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Genetics

एकल कोशिकाओं के ट्रांसक्रिप्शनल प्रोफाइल का विश्लेषण करने के लिए लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन और माइक्रोफ्लूइडिक क्यूपीसीआर का संयोजन: ओपिओइड निर्भरता के लिए एक सिस्टम जीव विज्ञान दृष्टिकोण

Published: March 8, 2020 doi: 10.3791/60612
Automatic Translation
1,2, 3, 1, 3, 1
1Daniel Baugh Institute for Functional Genomics and Computational Biology, Department of Pathology, Anatomy, and Cell Biology, Thomas Jefferson University, 2Sidney Kimmel Medical College, Thomas Jefferson University, 3Department of Pharmacology & Physiology, Drexel University College of Medicine

Summary

यह प्रोटोकॉल बताता है कि लेजर कैप्चर माइक्रोडिससेक्शन का उपयोग करके उच्च सटीकता और परमाणु विशिष्टता के साथ एमिग्डाला के केंद्रीय नाभिक से एकल न्यूरॉन्स, माइक्रोग्लिया और एस्ट्रोसाइट्स को कैसे इकट्ठा किया जाए। इसके अतिरिक्त, हम इन कोशिकाओं के ट्रांसक्रिप्टोम के सबसेट को मापने के लिए माइक्रोफ्लूइडिक आरटी-क्यूपीसीआर के उपयोग की व्याख्या करते हैं।

Abstract

शारीरिक रूप से आसन्न एकल कोशिकाओं में गहन प्रतिलेखन विषमता से पता चलता है कि सेलुलर फेनोटाइप विविधता द्वारा मजबूत ऊतक कार्यक्षमता हासिल की जा सकती है। जैविक प्रणालियों के नेटवर्क गतिशीलता की जांच करने वाले एकल-सेल प्रयोग जैविक रूप से सार्थक संकल्प पर विभिन्न स्थितियों के लिए सेलुलर और ऊतक प्रतिक्रियाओं को प्रदर्शित करते हैं। इसके साथ, हम शारीरिक रूप से विशिष्ट स्थानों से एकल कोशिकाओं को इकट्ठा करने और उनके जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल के सबसेट को सही ढंग से मापने के लिए अपने तरीकों की व्याख्या करते हैं। हम माइक्रोफ्लूइडिक रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन क्वांटिटेटिव पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (आरटी-क्यूपीसीआर) के साथ लेजर कैप्चर माइक्रोडिससेक्शन (एलसीएम) को जोड़ते हैं। हम आंत सामग्री की माइक्रोबियल बहुतायत को मापने के लिए इस माइक्रोफ्लूइडिक आरटी-क्यूपीसीआर प्लेटफॉर्म का भी उपयोग करते हैं।

Introduction

एकल कोशिकाओं के जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल को मापने के एक ऊतक के भीतर व्यापक फेनोटाइपिक विषमता का प्रदर्शन किया है । इस जटिलता ने ऊतक समारोह को नियंत्रित करने वाले जैविक नेटवर्कों की हमारी समझ को जटिल बना दिया है। हमारे समूह और अन्य लोगों ने कई ऊतकों और शर्तों1,2,3,4,5,6में इस घटना का पता लगाया है । इन प्रयोगों से न केवल यह सुझाव है कि जीन अभिव्यक्ति नेटवर्क का नियमन ऐसी विषमता को रेखांकित करता है, बल्कि यह भी कि एकल-कोशिका संकल्प ऊतक समारोह में जटिलता का पता चलता है कि ऊतक स्तर का संकल्प सराहना करने में विफल रहता है । दरअसल, केवल कोशिकाओं के एक छोटे से अल्पसंख्यक एक विशिष्ट स्थिति या चुनौती का जवाब हो सकता है, लेकिन समग्र शरीर विज्ञान पर उन कोशिकाओं का प्रभाव काफी हो सकता है । इसके अतिरिक्त, एक सिस्टम जीव विज्ञान दृष्टिकोण जो कई सेल प्रकारों और ऊतकों से उच्च आयामी डेटासेट के लिए बहुआयामी तरीकों को लागू करता है सिस्टम-व्यापी उपचार प्रभावों को स्पष्ट कर सकता है।

हम इस तरह के डेटासेट प्राप्त करने के लिए एलसीएम और माइक्रोफ्लूइडिक आरटी-क्यूपीसीआर को जोड़ते हैं। हम फ्लोरेसेंस-एक्टिवेटेड सेल छंटाई (एफएसीएस) के माध्यम से एकल कोशिकाओं को इकट्ठा करने और उनके ट्रांसपेम को मापने के लिए आरएनए अनुक्रमण (आरएनए-सीक्यू) का उपयोग करने के विपरीत यहां इस दृष्टिकोण को लेते हैं। FACS पर एलसीएम का लाभ यह है कि एकल कोशिकाओं की सटीक शारीरिक विशिष्टता को एलसीएम के साथ, अपेक्षाकृत और बिल्कुल प्रलेखित किया जा सकता है। इसके अलावा, जबकि आरएनए-सीक्यू अधिक सुविधाओं को माप सकता है कि आरटी-क्यूपीसीआर, माइक्रोफ्लूइडिक आरटी-क्यूपीसीआर कम खर्चीला है और इसमें उच्च संवेदनशीलता और विशिष्टता7है।

इस प्रतिनिधि प्रयोग में, हमने एमिग्डाला (सीईए) और आंत माइक्रोफ्लोरा बहुतायत4के केंद्रीय नाभिक में चूहा न्यूरोनल, माइक्रोग्लिया और एस्ट्रोसाइट जीन अभिव्यक्ति पर ओपिओइड निर्भरता और नाल्ट्रेक्सोन-उपजी ओपिओइड वापसी के प्रभावों की जांच की। चार उपचार समूहों का विश्लेषण किया गया: 1) प्लेसबो, 2) मॉर्फिन, 3) नाल्ट्रेक्सोन, और 4) वापसी(चित्रा 1)। हमने पाया कि ओपिओइड निर्भरता ने जीन अभिव्यक्ति को काफी हद तक नहीं बदला, लेकिन उस ओपिओइड वापसी ने विशेष रूप से भड़काऊ जीन, टीएनएफ की अभिव्यक्ति को प्रेरित किया । एस्ट्रोसाइट्स सबसे ज्यादा प्रभावित सेल टाइप थे । आंत माइक्रोबायोम ओपिओइड वापसी से गहराई से प्रभावित हुआ था जैसा कि फर्मीक्यूट्स से बैकेरॉयड अनुपात में कमी से संकेत मिलता है, जो आंत डिस्बायोसिस8,9का एक स्थापित मार्कर है।

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Protocol

यह अध्ययन थॉमस जेफरसन विश्वविद्यालय और ड्रेक्सेल यूनिवर्सिटी कॉलेज ऑफ मेडिसिन की एनिमल केयर एंड यूज कमेटी (आईएसीयूसी) की सिफारिशों के अनुसार किया गया। इस प्रोटोकॉल को थॉमस जेफरसन यूनिवर्सिटी और ड्रेक्सेल यूनिवर्सिटी कॉलेज ऑफ मेडिसिन आईएसयूसी ने मंजूरी दी थी ।

1. पशु मॉडल

  1. वयस्क पुरुष स्प्राग-डावले चूहों में दो 75 मिलीग्राम धीमी गति से रिलीज मॉर्फिन सल्फेट छर्रों या दो प्लेसबो छर्रों को काट दें।
    1. मामूली बाँझ सर्जरी के लिए उचित रूप से गाउन और दस्ताने का उपयोग करें। यदि आवश्यक हो तो कतरनी के साथ चूहे डोरसम दाढ़ी।
    2. जानवर की आंखों पर पशु चिकित्सक मरहम लगाएं। आइसोफ्लोरीन साँस लेना के लगभग 20 एस के साथ चूहे को एनेस्थेटइज़ करें। एनेस्थीसिया चेतना के नुकसान से पुष्टि होती है।
    3. मनका-निष्फल कुंद कैंची के साथ चूहे डोरसम में एक मिडलाइन चीरा बनाओ और एक मनका-निष्फल जांच के साथ शरीर की दीवार से डर्मिस अलग करें। मार्मिस के नीचे छर्रों को माड-स्टरलाइज्ड संदंश के साथ डालें। सीवन चीरा एक बाँझ सुई के साथ बंद कर दिया।
      नोट: पूरी प्रक्रिया चूहे के प्रति लगभग 5 मिन लेती है। प्रत्येक चूहे के लिए ताजा बाँझ दस्ताने का उपयोग किया जाता है।
    4. चूहे को पोस्टसर्जिकल रिकवरी के लिए एक आइसोलेशन पिंजरे में रखें। दिल की धड़कन और नियमित श्वसन लय की जांच करें। जब तक चेतना वापस आ जाए तब तक चूहे का निरीक्षण करें। शल्य चिकित्सा दर्द के लिए आकलन करें।
    5. चूहों 8 एच पोस्टसर्जरी और वसूली और संक्रमण के लिए हर 12 घंटे के बाद का आकलन करें। चूहों को बाकी पलटन के साथ पिंजरे में रखें जब वे सर्जरी से पूरी तरह से उबर जाते हैं, लगभग 24 एच पोस्टसर्जरी।
  2. मॉर्फिन एक्सपोजर के 6 दिनों के बाद जी और वापसी पलटन को इंट्रापेरिटोनियल नाल्ट्रेक्सोन इंजेक्शन (75 मिलीग्राम/किलो) दें।
    नोट: इस प्रतिनिधि प्रयोग में चार चूहा साथियों थे (चित्रा 1देखें) ।

2. नमूना कटाई

  1. मस्तिष्क को 6 दिन पैलेट डालने या नाल्ट्रेक्सोन इंजेक्शन के बाद 24 घंटे के बाद फसल करें।
    1. जानवर को लगभग 30 एस के लिए एक आइसोफ्लोरीन कक्ष में रखें या जब तक चेतना की हानि न हो, गति की कमी और श्वसन दर में कमी से संकेत मिलता है।
    2. जानवर को तेजी से काटना करने के लिए एक तेज गिलोटिन का उपयोग करें।
    3. जानवर की खोपड़ी से मस्तिष्क को काटना।
    4. हटाए गए मस्तिष्क के लिए निम्नलिखित सकल चीरों बनाने के लिए एक तेज हाथ वाले रेजर का उपयोग करें: सबसे पहले, सेरिबैलम को काट लें और त्यागें। दूसरा, ब्रेनस्टेम को अग्रमस्तिष्क से एक ट्रांसवर्स चीरा के साथ अलग कर दें। तीसरा, एक मिडलाइन sagittal चीरा के साथ अग्रमस्तिष्क और/या ब्रेनस्टेम hemisect ।
    5. मोल्ड के नीचे 3-4 सेमी इष्टतम कटिंग टेप कंपाउंड (OCT) के साथ अग्रमस्तिष्क और ब्रेनस्टेम को प्लास्टिक के ऊतकों-एम्बेडिंग मोल्ड में रखें। अक्टूबक्ट के साथ नमूना के बाकी कवर ।
    6. तुरंत प्लास्टिक के ऊतकों को एम्बेडिंग मोल्ड को अक्टूबर के साथ कवर किए गए नमूने के साथ सूखी बर्फ और मेथनॉल युक्त स्नान में रखें। मेथनॉल को टिश्यू एम्बेडिंग मोल्ड में न फैलने दें। ऊतक संग्रह समाप्त होने तक मेथनॉल-आइस बाथ में मस्तिष्क के नमूने के साथ एम्बेडिंग मोल्ड रखें (~ 10-15 सिन अधिकतम)।
    7. मस्तिष्क के नमूने को जल्द से जल्द -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में रखें।
  2. आंत के नमूनों को समवर्ती रूप से फसल दें।
    1. तेजी से डेपुटेशन के बाद, जानवर के पेट में एक मिडलाइन चीरा एक स्केलपेल के साथ बनाएं।
    2. सेकम का पता लगाएं और आरोही कोलन के लिए अपने कनेक्शन तोड़।
    3. एक 15 mL शंकुट्यूब में cecal सामग्री निचोड़।
    4. तुरंत शंकुई ट्यूब को सूखी बर्फ पर रखें और जितनी जल्दी हो सके -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में डाल दें।
      नोट: छोटी आंत सामग्री भी एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में एक ही तरीकों का उपयोग कर एकत्र किया जा सकता है ।

3. टुकड़ा करने की क्रिया

  1. एक क्रायोस्टेट का उपयोग करके हेमीसेक्रेड चूहा फोरब्रेन का टुकड़ा करें।
    1. - 80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से फोरब्रेन के साथ प्लास्टिक एम्बेडिंग मोल्ड निकालें और -20 डिग्री सेल्सियस क्रायोस्टेट में रखें।
    2. एम्बेडिंग मोल्ड से ऑक्टेश-एम्बेडेड हेमीसेक्रेड फोरब्रेन सैंपल निकालें। यदि आवश्यक हो तो प्लास्टिक एम्बेडिंग मोल्ड के कोनों को लंबवत टुकड़ा करने के लिए एक रेजर का उपयोग करें। अक्टूबर का उपयोग करके क्रायोस्टेट चक पर कौडल कोरोनल टुकड़ा करने के लिए रोस्ट्रल के लिए अग्रमस्तिष्क माउंट करें।
      नोट: सीईए की पहचान करने के लिए शारीरिक स्थलों में ऑप्टिक ट्रैक्ट और स्ट्राइया टर्मिनलिस(चित्रा 2बी)शामिल हैं। ऑप्टिक चिम से ऑप्टिक ट्रैक्ट शाखाएं और पृष्ठीय-पार्श्व को ट्रैक करती हैं क्योंकि मस्तिष्क को रोस्ट्रल से कौडल में कटा हुआ है। जब ऑप्टिक ट्रैक्ट में चूहे के मस्तिष्क एटलस ब्रेग्मा -2.12 मिमी10में देखी जाने वाली आकृति विज्ञान होता है, तो माइक्रोस्कोप के नीचे परीक्षण स्लाइस देखे जा सकते हैं। ऑप्टिक ट्रैक्ट और स्ट्राइया टर्मिनलिस मॉर्फोलॉजी को ब्रेग्मा की पहचान करने के लिए चूहे के मस्तिष्क एटलस10 में जांच की जा सकती है और क्या सीईए स्ट्राइया टर्मिनलों को घेरे हुए है।
    3. टुकड़ा 10 μm मोटी कोरोनल वर्गों से हेमीकेटेड फोरब्रेन रोस्ट्रल से कॉडल तक जब तक सीईए युक्त वर्गों तक पहुंच रहे हैं ।
      नोट: वर्गों की चौड़ाई और ऊंचाई लगभग 200 मिमी है।
    4. सादे ग्लास स्लाइड पर गल-बढ़ते 10 माइक्रोन वर्गों द्वारा सीईए, या पसंदीदा मस्तिष्क क्षेत्र वाले 10 μm वर्गों को इकट्ठा करें। तुरंत एक धातु सूखी बर्फ पर आराम पैन पर कांच स्लाइड जगह है । स्लाइड्स में रखें दिमाग के सेक्शन को जल्द से जल्द -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में रखें।
      नोट: एक ही स्लाइड पर कई स्लाइस रखे जा सकते हैं। यदि एक ही स्लाइड पर स्लाइस के लिए एक अलग सेल प्रकार दाग का उपयोग कर, स्लाइस के बीच के बारे में १०० मिमी छोड़ दें तो एक हाइड्रोफोबिक कलम स्लाइड पर सेल प्रकार विशिष्ट एंटीबॉडी समाधान अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । स्लाइस के प्रत्येक तरफ स्लाइड के किनारे से लगभग 20 मिमी छोड़ दें।

4. इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला

  1. इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग करके पसंद के मस्तिष्क कोशिका (जैसे, न्यूरॉन, माइक्रोग्लिया, एस्ट्रोसाइट, आदि) के लिए अग्रमस्तिष्क वर्गों को दाग दें।
    1. -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से सीईए के 10 माइक्रोन सेक्शन के साथ एक या अधिक स्लाइड निकालें।
    2. आगे की स्लाइड्स में 30 एस के लिए 75% इथेनॉल के साथ फिक्स करें अतिरिक्त लिक्विड निकालें।
    3. 1x फॉस्फेट बफर लवलाइन (पीबीएस) में 2% गोजातीय सीरम एंटीजन (बीएसए) के साथ 30 एस के लिए स्लाइस ब्लॉक करें। पीबीएस के साथ 1x धोएं।
    4. 2 मिन के लिए स्लाइड में प्राइमरी एंटीबॉडी सॉल्यूशन डालें 2% बीएसए सॉल्यूशन के साथ 1x को धोएं।
      नोट: प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान 2% प्राथमिक एंटीबॉडी, 1% आरएनएएस आउट, और ऊपर अवरुद्ध चरण (चरण 4.1.3) के लिए एक ही बीएसए पीबीएस समाधान का 96% से बना है। प्रतिनिधि प्रयोग में एक एंटी-न्यून एंटीबॉडी, एक एंटी-सीडी11एफ एंटीबॉडी, और निम्नलिखित मात्रा में एक एंटी-जीएफएपी एंटीबॉडी का उपयोग किया गया: प्राथमिक के 3 μL, आरएनए अवरोधक के 1.88 माइक्रोन, और बीएसए समाधान के 145.12 माइक्रोन।
    5. 3 मिन के लिए स्लाइड में सेकेंडरी एंटीबॉडी सॉल्यूशन डालें। 1x को पीबीएस के साथ धोएं।
      नोट: माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान बकरी विरोधी माउस 488 एनएम फ्लोरोसेंट टैग (1:500), आरएनए अवरोधक के 2.5 माइक्रोन, डीपीआई के 1.3 माइक्रोन (1:10,000), और 2% बीएसए के 196.5 माइक्रोन से बना है।

5. इथेनॉल और जाइलीन निर्जलीकरण श्रृंखला

  1. स्लाइड्स में 30 एस के लिए 75% इथेनॉल में डुबकी लगाने के तुरंत बाद, 30 एस के लिए 95% इथेनॉल में स्लाइड्स को डुबोएं। 30 एस के लिए 100% इथेनॉल में स्लाइड्स को डुबकी लगाने के तुरंत बाद, स्लाइड्स को 30 एस के लिए 100% इथेनॉल वाले दूसरे कंटेनर में डुबोएं।
  2. इथेनॉल डिहाइड्रेशन सीरीज के बाद स्लाइड्स को 1 मिन के लिए हौसले से डाला जाइलीन में डुबोएं। 4 मिन के लिए जाइलीन के दूसरे कंटेनर में स्लाइड्स में डुबोएं।
  3. स्लाइड्स में जानिए जाइलीन बाथ से 5 मिन के लिए हवा को अंधेरे में सुखाने दें।
  4. आगे सूखने के लिए 5 मिन के लिए एक डिसिक्टोर में स्लाइड्स रखें।

6. लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन

  1. यदि दाग, माइक्रोस्कोप में स्लाइड जगह है और ब्याज के क्षेत्र (सीईए) गुदानामील स्थलों (यानी, ऑप्टिक चिम और स्ट्राइया टर्मिनल्स) का उपयोग कर पाते हैं ।
  2. ब्याज के क्षेत्र में दाग सेल प्रकार और उसके नाभिक की पहचान करने के लिए फ्लोरेसेंस का उपयोग करें। एकल कोशिका पूल किए गए नमूने करते हुए एक कोशिका या कई कोशिकाओं का चयन करें। एलसीएम सॉफ्टवेयर का उपयोग करब्याज की कोशिकाओं को चिह्नित करें।
  3. ब्याज के क्षेत्र पर टुकड़ा के शीर्ष पर एलसीएम टोपी रखें।
  4. आईआर लेजर ताकत, आकार और अवधि को समायोजित करने के लिए एक अवरक्त (आईआर) लेजर के परीक्षण शॉट्स का उपयोग करें ताकि एलसीएम कैप चिपकने वाला केवल चयनित एकल कोशिका के क्षेत्र में पिघल जाए। यह सुनिश्चित करता है कि चयनित कोशिकाओं के अलावा कोई अन्य कोशिकाएकत्र नहीं की जाएगी।
    नोट: इस प्रतिनिधि प्रयोग में, एक ही सेल प्रकार के 10 सेल पूल एक ही उपचार के साथ नमूनों के बीच जीन अभिव्यक्ति में सेल-टू-सेल परिवर्तनशीलता को सीमित करने के लिए एक ही नमूने के रूप में इस्तेमाल किया गया था । हालांकि, इस विधि का उपयोग सच्चे एकल सेल प्रयोगों1,3के लिए किया जा सकता है।
  5. एलसीएम सॉफ्टवेयर टूल(चित्रा 2सी)का उपयोग करके विश्लेषण के लिए एकत्र की जाने वाली व्यक्तिगत कोशिकाओं का चयन करें। चयनित कोशिकाओं को चूहे के मस्तिष्क एटलस और ब्रेग्मा10के आधार पर सीईए (या पसंद का मस्तिष्क क्षेत्र) के शारीरिक क्षेत्र में होना चाहिए। कोशिकाओं को आसन्न दाग नाभिक से कम से कम 3 μm होना चाहिए।
  6. चिह्नित एकल कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए आईआर लेजर को आग लगाएं।
  7. कैप को क्वालिटी कंट्रोल (क्यूसी) स्टेशन में रखें और यह सुनिश्चित करने के लिए देखें कि केवल वांछित कोशिकाओं का चयन किया गया था। यदि अन्य कोशिकाओं को गलती से चुना गया था, तो एक पराबैंगनी लेजर का उपयोग अवांछित कोशिकाओं को नष्ट करने के लिए किया जा सकता है जबकि टोपी क्यूसी स्टेशन में रहती है।
  8. ऊतक अनुभाग की एक तस्वीर लें जहां से कोशिका को अपनी शारीरिक विशिष्टता दस्तावेज़ के लिए एकत्र किया गया था। यदि चूहे के मस्तिष्क एटलस का उपयोग संदर्भ10के रूप में उचित हो तो ब्रेग्मा से स्लाइस की दूरी रिकॉर्ड करें ।
  9. क्यूसी स्टेशन से एलसीएम कैप निकालें, नमूना निष्कर्षण डिवाइस संलग्न करें, और नमूने पर लाइसिस बफर के 5.5 माइक्रोन को पिपेट करें।
    नोट: लिसिस बफर सॉल्यूशन में लिसिस एन्हांसर के 0.5 माइक्रोन और रिस्पेंशन बफर के 5 माइक्रोन होते हैं।
  10. एक्सट्राएक्सवाई डिवाइस को 0.5 एमएल माइक्रोसेंट्रिकफ्यूज ट्यूब पर फिट करें और 15 मिन के लिए 75 डिग्री सेल्सियस पर हॉटप्लेट पर रखें।
  11. कम गति (0.01-0.02 x ग्राम)पर 30 एस के लिए नमूना और लाइसिस बफर को नीचे स्पिन करें और एकत्र किए गए नमूने को -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में रखें।

7. सिंगल-सेल माइक्रोफ्लूइडिक आरटी-क्यूपीसीआर

  1. 96.96 डायनेमिक ऐरे चिप के लिए एकल सेल एमआरएनए का प्रीम्प्लेशन
    1. प्रीम्पलीकरण (500 एनएम एकाग्रता प्रत्येक प्राइमर) के लिए एक प्राइमर पूल में कहे जा रहे सभी जीन के लिए आगे और रिवर्स एमआरएनए क्यूपीसीआर जीन प्राइमर को मिलाएं। उदाहरण के लिए, 80 माइक्रोन में 100 माइक्रोएम प्राइमर के 1 μL प्लस डीएनए सस्पेंशन बफर के 120 माइक्रोन।
      नोट: प्रतिनिधि प्रयोग के लिए इस्तेमाल किए जाने वाले प्राइमर दृश्य ओ सुलिवान एट अल4में पाए जा सकते हैं ।
    2. एक नई 96 x 96 पीसीआर प्लेट में, प्रत्येक कुएं में 5x VILO के 1 μL जोड़ें।
    3. -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित नमूनों से एलसीएम एकल कोशिका के नमूने निकालें, संक्षेप में गल जाएं, कम गति (0.01-0.02 x ग्राम)पर संक्षेप में अपकेंद्रित्र करें, और पीसीआर प्लेट में लाइसेड सिंगल-सेल नमूने का 5.5 माइक्रोन जोड़ें। प्रत्येक नमूना अपने आप में अच्छी तरह से जोड़ा जाता है।
    4. पीसीआर प्लेट को नमूनों और वाइएलओ के साथ थर्मोसाइकिलर में रखें और 1.5 मिन के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर हीट करें। 1 मिन के लिए प्लेट को 4 डिग्री सेल्सियस पर 1,300 x ग्राम पर स्पिन करें और प्लेट को बर्फ पर रखें।
    5. 10x cDNA संश्लेषण मास्टर मिश्रण, ०.१२ μL T4 जीन ३२ प्रोटीन, और डीएनए निलंबन बफर के ०.७३ μL प्रत्येक अच्छी तरह से जोड़ें ।
    6. पीसीआर प्लेट को थर्मोसाइकिलर में रखें और निम्नलिखित प्रोटोकॉल चलाएं- 5 मिन के लिए 25 डिग्री सेल्सियस, 30 मिन के लिए 50 डिग्री सेल्सियस, 25 मिन के लिए 55 डिग्री सेल्सियस, 5 मिन के लिए 60 डिग्री सेल्सियस, 10 मिन के लिए 70 डिग्री सेल्सियस, 4 डिग्री सेल्सियस खत्म होना।
    7. प्रत्येक अच्छी तरह से Taq बहुलक मास्टर मिश्रण के 7.5 μL जोड़ें।
    8. प्रत्येक कुएं में प्राइमर पूल (ऊपर देखें) के 1.5 माइक्रोन जोड़ें।
    9. पीसीआर प्लेट को थर्मोसाइकिलर में रखें और निम्नलिखित प्रीएम्पलीफिकेशन प्रोटोकॉल चलाएं: 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, इसके बाद 5 सेकंड के लिए 96 डिग्री सेल्सियस के 22 चक्र, 4 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस।
    10. एक्सोन्यूलीज के 0.6 माइक्रोन जोड़ें मैं प्रतिक्रिया बफर 10x, 1.2 μL exonuclease I, और डीएनए निलंबन बफर के 4.2 μL प्रत्येक अच्छी तरह से।
    11. पीसीआर प्लेट को थर्मोसाइकिलर में रखें और निम्नलिखित प्रोटोकॉल चलाएं: 30 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 15 मिन के लिए 80 डिग्री सेल्सियस।
    12. प्रत्येक अच्छी तरह से TE बफर के 54 μL जोड़ें। पीसीआर प्लेट को 5 मिन पर 1,300 x ग्राम पर स्पिन करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें यदि तुरंत अगले चरण तक जारी रखा जाए। अगले चरण के लिए 12 घंटे से अधिक इंतजार कर रहे हैं, तो -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. 96.96 डायनेमिक ऐरे चिप के लिए नमूना प्लेट तैयार करें।
    1. एक नई 96 अच्छी तरह से पीसीआर प्लेट में, प्रत्येक अच्छी तरह से कम रॉक्स मास्टरमिक्स के 20x डीएनए बाध्यकारी रंगे के 0.45 माइक्रोन और 4.55 माइक्रोन जोड़ें।
    2. प्रत्येक कुएं में प्रीम्प्प्लीफाइड नमूने के 3 माइक्रोन जोड़ें, पीसीआर प्लेट को 1,300 x ग्रामपर स्पिन करें, फिर प्लेट को बर्फ पर रखें।
  3. 96.96 डायनेमिक ऐरे चिप के लिए परख प्लेट तैयार करें।
    1. एक नई 96 अच्छी तरह से पीसीआर प्लेट में, प्रत्येक अच्छी तरह से 2x जीई परख लोडिंग एजेंट और डीएनए निलंबन बफर के 1.25 माइक्रोन के 3.75 माइक्रोन जोड़ें।
    2. प्रत्येक संबंधित अच्छी तरह से 10 μM qPCR प्राइमर के 2.5 μL जोड़ें। पीसीआर प्लेट को 5 मिन के लिए 1,300 x ग्राम पर स्पिन करें।
  4. लोड और 96.96 गतिशील सरणी चिप चलाते हैं।
    1. नियंत्रण रेखा तरल पदार्थ के साथ चिप प्राइम।
    2. चिप को आईएफसी कंट्रोलर एचएक्स में रखें और प्राइम (136X) स्क्रिप्ट चलाएं ।
    3. 96.96 डायनेमिक ऐरे चिप में इसी सैंपल वेल में पीसीआर सैंपल प्लेट से सैंपल के 6 माइक्रोन जोड़ें।
    4. 96.96 डायनेमिक ऐरे चिप में इसी परख कुओं में पीसीआर परख प्लेट से नमूना के 6 μL जोड़ें।
    5. 96.96 गतिशील सरणी चिप के कुओं में किसी भी हवा बुलबुले पॉप करने के लिए सुइयों का प्रयोग करें।
    6. आईएफसी कंट्रोलर एचएक्स में 96.96 डायनेमिक ऐरे चिप रखें और लोड मिक्स (136x) स्क्रिप्ट चलाएं।
    7. आईएफसी नियंत्रक एचएक्स से चिप निकालें, सुरक्षात्मक स्टीकर को छीलें, और 96.96 डायनेमिक ऐरे चिप को माइक्रोफ्लूइडिक आरटी-क्यूपीसीआर प्लेटफॉर्म में रखें। जीई फास्ट 96 x 96 पीसीआर प्रोटोकॉल (30 चक्र) चलाएं।
      नोट: आरएनए गुणवत्ता और परिणामों की वैधता कई तरीकों से मूल्यांकन कर रहे हैं, जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस के माध्यम से परख सत्यापन सहित, तापमान घटता पिघलने, नमूना और परख प्रतिकृति, और मानक कमजोर पड़ने श्रृंखला भूखंडों । इसके अतिरिक्त, ट्रांसक्रिप्शनल निष्कर्षों को पश्चिमी दाग और इम्यूनोफ्लोरेसेंस परसहित मस्तिष्क हेमीसेक्शन पर स्वतंत्र तरीकों से मान्य किया जा सकता है।

8. माइक्रोफ्लूइडिक आरटी-क्यूपीसीआर के साथ बैक्टीरियल बहुतायत को मापना

  1. मल डीएनए निष्कर्षण किट के निर्देशों का पालन बैक्टीरियल डीएनए निकालें।
  2. क्यूपीसीआर का उपयोग करके बैक्टीरियल डीएनए एकाग्रता का अनुमान लगाएं।
  3. निकाले गए बैक्टीरियल डीएनए को एक नई पीसीआर प्लेट में जोड़ें। निकाले गए बैक्टीरियल डीएनए के 1 μL और डीएनए निलंबन बफर के 9 μL जोड़ें ।
  4. 48.48 गतिशील सरणी चिप के लिए परख प्लेट तैयार करें (चरण 7.2.1-7.2.2 देखें)
  5. 48.48 डायनेमिक ऐरे चिप के लिए नमूना प्लेट तैयार करें (चरण 7.3.1-7.3.2 देखें)
    1. एक नई 96 अच्छी तरह से पीसीआर प्लेट में, 20x डीएनए बाध्यकारी रंगे के 0.45 माइक्रोन और 48 कुओं में कम रॉक्स मास्टरमिक्स के 4.55 माइक्रोन जोड़ें।
    2. पीसीआर प्लेट से 48 कुओं में बैक्टीरियल डीएनए युक्त नमूने के 3 माइक्रोन जोड़ें और पीसीआर प्लेट को 5 मिन के लिए 1,300 x ग्राम पर स्पिन करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  6. लोड करें और 48.48 डायनेमिक ऐरे चिप चलाएं (चरण 7.4.1-7.4.7 देखें)।

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Representative Results

एकल कोशिकाओं के चयन को नेत्रहीन और आणविक दोनों रूप से मान्य किया गया था। नेत्रहीन, सेलुलर आकृति विज्ञान सेल संग्रह से पहले देखा गया था। इसके बाद एकत्र की गई कोशिकाओं को क्यूसी स्टेशन और सेलुलर नाभिक दाग (DAPI) पर देखा गया, जो एकल सेल चयन मार्कर फ्लोरेसेंस के साथ छा गया था । चित्रा 2एक सीईए युक्त हेमीकेड चूहा फोरब्रेन के साथ एक स्लाइड की प्रतिनिधि छवियों को दिखाता है। बाद की छवियां(चित्रा 2बी-डी)एकल कोशिकाओं के चयन और ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषण के लिए ऊतक से उनके हटाने को दिखाती हैं। आणविक रूप से, सेल प्रकार-विशिष्ट मार्कर ने उस सेल प्रकार(चित्रा 1सी)में बढ़ी हुई अभिव्यक्ति का प्रदर्शन किया। हमने न्यूरॉन्स, माइक्रोग्लिया और एस्ट्रोसाइट्स को देखा और क्रमशः न्यून, माफऔर जीएफएपीकी अभिव्यक्ति को मापा। आंकड़े मूल रूप से ओ सुलिवान एट अल4में प्रकाशित किए गए थे ।

इसके अलावा, अभिव्यक्ति निष्कर्षों को मान्य करने के लिए माइक्रोफ्लूइडिक प्लेटफॉर्म में नियंत्रण भी चलाए जा सकते हैं (उदाहरण के लिए, नाभिक विशिष्टता प्रदर्शित करने के लिए एक ही ऊतक के अन्य क्षेत्रों का विश्लेषण)। ब्याज के ऊतकों में प्राइमर विशिष्टता प्रदर्शित करने के लिए वांछित नमूने की तुलना में एक अलग ऊतक की तुलना भी की जा सकती है। सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण जीन भी शामिल किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, जीन या तो चयनित ऊतक से अनुपस्थित होने के लिए जाना जाता है या अत्यधिक व्यक्त) । तीन या चार हाउसकीपिंग जीन को न केवल डेटा सामान्यीकरण उद्देश्यों के लिए बल्कि प्रायोगिक गुणवत्ता के उपाय के रूप में भी शामिल किया जाना चाहिए । इन जीन सभी नमूनों और उपचार में अभिव्यक्ति में सबसे कम विचरण प्रदर्शित करना चाहिए । इस प्रतिनिधि प्रयोग में, कोई वैकल्पिक मस्तिष्क क्षेत्र परख नहीं किया गया था, लेकिन हाउसकीपिंग जीन Ldha और Actb सामान्यीकरण के लिए इस्तेमाल किया गया । गगध का उपयोग आंतरिक नियंत्रण के रूप में किया जाता था।

चित्रा 3 हमारे डेटा का विश्लेषण करने के लिए हमारे समूह द्वारा उपयोग किए जाने वाले कुछ बहुआयामी तरीकों को प्रदर्शित करता है। हमने पाया कि निकासी समूह में एस्ट्रोसाइट्स सबसे अधिक प्रभावित सेल प्रकार थे। अन्य अध्ययनों के संदर्भ में इन आंकड़ों के आधार पर हम अटकलें लगाते हैं कि एस्ट्रोसाइट्स ओपिओइड वापसी के दौरान सीईए में सूजन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं और यह शारीरिक और भावनात्मक लक्षणों में योगदान देता है जो नकारात्मक सुदृढीकरण के माध्यम से दवा की मांग करते हैं। हम आंत माइक्रोफ्लोरा डेटा(चित्रा 4)भी दिखाते हैं ।

Figure 1
चित्रा 1: एकल सेल आरटी-qPCR कार्यप्रवाह और प्रतिलेखन विषमता । (A)प्रायोगिक प्रोटोकॉल (प्रत्येक शर्त के लिए एन = 4)(B)दस-सेल पूल नमूना ट्रांसक्रिप्टोम माप। (ग)बार प्लॉट औसत-10ct अभिव्यक्ति मूल्यों को प्रदर्शित करता है। न्यूरॉन्स = बैंगनी; माइक्रोग्लिया = पीला; एस्ट्रोसाइट्स = हरा। त्रुटि बार मानक त्रुटि दिखाते हैं। * पी एंड एलटी; 0.05, ***पी एंड एलटी; 0.0003; तुकी का ईमानदार महत्व परीक्षण। (ख)गर्मी के नक्शे में ४० परसाद जीन भर में सभी नमूनों की अभिव्यक्ति से पता चलता है । पंक्तियां 10-सेल पूल किए गए नमूने (930 न्यूरोनल नमूने, 950 माइक्रोग्ल नमूने, 840 एस्ट्रोसाइट नमूने के रूप में चिह्नित हैं); संख्या नमूना समूहों निरूपित और कॉलम जीन हैं । यह आंकड़ा ओ सुलिवान एट अल4से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन छवियां। (क)निर्जलित हेमीकेटेड चूहे के फोरब्रेन के चार स्लाइस जो एक स्लाइड पर सीईए युक्त होते हैं। स्लाइस पिछले टुकड़ा से बिल्कुल 10 μm स्लाइड पर रखा गया था । वाम पूर्वकाल है और सही पीछे है । ब्रेग्मा से दूरी का अनुमान एक चूहा मस्तिष्क एटलस और स्थलों का उपयोग करके लगाया जा सकता है, जिसमें ऑप्टिक ट्रैक्ट और स्ट्राइया टर्मिनलिस शामिल हैं। (बी-डी) सीईए(सी)में एकल कोशिकाओं के चयन और ऊतक(डी)से उनके हटाने को दिखाने वाली छवियों का अनुक्रम। इन कोशिकाओं का चयन करने के लिए कई एलसीएम कैप का उपयोग किया गया था। एक कैप का उपयोग एक सेल प्रकार की 10 कोशिकाओं को चुनने के लिए किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: प्रतिनिधि परिणाम 1. (क)जीन को संयोजित करने वाले कोशिका का कार्टून योजनाबद्ध और उनका स्थान । यहां लेबल जीन प्रतीक पैनल बी(बी)रंगीन वर्गों के लिए एक संदर्भ है सापेक्ष जीन अभिव्यक्ति (औसत-10Ct मूल्य) पैनल ए में प्रतिनिधित्व जीन के लिए प्रतिनिधित्व करते हैं । वर्गों का स्थान संबंधित प्रोटीन के सेलुलर स्थानीयकरण या कार्य का प्रतिनिधित्व करता है। पैनल उपचार और कोशिका प्रकारों में रंग द्वारा प्रतिनिधित्व सापेक्ष जीन अभिव्यक्ति प्रदर्शित करते हैं। पीला = उच्च अभिव्यक्ति; नीला = कम अभिव्यक्ति; सफेद = तटस्थ अभिव्यक्ति। यह आंकड़ा ओ सुलिवान एट अल4से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: प्रतिनिधि परिणाम 2 . (क)जीन सहसंबंध नेटवर्क। पियर्सन सहसंबंध एक उपचार और सेल प्रकार के भीतर -100Ct मूल्यों पर किया गया था। नोड्स जीन को दर्शाता है और उनका रंग सापेक्ष अभिव्यक्ति के स्तर (प्रत्येक जीन के लिए औसत -100Ct मूल्य) का प्रतीक है। किनारों अभिव्यक्ति सहसंबंधों को निरूपित और मोटाई अभिव्यक्ति सहसंबंध () की ताकत का प्रतीक है । क्यू-वैल्यू और एलटी;0.001 के साथ सहसंबंध प्रदर्शित किए जाते हैं। काले किनारों = सकारात्मक सहसंबंध; हरे रंग के किनारों = नकारात्मक सहसंबंध। (ख)महत्वपूर्ण अंतर जीन अभिव्यक्ति का प्रदर्शन करने वाले चुनिंदा जीनों के बार प्लॉट । आंकड़ों की गणना नेस्टेड एनोवा #p & ०.१, * पी एंड एलटी; ०.०५, * * पी & ०.०१, * * पी & ०.००१, * * पी & ०.०००१ (n = 4 जानवरों के सभी उपचारों के लिए) का उपयोग करके की गई थी । यह आंकड़ा ओ सुलिवान एट अल4से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: आंत माइक्रोफ्लोरा की सापेक्ष बहुतायत। बारप्लॉट बैक्टीरियल प्रजातियों (--اिक्क मूल्यों) की सापेक्ष बहुतायत प्रदर्शित करते हैं। #p <0.1, * पी एंड एलटी;0.05, **p <0.008, ***p = 0.0009; दो तरह से ANOVA; n = प्रत्येक उपचार के लिए 4 जानवर। यह आंकड़ा ओ सुलिवान एट अल4से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

एकल सेल जीव विज्ञान सेलुलर फेनोटाइप और ऊतक समारोह की मजबूती की विषमता का प्रदर्शन किया है । इन निष्कर्षों ने मैक्रो और माइक्रो स्केल दोनों पर जैविक प्रणालियों के संगठन के बारे में अंतर्दृष्टि प्रदान की है । यहां, हम दो तरीकों, एलसीएम और माइक्रोफ्लूइडिक क्यूपीसीआर के संयोजन का वर्णन करते हैं, एकल-सेल ट्रांसक्रिप्टोम उपाय प्राप्त करने के लिए जो अपेक्षाकृत कम लागत पर शारीरिक विशिष्टता और प्रतिलेखन सटीकता प्रदान करते हैं(चित्रा 1)। हमारा समूह एक सिस्टम जीव विज्ञान दृष्टिकोण लेता है और अक्सर एक ही जानवर में कई ऊतकों को मापता है। हम इन तरीकों को यह निर्धारित करने में लचीला और फलदायी पाते हैं कि जैविक प्रणालियां प्रतिलेखन स्तर पर विभिन्न चुनौतियों का जवाब कैसे देती हैं । इसके अतिरिक्त, हम बेसलाइन स्थितियों में सेलुलर फेनोटाइप के शारीरिक मानचित्रण में इन तरीकों का उपयोग करते हैं।

हम हाल ही में एक प्रकाशन से डेटा और संशोधित आंकड़े प्रदान करते हैं जिसमें यह पता लगाया गया है कि सीईए ओपिओइड निर्भरता और वापसी4का जवाब कैसे देता है । इस उदाहरण में, हमने आंत माइक्रोफ्लोरा की सापेक्ष बहुतायत को मापने के लिए उसी माइक्रोफ्लूइडिक क्यूपीसीआर प्लेटफॉर्म का उपयोग किया। तरीकों और कार्यप्रवाह चित्र 1 में संक्षेप में कर रहे है और मूल रूप से ओ सुलिवान एट अल4में प्रकाशित किया गया । हाई-थ्रूपुट माइक्रोफ्लूइडिक आरटी-क्यूपीसीआर के प्रमुख निष्कर्षों को बाद में पश्चिमी दाग या प्रतिकार 4 जैसे प्रोटीन उपायों द्वारा मान्य किया जा सकताहै।

इस प्रणाली जीव विज्ञान दृष्टिकोण की एक बड़ी चुनौती विशिष्ट कारण जैविक तंत्र का निर्धारण है । फजी तर्क एक मान्य समाधान है जिसे हमने जीन नियामक नेटवर्क व्यवहार2में एजेंटों का अनुमान लगाने के लिए सफलता के साथ नियोजित किया है । पशु मॉडल हेरफेर भी प्रणालीगत तंत्र में अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए नियोजित किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, गैस्ट्रिक वागोटॉमी के साथ चूहे के पलटन को जोडऩे के साथ यहां प्रदान किया गया एक ही प्रोटोकॉल डेटा देगा जो वेगस तंत्रिका के माध्यम से जानकारी के प्रवाह में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

यहां प्रस्तुत काम NIH HLB U01 HL133360 के माध्यम से जेएस और आरवी, निदा R21 DA036372 जेएस और EVB को संमानित किया, और T32 एए-007463 के समर्थन में जन Hoek को संमानित किया गया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20X DNA Binding Dye Fluidigm 100-7609 NA
2x GE Assay Loading Reagent Fluidigm 85000802-R NA
48.48 Dynamic Array IFC for Gene Expression Fluidigm BMK-M-48.48 NA
96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression Fluidigm BMK-M-96.96 NA
Anti-Cd11β Antibody Genway Biotech CCEC48 Microglia Stain
Anti-NeuN Antibody, clone A60 EMD Millipore MAB377 Neuronal Stain
ArcturusXT Laser Capture Microdissection System Arcturus NA NA
Biomark HD Fluidigm NA RT-qPCR platform
Bovine Serum Antigen Sigma-Aldrich B4287
CapSure Macro LCM Caps ThermoFisher Scientific LCM0211 NA
CellDirect One-Step qRT-PCR Kit ThermoFisher Scientific 11753500 Lysis buffer solution components
DAPI ThermoFisher Scientific 62248 Nucleus Stain
DNA Suspension Buffer TEKnova T0221
Exonuclease I New Englnad BioLabs, Inc. M0293S NA
ExtracSure Sample Extraction Device ThermoFisher Scientific LCM0208 NA
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides ThermoFisher Scientific 22-037-246 Plain glass slides
GeneAmp Thin-Walled Reaction Tube ThermoFisher Scientific N8010611
GFAP Monoclonal Antibody ThermoFisher Scientific A-21294 Astrocyte Stain
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Superclonal™ Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 ThermoFisher Scientific A28175 Seconadry Antibody
IFC Controller Fluidigm NA NA
RNaseOut ThermoFisher Scientific 10777019
SsoFast EvaGreen Supermix with Low Rox Bio-Rad PN 172-5211 Rox master mix
SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit ThermoFisher Scientific 11754250 Contains VILO and SuperScript
T4 Gene 32 Protein New Englnad BioLabs, Inc. M0300S NA
TaqMan PreAmp Master Mix ThermoFisher Scientific 4391128 NA
TE Buffer TEKnova T0225 NA

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References

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  4. O'Sullivan, S. J., et al. Single-Cell Glia and Neuron Gene Expression in the Central Amygdala in Opioid Withdrawal Suggests Inflammation With Correlated Gut Dysbiosis. Frontiers in Neuroscience. 13, 665 (2019).
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  10. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates: Hard Cover Edition. , (2006).

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जेनेटिक्स इश्यू 157 सिंगल सेल जीन एक्सप्रेशन लेजर कैप्चर माइक्रोडिससेक्शन माइक्रोफ्लूइडिक क्यूपीसीआर ओपिओइड निर्भरता एनेटॉमिक स्पेसिसिटी एमिग्डाला आंत माइक्रोबायोम ग्लिया
एकल कोशिकाओं के ट्रांसक्रिप्शनल प्रोफाइल का विश्लेषण करने के लिए लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन और माइक्रोफ्लूइडिक क्यूपीसीआर का संयोजन: ओपिओइड निर्भरता के लिए एक सिस्टम जीव विज्ञान दृष्टिकोण
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O'Sullivan, S. J., Reyes, B. A. S.,… More

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