Summary
Dit protocol legt uit hoe je enkele neuronen, microglia's en astrocyten verzamelt uit de centrale kern van de amygdala met hoge nauwkeurigheid en anatomische specificiteit met behulp van lasercapture microdissectie. Daarnaast leggen we ons gebruik van microfluïdeRT-qPCR uit om een subset van het transcriptome van deze cellen te meten.
Abstract
Diepgaande transcriptie heterogeniteit in anatomisch aangrenzende enkele cellen suggereert dat robuuste weefselfunctionaliteit kan worden bereikt door cellulaire fenotype diversiteit. Eencellige experimenten die de netwerkdynamiek van biologische systemen onderzoeken, tonen cellulaire en weefselreacties aan op verschillende omstandigheden bij biologisch zinvolle resolutie. Hierin leggen we onze methoden voor het verzamelen van enkele cellen uit anatomisch specifieke locaties uit en het nauwkeurig meten van een subset van hun genexpressieprofielen. We combineren lasercapture microdissectie (LCM) met microfluïde omgekeerde transcriptie kwantitatieve polymerase kettingreacties (RT-qPCR). We gebruiken ook dit microfluïde RT-qPCR-platform om de microbiële overvloed aan darminhoud te meten.
Introduction
Het meten van de genexpressieprofielen van enkele cellen heeft uitgebreide fenotypische heterogeniteit in een weefsel aangetoond. Deze complexiteit heeft ons begrip van de biologische netwerken die weefselfunctie regelen, gecompliceerd. Onze fractie en anderen hebben dit fenomeen in vele weefsels en omstandighedenonderzocht 1,2,3,4,5,6. Deze experimenten suggereren niet alleen dat regulering van genexpressienetwerken ten grondslag ligt aan een dergelijke heterogeniteit, maar ook dat eeneencellige resolutie een complexiteit in weefselfunctie aanhet licht brengt die weefselresolutie niet waardeert. Slechts een kleine minderheid van cellen kan immers reageren op een specifieke aandoening of uitdaging, maar de impact van die cellen op de algehele fysiologie kan aanzienlijk zijn. Bovendien kan een systeembiologiebenadering die multivariate-methoden toepast op hoogdimensionale gegevenssets van meerdere celtypen en weefsels systeembrede behandelingseffecten verduidelijken.
We combineren LCM en microfluidic RT-qPCR om dergelijke datasets te verkrijgen. We nemen deze aanpak hier in tegenstelling tot het verzamelen van enkele cellen via fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) en het gebruik van RNA sequencing (RNA-seq) om hun transcriptoom te meten. Het voordeel van LCM ten opzichte van FACS is dat de exacte anatomische specificiteit van enkele cellen relatief en absoluut met LCM kan worden gedocumenteerd. Verder, terwijl RNA-seq kan meten meer functies die RT-qPCR, microfluïde RT-qPCR is minder duur en heeft een hogere gevoeligheid en specificiteit7.
In dit representatieve experiment onderzochten we de effecten van opioïdeafhankelijkheid en naltrexon-neergeslagen opioïde terugtrekking op rattenneuronale, microglia- en astrocytengenexpressie in de centrale kern van de amygdala (CeA) en darmmicroflora overvloed4. Vier behandelingsgroepen werden geanalyseerd: 1) Placebo, 2) Morfine, 3) Naltrexon, en 4) Terugtrekking(Figuur 1). We ontdekten dat opioïdenafhankelijkheid de genexpressie niet wezenlijk veranderde, maar dat opioïde terugtrekking de expressie van ontstekingsgenen veroorzaakte, Tnf in het bijzonder. Astrocyten waren het meest getroffen celtype. Het darmmicrobioom werd ernstig beïnvloed door opioïde terugtrekking zoals aangegeven door een afname van de Firmicutes tot Bacteroides ratio, dat is een gevestigde marker van darmdysbiose8,9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deze studie werd uitgevoerd in overeenstemming met de aanbevelingen van Animal Care and Use Committee (IACUC) van Thomas Jefferson University en Drexel University College of Medicine. Het protocol werd goedgekeurd door de Thomas Jefferson University en Drexel University College of Medicine IACUC.
1. Diermodel
- Voeg twee 75 mg slow-release morfine sulfaat pellets of twee placebo pellets onderhuids bij volwassen mannelijke Sprague-Dawley ratten.
- Gebruik een jurk en handschoenen op de juiste manier voor kleine steriele chirurgie. Scheer de rat dorsum met tondeuse indien nodig.
- Breng vetzalf aan op de ogen van het dier. Verdoven de rat met ongeveer 20 s isoflurane inademing. Anesthesie wordt bevestigd door bewustzijnsverlies.
- Maak een middellijn incisie in de rat dorsum met kraal gesteriliseerde stompe schaar en scheid de dermis van de lichaamswand met een kraal-gesteriliseerde sonde. Steek de pellets onder de dermis met kraal-gesteriliseerde tangen. Hecht de incisie af gesloten met een steriele naald.
LET OP: De hele procedure duurt ongeveer 5 min per rat. Voor elke rat worden verse steriele handschoenen gebruikt. - Plaats de rat in een isolatiekooi voor postchirurgisch herstel. Controleer op een hartslag en regelmatig ademhalingsritme. Observeer de rat tot het bewustzijn weer is opgedaan. Beoordeel op postchirurgische pijn.
- Beoordeel de ratten 8 uur na de operatie en elke 12 uur na voor herstel en infectie. Plaats ratten in een kooi met de rest van het cohort wanneer ze volledig zijn hersteld van een operatie, ongeveer 24 uur na de operatie.
- Geef een intraperitoneale naltrexoninjectie (75 mg/kg) aan de G en de terugtrekkingscohorten na 6 dagen blootstelling aan morfine.
OPMERKING: Er waren vier rattencohorten in dit representatieve experiment (zie figuur 1).
2. Monsteroogst
- Oogst de hersenen 6 dagen na de pellet invoeging of 24 uur na de naltrexon injectie.
- Plaats het dier in een isoflurane kamer voor ongeveer 30 s of tot verlies van bewustzijn optreedt, aangegeven door een gebrek aan beweging en verminderde ademhalingsfrequentie.
- Gebruik een scherpe guillotine om het dier snel te onthoofden.
- Ontleed de hersenen uit de schedel van het dier.
- Gebruik een scherp handscheermes om de volgende grove insnijdingen naar de verwijderde hersenen te maken: Snijd eerst het cerebellum af en gooi het weg. Ten tweede, scheid de hersenstam van de voorhersenen met een dwarse incisie. Ten derde, hemisect de voorhersenen en / of hersenstam met een midline sagittale incisie.
- Plaats de voorhersenen en hersenstam in een plastic weefsel-inbedding schimmel met 3-4 cm van Optimale Snijtemperatuur compound (OCT) in de bodem van de mal. Bedek de rest van het monster met OCT.
- Plaats onmiddellijk de kunststof weefsel-inbedding schimmel met het monster bedekt met OCT in een bad met droogijs en methanol. Laat de methanol niet morsen in de weefsel-inbedding schimmel. Houd de inbedding schimmel met de hersenen monster in de methanol-ijsbad totdat weefsel collectie is voltooid (~ 10-15 min maximum).
- Plaats het hersenmonster zo snel mogelijk in een vriezer van -80 °C.
- Oogst de darmmonsters tegelijkertijd.
- Na een snelle onthoofding, maak een middellijn incisie in de buik van het dier met een scalpel.
- Zoek de cecum en sever zijn verbinding met de opgaande dikke darm.
- Knijp de cecale inhoud in een conische buis van 15 mL.
- Plaats de conische buis onmiddellijk op droogijs en zet zo snel mogelijk in een vrieskist -80 °C.
OPMERKING: De dunne darm inhoud kan ook worden verzameld met behulp van dezelfde methoden als een negatieve controle.
3. Snijden
- Snijd de gezoomde rattenvoorhersenen met behulp van een cryostat.
- Verwijder de kunststof inbeddingsvorm met het voorbrein uit de vriezer -80 °C en plaats in een cryostat -20 °C.
- Verwijder het OCT-embedded gezoomde voorhersenmonster uit de inbeddingsmal. Gebruik een scheermes om de hoeken van de plastic inbedding schimmel verticaal snijden indien nodig. Monteer de voorhersenen voor rostral tot caudal coronale snijden op een cryostat chuck met behulp van OCT.
OPMERKING: Anatomische oriëntatiepunten om de CeA te identificeren omvatten de optische tract en stria terminalis(figuur 2B). De optische darmtakken van de optische chiasm en tracks dorsale laterale als de hersenen is gesneden rostral tot caudal. Wanneer het optische kanaal een morfologie heeft die vergelijkbaar is met wat wordt gezien in een rattenhersenatlas bregma -2,12 mm10,kunnen testsegmenten onder een microscoop worden bekeken. Het optische kanaal en stria terminalis morfologie kan worden gecontroleerd in een rat hersenen atlas10 om de bregma te identificeren en of de CeA omringt de stria terminals. - Snijd 10 μm dikke coronale secties van de gezoomde voorhersenen rostral tot caudal totdat secties met de CeA zijn bereikt.
LET OP: De breedte en hoogte van de secties zijn ongeveer 200 mm. - Verzamel secties van 10 μm met de CeA, of het gewenste hersengebied, door 10 μm secties te ontdooien op gewone glasplaten. Plaats de glazen glijbanen onmiddellijk op een metalen pan die op droogijs rust. Leg de glijbanen met hersendelen zo snel mogelijk in een vriezer van -80 °C.
OPMERKING: Meerdere segmenten kunnen op dezelfde dia worden geplaatst. Als u een andere celtypevlek gebruikt voor segmenten op dezelfde dia, laat dan ongeveer 100 mm tussen de segmenten achter, zodat een hydrofobe pen kan worden gebruikt om celtypespecifieke antilichaamoplossingen op de dia te scheiden. Laat ongeveer 20 mm van de rand van de dia aan elke kant van het segment.
4. Immunofluorescentiekleuring
- Besmin de voorhersenen secties voor de hersencel van keuze (bijvoorbeeld neuron, microglia, astrocyat, enz.) met behulp van immunofluorescentie.
- Verwijder een of meer dia's met 10 μm secties van de CeA uit de vriezer -80 °C.
- Bevestig de dia's met 75% ethanol voor 30 s. Verwijder de overtollige vloeistof.
- Blokkeer de plakjes voor 30 s met 2% runderserumantigeen (BSA) in 1x fosfaatbufferzout (PBS). Was 1x met PBS.
- Voeg een primaire antilichaamoplossing toe aan de dia gedurende 2 min. Was 1x met 2% BSA-oplossing.
OPMERKING: De primaire antilichaamoplossing bestaat uit 2% primair antilichaam, 1% RNase Out en 96% van dezelfde BSA PBS-oplossing voor de bovenstaande blokkeringsstap (stap 4.1.3). Het representatieve experiment gebruikte een anti-NeuN-antilichaam, een anti-Cd11β-antilichaam en een anti-GFAP-antilichaam in de volgende hoeveelheden: 3 μL primair, 1,88 μL RNA-remmer en 145,12 μL BSA-oplossing. - Voeg de secundaire antilichaamoplossing 3 min toe aan de dia. Was 1x met PBS.
OPMERKING: De secundaire antilichaamoplossing bestaat uit 1 μL geitenanti-muis 488 nm fluorescerende tag (1:500), 2,5 μL RNA-remmer, 1,3 μL DAPI (1:10.000) en 196,5 μL van 2% BSA.
5. Ethanol- en xyleenuitdrogingsreeks
- Dompel de dia's in 75% ethanol voor 30 s. Onmiddellijk daarna, dompel de dia's in 95% ethanol voor 30 s. Onmiddellijk daarna, dompel de dia's in 100% ethanol voor 30 s. Onmiddellijk daarna, dompel de dia's in een tweede container met 100% ethanol voor 30 s.
- Na de ethanol dehydratie serie, dompel de dia's in vers gegoten xyleen voor 1 min. Onmiddellijk na, dompel de dia's in een tweede container van xyleen voor 4 min.
- Haal de glijbanen uit het xyleenbad en laat de lucht 5 min in het donker drogen.
- Plaats de glijbanen in een desiccator voor 5 min om verder te drogen.
6. Lasercapture microdissectie
- Als gekleurd, plaats de dia in de microscoop en vind het gebied van belang (CeA) met behulp van anatomische oriëntatiepunten (dat wil zeggen, de optische chiasm en stria terminalis).
- Gebruik fluorescentie om het gekleurde celtype en de kern ervan in de interesseregio te identificeren. Kies één cel of meerdere cellen als u enkelcellige samengevoegde monsters doet. Markeer de cellen van belang met behulp van LCM-software.
- Plaats de LCM-dop bovenop het segment op de interesseregio.
- Gebruik testopnamen van een infraroodlaser (IR) om de IR-lasersterkte, grootte en duur aan te passen, zodat de LCM-doplijm alleen over het gebied van de geselecteerde eencellig smelt. Dit zorgt ervoor dat er geen andere cellen worden verzameld dan de geselecteerde cellen.
OPMERKING: In dit representatieve experiment werden 10 celgroepen van hetzelfde celtype gebruikt als één monster om de cel-op-celvariabiliteit in genexpressie tussen monsters met dezelfde behandeling te beperken. Deze methode kan echter worden gebruikt voor echte eencellige experimenten1,3. - Selecteer de afzonderlijke cellen die moeten worden verzameld voor analyse met behulp van de LCM-softwaretools(figuur 2C). Geselecteerde cellen moeten zich in het anatomische gebied van de CeA (of het hersengebied van keuze) bevinden op basis van de rattenhersenatlas en de bregma10. Cellen moeten ten minste 3 μm van de aangrenzende gekleurde kernen.
- Vuur de IR-laser af om de geïdentificeerde enkele cellen te verzamelen.
- Plaats de dop in het QC-station (Quality Control) en bekijk deze om ervoor te zorgen dat alleen de gewenste cellen zijn geselecteerd. Als andere cellen ten onrechte werden geselecteerd, kan een ultraviolette laser worden gebruikt om de ongewenste cellen te vernietigen terwijl de dop in het QC-station blijft.
- Maak een foto van de weefselsectie van waaruit de cel werd verzameld om de anatomische specificiteit ervan vast te leggen. Noteer de afstand van het segment van de bregma indien van toepassing met behulp van een rattenhersenatlas als referentie10.
- Verwijder de LCM-dop uit het QC-station, bevestig de monsterafzuiginrichting en pipeter 5,5 μL lysisbuffer op het monster.
OPMERKING: De lysisbufferoplossing bestaat uit 0,5 μL lysisversterker en 5 μL resuspensionbuffer. - Plaats het ExtracSure-apparaat op een microcentrifugebuis van 0,5 mL en plaats gedurende 15 min op een kookplaat bij 75 °C.
- Draai het monster en de lysisbuffer voor 30 s bij lage snelheid (0,01-0,02 x g)en plaats het verzamelde monster in een vrieskist van -80 °C.
7. Microfluïde RT-qPCR met één cel
- Voorversterking van enkelcellige mRNA voor 96.96 Dynamic Array Chip
- Combineer de voorwaartse en omgekeerde mRNA qPCR genprimers voor alle genen die worden geassuieerd in een primerpool voor vooramplificatie (500 nM-concentratie per primer). Bijvoorbeeld 1 μL van 100 μM primers in 80 μL plus 120 μL DNA Suspension Buffer.
OPMERKING: De primer sequenties die worden gebruikt voor de representatieve experiment kan worden gevonden in O'Sullivan et al.4. - Voeg in een nieuwe 96 x 96 PCR-plaat 1 μL 5x VILO toe aan elke put.
- Verwijder LCM eencellige monsters uit de monsters die bij -80 °C zijn opgeslagen, laat kort ontdooien, centrifugeer kort bij een lage snelheid (0,01-0,02 x g)en voeg 5,5 μL van het lysed enkelcellige monster toe aan de PCR-plaat. Elk monster wordt toegevoegd aan zijn eigen put.
- Plaats de PCR-plaat met de monsters en VILO in de thermocycler en verwarm 1,5 min op 65 °C. Draai de plaat 1 min bij 1.300 x g bij 4 °C en leg de plaat op ijs.
- Voeg 0,15 μL 10x cDNA synthese master mix, 0,12 μL T4 Gene 32 eiwit en 0,73 μL DNA-suspensiebuffer toe aan elke put.
- Plaats de PCR-plaat in de thermocycler en voer het volgende protocol uit: 25 °C gedurende 5 min, 50 °C gedurende 30 min, 55 °C gedurende 25 min, 60 °C gedurende 5 min, 70 °C gedurende 10 min, 4 °C tot het einde.
- Voeg 7,5 μL Taq polymerase master mix toe aan elke put.
- Voeg 1,5 μL van het primerzwembad (zie hierboven) toe aan elke put.
- Plaats de PCR-plaat in de thermocycler en voer het volgende voorversterkerprotocol uit: 95 °C gedurende 10 min, gevolgd door 22 cycli van 96 °C gedurende 5 sec, 60 °C gedurende 4 min.
- Voeg 0,6 μL exonuclease I reactiebuffer 10x, 1,2 μL exonuclease I en 4,2 μL DNA-suspensiebuffer toe aan elke put.
- Plaats de PCR-plaat in de thermocycler en voer het volgende protocol uit: 37 °C gedurende 30 min, 80 °C gedurende 15 min.
- Voeg 54 μL TE-buffer toe aan elke put. Draai de PCR-plaat op 1.300 x g bij 5 min. Bewaar bij 4 °C als je onmiddellijk doorgaat naar de volgende stap. Bewaar bij -20 °C als u meer dan 12 uur wacht op de volgende stap.
- Combineer de voorwaartse en omgekeerde mRNA qPCR genprimers voor alle genen die worden geassuieerd in een primerpool voor vooramplificatie (500 nM-concentratie per primer). Bijvoorbeeld 1 μL van 100 μM primers in 80 μL plus 120 μL DNA Suspension Buffer.
- Bereid de monsterplaat voor op de 96.96 Dynamic Array Chip.
- Voeg in een nieuwe 96 well PCR-plaat 0,45 μL 20x DNA bindingskleurstof en 4,55 μL lage ROX mastermix toe aan elke put.
- Voeg 3 μL voorversterkt monster toe aan elke put, draai de PCR-plaat op 1.300 x gen zet de plaat op ijs.
- Bereid de testplaat voor op de 96.96 Dynamic Array Chip.
- Voeg in een nieuwe 96 well PCR-plaat 3,75 μL 2x GE-testlaadrea en 1,25 μL DNA-suspensiebuffer toe aan elke put.
- Voeg aan elke overeenkomstige put 2,5 μL van 10 μM qPCR primer toe. Draai de PCR plaat op 1.300 x g voor 5 min.
- Laad en voer de 96.96 Dynamic Array Chip uit.
- Prime de chip met regelvloeistof.
- Plaats de chip in een IFC Controller HX en voer het Prime (136X) script uit.
- Voeg 6 μL van het monster van de PCR-monsterplaat toe aan de overeenkomstige monsterputten in de 96.96 Dynamic Array Chip.
- Voeg 6 μL van het monster van de PCR-testplaat toe aan de overeenkomstige testputten in de 96.96 Dynamic Array Chip.
- Gebruik naalden om eventuele luchtbellen in de putten van de 96.96 Dynamic Array Chip te knallen.
- Plaats de 96.96 Dynamic Array Chip in de IFC Controller HX en voer het load mix (136x) script uit.
- Verwijder de chip van de IFC Controller HX, pel de beschermende sticker af en plaats de 96.96 Dynamic Array Chip in een microfluïdisch RT-qPCR-platform. Voer het GE Fast 96 x 96 PCR-protocol (30 cycli) uit.
OPMERKING: De RNA-kwaliteit en -validiteit van de resultaten worden beoordeeld aan de hand van meerdere methoden, waaronder testvalidatie via gelelektroforese, smelttemperatuurcurven, monster- en testrepliceert en standaard verdunningsreeksplots. Bovendien kunnen transcriptiebevindingen worden gevalideerd door onafhankelijke methoden op hersenhemisectie, waaronder westerse vlek- en immunofluorescentietests.
8. Het meten van de bacteriële overvloed met microfluïde RT-qPCR
- Extract van de bacteriële DNA naar aanleiding van de aanwijzingen van de ontlasting DNA extractie kit.
- Schat de bacteriële DNA-concentratie met qPCR.
- Voeg het geëxtraheerde bacteriële DNA toe aan een nieuwe PCR-plaat. Voeg 1 μL geëxtraheerd bacterieel DNA en 9 μL DNA-suspensiebuffer toe.
- Bereid de testplaat voor op de 48.48 Dynamic Array Chip (zie stappen 7.2.1-7.2.2)
- Bereid de monsterplaat voor op de 48,48 Dynamic Array Chip (zie stappen 7.3.1-7.3.2)
- Voeg in een nieuwe 96 well PCR-plaat 0,45 μL 20x DNA bindingskleurstof en 4,55 μL lage ROX mastermix toe aan 48 putten.
- Voeg 3 μL van het monster van de PCR-plaat met het bacteriële DNA toe aan de 48 putten en draai de PCR-plaat op 1.300 x g voor 5 min. Bewaar bij 4 °C.
- Laad en voer de 48,48 Dynamic Array Chip uit (zie stappen 7.4.1-7.4.7).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De selectie van de enkele cellen werd zowel visueel als moleculair gevalideerd. Visueel werd cellulaire morfologie bekeken voordat de celverzameling werd gevisualerd. Cellen verzameld werden vervolgens bekeken op de QC station en de cellulaire kernen vlek (DAPI) overlapte met de single cell selection marker fluorescentie. Figuur 2A toont representatieve beelden van een dia met gezoomde rattenvoorhersenen met de CeA. Latere afbeeldingen(figuur 2B-D)tonen de selectie van enkele cellen en hun verwijdering uit het weefsel voor transcriptomische analyse. Moleculair toonden de celtypespecifieke markers een verhoogde expressie in dat celtype aan (figuur 1C). We keken naar neuronen, microglia' s en astrocyten en maten de expressie van respectievelijk NeuN, Mafen Gfap. De cijfers werden oorspronkelijk gepubliceerd in O'Sullivan et al.4.
Verder kunnen de controles ook in het microfluidic platform worden uitgevoerd om de uitdrukkingsbevindingen te valideren (b.v., analyse van andere gebieden van het zelfde weefsel om kernspecificiteit aan te tonen). Een apart weefsel kan ook worden vergeleken met het gewenste monster om primer specificiteit in het weefsel van belang aan te tonen. Positieve en negatieve controlegenen kunnen ook worden opgenomen (bijvoorbeeld genen waarvan bekend is dat ze afwezig zijn in het geselecteerde weefsel of sterk uitgedrukt zijn). Drie of vier huishoudingsgenen moeten ook worden opgenomen, niet alleen voor gegevensnormalisatiedoeleinden, maar ook als een maat voor experimentele kwaliteit. Deze genen moeten de laagste variantie in expressie voor alle monsters en behandelingen aantonen. In dit representatieve experiment werd geen alternatief hersengebied geassaid, maar de huishoudgenen Ldha en Actb werden gebruikt voor normalisatie. Gapdh werd gebruikt als interne controle.
Figuur 3 toont enkele van de multivariate methoden die onze groep gebruikte om onze gegevens te analyseren. We ontdekten dat astrocyten in de terugtrekkingsgroep het meest getroffen celtype waren. Op basis van deze gegevens in het kader van andere studies speculeren we dat astrocyten een belangrijke rol spelen bij ontsteking in de CeA tijdens de opioïde ontwenning en dat dit bijdraagt aan de fysieke en emotionele symptomen die het zoeken naar drugs stimuleren via negatieve versterking. We tonen ook de darmmicroflora gegevens (Figuur 4).
Figuur 1: Single-cell RT-qPCR workflow en transcriptie heterogeniteit. (A) Experimenteel protocol (n = 4 voor elke voorwaarde) (B) Tiencel samengevoegdmonster transcriptome meting. (C) Staafplot geeft mediaan -ΔΔCt expressiewaarden weer. Neuronen = paars; microglia = geel; astrocyten = groen. Foutbalken tonen standaardfouten. *p < 0,05, ***p < 0,0003; Tukey's eerlijke betekenis test. (D) De heat map toont de expressie van alle monsters in 40 geteste genen. Rijen zijn 10-cel gepoolde monsters (930 neuronale monsters, 950 microgliale monsters, 840 astrocyten monsters zoals aangeduid); de getallen geven de monsterclusters aan en de kolommen zijn de genen. De figuur is gewijzigd van O'Sullivan et al.4. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Laser vangen microdissectie beelden. (A) Vier plakjes uitgedroogde gemeste rattenvoorhersenen met de CeA op een glijbaan. Op de dia werden precies 10 μm van het vorige segment plakjes geplaatst. Links is voorste en rechts is achterste. De afstand tot de bregma kan worden geschat met behulp van een rat hersenen atlas en oriëntatiepunten, met inbegrip van de optische darmkanaal en stria terminalis. (B-D) Reeks beelden die de selectie van enkele cellen in cea(C) en hun verwijdering van het weefsel(D) tonen. Meerdere LCM-doppen werden gebruikt om deze cellen te selecteren. Een dop wordt gebruikt om 10 cellen van een celtype te kiezen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Representatieve resultaten 1. (A) Een cartoon schema van een cel met de genen in de orde en hun locatie. De hier gelabelde gensymbolen zijn een referentie voor paneel B. (B) De gekleurde vierkanten vertegenwoordigen relatieve genexpressie (mediaan -ΔΔCt-waarde) voor de genen die in paneel A worden vertegenwoordigd. De locatie van de vierkanten vertegenwoordigt de cellulaire lokalisatie of functie van het overeenkomstige eiwit. De panelen geven de relatieve genexpressie weer die door kleur wordt weergegeven voor behandelingen en celtypen. Geel = hoge expressie; blauw = lage expressie; witte = neutrale expressie. De figuur is gewijzigd van O'Sullivan et al.4. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Representatieve resultaten 2. (A) Gencorrelatienetwerken. Pearson correlatie werd uitgevoerd op de -ΔΔCt waarden binnen een behandeling en celtype. De knooppunten duiden de genen en hun kleur betekent de relatieve expressieniveaus (de mediaan -ΔΔCt-waarde voor elk gen). De randen duiden expressiecorrelaties en de dikte aan, wat de sterkte van de expressiecorrelatie (ρ) betekent. Correlaties met een q-value <0,001 worden weergegeven. Zwarte randen = positieve correlaties; groene randen = negatieve correlaties. (B) Staafpercelen van geselecteerde genen die significante differentiële genexpressie aantonen. De statistieken werden berekend met behulp van geneste ANOVA #p < 0,1, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,0001 (n = 4 dieren voor alle behandelingen). De figuur is gewijzigd van O'Sullivan et al.4. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Relatieve overvloed aan darmmicroflora. De barplots tonen de relatieve overvloed aan bacteriële soorten (-ΔΔCt-waarden). #p < 0,1, *p < 0,05, **p < 0,008, ***p = 0,0009; tweerichtingsverkeer ANOVA; n = 4 dieren voor elke behandeling. De figuur is gewijzigd van O'Sullivan et al.4. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Eencellige biologie heeft aangetoond dat de heterogeniteit van cellulaire fenotypes en robuustheid van weefselfunctie. Deze bevindingen hebben inzicht gegeven in de organisatie van biologische systemen op zowel macro- als microschalen. Hier beschrijven we de combinatie van twee methoden, LCM en microfluïsche qPCR, om single-cell transcriptome maatregelen te verkrijgen die anatomische specificiteit en transcriptienauwkeurigheid tegen relatief lage kosten bieden (figuur 1). Onze groep hanteert een systeembiologiebenadering en meet vaak meerdere weefsels bij hetzelfde dier. We vinden deze methoden flexibel en vruchtbaar om te bepalen hoe biologische systemen reageren op verschillende uitdagingen op transcriptieniveau. Daarnaast gebruiken we deze methoden in de anatomische mapping van cellulaire fenotypes in basislijnomstandigheden.
We verstrekken gegevens en gewijzigde cijfers uit een recente publicatie waarin wordt onderzocht hoe de CeA reageert op afhankelijkheid van opioïden en onttrekking4. In dit voorbeeld gebruikten we hetzelfde microfluïde qPCR-platform om de relatieve overvloed van de darmmicroflora te meten. De methoden en werkstroom worden samengevat in figuur 1 en werden oorspronkelijk gepubliceerd in O'Sullivan et al.4. Belangrijke bevindingen van microfluïde RT-qPCR met hoge doorvoer kunnen vervolgens worden gevalideerd door eiwitmetingen zoals westerse vlek of immunofluorescentie4.
Een grote uitdaging van deze systeembiologiebenadering is het bepalen van specifieke causale biologische mechanismen. Fuzzy logic is een gevalideerde oplossing die we met succes hebben gebruikt om agenten af te leiden in genregulerend netwerkgedrag2. Manipulatie van diermodellen kan ook worden gebruikt om inzicht te geven in systemische mechanismen. Bijvoorbeeld, hetzelfde protocol hierin met de toevoeging van een rat cohort met een maag-vagotomie zal gegevens opleveren die inzicht geven in de informatiestroom via de nervus vagus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
Het hier gepresenteerde werk werd gefinancierd door NIH HLB U01 HL133360 toegekend aan JS en RV, NIDA R21 DA036372 toegekend aan JS en EVB, en T32 AA-007463 toegekend aan Jan Hoek ter ondersteuning van SJO's.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20X DNA Binding Dye | Fluidigm | 100-7609 | NA |
| 2x GE Assay Loading Reagent | Fluidigm | 85000802-R | NA |
| 48.48 Dynamic Array IFC for Gene Expression | Fluidigm | BMK-M-48.48 | NA |
| 96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression | Fluidigm | BMK-M-96.96 | NA |
| Anti-Cd11β Antibody | Genway Biotech | CCEC48 | Microglia Stain |
| Anti-NeuN Antibody, clone A60 | EMD Millipore | MAB377 | Neuronal Stain |
| ArcturusXT Laser Capture Microdissection System | Arcturus | NA | NA |
| Biomark HD | Fluidigm | NA | RT-qPCR platform |
| Bovine Serum Antigen | Sigma-Aldrich | B4287 | |
| CapSure Macro LCM Caps | ThermoFisher Scientific | LCM0211 | NA |
| CellDirect One-Step qRT-PCR Kit | ThermoFisher Scientific | 11753500 | Lysis buffer solution components |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62248 | Nucleus Stain |
| DNA Suspension Buffer | TEKnova | T0221 | |
| Exonuclease I | New Englnad BioLabs, Inc. | M0293S | NA |
| ExtracSure Sample Extraction Device | ThermoFisher Scientific | LCM0208 | NA |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | ThermoFisher Scientific | 22-037-246 | Plain glass slides |
| GeneAmp Thin-Walled Reaction Tube | ThermoFisher Scientific | N8010611 | |
| GFAP Monoclonal Antibody | ThermoFisher Scientific | A-21294 | Astrocyte Stain |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Superclonal™ Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A28175 | Seconadry Antibody |
| IFC Controller | Fluidigm | NA | NA |
| RNaseOut | ThermoFisher Scientific | 10777019 | |
| SsoFast EvaGreen Supermix with Low Rox | Bio-Rad | PN 172-5211 | Rox master mix |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | ThermoFisher Scientific | 11754250 | Contains VILO and SuperScript |
| T4 Gene 32 Protein | New Englnad BioLabs, Inc. | M0300S | NA |
| TaqMan PreAmp Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4391128 | NA |
| TE Buffer | TEKnova | T0225 | NA |
References
- Park, J., et al. Inputs drive cell phenotype variability. Genome Research. 24, 930-941 (2014).
- Park, J., Ogunnaike, B., Schwaber, J., Vadigepalli, R. Identifying functional gene regulatory network phenotypes underlying single cell transcriptional variability. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 117, 87-98 (2015).
- Park, J., et al. Single-Cell Transcriptional Analysis Reveals Novel Neuronal Phenotypes and Interaction Networks Involved in the Central Circadian Clock. Frontiers in Neuroscience. 10, 481 (2016).
- O'Sullivan, S. J., et al. Single-Cell Glia and Neuron Gene Expression in the Central Amygdala in Opioid Withdrawal Suggests Inflammation With Correlated Gut Dysbiosis. Frontiers in Neuroscience. 13, 665 (2019).
- Buettner, F., et al. Computational analysis of cell-to-cell heterogeneity in single cell RNA-sequencing data reveals hidden subpopulations of cells. Nature Biotechnology. 33, 155-160 (2015).
- Papalexi, E., Satija, R. Single-cell RNA sequencing to explore immune cell heterogeneity. Nature Reviews Immunolology. 18, 35-45 (2018).
- SEQC/MAQC-III Consortium. A comprehensive assessment of RNA-seq accuracy, reproducibility and information content by the Sequencing Quality Control Consortium. Nature Biotechnology. 32, 903-914 (2014).
- Rowin, J., Xia, Y., Jung, B., Sun, J. Gut inflammation and dysbiosis in human motor neuron disease. Physiological Reports. 5, (2017).
- Tamboli, C. P., Neut, C., Desreumaux, P., Colombel, J. F. Dysbiosis in inflammatory bowel disease. Gut. 53, 1-4 (2004).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates: Hard Cover Edition. , (2006).
