
SC5b-9 ELISA TECOmedical, Buende, Germany A029
Scanning electron microscope Cambridge Instruments, Cambridge, UK -
Sealing tape (96 well plate) Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany 15036
Syringe 10/12 mL Norm-Ject Henke-Sass-Wolf, Tuttlingen, Germany 10080010
TAT micro kit Siemens Healthcare, Marburg, Germany OWMG15
Waterbath Type 1083 Gesellschaft für Labortechnik, Burgwedel, Germany -

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References

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चिकित्सा अंक १५७ हीमोcompatibility प्रवाह पाश मॉडल रक्त से संपर्क उपकरणों मानव रक्त आईएसओ 10993-4 चिकित्सा उपकरणों का मूल्यांकन
मानव रक्त प्रवाह की नकल करने वाले फ्लो लूप मॉडल में रक्त-संपर्क प्रत्यारोपण का हीमोकॉम्पिटीशन परीक्षण
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