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Medicine

Teste de hemocompatibilidade de implantes de contato com o sangue em um modelo de loop de fluxo imitando o fluxo sanguíneo humano

Published: March 5, 2020 doi: 10.3791/60610

Summary

Este protocolo descreve uma avaliação abrangente da hemocompatibilidade de dispositivos de contato com o sangue usando implantes neurovasculares cortados a laser. Um modelo de loop de fluxo com sangue humano fresco e heparinizado é aplicado para imitar o fluxo sanguíneo. Após a perfusão, vários marcadores hematológicos são analisados e comparados aos valores obtidos diretamente após a coleta de sangue para avaliação da hemocompatibilidade dos dispositivos testados.

Abstract

O uso crescente de dispositivos médicos (por exemplo, enxertos vasculares, stents e cateteres cardíacos) para fins temporários ou permanentes que permanecem no sistema circulatório do corpo exige uma abordagem confiável e multiparamétrica que avalia as possíveis complicações hematológicas causadas por esses dispositivos (ou seja, ativação e destruição de componentes sanguíneos). O teste abrangente de hemocompatibilidade in vitro de implantes de contato com o sangue é o primeiro passo para a implementação bem-sucedida in vivo. Portanto, a análise extensiva de acordo com a Organização Internacional para a Padronização 10993-4 (ISO 10993-4) é obrigatória antes da aplicação clínica. O ciclo de fluxo apresentado descreve um modelo sensível para analisar o desempenho hemostático dos stents (neste caso, neurovascular) e revelar efeitos adversos. O uso de sangue inteiro humano fresco e amostragem de sangue suave são essenciais para evitar a pré-ativação do sangue. O sangue é perfundido através de uma tubulação heparinizada contendo a amostra de ensaio usando uma bomba peristáltica a uma taxa de 150 mL/min a 37 °C por 60 min. Antes e depois da perfusão, marcadores hematológicos (i.e., contagem de células sanguíneas, hemoglobina, hematócrito e marcadores plasmáticos) indicando a ativação de leucócitos (polimorfonuclear [PMN]-elastase), plaquetas (β-tromboglobulina [β-TG]), o sistema de coagulação (thombin-antitrombina III [TAT]), e a cascata complementar (SC5b-9) são analisadas. Em conclusão, apresentamos um modelo essencial e confiável para testes extensivos de hemocompatibilidade de stents e outros dispositivos de contato com o sangue antes da aplicação clínica.

Introduction

A aplicação in vivo de implantes e biomateriais, que interagem com o sangue humano, requer intensos testes pré-clínicos com foco na investigação de vários marcadores do sistema hemosático. A Organização Internacional para a Padronização 10993-4 (ISO 10993-4) especifica os princípios centrais para a avaliação de dispositivos de contato com o sangue (ou seja, stents e enxertos vasculares) e considera o projeto do dispositivo, utilidade clínica e materiais necessários1.

O sangue humano é um fluido que contém várias proteínas e células plasmáticas, incluindo leucócitos (glóbulos brancos [CS),eritrócitos (glóbulos vermelhos [RBCs]) e plaquetas, que realizam funções complexas no corpo humano2. O contato direto de materiais estranhos com sangue pode causar efeitos adversos, como a ativação do sistema imunológico ou coagulante, que pode levar a inflamações ou complicações trombóticas e problemas graves após a implantação3,4,5. Portanto, a validação da hemocompatibilidade in vitro oferece uma oportunidade anterior à implantação para detectar e excluir quaisquer complicações hematológicas que possam ser induzidas ao contato do sangue com uma superfície estranha6.

O modelo de loop de fluxo apresentado foi estabelecido para avaliar a hemocompatibilidade de stents neurovasculares e dispositivos similares, aplicando uma taxa de fluxo de 150 mL/min na tubulação (diâmetro de 3,2 mm) para imitar condições de fluxo cerebral e diâmetros da artéria2,7. Além da necessidade de um modelo in vitro ideal, a fonte de sangue é um fator importante na obtenção de resultados confiáveis e inalterados ao analisar a hemocompatibilidade de um biomaterial8. O sangue coletado deve ser usado imediatamente após a amostragem para evitar alterações causadas pelo armazenamento prolongado. Em geral, uma coleta suave de sangue sem estase usando uma agulha de 21 G deve ser realizada para minimizar a pré-ativação de plaquetas e a cascata de coagulação durante a coleta de sangue. Além disso, os critérios de exclusão dos doadores incluem aqueles que fumam, estão grávidas, estão em estado de saúde ruim ou tomaram contraceptivos orais ou analgésicos nos últimos 14 dias.

Este estudo descreve um modelo in vitro para o extenso teste de hemocompatibilidade de implantes de stent em condições de fluxo. Ao comparar os stents revestidos com fibrina-heparina, os resultados dos testes abrangentes de hemocompatibilidade refletem a hemocompatibilidade melhorada dos stents revestidos com fibrina-heparina9. Em contraste, os stents não revestidos induzem a ativação da cascata de coagulação, como demonstrado por um aumento nas concentrações de thombin-antitrombina III (TAT) e perda de números de plaquetas sanguíneas devido à adesão das plaquetas à superfície do stent. No geral, recomenda-se a integração deste modelo de hemocompatibilidade como teste pré-clínico para detectar quaisquer efeitos adversos no sistema hemosático causados pelo dispositivo.

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Protocol

O procedimento de amostragem de sangue foi aprovado pelo Comitê de Ética da faculdade de medicina da Universidade de Tuebingen (código de identificação do projeto: 270/2010BO1). Todos os sujeitos forneceram consentimento por escrito e informado para inclusão antes da participação.

1. Preparação de Monovetas carregadas de heparina

  1. Misture a heparina não diluída (5.000 UI/mL) com cloreto de sódio (NaCl, 0,9%) solução e preparar uma solução com uma concentração resultante de 15 UI/mL de heparina.
  2. Adicione 900 μL da solução de heparina diluída a cada monovette neutra (9 mL) para obter uma concentração final de heparina de 1,5 UI/mL após a amostragem de sangue. Prepare três monovetas por doador mais três monovetas de reserva e armazene as monovetas carregadas de heparina a 4 °C até a amostragem de sangue.

2. Amostragem de sangue

  1. Tire as monovetas carregadas de heparina da geladeira 30 min antes da amostragem de sangue.
  2. Coletar uma amostra de sangue de 27 mL de cada doador saudável (n = 5) por punção venosa para o ciclo de fluxo. Aplique apenas um torniquete liso para evitar a ativação prematura das plaquetas e da cascata de coagulação sanguínea.
  3. Coletar amostras de sangue em três monovetas contendo 900 μL da solução de heparina (1,5 UI/mL) e juntar todas as três monovetas em um recipiente plástico para garantir que todos os componentes sejam distribuídos uniformemente.
  4. Transfira diretamente o sangue heparinizado agrupado em três monovetas diferentes contendo EDTA (1,2 mL), citrato (1,4 mL), ou uma mistura de citrato, teorilina, adenosina e dippiridamole (CTAD, 2,7 mL) para coletar valores de linha de base. Proceda com as amostras conforme descrito nas seções 5-8.
    NOTA: Para garantir o comportamento de coagulação não influenciado, os doadores devem evitar a ingestão de drogas que afetam a hemostasia (por exemplo, ácido acetilsalicílico, naproxeno e carbenicillin) nos últimos 14 dias, bem como contraceptivos orais e tabagismo.

3. Preparação do Ciclo de Fluxo

  1. Corte três tubos de cloreto de polivinil revestido sino revestido de heparina com um comprimento de 75 cm e diâmetro interno de 3,2 mm. Carregue os tubos com os implantes neurovasculares cortados a laser com ou sem o revestimento de fibrina-heparina. Lembre-se de deixar uma banheira descarregada como controle.
  2. Coloque uma extremidade do tubo em um reservatório preenchido com 0,9% de NaCl, conecte a tubulação à cabeça da bomba e insira a outra extremidade em um cilindro de medição.
  3. Ajuste as configurações da bomba peristáltica para obter uma taxa de fluxo de 150 mL/min usando um temporizador enquanto verifica o nível de preenchimento no cilindro de medição.

4. Desempenho dos testes de hemocompatibilidade

  1. Use uma seringa de 12 mL para encher os tubos com sangue. Deixe 6 mL de sangue fluir suavemente em cada tubo contendo uma amostra ou controle descarregado.
  2. Forme um circuito e feche os tubos firmemente usando um tubo de conexão de silicone de 0,5 cm. Coloque os tubos em um banho de água de 37 °C e inicie a perfusão por 60 min.

5. Análise completa da contagem sanguínea

  1. Coloque 1,2 mL de sangue após a amostragem (linha de base) ou após a perfusão em uma monoveta contendo EDTA e inverta cuidadosamente o tubo 5x.
  2. Insira a monoveta no analisador de sangue e faça uma análise de hemograma para cada amostra. Em seguida, incubar as monovetas no gelo por 15-60 min após a medição da contagem sanguínea para análise posterior, conforme descrito na seção 7.

6. Coleção de Plasma citrato

  1. Encha as monovetas contendo citrato com 1,4 mL de sangue (recém-desenhado ou após a circulação) e inverta cuidadosamente 5x.
  2. Centrifugar os tubos por 18 min a 1.800 x g à temperatura ambiente (RT). Alice três amostras de 250 μL da fração de plasma em tubos de reação de 1,5 mL e congele as amostras de plasma em nitrogênio líquido. Guarde-os a -20 °C até a análise.

7. Coleção de plasma EDTA

  1. Incubar as monovetas no gelo por 15-60 min após a medição da contagem sanguínea. Em seguida, centrifugue os tubos por 20 min a 2.500 x g e 4 °C.
  2. Alition três amostras de 250 μL da fração de plasma em tubos de reação de 1,5 mL após a centrifugação e congelar os tubos em nitrogênio líquido. Guarde-os a -80 °C até a análise.

8. Coleção de Plasma CTAD

  1. Encha as monovetas contendo a mistura de CTAD com 2,7 mL de sangue (recém-desenhado ou após a incubação) e inverta cuidadosamente 5x. Depois, incubar as monovetas no gelo por 15-60 min. Em seguida, centrifugue os tubos por 20 min a 2.500 x g e 4 °C.
  2. Transfira 700 μL da fração de plasma médio para um tubo de reação de 1,5 mL e centrifuga os tubos de reação preenchidos por 20 min a 2.500 x g e 4 °C.
  3. Alition duas amostras de 100 μL da fração média em tubos de reação de 1,5 mL após a centrifugação e congele os tubos em nitrogênio líquido. Guarde-os a -20 °C até a análise.
    NOTA: A coleção de plasma EDTA e plasma CTAD pode ser realizada em conjunto porque as condições de operação são as mesmas.

9. Medição de TAT humano a partir de plasma citrato

  1. Descongele o plasma citrato em um banho de água de 37 °C.
  2. Use o kit de ensaio imunosorbent (ELISA) ligado à enzima TAT de acordo com as instruções do fabricante. Reconstruir os padrões plasmáticos e controlar e diluir a solução de lavagem, anticorpo conjugado anti-humano-TAT (POD) e solução cromogenal. Deixe todos os reagentes e a placa de microtiter em RT (15-25 °C) por 30 min antes de iniciar o teste.
  3. Pipet 50 μL do tampão de amostra em cada poço da placa de microtiter e adicione 50 μL do tampão de amostra (em branco), padrão de plasma, controle de plasma e amostra de plasma não diluída em duplicatas à placa do poço. Sele a placa e incuba a 37 °C por 15 min com agitação suave. Em seguida, lave a placa 3x com 300 μL de solução de lavagem.
  4. Adicione 100 μL do anticorpo anti-humano-TAT conjugado pod a cada poço. Sele a placa e incuba a 37 °C por 15 min com agitação suave. Em seguida, lave a placa 3x com 300 μL de solução de lavagem.
  5. Adicione 100 μL da solução cromógena recém-preparada para cada poço. Sele a placa e incubar em RT por 30 min.
  6. Remova a filme de vedação e adicione 100 μL de solução de parada a cada poço. Leia a densidade óptica (OD) com um fotômetro a 490-500 nm. Encaixe os dados da curva padrão como linha de tendência e calcule a concentração das amostras.

10. Medição de PMN-elastase de Plasma citrato

  1. Descongele o plasma citrato em banho-maria a 37 °C.
  2. Use o kit polimorfonuclear (PMN)-elastase ELISA de acordo com as instruções do fabricante: reconstrua o controle PMN-elastase e o padrão PMN-elastase para preparar uma curva padrão usando o tampão de diluição do kit.
  3. Diluir a solução de lavagem de acordo com a descrição do fabricante. Deixe todos os reagentes e a placa de microtiter em RT por 30 min antes de iniciar o teste. Diluir as amostras de plasma citrato para 1:100 com o tampão de diluição.
  4. Adicione 100 μL do tampão amostral (em branco), a curva padrão PMN-elastase (15,6-1.000 ng/mL), os controles PMN-elastase (altas e baixas concentrações) e amostras de plasma diluídas em duplicatas para a placa do poço. Sele a placa e incubar-se em RT por 60 min com agitação suave. Depois, lave a placa 4x com 300 μL de solução de lavagem.
  5. Adicione 150 μL do anticorpo conjugado com enzimas a cada poço. Sele a placa e incubar-se em RT por 60 min com agitação suave. Depois, lave a placa 4x com 300 μL de solução de lavagem.
  6. Adicione 200 μL da solução de 3,3',5,5'-tetrametilbenzidin (TMB)-substrato para cada poço. Sele a placa e incubar em RT por 20 min no escuro. Em seguida, remova a película de vedação e adicione 50 μL da solução de parada a cada poço.
  7. Leia o OD com um fotômetro a 450 nm com uma leitura de referência a 630 nm. Encaixe os dados da curva padrão como linha de tendência e calcule a concentração das amostras.

11. Medição do Complexo Complementar terminal (TCC) do PLASMA EDTA

  1. Descongele o plasma EDTA em um banho de água a 37 °C, e armazene no gelo após o descongelamento.
  2. Utilize o kit eLISA em cascata complementar SC5b-9 de acordo com as instruções do fabricante: diluir a solução de lavagem conforme descrito no protocolo do fabricante. Deixe todos os reagentes e a placa de microtiter em RT por 30 min antes de iniciar o teste. Diluir as amostras de plasma EDTA para 1:10 com o tampão de diluição do kit.
  3. Adicione 300 μL de solução de lavagem a cada poço para reidratar a superfície e aspirar após 2 min. Adicione 100 μL do tampão de amostra (em branco), padrões SC5b-9, controles SC5b-9 (altas e baixas concentrações) e as amostras de plasma diluídas em duplicatas para a placa do poço.
  4. Sele a placa e incubar em RT por 60 min. Em seguida, lave a placa 5x com 300 μL de solução de lavagem.
  5. Adicione 50 μL do anticorpo conjugado com enzimas em cada poço. Sele a placa e incubar em RT por 30 min. Em seguida, lave a placa 5x com 300 μL de solução de lavagem.
  6. Adicione 100 μL da solução tmb-substrato a cada poço. Sele a placa e incubar em RT por 15 min no escuro.
  7. Remova a filme de vedação e adicione 100 μL da solução de parada a cada poço. Leia o OD com um fotômetro a 450 nm. Encaixe os dados da curva padrão como linha de tendência e calcule a concentração das amostras.

12. Medição de β-tromboglobulna do Plasma CTAD

  1. Descongele o plasma CTAD em banho-maria a 37 °C.
  2. Use o kit β-tromboglobulina (β-TG) ELISA de acordo com as instruções do fabricante: reconstrua o controle β-TG e o padrão β-TG e dilua a solução de lavagem usando h2O. Reconstrua o anticorpo conjugado com POD usando o tampão de fosfato fornecido. Deixe todos os reagentes e a placa de microtiter em RT por 30 min antes de iniciar o teste.
  3. Prepare a curva padrão e o controle de acordo com as instruções do fabricante com o tampão de fosfato fornecido. Diluir as amostras de plasma CTAD para 1:21.
  4. Adicione 200 μL do tampão fosfato (em branco), padrões β-TG, controles β-TG (altas e baixas concentrações) e amostras de plasma diluídas em duplicatas para a placa do poço. Sele a placa e incubar em RT por 60 min. Depois, lave a placa 5x com 300 μL de solução de lavagem.
  5. Adicione 200 μL do anticorpo conjugado com enzimas a cada poço. Sele a placa e incubar em RT por 60 min. Depois, lave a placa 5x com 300 μL de solução de lavagem.
  6. Adicione 200 μL da solução tmb-substrato a cada poço. Sele a placa e incubar-se em RT por 5 min no escuro. Remova a película de vedação e pare a reação adicionando 50 μL de ácido sulfúrico de 1 M (H2SO4) a cada poço.
  7. Deixe a placa por 15-60 min, depois leia o OD com um fotômetro a 450 nm. Encaixe os dados da curva padrão como linha de tendência e calcule a concentração das amostras.

13. Preparação da amostra para microscopia eletrônica de varredura

  1. Remova o implante do tubo usando fórceps e enxágue o implante brevemente mergulhando-o em 0,9% solução NaCl 3x.
  2. Armazenar na solução de glutaraldeído (2% glutaraldeído em soro tampão de fosfato [PBS-buffer sem Ca2+/Mg2+]) durante a noite a 4 °C.
  3. Em seguida, incubar os implantes em PBS-tampão por 10 min. Desidratar as amostras incubando no etanol com concentração crescente de 10 min cada: 40, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 96% e 100%. Guarde as amostras desidratadas em 100% de etanol até análise suplementar.
  4. Realize a secagem de ponto crítico de acordo com as instruções do dispositivo de secagem ou literatura10 pouco antes de digitalizar a microscopia eletrônica (SEM).

14. Microscopia eletrônica de varredura

  1. Conecte os implantes secos a um portador de amostra para o microscópio de varredura e sputter as amostras com paládio de ouro.
  2. Introduza os implantes sputtered na câmara de amostra. Tire fotos em ampliação de 100, 500, 1.000 e 2.500 vezes das áreas com a superfície representativa e aadesão celular.

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Representative Results

Resumido resumidamente, todo o sangue humano foi coletado em monovetas carregadas de heparina e então agrupadas e usadas para avaliar os níveis de base da contagem celular, bem como marcadores de hemocompatibilidade plasmática.

Posteriormente, o tubo contendo as amostras de implante neurovascular foi preenchido, e o sangue foi perfundido por 60 min a 150 mL/min e 37 °C usando uma bomba peristáltica. Novamente, o número de células foi analisado em todos os grupos, e as amostras de plasma foram preparadas para análises ELISA (Figura 1). A quantificação das células sanguíneas e parâmetros sanguíneos, como hemoglobina e hematócrito, foi realizada logo após a coleta de sangue, bem como após a perfusão no modelo de loop de fluxo para todos os tipos de amostra e controle. Não foram detectadas alterações em relação ao número de PCB(Figura 2A),RBCs(Figura 2B),ou valores hematócritos(Figura 2C). No entanto, foi detectada uma diminuição nos níveis de hemoglobina após a incubação do sangue no modelo de loop de fluxo quando comparado aos valores da linha de base, o que foi devido à perfusão de sangue no sistema de loop de fluxo(Figura 2D). Além disso, observou-se queda no número de plaquetas devido à perfusão sanguínea. Além disso, esse efeito foi aumentado quando um stent não revestido estava presente na tubulação, indicando a adesão das plaquetas ao biomaterial. No entanto, foi claramente demonstrado que a perda de plaquetas foi significativamente maior quando o stent não revestido foi incubado com sangue, em oposição ao stent revestido de fibrina-heparina(Figura 2E).

Alterações potenciais dos marcadores plasmáticos hematológicos também foram investigadas nos grupos de teste após a perfusão e comparadas com os valores de linha de base do sangue recém-extraído. A concentração do complexo TAT, que reflete o estado de ativação do sistema de coagulação, foi levemente aumentada devido à perfusão sanguínea(Figura 3A). No grupo de stents metálicos nus, no entanto, foi detectado um aumento significativo no TAT, indicando uma ativação profunda do sistema de coagulação. O stent revestido com fibrina impediu a ativação do sistema de coagulação, uma vez que não foi determinado aumento no TAT.

A perfusão levou a uma ativação maior da cascata complementar, que foi determinada medindo SC5b-9(Figura 3B). No entanto, a incubação com stents não revestidos ou revestidos de fibrina não aumentou ainda mais a concentração de SC5b-9. Resultados semelhantes foram obtidos ao analisar a ativação dos granulócitos neutrófilos através da quantificação das concentrações de PMN-elastase (Figura 3C).

A visualização da superfície do stent foi realizada utilizando-se sem. Diferenças claras entre os dois grupos de stent foram detectadas após a incubação sanguínea. Enquanto na superfície do stent não revestido uma densa rede de células sanguíneas e proteínas estava presente, nenhuma adesão de proteínas ou células foi detectada na superfície do stent revestido com fibrina -heparina(Figura 4).

Figure 1
Figura 1: Visão geral esquemmática da avaliação da hemocompatibilidade dos stents em um modelo de loop de fluxo bem estabelecido. Sangue inteiro humano fresco é coletado de doadores saudáveis em tubos sanguíneos contendo heparina para anticoagulação. Para cada doador, um tubo vazio, bem como tubos pré-carregados com o material amostral são posteriormente preenchidos com sangue fresco e incubados no ciclo de fluxo a uma taxa de 150 mL/min a 37 °C por 60 min. Além disso, amostras de plasma são preparadas a partir de sangue recém-extraído para obter os valores de base de cada doador. Após a incubação, as amostras de plasma da tubulação de ensaio, com e sem materiais amostrais, são preparadas e analisadas usando um ELISA específico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Análise de diferentes tipos de células e parâmetros sanguíneos antes e depois da incubação de diferentes implantes de stent no modelo de loop de fluxo. Foi realizada a determinação de glóbulos brancos(A),glóbulos vermelhos(B),hematócrito(C),hemoglobina(D)e plaquetas(E). Os dados são apresentados como média ± SEM (n = 5, p* < 0,5, p*** < 0,001). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Determinação de marcadores de ativação de plaquetas ou do sistema imunológico antes e depois da incubação com implantes neurovasculares. Os marcadores para a ativação(A)da coagulação sanguínea (TAT),(B)sistema complementar (SC5b-9) e(C) neutrófilos (PMN-elastase) foram quantificados por meio de ELISA. A análise foi realizada em amostras de plasma obtidas a partir de sangue recém-extraído ou sangue incubado com diferentes stents no modelo de loop de fluxo. Os dados são apresentados como média ± SEM (n = 5, p* < 0,5). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Análise microscópica eletrônica de stents após incubação com sangue. Observou-se a agregação de proteínas plasmáticas sanguíneas e plaquetas em material de stent não revestido. Em comparação, os materiais do stent com o revestimento de fibrina-heparina não demonstraram adesão de células ou outros componentes sanguíneos na superfície (ampliação de 500-, 1.000-, e 2.500 vezes). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

O protocolo apresentado descreve um método abrangente e confiável para o teste de hemocompatibilidade de implantes de contato com o sangue de acordo com a ISO 10993-4 em um modelo de fluxo de cisalhamento imitando o fluxo sanguíneo humano. Este estudo baseia-se no teste de implantes neurovasculares cortados a laser, mas pode ser realizado com uma variedade de amostras. Os resultados demonstram que este método permite a análise ampla de vários parâmetros, como a contagem de células sanguíneas, prevalência de vários marcadores de hemocompatibilidade e visualização microscópica da superfície do dispositivo após contato sanguíneo. Usando este protocolo, podem ser detectadas possíveis diferenças quanto à hemocompatibilidade de diferentes dispositivos.

Uma alternativa à avaliação da hemocompatibilidade in vitro consiste em testes em animais in vivo, que estão associados a várias desvantagens, como maior variabilidade e distorção dos efeitos relacionados ao dispositivo devido aos efeitos esmagadores a curto prazo da lesão tecidual6.

Para testes de hemocompatibilidade in vitro, três tipos de modelos estão disponíveis: (1) modelos de incubação de sangue estático, (2) modelos de incubação sanguínea agitada e (3) modelos de fluxo de cisalhamento. O modelo estático fornece um método simples e rápido para determinar a trombogenicidade incubando o dispositivo diretamente com sangue, mas só leva a resultados rudimentares em relação à hemocompatibilidade11. Para superar as principais desvantagens dos modelos estáticos (ou seja, sedimentação das células sanguíneas e da grande superfície de contato com o ar), pode ser utilizado o modelo de incubação sanguínea agitado, no qual uma câmara de ensaio contendo os implantes é preenchida com sangue e incubada em uma plataforma de balanço12. No entanto, esses tipos de modelo ainda são inferiores em comparação com os modelos de fluxo de cisalhamento existentes, como o loop de fluxo apresentado aqui. A quintessência desses modelos é que o fluxo sanguíneo humano vascular pode ser imitado; assim, uma representação próxima da interação real entre o implante e as células sanguíneas pode ser exibida13. Além do modelo de loop de fluxo, modelos como o loop chandler ou várias câmaras de fluxo perfundidas existem14,15,16.

O laço de Chandler é um sistema de tubo fechado que é parcialmente preenchido com ar e preso em um dispositivo rotativo, resultando em circulação sanguínea através da tubulação17. No presente sistema de loop de fluxo, o tubo está completamente cheio de sangue, e o fluxo é forçado usando uma bomba peristáltica. Ao usar o modelo de loop chandler, os operadores enfrentam duas grandes desvantagens devido à necessidade de incluir ar na tubulação de teste. Em primeiro lugar, sabe-se que a interação constante entre sangue e ar desencadeia a agregação de leucócitos e plaquetas, bem como a desnaturação proteica18,19. Em segundo lugar, a taxa de circulação sanguínea é limitada, pois o ar permanece sempre no ponto mais alto do loop20.

Essas desvantagens podem ser superadas ao usar o sistema de loop de fluxo. Como não há interface ar-líquido no sistema, não ocorre ativação de plaquetas. Assim, o modelo possui um baixo fundo para eventos trombóticos de modo que uma baixa concentração de anticoagulantes, tipicamente 1 UI/mL ou 1,5 UI/mL de heparina, é suficiente para evitar a coagulação, mesmo que altas taxas de fluxo sejam aplicadas6. A taxa de fluxo sanguíneo regulada pela bomba ajustável e o diâmetro do tubo livremente selecionável permitem ao operador imitar as condições fisiológicas de uma veia ou artéria, que correspondem ao implante a ser testado, e alcançar resultados de teste relevantes21. No entanto, essa vantagem é, ao mesmo tempo, uma limitação, devido ao estresse mecânico aplicado ao sangue através da bomba, e a destruição de eritrócitos (ou seja, hemólise) pode ocorrer2. Este dano sanguíneo intrínseco reduz a sensibilidade do método e impede a exposição prolongada ao sangue21. No entanto, vários estudos têm demonstrado o uso efetivo do modelo de loop de fluxo para avaliação da hemocompatibilidade22,23,24.

No entanto, a principal lacuna entre todos os modelos in vitro e os mecanismos in vivo inclui o endotélio ausente, que expressa citocinas, componentes antitrombóticos e moléculas de adesão; portanto, este componente desempenha um papel crucial na interação do implante e do sangue circulante25. Em conclusão, o modelo de loop de fluxo é ajustável, eficiente, confiável e econômico para avaliar a hemocompatibilidade dos implantes antes do uso clínico.

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Disclosures

Os autores não têm nada para revelar.

Acknowledgments

Pela realização da microscopia eletrônica de varredura, agradecemos a Ernst Schweizer da seção de Ciência e Tecnologia de Materiais Médicos do Hospital Universitário tuebingen. A pesquisa contou com o apoio do Ministério da Educação, Juventude e Esportes do CR dentro do Programa Nacional de Sustentabilidade II (Projeto BIOCEV-FAR LQ1604) e pelo projeto da Fundação Ciência Tcheca nº 18-01163S.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
aqua ad iniectabilia Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany 1088813
beta-TG ELISA Diagnostica Stago, Duesseldorf, Germany 00950
Centrifuge Rotana 460 R Andreas Hettich, Tuttlingen, Germany -
Citrat monovettes (1.4 mL) Sarstedt, Nümbrecht, Germany 6,16,68,001
CTAD monovettes (2.7 mL) BD Biosciences, Heidelberg, Germany 367562
EDTA monovettes (1.2 mL) Sarstedt, Nümbrecht, Germany 6,16,62,001
Ethanol p.A. (1000 mL) AppliChem, Darmstadt, Germany 1,31,08,61,611
Glutaraldehyde (25 % in water) SERVA Electrophoresis, Heidelberg, Germany 23114.01
Heparin coating for tubes Ension, Pittsburgh, USA -
Heparin-Natrium (25.000 IE/ 5 mL) LEO Pharma, Neu-Isenburg, Germany PZN 15261203
Multiplate Reader Mithras LB 940 Berthold, Bad Wildbad, Germany -
NaCl 0,9% Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany 1312813
Neutral monovettes (9 mL) Sarstedt, Nümbrecht, Germany 2,10,63,001
PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+) Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany 70011044
Peristaltic pump ISM444B Cole Parmer, Wertheim, Germany 3475
Pipette (100 µL) Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany 3124000075
Pipette (1000 µL) Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany 3123000063
Plastic container (100 mL) Sarstedt, Nümbrecht, Germany 7,55,62,300
PMN-Elastase ELISA Demeditec Diagnostics, Kiel Germany DEH3311
Polyvinyl chloride tube Saint-Gobain Performance Plastics Inc., Courbevoie France -
Reaction Tubes (1.5 mL) Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany 30123328
neurovascular laser-cut implants Acandis GmbH, Pforzheim 01-0011x
SC5b-9 ELISA TECOmedical, Buende, Germany A029
Scanning electron microscope Cambridge Instruments, Cambridge, UK -
Sealing tape (96 well plate) Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany 15036
Syringe 10/12 mL Norm-Ject Henke-Sass-Wolf, Tuttlingen, Germany 10080010
TAT micro kit Siemens Healthcare, Marburg, Germany OWMG15
Waterbath Type 1083 Gesellschaft für Labortechnik, Burgwedel, Germany -

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References

  1. ISO. Biological evaluation of medical devices. , ISO 10993-4 (2002).
  2. Weber, M., et al. Blood-Contacting Biomaterials: In Vitro Evaluation of the Hemocompatibility. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 99 (2018).
  3. Li, Y., Boraschi, D. Endotoxin contamination: a key element in the interpretation of nanosafety studies. Nanomedicine (Lond). 11 (3), 269-287 (2016).
  4. Cattaneo, G., et al. In vitro investigation of chemical properties and biocompatibility of neurovascular braided implants. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 30 (6), 67 (2019).
  5. Stang, K., et al. Hemocompatibility testing according to ISO 10993-4: discrimination between pyrogen- and device-induced hemostatic activation. Materials Science and Engineering: C Materials for Biological Applications. 42, 422-428 (2014).
  6. van Oeveren, W. Obstacles in haemocompatibility testing. Scientifica (Cairo). , 392584 (2013).
  7. Engels, G. E., Blok, S. L., van Oeveren, W. In vitro blood flow model with physiological wall shear stress for hemocompatibility testing-An example of coronary stent testing. Biointerphases. 11 (3), 031004 (2016).
  8. Blok, S. L., Engels, G. E., van Oeveren, W. In vitro hemocompatibility testing: The importance of fresh blood. Biointerphases. 11 (2), 029802 (2016).
  9. Kaplan, O., et al. Low-thrombogenic fibrin-heparin coating promotes in vitro endothelialization. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 105 (11), 2995-3005 (2017).
  10. JoVE. SEM Imaging of Biological Samples. , Available from: https://www.jove.com/science-education/10492/sem-imaging-of-biological-samples (2019).
  11. Mohan, C. C., Chennazhi, K. P., Menon, D. In vitro hemocompatibility and vascular endothelial cell functionality on titania nanostructures under static and dynamic conditions for improved coronary stenting applications. Acta Biomaterialia. 9 (12), 9568-9577 (2013).
  12. Streller, U., Sperling, C., Hubner, J., Hanke, R., Werner, C. Design and evaluation of novel blood incubation systems for in vitro hemocompatibility assessment of planar solid surfaces. The Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 66 (1), 379-390 (2003).
  13. Sanak, M., Jakieła, B., Węgrzyn, W. Assessment of hemocompatibility of materials with arterial blood flow by platelet functional tests. Bulletin of the Polish Academy of Sciences: Technical Sciences. 58 (2), 317-322 (2010).
  14. Krajewski, S., et al. Hemocompatibility evaluation of different silver nanoparticle concentrations employing a modified Chandler-loop in vitro assay on human blood. Acta Biomaterialia. 9 (7), 7460-7468 (2013).
  15. Podias, A., Groth, T., Missirlis, Y. The effect of shear rate on the adhesion/activation of human platelets in flow through a closed-loop polymeric tubular system. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 6 (5), 399-410 (1994).
  16. Van Kruchten, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Measurement of whole blood thrombus formation using parallel-plate flow chambers-a practical guide. Platelets. 23 (3), 229-242 (2012).
  17. Müller, M., Krolitzki, B., Glasmacher, B. Dynamic in vitro hemocompatibility testing-improving the signal to noise ratio. Biomedical Engineering/Biomedizinische Technik. 57, SI-1 Track-D 549-552 (2012).
  18. Ritz-Timme, S., Eckelt, N., Schmidtke, E., Thomsen, H. Genesis and diagnostic value of leukocyte and platelet accumulations around "air bubbles" in blood after venous air embolism. International Journal of Legal Medicine. 111 (1), 22-26 (1998).
  19. Miller, R., et al. Characterisation of the initial period of protein adsorption by dynamic surface tension measurements using different drop techniques. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 131 (1), 225-230 (1998).
  20. van Oeveren, W., Tielliu, I. F., de Hart, J. Comparison of modified chandler, roller pump, and ball valve circulation models for in vitro testing in high blood flow conditions: application in thrombogenicity testing of different materials for vascular applications. International Journal of Biomaterials. , 673163 (2012).
  21. Krajewski, S., et al. Preclinical evaluation of the thrombogenicity and endothelialization of bare metal and surface-coated neurovascular stents. AJNR American Journal of Neuroradiology. 36 (1), 133-139 (2015).
  22. Monnink, S. H., et al. Silicon-carbide coated coronary stents have low platelet and leukocyte adhesion during platelet activation. Journal of Investigative Medicine. 47 (6), 304-310 (1999).
  23. Amoroso, G., van Boven, A. J., Volkers, C., Crijns, H. J., van Oeveren, W. Multilink stent promotes less platelet and leukocyte adhesion than a traditional stainless steel stent: an in vitro experimental study. Journal of Investigative Medicine. 49 (3), 265-272 (2001).
  24. Mulvihill, J., Crost, T., Renaux, J. L., Cazenave, J. P. Evaluation of haemodialysis membrane biocompatibility by parallel assessment in an ex vivo model in healthy volunteers. Nephrology Dialysis Transplantation. 12 (9), 1968-1973 (1997).
  25. Nordling, S., Nilsson, B., Magnusson, P. U. A novel in vitro model for studying the interactions between human whole blood and endothelium. Journal of Visualized Experiments. (93), e52112 (2014).

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Teste de hemocompatibilidade de implantes de contato com o sangue em um modelo de loop de fluxo imitando o fluxo sanguíneo humano
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