Summary
צבעי פלורסנט חיוניים הם כלים חיוניים לניתוח הדמיה של תא חי בביולוגיה מודרנית של תאים פטרייתיים. נייר זה מפרט את היישום של צבעי פלורסנט ידוע פחות ידועים עבור מעקב הדינמיקה קרום הפלזמה, אנדו-/אקסוציטוזה וקיר התא מורגנזה בפטריות filamentous.
Abstract
היישום של קרום וקיר התא צבעי פלורסנט סלקטיבית לניתוח הדמיה של תא חי של אורגונל דינמיקה בתאי פטרייתי התחיל לפני שני עשורים ומאז ממשיך לתרום במידה רבה להבנת הפטרייתי הפילאמנטבי חיים. נייר זה מספק מדריך מעשי לניצול של שני צבעי הממברנה FM 1-43 ו-FM 4-64 ואת ארבעה כתמי קיר תא Calcofluor לבן M2R, סולופניאיל Flavine 7GFE 500, Pontamine Fast סקרלט 48 וקונגו האדום. המוקד הוא על היישום במינון נמוך שלהם כדי לוודא כתמים ללא פריט, הדמיה שיתוף המאפיינים שלהם, ואת ההערכה הכמותית שלהם. השיטות המוצגות חלות על כל הדגימות הפטרייתי הפילנטיות שניתן להכין בדרכים המתוארות. הגישות הבסיסיות לצביעת יכולות לשמש כנקודות התחלה למינים העשויים לדרוש תנאי טיפוח שונים. ראשית, התכונות הביופיסיים והביוכימי נבדקות כאשר הבנתם חיונית לשימוש בצבעים אלה ככתמי פלורסנט חיוניים באמת. שנית, הפרוטוקולים צעד-אחר-צעד מוצגים כי פירוט הכנת סוגים שונים של דגימות פטרייתי עבור הדמיה לחיות הפלורסנט. לבסוף, ניסויים לדוגמה להמחיש גישות שונות: (1) לזהות פגמים בארגון הזמני בזמן של אנדוקציטוזה במוטציות גנטיות, (2) בצורה יחסית לאפיין משותף וברור שיתוף לוקליזציה של GFP-שכותרתו חלבונים היעד במסלול endocytic, (3) זיהוי מורורפולתאי הקיר מומים במוטציה גנטית, ו (4) לפקח על הקיר תא biogenesis בזמן אמת.
Introduction
לפני עשרים שנה, את האופן שבו hyphal מורפולגנזה ואת הביולוגיה התא המולקולרי הבסיסי יכול להיות דמיינו בפטריות filamentous היה מהפכה על ידי יישום של הקרום הפלורסנט הסלקטיבית פיי מאו צבע FM 4-641. מאוחר יותר, היתרון של הטיה-כריכת הצבע Calcofluor לבן כסמן פלורסנט חיוני של הדינמיקה הדופן של התא פטרייתי התממשו2. מאז, הצבעים והמשתנים שלהם הפכו לחלק בלתי נפרד מניתוחי הדמיה של אורגל דינמיקה בפטריות, וממשיכים לספק תובנות חסרות תקדים לאורח החיים הפטרייתי הפילנטאלי. נייר זה מפרט את היישום של צבעי פלורסנט הוקמה ופחות ידוע עבור מעקב הדינמיקה קרום הפלזמה, אנדו-ואקסוציטוזה וקיר התא מורפולגנזה בפטריות filamentous. מעקב אנדוקציטוזה מאפשר שאלות ביולוגיות שונות הקשורות לחקר המחקר הכללי של האנדוציטוזה המתייחס ל-3. בשביל זה, לוקליזציה, מהירות וירושה של תאים ויטראז על התוספת לצבוע FM נרשם על ידי מיקרוסקופ הזמן לשגות וכימות לעומת הזנים פטריות נבדק4. צבע קיר תאים להתוות את הגבול החיצוני של התא ולאפשר מעקב אחר אירועים מורפולגנטיים, כולל התגבשות מקוטב קצה הצמיחה2, מסעףhyphal היתוך מיקוף6,7 והיווצרות מחיצת8. יתר על כן, הם להקל על כימות התצהיר של קיר התא מקומי זיהוי פגמים במהלך הקיר תאים biogenesis9. מכיוון שידע מפורט בתכונות הביוכימי והביופיזיקלי של כל סמן פלורסנט הוא תנאי מוקדם בסיסי עבור מוצלח ביישום vivo, מאפיינים אלה מסוכמים לראשונה עבור ששת הצבעים המוצגים במאמר זה.
צבעי ממברנה סלקטיבית
FM (פיי מאו) צבעי לבנה הם מולקולות אמפיניתיים קטנות שאינן יכולות לעבור דרך הקשר אך הפיך עם העלון החיצוני של הביריות השומנים של הממברנות הביולוגית10. הם כמעט לא פלורסנט בתמיסה מימית, אבל להיות פלורסנט באינטנסיביות על שילוב קרום הפלזמה, יצירת אות לרעש מעולה (S/N)-יחס11. מאפיינים אלה הופכים אותם למותאמים באופן אידיאלי לצורך המחשה של קרום הפלזמה והדינמיקה התאיים, כולל מעקב אחר האנדו והאקסוציטוזה12. ירוק-פלורסנט FM 1-43 והאדום-פלורסנט FM 4-64 הם שני סמנים הנפוץ ביותר בשימוש בקרום פלורסנט למטרות אלה. SynaptoGreen C4 ו SynaptoRed C2 הם מולקולות גנריות מספקים חלופיים שניתן להלסירוגין בשימוש במקום FM 1-43 ו-FM 4-64, בהתאמה.
צבע הצבעים מהווה שלושה אזורים מבניים מרכזיים: (1) הזנב ליפופילית המקל על החדרת הצבע לתוך שומנים בלהה, (2) הליבה fluorophore הקובע את התכונות ספקטרליות של הצבע, והוא היווה על ידי שתי טבעות ארומטי מחובר על ידי אחד לשלושה איגרות חוב כפולות, ו (3) ראש הידרופילי טעונה חיובי המונע הכנסה מלאה וחדירות של הצבע דרך הקרום (איור 1A).
ככל הזנב ליפופילית, גבוה יותר הוא hydrophobicity של הצבע ובכך מחייב זיקה הקרום, אבל התחתון הוא מסיסות המים שלה ואת הקרום דה צביעת שיעור. כתוצאה מכך, משתני צבע FM שונים מייצרים הדינאמיקה ודפוסי הצביעת השונים. ההידרופוטביטי הגבוה ביותר של ה-C4-זנבית 1-43 מספק אות זריחה חזקה ויציבה יותר בקרומים פלזמה ומהירות ארגונית פנימית מהירה יותר מאשר ה-FM הקצר יותר C2 4-64, כאשר מיושם בריכוזים שווים (איור 2).
חשוב מכך, שיעורי ההתאגדות/הדיסוציאציה הקבועה והגבוהה של שני צבעי FM11 עם זמני ההחזקה הממוצעים של 1 – 6 לכל מולקולה לצבוע בודדים13 להפחית את הסיכויים לשיבוש הפרעה של תפקוד הממברנה, למשל, באמצעות שינוי של נזילות ממברנה או אינטראקציה קבועה בכפייה של חלבונים ממברנה. זו כנראה הסיבה העיקרית מדוע מולקולות אלה ניתן להשתמש כצבעים חיוניים. אף על פי כן, ריכוזי צבע FM מעל 50 μm רעילים לתאים פטרייתיים וצמחים2,14, וראיות של BY-2 פרוטואופרזה טבק מצביע על כך יותר 20 μm צבע FM להוביל לרוויה הממברנה פלזמה14. לכן, רצוי שלא לחרוג ממגבלה זו, במיוחד בהתחשב בעובדה כי הדמיה מעולה הושג עם מעט כמו 2 – 5 μm15,16.
בעיקר, תכונות ספקטרליות של הצבעים FM להשתנות מאוד בהתאם מיקרוסביבה קרום מסוים (נבדקו14). בדרך כלל, העירור וספקטרום הפליטה של צבעי FM בפתרונות ממיסים טהורים (כפי שניתן בדרך כלל במידע המוצר) שונים באופן משמעותי מזה בסביבות הסלולר ויכולים, ברוב המקרים, לא ישירות להתייעץ לבחירת הגדרות הדמיה של תא חי. עירור/פליטה מקסימה של FM 1-43 ו-FM 4-64, למשל, להיות כחול מוזז על ידי 37/46 nm ו 43/64 ננומטר, בהתאמה, כאשר מאוגד ממברנות פטריות בהשוואה לפתרונות שלהם ב מתנול (שולחן 1).
יסודות שבירת הקרקע לשימוש fm 4-64 ו-fm 1-43 עבור מעקב ממברנה פלזמה, אנדו-/exסוציציטוזה ו אורגונל דינמיקה, כולל הספיזנקירפר והמיטומטר, כבר תועד באופן מקיף עבור מגוון רחב של מינים פטרייתי filamentous בעבר2,4,17,18,19. הגדרות הדמיה מומלצות לצבעי FM הפועלים במינים מסוגים שונים של פטרייתי, מתוארים באיור 1B. מגבלות טכניות של הציוד הזמין או תנאים סלולריים וניסיוניים מסוימים, כגון בינוני התרבות, pH או טמפרטורה, עם זאת, עשוי לדרוש כמה עיבודים. למרבה המזל, צבעי FM לפעול מעל טווח ספקטרלי רחב, ותוצאות הדמיה טובה מאוד מושגת על ידי FM מרגש 1-43 עם 514 nm או FM 4-64 עם 488 nm. כתוצאה מכך, יש לקבוע את הגדרות ההדמיה האופטימליות בנפרד עבור כל סוג לדוגמה ויישום מיועד.
המשמרת של סטוק משמעותית של יותר מ 135 ננומטר של FM 4-64 מאפשר מעולה, במקביל שיתוף הדמיה עם fluorophores פולט אור ירוק; זה מנוצל לעתים קרובות כדי להעריך את הדינמיקה לוקליזציה תאיים של חלבון פלורסנט ירוק (gfp)-התווית היתוך חלבונים ביחס קרום פלזמה השביל endocytic9,20.
קירות תא-צבע סלקטיבי
Calcofluor לבן M2R (CFW), גם משווק כמו פלורסנט בריאר 28, הוא כנראה צבע הפלורסנט הידוע ביותר המשמש כדי להכתים את קירות התא של חיידקים, פטריות, אצות, צמחים גבוהים חרקים. בתחילה משמש כסוכן הלבנה אופטית בתעשיית נייר, טקסטיל וחומרי ניקוי, היתרונות שלה עבור אבחון קליני של זיהומים פטרייתיים התממשו מוקדם על21,22. בגלל CFW intercalates הפיכה לתוך שרשרת כיטין המתהווה זה מפריע כאשר הרכבה רגילה של מיקרופיבריל במהלך biogenesis קיר התא ובכך לייצר לחץ קיר תא23. זה בתורו מעורר נזק קיר תא מנגנון תיקון המוביל לתוך מקומי מוגבר הקיר בתצהיר הגדר כתוצאה של גלוקן ו הפעלת הפעלה סטנדרטים24,25. תופעה זו יכולה להתרחש עם כל צבע שפועל על ידי מחייב באופן בלתי נשכח לפולימר קיר התא, הוא תלוי ריכוז והוא בולט ביותר בטיפים hyphal המייצגים את החלקים הפורה ביותר ובכך רגיש ביותר של תפטיר (איור 3). סיכום מקיף של המכונות המולקולריות המגיב לנזק לקיר התאים המסופק לאחרונה26.
צבע מנת יתר בשילוב עם רעילות יכול להוביל לפירוק התא מהיר של תאי hyphal (סרט 1). עם זאת, רגישות מוגברת כדי לצבוע ריכוזי כי הם "חיוניים" בסוג פראי ניתן לנצל כדי לזהות פגמים בביוסינתזה קיר התא של מוטציות הפסד של הגן9. עבור CFW ו קונגו האדום (CR), עוד צבע טקסטיל הידוע גם אדום ישיר 28 ו מועסקים כמו α-ו-β-כיטין-ספציפית קיר תא כתם עבור פטריות וחרקים27,28, ריכוזי הסף כי מאוד לגרום כיטין סטנדרטים היו נחושים עם > 60 μm CFW ו > 70 μm CR, בהתאמה, בעוד ריכוזים <15 μm של כל צבע לא לשנות או לעכב את הצמיחה פטרייתי29,30,31. היקי ואח ' הניח את הריכוז הזה הסף עבור CFW ב 25 μM2. לכן, מומלץ להשתמש ריכוזי צבען ≤ 5 μm להוציא את הלחץ הקשורות חפצים ולהבטיח באמצעות מולקולות אלה כמו באמת "צבעי פלורסנט חיוניים"2,32. זה חל באופן שווה על סולופניאיל Flavine 7GFE 500 (SPF) ו Pontamine Fast סקרלט 4B (PFS), נרדף ישירה צהוב 86 ישיר אדום 23, בהתאמה, שני צבעים אחרים שימושי קיר תאים אשר בקשת עבור פטריות דווחו בפעם הראשונה יותר מאשר לפני עשור33. אבל למרות תכונות ספקטרליות מדהים שלהם34,35, השימוש בשני הצבעים יש מאז מאוד מוגבלת36,37. כפי שהוצג בעבר עבור 1.5 μM CFW2, 2 ΜM SPF מספיקים כדי לפתור את הדינמיקה של קיר התא תחת תנאים מקומיים עם רזולוציה גבוהה מאוד הזמני (סרט 2). את אותן תוצאות ניתן להשיג עם 2 μM CR או PFS.
יחד, אלה ארבעת הצבעים, CFW, SPF, PFS ו-CR, מהווים ערכה של הקיר-סמנים מבוססי-פלורסנט סלקטיבי המכסה כמעט את ספקטרום אור הפליטה המלא לעין (400-700 ננומטר) מנוצל על מיקרוסקופ פלורסנט מודרני (איור 4). העלייה המשמעותית בעוצמת הקרינה הפלואורסצנטית על-ידי הקשירה לפולימרים של וול-cell היא הטבועה בכל הארבעה ומפיקה יחסי S/N מצוינים. זה בתורו היתרי לשמור על ריכוזי הצבע ואת עוצמת האור העירור נמוך מאוד מאפשר לבצע מכתים קיר תא כמו "מינון נמוך" לחיות הדמיה תא טכניקה2. מכיוון שצבעי הקיר האלה הם ממברנות פלזמה הניתנים לפעולה, הם מתפקדים בו ככתמים חיים/מתים. בעיקר, בשל ספקטרום מאוד רחב שלהם אור הפליטה, כמה מגבלות לגבי התכונות שיתוף הדמיה של CFW ו SPF עם fluorophores אחרים צריך להיחשב בזהירות.
Protocol
1. הכנת דגימות פטרייתי
- מקדם תרבויות פטרייתי
- איחסן את המתח הרצוי על בינונית מוצק אגר מתאים, כגון תפוחי אדמה דקסטרוז אגר (PDA) עבור Trichoderma האטרויום או בינוני מינימלי של ווגל (vmm) עבור neurospora crassa. הוסף סמן בחירה מתאים בעת עבודה עם זנים טרנספורקנטים.
- מודמת את התרבות הקדם בטמפרטורה אופטימלית של האורגניזם. למשל, T. מתנוון ב -25 ° c ו -N. crassa ב -30 ° c, ו 12 h/12 h מחזורי אור/כהות עד התפתחה מיקליום המטיר אך עדיין לא הגיעה לקצה הלוחית. על גודל סטנדרטי צלחת פטרי (9.2 ס מ Ø), זה לוקח פראי-סוג T. מתנוון על 4-6 ימים בממוצע, בעוד N. crassa סוג פראי מגיע לשלב זה אחרי 3 – 4 ימים בממוצע.
- טיפוח מושבות פטרייתיים
- באמצעות אזמל סטרילי, לגזור קטן 3 מ"מ x 3 מ"מ בלוק אגר הנושאת אי-הספורייצ'יום מקצה המושבה של טרום התרבות.
- מניחים את בלוק אגר במרכז של צלחת בינונית מוצק טרי כדי לחסן את התרבות הניסיונית.
- מודאת התרבות הניסיונית על פי השלב ההתפתחותי שנועד להיחקר. למשל, הסוג הפראי T. המתנוון דורש 20 – 22 שעות ב -25 ° c בחשכה לפתח מושבות של כ 2 ס"מ בקוטר על מחשב כף יד, ואילו מסוג פראי N. crassa מגיע קטרים המושבה של כ 4 ס"מ אחרי 14-16 h הדגירה ב 30 ° c בחושך על vmm.
הערה: הדגירה בחשכה מונעת היווצרות של פיגמנטים שעשויים להחדיר לקרינה פלואורסצנטית אוטומטי. על מנת לסלק את הזריחה הבינונית ברקע מן התרבות הניסיונית, להחליף את אגר עם 1.5% w/v של סוכן מיצוק שקוף (לראות את הטבלה של חומרים), וכל מדיום מורכב עם מדיום מוגדר מינימלי.
- טיפוח תרבויות מוצקות
- השתמש 5 מ ל של פתרון מלחים פיזיולוגיים סטרילי (0.9% w/v) כדי לקצור נבגים con, הקציר מן הצלחת טרום תרבות ולאסוף את הבולם נבג שנוצר בצינור 15 מ ל בורג.
- מערבבים את ההשעיה נבג היטב על ידי vortexing נמרץ ולאחר מכן לסנן אותו על 1 ס מ x 5 ס מ הרצועה של בד סינון סטרילי (לראות את הטבלה של חומרים) ממולאים בקלות לתוך הטיפ 1 מ ל צינור (שניהם התאספו מראש) לתוך צינורית סטרילי טרי.
- לקבוע את צפיפות הנבג עם תא ספירת תאים ולהכין 1 x 107 תאים/mL השעיה נבג עם פתרון המלח הפיזיולוגי.
הערה: ניתן לשמור על השעיית הנבג ב-4 ° צ' עד שבועיים. - הכן צלחת פטרי בגודל סטנדרטי (9.2 ס מ Ø) עם 20 מ ל של בינוני אחיד ולהוסיף 15 – 20 חרוזי זכוכית סטרילית (3 מ"מ Ø) על גבי.
- פיפטה 200 μL של ההשעיה נבג על הלוח הבינוני באופן שווה להפיץ את התאים על פני הצלחת כולה על ידי טלטול עדין. לאסוף את חרוזי זכוכית לתוך גביע עם 70% אתנול לשימוש חוזר.
- מודאת התרבות הניסיונית על פי השלב ההתפתחותי שנועד להיחקר. לדוגמה, הסוג הפראי של ה -T מחייב 5 – 6 h ב -25 ° c בחשכה כדי לפתח מגרדים שחורים במחשב כף-יד, ואילו הסוג הפראי של N. crassa מפתח מגרדים לאחר 3 – 4 מהדגירה ב -30 ° c בחשכה ב-vmm.
הערה: כדי לסלק את הקרינה הפלואורסצנטית בינונית מהתרבות הניסיונית, החלף את אגר עם 1.5% w/v של סוכן מיצוק שקוף, וכל מדיום מורכב עם מדיום מינימלי מוגדר.
- טיפוח של תרביות גרלינג נוזלי
- מילוי 190 μL של בינוני תרבותי נוזלי לתוך כל טוב של 8-היטב שקופית מיקרו-שקופיות.
- הוסף 10 μL של 1 x 107 תאים/לפתרון נבג mL (מוכן בשלבים 1.4.1 – 1.4.3) ולערבב על ידי ליטוף בעדינות למעלה ולמטה כמה פעמים. מספר התאים הכולל שהתקבל הוא 1 x 105 לכל היותר.
- מודאת התרבות הניסיונית על פי השלב ההתפתחותי שנועד להיחקר. למשל, הסוג הפראי T. האטרויום דורש 5 – 6 h ב -25 ° c בחושך כדי לפתח מגרדים הקונדידים בדקסטרוז מרק תפוחי אדמה (PDB), ואילו סוג פראי N. crassa מפתחת הקונדינגס לאחר 3 – 4 h של דגירה ב 30 ° c בחושך ב vmm נוזלי.
2. הכנת פתרונות לעיבוד צבע
- כדי להבטיח מסיסות מלאה של כל צבע, להכין 2 מ"מ פתרונות מדמין diמתיל סולפוקסיד (DMSO) על ידי הוספת הסכום המתאים (ראה משקולות המדויק בטבלה 1) ל 1 מ ל של 100% dmso ומערבבים היטב על ידי vortexing.
התראה: הקפד לקחת את DMSO מן בקבוק אטום מחיצת ממחיצה; זה צריך להיות נוזל שקוף ברור. עם מגע עם האוויר, DMSO הופך חום-כנראה בשל החמצון של מעקב זיהומים-ועלול להשפיע לרעה על צמיחת תאים או צביעת צבע. - מסנן לעקר את הפתרון מניות באמצעות מסנן 0.2 יקרומטר מזרק ממברנה לתוך צינור חדש סטרילי 1.5 mL התגובה. כדי למזער את צבע הלבנת, לעטוף את הצינור רדיד אלומיניום.
הערה: פתרון מלאי הצבע ניתן לצוטט לנפחים קטנים יותר כדי למנוע החלקה/הקפאה של מחזורי, ושמרו על 4 ° c במשך מספר חודשים. - להכין 20 μM מימית צבע הפתרון לעבוד על ידי המסת 2 μL של פתרון מלאי צבע ב 198 μL של מים מזוקקים סטרילי בצינור חדש סטרילי 1.5 mL התגובה. כדי למזער את צבע הלבנת, לעטוף את הצינור רדיד אלומיניום.
הערה: יש להכין את פתרון עבודת הצבע הטרייה ביום הניסוי. - במהלך הרכבה לדוגמה (ראה סעיף 3), פתרון העבודה לצבוע יהיה מדולל בלהיטות 1:10, וכתוצאה מכך ריכוז הצבע הסופי של 2 μM ו 0.1% w/v הסופי ריכוז DMSO.
הערה: בחירת גורמי דילול שונים על-ידי שינוי היחס בין פתרון העבודה לצבען לבין הנוזל הגובר, מאפשר להתאים בקלות את ריכוז הצבע הסופי הרצוי.
התראה: כדי למנוע השפעות לא רצויות עקב הרעילות או הרעלת DMSO, מקדם הדילול לא צריך ליפול תחת 1:4 כדי לגרום לריכוזים הסופיים המרבי של 5 לצבוע μM ו 0.4% w/v DMSO. ריכוזי לצבוע גבוה במהירות לרוויה המערכת ולמנוע כימות האות אמין, בעוד יותר מ 0.5% w/v (≥ 62.5 mM) DMSO יכול לפגוע בפיתוח תאים38.
3. הכנה לדוגמא למיקרוסקופיה
- דגימות הר ממושבות פטרייתי (שלב 1.2) או בתרבויות germling מוצק (שלב 1.3) על ידי שיטת הבלוק הפוכה אגר.
- שמור על נקי 24 מ"מ x 60 מ"מ מכסה זכוכית (#1 = 0.13 – 0.16 mm עובי) מוכן ולהוסיף 18 μL של בינונית נוזלית מינימלית (VMM או M9) או תמיסת מלח פיזיולוגית על המרכז.
- הוסף 2 μL של הפתרון 20 μM צבע העבודה ל 18 μL של נוזל ומערבבים היטב על ידי ליטוף למעלה ולמטה מספר פעמים, תוך הימנעות הייצור של בועות אוויר.
הערה: כאשר עובדים עם מספר דוגמאות, רצוי להכין שילוב מאסטר של פתרון הצבע הנוזלי עבור כולם על מנת להבטיח ריכוז שווה של צבע במהלך הניסוי. - עם אזמל נקי, לגזור מדגם 15 מ"מ x 15 מ"מ מן הפריפריה של המושבה או התרבות germling מוצק ומניחים אותו באופן אנכי לצד ירידה בינונית על מכסה המכסה.
- באמצעות האזמל לתמוך בקצה העליון של הבלוק ואצבע כדי להחזיק את הצד האחורי של הבלוק במקום, לאט להנמיך את הצד נושאת תפטיר או הגרמנגס על הנוזל. הדגימה כעת מוכנה להעברה. אל במת המיקרוסקופ
התראה: חיוני לעשות זאת לאט ובזהירות רבה כדי למזער את הלחץ המכני על התאים וכדי למנוע בועות אוויר לכוד בין דגימה לכיסוי.
- לעלות את התרביות germling נוזלי משלב 1.4.
הערה: באופן הנוח ביותר, תרבויות germling נוזלי ב-מיקרו-טוב שקופיות שניתן להעביר ישירות ועוד מניפולציות על הבמה במיקרוסקופ.- הוסף 22 μL של פתרון עבודה בצבע כדי 200 μL של בינוני נוזלי כדי לגרום לריכוזים סופיים סטנדרטיים של 2 לצבוע μM ו 0.1% w/v DMSO.
הערה: לתרביות הנוזל הנוזלי יש את היתרון הגדול שצבעי פלורסנט (או כימיקלים אחרים, כגון מעכבי) ניתן להוסיף בכל נקודת זמן רצויה של הניסוי, גם במהלך ההקלטה. במקרה זה, טיפול מיוחד צריך להילקח כדי לנהל את טיפות נוזלי לאט מאוד כדי לא להפריע את התאים. מערכת תנודות ותנועה בראונית עשויים כבר להציג כמה תנועות תא.
- הוסף 22 μL של פתרון עבודה בצבע כדי 200 μL של בינוני נוזלי כדי לגרום לריכוזים סופיים סטנדרטיים של 2 לצבוע μM ו 0.1% w/v DMSO.
4. מיקרוסקופ תאים חי
- כוונן את הגדרות רכישת התמונות הבסיסיות. הגדרות רכישת התמונה הבאות מאפשרות ללכוד דינמיקת הצביעת בלקורבן בודדים וחלים על שני הצדדים הבאים:
- החל 5 – 10% כוח לייזר של 20% מעוצמת הפלט המלאה של המכשיר.
- השתמש בתוכנית של Apo 60x – 63 x גליצרול או מטרה טבילה מים עם צמצם מספרי גבוה ≥ 1.2.
- הגבל את אזור רכישת התמונה למתאר של הלקורבן על-ידי הגדרת גודל תמונה של 1024 x 256 פיקסלים ובאמצעות פקטור זום אופטי של 2 – 3.
- השתמש בסריקה דו-כיוונית עם 400 Hz. כוונן את גודל הנקב ליחידה אוורירית אחת.
- הגדר את הרווח של הגלאי הרגיש ביותר עד 100%.
- עבור הקפות זמן הקלטה, להתחיל רכישת תמונה עם מסגרת אחת כל 15 s כדי לאפשר רזולוציית הזמן סבירים מבלי לייצר הלבנת צבע או לחץ צילום.
- עבור הקלטה תלת-ממדית, הגדר את הגבול המרחבי העליון והתחתון לגבול של הרכיבים האופטיים והרווחים באזור 1 יקרומטר מלבד כדי לאפשר רזולוציה מרחבית סבירה.
הערה: בשל הצמיחה המהירה של הhyphae רזולוציה גבוהה מרחבית בציר Z הוקרב לעתים קרובות לרזולוציה גבוהה בציר X/Y או להיפך. רק מיקרוסקופים מאוד מודרנית סריקת לייזר סריקה מספיק מהר כדי לספק את שתי הדרישות.
- ספיגת האנדוציטוזה אומרת
- עיין באיור 1 ובטבלה 1 כדי לזהות את הגדרות העירור/הפליטה הטובות ביותר עבור fm 1-43 ו/או FM 4-64 הזמינות במערכת המיקרוסקופיה והתאם בהתאם.
הערה: עם ריכוז 2 μM המומלץ, התאגדות של צבע FM לתוך קרום הפלזמה הוא מיידית בתאים בריאים נורמליים. התהליך כולו מתוך הקרום פלזמה הראשונית כתמים כדי לצבוע את המראה בתוך ובחללים צינורי הוא הושלם בדרך כלל בטווח של 30 עד 45 דקות בטמפרטורת החדר. הגדלת הריכוז לצבוע FM מגדיל את S/N-יחס ובכך מייצרת תמונות חדות גבוהה יותר מהר. עם זאת, זה גם מאיץ את תהליך תיוג להקשות יותר להבדיל את הרצף הכרונולוגי של כתמים ארגונית. - התחל הקלטת תמונה באמצעות ההגדרות המומלצות לרכישת תמונות בסיסיות והערך את התוצאות.
- מטב את הגדרות רכישת התמונה לרזולוציה המרחבית והטמפורלית הנדרשת כדי ללכוד את ההיבט של ממברנה פלזמה או דינמיקה אנדוציטוזה הניסוי מתמקד.
- למשל, כדי ללכוד הדינמיקה מהירה מאוד ב-X/Y, להקטין את גודל התמונה הכוללת, התמונה רק מטוס מוקד אחד ולהגדיל את קצב הסריקה ל 1 fps. לקבלת רזולוציה גבוהה יותר בציר Z, הפחת את הרזולוציה ב-X/Y, הקטן את גודל התמונה והקטן את המרחק בין המקטעים האופטיים ל-0.5 μm.
- עיין באיור 1 ובטבלה 1 כדי לזהות את הגדרות העירור/הפליטה הטובות ביותר עבור fm 1-43 ו/או FM 4-64 הזמינות במערכת המיקרוסקופיה והתאם בהתאם.
- דינמיקה של קיר התא
- עיין באיור 4 ובטבלה 1 כדי לזהות את הגדרות העירור/פליטה הטובות ביותר עבור צבע התא המוחל הזמין במערכת המיקרוסקופיה והתאם בהתאם.
הערה: בשל ספקטרום הפליטה הרחב שלהם, CFW ו-SPF אינם מתאימים היטב שיתוף הדמיה בו עם fluorophores אחרים, בעיקר GFP. הגבלות מסוימות מוחלות אף הן על גישות של הדמיה רציפה עם צבעים אלה, ולכן יש למטב אותן בנפרד. - התחל הקלטת תמונה באמצעות ההגדרות המומלצות לרכישת תמונות בסיסיות והערך את התוצאות.
הערה: עם הריכוז המומלץ של 2 μM, שילוב הצבע לקיר התא אינו בהכרח מיידי אך מהיר באופן סביר. התהליך כולו של היווצרות המחיצה, למשל, לוקח בממוצע כ-5 – 7 דקות בטמפרטורת החדר20. הגדלת ריכוז צבע קיר התא מגדיל את S/N-יחס ובכך מייצרת תמונות חדות גבוהה יותר מהר. עם זאת, הוא גם מציג במהירות פריטים עקב תיקון המושרה קיר תא נזק. - מטב את הגדרות רכישת התמונה לרזולוציה המרחבית והטמפורלית הנדרשת כדי ללכוד את ההיבט של קיר התא מורפולגנזה הניסוי מתמקד, כפי שמתואר בסעיף 4.2.3.
- עיין באיור 4 ובטבלה 1 כדי לזהות את הגדרות העירור/פליטה הטובות ביותר עבור צבע התא המוחל הזמין במערכת המיקרוסקופיה והתאם בהתאם.
Representative Results
ניתוח תמונה כמותי
בנוסף ל-"רק" מדמיין תהליכים סלולאריים, הדמיה של תא חי מאפשרת לחלץ מידע כמותי מהנתונים הנרשמים. בדרך כלל, ניתוח תמונה כמותית הוא נושא מורכב אשר הדיון הנכון הוא הרבה מעבר לטווח של מאמר זה, ולכן, הקורא הוא התייחס לספרי לימוד ייעודי ומאמרים39,40,41. עם זאת, חלק מההנחיות הבסיסיות המשויכות לנתונים הבאים לדוגמה מסופקות. יש להכיר מספר דרישות מוקדמות קריטיות כדי לאפשר את כימות התמונה, כולל: (1) מולולי מוגדרים של צבעי פלורסנט יש להחיל על כל הדגימות כדי לאפשר השוואה יחסית מדויקת; (2) יש לכוונן את הגדרות רכישת התמונה באופן שבו גלאי האור לעולם אינו רווי, אחרת העוצמות המרביות נחתכו; (3) הגדרות רכישת תמונות חייבות להישאר קבועות במהלך מערכת ניסיונית קוהרנטית, אחרת מוצגים שינויים בעוצמה מלאכותית; (4) נתוני תמונה חייבים להישמר בתבנית קובץ ללא אובדן מידע יחד עם המטא-מידע המכיל את כל הגדרות המכשירים; ו (5) ניתוח תמונה צריך להיות מוגבל למספר מינימלי של שלבי עיבוד שלאחר הנדרש כדי לחלץ את המידע הכמותי הרצוי.
בדרך כלל, תקנים מוגדרים שיאפשרו כימות מוחלטת של אותות מוקלטים אינם זמינים בתא המגורים. כך, בצורתו הפשוטה ביותר, ניתוח דימוי כמותי מסתמך על ההשוואה היחסית של עוצמות הפיקסלים באותה תמונה או בין תמונות שונות המוקלטות עם הגדרות זהות. התוכנה לבקרת מיקרוסקופ של היצרן כולל בדרך כלל כלים בסיסיים לעיבוד תמונה וניתוח כמותי, או ניתן לשדרג עם פונקציות נוספות עבור פילוח תמונה, סף, יחס הדמיה, וכו '. מספר פלטפורמות עיבוד תמונות קוד פתוח, המתאימות באופן שונה לסוגים שונים של נתוני דימות, זמינים, כולל ImageJ (https://imagej.net; https://imagej.nih.gov/ij/), קרח (http://icy.bioimageanalysis.org/), מידע ביולוגי CMEIAS (http://cme.msu.edu/cmeias/) ו-Wimasis (https://www.wimasis.com/en/).
הנתונים המוצגים לדוגמה עובדו ונותחו באמצעות פלטפורמת ImageJ. בקצרה, אזורים מסוימים בתא, כגון קודקוד קצה הhyphal septa, מסומנים בכלי בחירת אזור בגודל ניכר, ועוצמת כל הפיקסלים המוכלים היא בדיקה עם התוכנה המיושמת "כלי מדידה". נתוני העוצמה מבקרות ומדגימות נסיוניות מועברים לקובץ גיליון אלקטרוני, מנותח באופן מתמטי ומוכן כגרף. פרטים נוספים ניתן למצוא בפרסומים המקוריים המצוטטים.
נתונים לדוגמה 1: FM 4-64 קליטת ספיגת הספר
דגימות פטרייתי טיפח כמושבות (שלב 1.2) ו רכוב על ידי שיטת בלוק הפוכה אגר (שלב 3.1). הריכוז הסופי של FM 4-64 הייתה 1.67 μm. הגדרות הדמיה: מימן המחשב החיצוני PL-63 x/1.3 NA מטרת טבילה על מיקרוסקופ לייזר קונפוקלית וקד הפוך (לראות את הטבלה של חומרים); FM 4-64 עירור ב 488 ננומטר ופליטה ב 600 – 700 ננומטר; מסגרת אחת כל דקה עד 150 דקות. FM 4-64 הספיגה מזוהה פגמים מזוהים בארגון הזמני בתוך הזמן של endocyציטוזה במחיקה גנטית וגנים לבטא מוטנטים של Sur7 משפחה פטרייתי ספציפי-2 (Sfp2) של T. האטרויום9 (איור 5).
נתונים לדוגמה 2: FM 4-64 כתמים משותף של היתוך פלורסנט חלבונים המיועדים לתאי endocytic
דגימות פטרייתי טיפח כמושבות (שלב 1.2) ו רכוב על ידי שיטת בלוק הפוכה אגר (שלב 3.1). הריכוז הסופי של FM 4-64 היה 2 μm. הגדרות דימות: cfi תוכנית Apo VC 60x/1.2 NA XC המים מטרת טבילה על מיקרוסקופ לייזר קונפוקלית הפוכה (לראות את הטבלה של חומרים); הריגוש GFP ב 488 nm ופליטה ב 500-530 ננומטר, FM 4-64 עירור ב 488 nm ו פליטה ב 600-700 ננומטר, ובהיר שדה עם גלאי אור המשודר, כל בו זמנית; מסגרת אחת כל 15 s עד 15 דקות FM4-64 שיתוף כתמים היה מועסק לקשר את התפלגות subcellular של שני חלבון פלורסנט ירוק משופר (EGFP)-מתויג טרנסקרום חלבונים Sfp2 ו Gpr1 למסלול endocytic ב T. האטרויום (איור 6, סרט 3, סרט 4).
נתונים לדוגמה 3: FM 4-64 שיתוף כתמים לזיהוי הבדלים מורפולגנטיים
דגימות פטרייתי טיפח כמושבות (שלב 1.2) ו רכוב על ידי שיטת בלוק הפוכה אגר (שלב 3.1). הריכוז הסופי של FM 4-64 היה 2 μm. הגדרות הדמיה: תוכנית apochromat 63 x/1.4 NA שמן טבילה מטרה על מיקרוסקופ לייזר קונפוקלית הפוך (לראות את הטבלה של חומרים); הריגוש GFP ב 488 ננומטר ופליטה ב 505 – 550 ננומטר, FM 4-62 עירור ב 488 nm ו פליטה ב 574 – 691 nm, ובהיר שדה עם גלאי אור המשודר, כל בו זמנית; מסגרת אחת כל 8.5 s עבור עד 15 דקות. FM4-64 שיתוף מותר לקשור את הדינמיקה subcellular לוקליזציה של התווית של התאמה בלתי מותנית ניצן-6 הקיטוב כמה חלבון מורכב אנדוכמה תהליכים תלויי הסחר, כגון היווצרות septa וצמיחה מקוטב קצה הגדילה, והתאפיין הבדלים בארגון subcellular ואדריכלות hyphal בין סוג פראי וזנים מוטציה של N. crassa (איור 7, סרט 5).
נתונים לדוגמה 4: קיר תא מכתים חושף הבדלים מורפולגנטיים
דגימות פטרייתי טיפח כמושבות (שלב 1.2) ו רכוב על ידי שיטת בלוק הפוכה אגר (שלב 3.1). ריכוזי הסופי של 2 μM CFW, 20 μM SPF ו-100 μM CR שימשו. הגדרות הדמיה: cfi תוכנית Apo VC 60x/1.2 NA XC המים מטרה על מיקרוסקופ לייזר קונפוקלית יקוד הפוך (לראות את הטבלה של חומרים); CFW ועירור SPF ב 405 ננומטר ופליטה ב 430 – 470 nm, עירור CR ב 543 nm ו פליטה ב 580 – 620 ננומטר. התכונות אינטראקציה שונות של CFW, SPF ו-CR עם פולימר קיר תאים להדגיש הבדלים מורפולגנטיות בין Δsfp2 המוטציות ואת המתח סוג פראי של T. האטרויום9. הגדלת הלחץ של קיר התא שנגרם על ידי ריכוזי הצבע הגבוהות מתרחשת מהר יותר מבוטא יותר מוטציה בהשוואה לסוג פראי. בנוסף, התמונות אותן מאפשרות לכמת הבדלים מורפולגנטיות בנוגע לקוטר הhyphal-מחיצה בין שני הזנים (איור 8).
נתונים לדוגמה 5: ניטור בזמן אמת של ביוסינתזה של קיר התא
גרנגס היו מעובדים כתרבות נוזלית (שלב 1.4) ב -8-היטב שקופיות מיקרו (שלב 3.2). הריכוז CFW הסופי היה 0.12 μM. הגדרות הדמיה: CFI תוכנית Apo VC 60x/1.2 NA XC המים מטרת טבילה על מיקרוסקופ הפוך לייזר מיקוד סריקה; העירור CFW ב 405 ננומטר ופליטה ב 420 – 470 ננומטר; מסגרת אחת כל 20 s עד 35 דקות. הריכוז CFW נמוך מאוד מונע רוויה של קיר התא עם מולקולות צבע ומאפשר ניטור כמותי בזמן אמת של ביוסינתזה קיר התא. זה מגלה כי התצהיר של חומר חדש קיר התא אינו אחיד, אך מגיב במהירות רבה ללחצים פיזיים מקומי הנובע העקירה היחסית של תא אחד על תא לתא המצורף לפני היתוך germling ב N. crassa (איור 9, סרט 6).
איור 1: המאפיינים הביוכימיים והביופיסיים של צבעי FM. (א) מבנים כימיים של FM 1-43/SynaptoGreen C4 ו-fm 4-64/SynaptoRed C2. (ב) ספקטרום הקליטה והפליטה של צבעי ה-FM, מצופה הגדרות הדמיה אופטימלית עבור צבעים מאוגדים קרום בפטריות filamentous: 445 – 495 ננומטר אור כחול יהיה לרגש FM 1-43 עם 100 – 80% יעילות, בעוד 488 nm של לייזר ארגון יהיה להלהיב את הצבע עם 91% יעילות. בשל המשמרת הכחולה על כריכת ממברנה (*), טווח הזיהוי האופטימלי של הפליטה 1-43 FM הוא בין 520 – 590 ננומטר. באופן דומה, הגדרות הדמיה אופטימלית עבור FM 4-64 בפטריות הם 471 – 541 nm (100-80% יעילות) בעת שימוש במקור אור עירור רב כרומטי או 514 nm (99% יעילות) בעת שימוש בלייזר ארגון, ו 650 – 750 ננומטר עבור גילוי אור פליטה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: שיתוף הדמיה בו של fm 1-43 ו-fm 4-64. תערובת שווה של שתי הצבעים נוספה לתרבות germling נוזלית של N. crassa מניב ריכוז סופי של 10 μm. ב 25 דקות לאחר הוספת צבע, FM 1-43 הכתים את קרום הפלזמה והצטבר כבר בקרומים הפנימיים, כולל ויטראז ' מאוד (m) אבל במידה רבה ללא ממברנות וולאר (v), והוא יותר מאשר שמונה פעמים חזק יותר לעומת FM 4-64 (הממוצע כוונות זריחה 176 כדי 21, בהתאמה), אשר נמוך hydrophobicity/גבוהה hydrophilicity מאט את שיעור הפנמה שלה המוביל זמן מגורים ממושך על קרום פלזמה. סרגל בקנה מידה = 10 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הנחת קיר התא המושרה התצהיר של פולימרים של הקיר התא על איפקס הקצה מצריכה לעתים קרובות את התאים. מיקוף של T. ביטוי cytoplasmic gfp היו מוכתמים עם 10 Μm סולופניאיל FLAGFE 500 (SPF) ו התמונה באופן מיידי על הרכבה. לקורבן לא הדגיש (א), לקורבן הדגיש עם מעט מוגבר glucan מוגברת התצהיר על הפיסגה ומתקדם אוטוליזיס (ב), והדגיש בכבדות עם הודגש פסגה/chitin כובע (כוכבית) מסוף אוטוליזיס (c) ברור על ידי אובדן הכולל של הזריחה gfp וחללים נרחבים. סרגל קנה מידה = 10 μm. ראה סרט 1 עבור רצף קורס בזמן מלא. שימו לב כי שלושת הפרמהה היו אכן ממוקמים זה ליד זה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: המאפיינים הביוכימיים והביופיסיים של קיר התא צבעים סלקטיביים. תכונות כימיות שניתנו הן של מלחי הנתרן של כל צבע. ספקטרום הקליטה והפליטה תואם לאלה הנמצאים בסביבות סלולריות. המצוין מונוכרומטי קווים עירור שורות (נכתב בצבע), מגוון עירור רב כרומטי החלים על מיקרוסקופים epiפלואורסצנטית, ו פליטה טווחי זיהוי האור הם אלה המומלצים לדימות בפטריות filamentous. שני קווים עירור לייזר מצוינים כאשר הן פועלות בצורה שווה. (*) ספקטרום הפליטה של PFS מאוגד קיר התא הוא באופן משמעותי יותר אדום-השתנה מאשר ציין בעבר33, עם זאת, וכתוצאה מכך טוב מאוד S/N-יחס עם ריכוזי צבע נמוך יותר מאשר בשימוש לפני. הספקטרום המלא של CR הוא כרגע לא זמין, ומכאן של הנילוס אדום (CAS No: 7385-67-3) מוצג כהתאמה הקרובה ביותר. מידע מפורט על התכונות הספקטרליות של CR ניתן למצוא במקום אחר42. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: השפעת Sfp2 על קליטת endocytic של FM4-64. שלושה בשלבים מרכזיים רצופים של ספיגת צבע FM ניתן להבחין בקלות בסוג פראי (wt). שלב I: ממברנה בלעדית של פלזמה כתמים, שלב II: הופעתו הראשונה של צבען FM ב ושלפוחיות ושלב III: כתמים בלעדיים של שלפוחית העין ושלפוחיות. תבניות כתמים מקבילות מוצגות בנקודת הזמן המוקדמת ביותר של הופעתם. בהשוואה לסוג הפראי T. מתנוון , endocyציטוזה הוא מעט מואץ ב sfp2 over-הביע המוטציה (OEsfp2), ואילו ספיגת צבע מתעכב באופן דרמטי במוטציה sfp2 מחיקה (Δsfp2). למשל, ספיגת צבע לתוך קרום הפלזמה מתרחשת באופן מיידי ב OEsfp2 אבל לוקח 2 דקות בסוג פראי; והפנמה מלאה של צבע FM מן קרום הפלזמה מתרחשת 10x מהר יותר OEsfp2 לעומת Δsfp2. קנה מידה של סרגלים = 5 μm. האיור מועתק מאתנסנובה ואח '9 בהסכם עם רישיון קריאייטיב מלאי (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: שיתוף כתמים של חלבונים הממברנה EGFP עם תווית עם FM 4-64 מקלה על הבידול של דינמיקה ברורה subcellular לוקליזציה ב -T. מתנוון. (א) הSfp2 בעלי התחום בעל ארבעה ממברנות, הכוללים את קרום הפלזמה של FM4-64, כולל ממברנה הפלסמה והספטטה, הספיזנקרול (spk; חץ) והוולולים הצינורי. (ב) החלבון הדומה ל-Gpr1 מכיל שבעה ממברנות עם FM4-64 לאותם אורגלים כמו Sfp2, מלבד Spk. סרגל שורות, 10 μm. ראה סרט 3 וסרט 4 עבור רצפי הקורס בזמן מלא. הדמות השתנתה מאתנסנובה ואח '9 בהסכם עם רישיון Creative commons. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: FM 4-64 מכתים את הבדיל Δbud-6 מוטציה מסוג פראי, ולוקליזציה ניצן -6 בטבעת מחיצה. (א) FM 4-64 כתמים של לקורבן של N. crassa סוג פראי (חיצים מצביעים על septa; ראשי חץ מצביעים על spk). (ב) septa ו-spk נעדרים ב ∆bud-6. סרגלי קנה מידה, 50 μm. (c ו -D) תקריב של הפיסגה hyphal ו subapex של סוג פראי (C) ו ∆bud-6 (ד). Spk (ראש חץ) מבדיל בסוג פראי אבל לא ∆bud-6. הסוגריים המרובעים מציינים שאזור הדרה הגרעינית לא הוקם ב ∆bud-6. קנה מידה ברים = 5 μm. (ה) ניצן-6-gfp הגיוס לאתר המחיצה לפני השטח לפני הפולשים ממברנה הפלזמה (ראשי חץ) וליווי מכווץ המחיצה. קנה מידה של סרגלים = 5 μm. ראה את הסרט 5a והסרט 5a עבור רצפי קורס הזמן המלא. הדמות שוחזר עם שינויים של Lichius ואח '16 בהסכם עם רישיון מלאי יצירתי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 8: מחיקה של sfp2 משנה את דפוס התצהיר של החומר הקיר התא ומשפיע hyphal מורפולגנזה של T. מתנוון. (A) CFW ו-SPF מכתים חושף מוגבר קיר התא התצהיר ב Δsfp2 (חיצים) לעומת סוג פראי (wt). מכתים CR גורם לנפיחות של טיפ נרחב רק ב Δsfp2 (ראשי חץ). סולם ברים = 10 μm. (ב) פגמים גנטיים מורפולΔsfp2 כוללים מרחקים מופחתת מחיצה מופחת (Δsfp2 = 26.0 μm, פראי סוג = 85 μm; n = 60; ANOVA Pr < 2-16) וקטרים קטנים יותר (∆sfp2 = 5.6 μm, פראי סוג = 12.6 μm; n = 100; יחסי הציבור של ANOVA < 2-16). (ג) הגדילה את הקרינה הפלואורסצנטית בחוד הקצה לעומת ה-subapex. סרגל בקנה מידה = 5 μm. (ד) עוצמה-מקודד משטח תלת-ממד של הקרקע (ג). (ה) קוונפיקציה של עוצמות הזריחה היחסיים ב Δsfp2 וסוג פראי (n = 55). האיור שוחזר מאתנסנובה ואח '9 בהסכם עם רישיון Creative commons. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 9: ניטור בזמן אמת של ביוסינתזה קיר התא. (א) פיוז'ן שפופרת השקה (CAT) בין מגרנגס של נ. קראסה. מגע פיזי מתברר על ידי תגובת מומנט germling (21 – 28 דקות). עוצמה מקודד צבע הזריחה CFW מציין אזורים עם מעט (כחול כהה) ואינטנסיבי (צהוב) הקיר תא התצהיר. קצה הביות הבלתי מוכתם הראשון (ראש חץ), הפקדות חומר חדש בקיר התאים על קשר התשר ובאזור החווה את הלחץ הפיסי הגדול ביותר (חץ). סרגל קנה מידה = 5 μm. ראה סרט 6 עבור רצף הקורס במשרה מלאה. איור ששוחזר מ38 עם אישור. (ב) היטל (א) המציין ארבעה אזורים עגולים שבהם נמדדו עוצמות הקרינה הפלואורסצנטית. סרגל קנה מידה = 5 μm. (ג) מגרש האזורים המצוינים המראים את העלייה המהירה בביוסינתזה של קיר התא המותאם לשפות אחרות בתגובה ללחץ פיסי (CAT 1, חץ). בצינור הנבט (GT) והגוף נבג (con, um), ביוסינתזה קיר התא גדל בהתמדה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
סרט 1: מתח בקיר המושרה לחץ. 10 μM SPF (ציאן) נוספו ל -T. מתנוון ביטוי של cytoplasmic gfp (מגנטה). הצביעת עצה נרחבת מתרחשת מיד, ואחריו הפירוק המהיר של תאי hyphal בתוך 2 דקות; ניכרת על ידי היעלמותו של הזריחה GFP. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרט.
סרט 2: כתמים חיוניים של SPF. 2 μM SPF (ציאן) לאפשר לעקוב אחר הצמיחה הקצה של T. מתנוון hypvi, עם המרחב הגבוה ברזולוציה הטמפורלית מבלי לגרימת הלחץ הקיר חפצים המתח על איפקס קצה. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרט.
סרט 3: FM 4-64 שיתוף כתמים של Sfp2-GFP. שיתוף כתמים של T. ביטוי Sfp2-megfp (ירוק) עם 1.67 ΜM FM 4-64 (אדום) לחשוף את חופפים וברורים לוקליזציה של חלבון ממברנה עם מסלול endocytic. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרט.
סרט 4: FM 4-64 כתמים שיתוף של Gpr1-GFP. שיתוף כתמים של T. ביטוי Gpr1-megfp (ירוק) עם 1.67 ΜM FM 4-64 (אדום) לחשוף את חופפים וברורים לוקליזציה של חלבון ממברנה עם מסלול endocytic. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרט.
סרט 5: FM 4-64 כתמים משותף של ניצן-6-GFP. (5a) שיתוף כתמים של N. crassa ביטוי ניצן-6-gfp (ירוק) עם 2 μm FM 4-64 (אדום) לאפשר מעקב של ניצן-6 דינמיקה במהלך היווצרות מחיצת ממחיצה יחסית הפולשים הקשורים לקרום הפלזמה. (5b) חיתוך ומיזוג של תמונה (5b). אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרט 5a
אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרט 5b.
סרט 6: ניטור בזמן אמת של ביוסינתזה קיר התא. (ש ע ) כחול (ירוק) היה מוכתם עם 0.12 ΜM CFW (בכחול) כדי לחשוף את ביוגנזה הקיר התא המותאם לשפות אחרות במהלך היתוך של החתול בתיווך. שים לב כי יש כמה דימום דרך האות CFW לתוך ערוצי GFP, הממחישות כי SPF או CR הם בחירות טובות יותר כמו שיתוף הדמיה בו בו בו במקביל צבע עבור GFP, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרט.
טבלה 1: מאפיינים של קרום וקיר התא צבעי פלורסנט סלקטיבית. * = mg ו-mL הערכים תוקנו עבור תוכן טוהר/צבע מופחת לתוצאה שווה ערך בכל הפתרונות; n.i.a. = אין מידע זמין. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הטבלה.
Discussion
מאמר זה ממשיך את העבודה שבירת הקרקע אשר הקימה את השימוש בצבעי פלורסנט שונים כמו סמנים מאורגל החיוניות עבור פטריות filamentous בתחילתשנות ה-2000,4,43, וניסיונות לדון המאפיינים הביולוגיים של התאים והתא של צבע FM וצבע תא נבחר הקיר בפירוט רב יותר מבעבר. במיוחד ביחס להשפעות סלולריות לא רצויות, כגון רוויית ממברנה או נזק לקיר התא, המתרחשות מעל ריכוזי צבע מסוימים. מה שהיה בעבר נחשב שאינו רעיל ברמה התאית נחשב כעת רעיל ברמה המולקולרית. למרות ההשפעות הללו עשוי להיות מאוד עדין ולא ברור ישירות על ידי שינויים ברורים ארגונית או התנהגות התא, כל הפרעה אפשרית של יישום צבע אחר מאשר הדמיה צריך להיות ממוזער לחקירה של תפקוד מולקולרי יליד. למרבה המזל, רגישות משופרת ויעילות קוונטית של גלאים מודרניים, כגון מפולת סיליקון גלאי פוטודיודה (Si-APDs)44 או הגלאי אזור Airyscan45, להקל על השימוש של כמויות צבע נמוכות אפילו יותר מבעבר. מטרת מפתח נוספת של המאמר היא להדגים את המאפיינים שיתוף הדמיה של צבעים אלה עם fluorophores אחרים, החשוב ביותר, אלה של GFP כמו חלבון פלורסנט בשימוש תכוף ביותר בביולוגיה. זה צריך לסייע בעיצוב של ניסויים הדמיה כי המטרה להתאים את הדינמיקה לוקליזציה subcellular של חלבונים פיוז'ן פלורסנט לאלה של קיר התא פטרייתי, את קרום הפלזמה או את מסלול אנדו ואקסוציטוזה וכו '.
הדמיה בתנאים טבעיים וללא מתח היא המפתח לרכישת נתונים אמינים. כמה שיקולים מעשיים לגבי תרבות בינונית והכנה לדוגמה למטרה לספק נקודת התחלה למציאת התנאים האופטימליים המאפשרים הוצאת חפץ, זמן רב התבוננות של תאים בריאים, בלתי לחוצים עם S/היחס הגבוה ביותר האפשרי עבור כל מדגם נתון. אין דרך אוניברסלית להשגת תוצאות דימות אמינות ומשמעותיות. היא טבועה בגישה שווריאציה הביולוגית של המדגם, הסובייקטיביות והציפיות של המיקרוסקוסט, כמו גם עיבוד לאחר תמונה יש השפעה משמעותית על רכישת נתונים ופרשנות, בהתאמה. מכאן, החוויה המעשית של הmicroscopist, הידע האינטימי שלה על ביולוגיה התא של הפטריה תחת חקירה, כמו גם הכנה לדוגמה מיומנת כדי ליצור תנאים כמו ' טבעי ' ו מופרעת ככל האפשר בהגדרת מעבדה, הם העליונה לרכישת והערכת נתוני דימות כי בכנות משקף את התופעות הסלולר למדה. ככלל אצבע, התרחשות תופעות לוואי לא רצויות של צבעי פלורסנט, החל מעודן ולכן לא ברור לעין הפעלה של קרום פלזמה או קיר תא מחדש דוגמנות מתח מסלולים תגובה האינדוקציה ציטוטוקסיים ישירה של התאים אוטוליזיס, ניתן למנוע באופן מאובטח רק על ידי החלת ריכוזי צבע נמוך ≤ 2 μM.
היישום של צבעי פלורסנט הוא פשוט, ובכל זאת המינים שלהם הם מאופיינים בצורה גרועה. חוזק מפתח של שימוש בצבעי פלורסנט הוא הפשטות הדרך של הפרוטוקולים הניסיוניים. טיפוח ודגימה של הפטריה, הוספת הצבען (ים), והרכבה על המיקרוסקופ הם (עם תרגול) ישיר. התאמה של הגדרות הדמיה בסיסיות, כולל העירור ואת אורכי הגל, החשיפה פעמים, הגדרות קורס זמן וכו ', בעקבות כללי ביופיזיים פשוטים של המיקרוסקופ והכללים הביולוגיים של צבעי הפלורסנט המשמשים בתוך התאים. טבלה 1 מתכוונת לתמוך בזיהוי של שילוב הצבע או הצבע המתאימים ביותר לניסויים. יתר על כן, צבעי פלורסנט הם תחרותיים באופן סביר, זמין עם איכות גבוהה אמין ובכך להבטיח יישום מאוד מתוכנת.
שתי הגבלות גדולות של שימוש בקרום או קיר התא צבעי פלורסנט סלקטיבית הם (לעתים קרובות) ידע מוגבל של תכונות מדויקות שלהם, אשר ברוב המקרים הם לא ספציפיים על ארגונית מולקולרית הרמה, ואת הריכוז שלהם תלוי התופעות לוואי לא רצויות. צבעי FM הם ספציפיים עבור bilayers השומנים השתתפות אנדו-ו אקסוציציטוזה. עם זאת, בדיוק אילו מרכיבי הסלולר הופכים להיות מתויג ברציפות תחת התנאים נבדק אינו ברור באופן מיידי והוא דורש השוואה של משתני צבען FM שונים, ושיתוף תיוג עם סמנים נוספים מסוימים ספציפיים. ההעדפה של FM 1-43 עבור ממברנות מיטוכונדריאלי, בהשוואה ל-FM 4-64, היא אחת הדוגמאות. קיר תא צבע סלקטיבי להציג ספציפיות שונות עבור שלושת הפולימרים העיקריים של קיר התא פטרייתי. CFW הוא נחשב כתם לא ספציפי עבור β-glucans ו כיאין, SPF הוא חשב להיות סלקטיבי ביותר עבור β-1, 4-הגלוקנים, ו CR הוא חשב להיות סלקטיבי מאוד עבור α-ו β-chitin. מידע על הקשירה הספציפיות של PFS ל-pvc של דופן התא אינו זמין כרגע. לאיזה יחס שאותו פולימר קיר התאים הפטרייתיים מסומן באופן יעיל ביותר בריכוז צבע מסוים במינים הפטרייתיים בחקירה, לא ניתן להשיב בקלות, והיישום של מדידות מפורטות שנרכשו בתוך מבחנה או בvivo באורגניזמים אחרים או במינים פטרייתיים אחרים, חייבים להיחשב בזהירות רבה. למרבה הצער, מידע זה הוא דליל ומפוזר מאוד בספרות35,42,46. רשומות עדכניות יותר שיעקבו אחרי מחקרים קודמים33 כדי לספק תובנות חדשות למאפייני הצבע המדויקים של הצבעים המוצגים במיוחד בפטריות כרגע אינם זמינים.
שולטת הדמיה חיוניים כדי להעריך דפוסי הצביעת ותגובות הסלולר במדויק. כנראה החלק המאתגר ביותר, עם זאת, הוא לדעת את הביולוגיה התא של הפטריה כל כך טוב כי שינויים מוקלטים לוקליזציה subcellular של קרום וקיר תא צבעי פלורסנט סלקטיבית, שינויים באדריכלות הסלולר או בדפוס הצמיחה hyphal יכול באופן בלעדי ובביטחון להיות קשור להשפעות המיועדות של הטיפול הניסיוני. בשביל זה, זה חיוני לקבל שליטה טובה לצד כל ניסוי חדש של הדמיה תא חי. אלה כוללים את סוג פראי מטופל כמו שליטה הדמיה שלילית כדי להוציא את הרקע האוטומטי ורעש הגלאי של התמונה רכשה, ולהיות בעל המשווה מורפולוגית כאשר עובדים עם מוטציות. יתר על כן, שליטה חיובית הדמיה, למשל זן המבטא GFP או RFP בציטופלסמה או אחר מוכר היטב של חלבון סמן פלורסנט, חיוני להגדיר את עוצמת האור עירור למינימום הנדרש ויש להם שליטה חיוניות התא. לאחר שפקדים אלה מוגדרים, השימוש בצבעי פלורסנט אינו מוגבל למשימות ויזואליזציה בלבד, אך הדינמיקה שלהם תלויה בריכוז, כמו גם תופעות לוואי תלויות-ריכוז, יכולות להיות מנוצלות באופן אנליסטי; למשל, עבור הניטור ככמת ביולוגי הקיר תא בזמן אמת או לזיהוי של פנוטיפים ספציפיים מוטציה הרגישות בחני47.
יישומים משופרים בעתיד תלוי בניתוח פונקציונלי מפורט של מאפייני צבען צביעת. אתגר מתמשך הגדול הוא לשפר עוד ולהפוך ניתוח התמונה כמותית על מנת לקדם הערכה תפקודית של הדינמיקה subcellular של קרום התא ממברנה בררניים צבעי פלורסנט בפטריות filamentous. בשביל זה, נרחב, כמותי לוקליזציה מחקרים של צבעים אלה עם ארגונית ידוע ו-cell סמנים פולימר הקיר בשילוב עם זנים מוטציה לקויה מסלולים הובלה מסוימים או חוסר רכיבים מבניים ספציפיים נדרשים לראשונה. מספר סמנים endocyציטוזה לניתוח השוואתי עם צבעי FM זמינים48,49, וביחס עדין מאופיין specificities של צבע קירות הקיר בפטריות, היישום של50 נוגדנים בעלי תווית מוגדרת על-ידי fluorto-ספציפי לשימוש התוויות יכול לספק אפשרות אחת כדי לטפל בבעיה זו.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים ושום דבר לחשוף.
Acknowledgments
תודה בשל הקרן טירולית (TWF) למתן מענק #256524 אל, אל המדע והטכנולוגיה של וינה הקרן (WWTF) עבור מתן מענק #LS13-086 ש', ו לקרן פרסום של אוניברסיטת אינסברוק על תמיכה בפרסום גישה פתוחה. המחברים גם מודים למחלקה לזואולוגיה של אוניברסיטת אינסברוק לאספקת TCS לייקה SP5 II מיקרוסקופ סריקת לייזר מיקוד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BRAND cell counting chamber | Merck | BR718005 | Thoma format |
| Calcofluor White M2R | Merck/Sigma-Aldrich | F3543 | cell wall dye |
| CFI Plan Apo VC 60x/1.2 NA XC WI | Nikon | MRD07602 | water immersion objective |
| CFI Plan Apo VC 60x/1.2 NA XC WI | Nikon | MRD07602 | water immersion objective |
| Congo Red | Merck/Sigma-Aldrich | C6277 | cell wall dye |
| Dimethyl sulfoxide | VWR | 8,36,73,230 | organic solvent |
| Eclipse TE2000-E with C1 scanning unit | Nikon | custom configuration | inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 2 and 4 |
| Eclipse TE2000-U with Bio-Rad Radiance 2100 scannig unit | Nikon | custom configuration | inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 5 |
| FM 1-43 | Merck/Sigma-Aldrich | S6814 | membrane dye |
| FM 4-64 | Merck/Sigma-Aldrich | S6689 | membrane dye |
| Glass beads | Rettberg | 1340691030 | 3 mm glass beads |
| Glass cover slips | Thermo Fisher Scientific | BB02400600A113MNT0 | 24 x 60 # 1 glass cover slips |
| HCX PL APO 63x/1.3 NA Glyc | Leica | 15506353 | glycerol immersion objective |
| LSM 510 Meta | Zeiss | custom configuration | inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 3 |
| M9 Minimal Medium | Merck/Sigma-Aldrich | M6030 | generic fungal growth medium |
| Micro-slide 8-well | ibidi | 80826 | ibiTreat #1.5 polymer coverslip |
| Miracloth | Merck/Millipore | 475855-1R | polyester filtration material |
| Petri dish | Sarstedt | 8,21,472 | 92 x 16 mm culture dish w/o cams |
| Phytagel | Merck/Sigma-Aldrich | P8169 | transparent gelling agent |
| Plan Apochromat 63x/1.4 NA Oil DIC | Zeiss | 440762-9904-000 | oil immersion objective |
| Pontamine Fast Scarlet 4B | Merck/Sigma-Aldrich | 212490 | cell wall dye |
| Potato Dextrose Agar (PDA) | BD Difco | 213400 | fungal growth medium for T. atroviride |
| Potato Dextrose Broth (PDB) | BD Difco | 254920 | fungal growth medium for T. atroviride |
| Reaction tube | Sarstedt | 72,706 | 1.5 mL SafeSeal tube |
| Scalpel | B.Braun | 5518016 | Cutfix sterile scalpel #23 |
| Screw cap tube | Sarstedt | 6,25,54,502 | 15 mL polypropylene tube |
| Solophenyl Flavine 7GFE 500 | CIBA | 1485385V6 | cell wall dye |
| SynaptoGreen C4 | Biotum | 70020 | membrane dye |
| SynaptoRed C2 | Biotum | 70021 | membrane dye |
| Syringe membrane filter | Thermo Fisher Scientific | 723-9945 | 0.45 µm SFCA syringe filter |
| TCS SP5 II | Leica | custom configuration | inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 1 |
| Vogel's Minimal Medium (VMM) | FGSC | Fungal Genetics Stock Centre | fungal growth medium for N. crassa |
References
- Read, N. D., Fischer, S., Parton, R. M. Imaging Spitzenkörper, pH and calcium dynamics in growing fungal hyphae. Pesticide Science. 54 (2), 179-181 (1998).
- Hickey, P. C., Swift, S. R., Roca, M. G., Read, N. D. Live-cell imaging of filamentous fungi using vital fluorescent dyes and confocal microscopy. Microbial Imaging. , Elsevier. 63-87 (2004).
- Jelínková, A., et al. Probing plant membranes with FM dyes: tracking, dragging or blocking. The Plant Journal. 61 (5), 883-892 (2010).
- Fischer-Parton, S., et al. Confocal microscopy of FM4-64 as a tool for analysing endocytosis and vesicle trafficking in living fungal hyphae. Journal of Microscopy. 198 (3), 246-259 (2000).
- Harris, S. D. Branching of fungal hyphae: regulation, mechanisms and comparison with other branching systems. Mycologia. 100 (6), 823-832 (2008).
- Roca, M. G., Arlt, J., Jeffree, C. E., Read, N. D. Cell biology of conidial anastomosis tubes in Neurospora crassa. Eukaryotic Cell. 4 (5), 911-919 (2005).
- Becker, Y., et al. The fungal cell-wall integrity MAPK cascade is crucial for hyphal network formation and maintenance of restrictive growth of Epichloë festucae in symbiosis with Lolium perenne. Molecular Plant-Microbe Interactions. 28 (1), 69-85 (2015).
- Justa-Schuch, D., Heilig, Y., Richthammer, C., Seiler, S. Septum formation is regulated by the RHO4-specific exchange factors BUD3 and RGF3 and by the landmark protein BUD4 in Neurospora crassa. Molecular Microbiology. 76 (1), 220-235 (2010).
- Atanasova, L., et al. The Gpr1-regulated Sur7 family protein Sfp2 is required for hyphal growth and cell wall stability in the mycoparasite Trichoderma atroviride. Scientific Reports. 8 (1), 12064 (2018).
- Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. Journal of Neuroscience. 12 (2), 363-375 (1992).
- Wu, Y., Yeh, F. L., Mao, F., Chapman, E. R. Biophysical characterization of styryl dye-membrane interactions. Biophysical Journal. 97 (1), 101-109 (2009).
- Betz, W. J., Mao, F., B, S. C. Imaging exocytosis and endocytosis. Current Opinion in Neurobiology. 6, 365-371 (1996).
- Hoopmann, P., Rizzoli, S. O., Betz, W. J. Imaging synaptic vesicle recycling by staining and destaining vesicles with FM dyes. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (1), 77-83 (2012).
- Bolte, S., et al. FM-dyes as experimental probes for dissecting vesicle trafficking in living plant cells. Journal of Microscopy. 214, Pt 2 159-173 (2004).
- Riquelme, M., et al. Spitzenkorper localization and intracellular traffic of green fluorescent protein-labeled CHS-3 and CHS-6 chitin synthases in living hyphae of Neurospora crassa. Eukayotic Cell. 6 (10), 1853-1864 (2007).
- Lichius, A., Yáñez-Gutiérrez, M. E., Read, N. D., Castro-Longoria, E. Comparative live-cell imaging analyses of SPA-2, BUD-6 and BNI-1 in Neurospora crassa reveal novel features of the filamentous fungal polarisome. PloS one. 7 (1), 30372 (2012).
- Peñalva, M. A. Tracing the endocytic pathway of Aspergillus nidulans with FM4-64. Fungal Genetics and Biology. 42 (12), 963-975 (2005).
- Dijksterhuis, J., Molenaar, D. Vesicle trafficking via the Spitzenkörper during hyphal tip growth in Rhizoctonia solani. Antonie van Leeuwenhoek. 103 (4), 921-931 (2013).
- Hickey, P. C., Read, N. D. Imaging living cells of Aspergillus in vitro. Medical Mycology. 47, 110-119 (2009).
- Delgado-Álvarez, D. L., Bartnicki-García, S., Seiler, S., Mouriño-Pérez, R. R. Septum development in Neurospora crassa: the septal actomyosin tangle. PLoS One. 9 (5), 96744 (2014).
- Hageage, G. J., Harrington, B. J. Use of Calcofluor White in clinical mycology. Laboratory Medicine. 15 (2), 109-112 (1984).
- Monheit, J. E., Cowan, D. F., Moore, D. G. Rapid detection of fungi in tissues using Calcofluor White and fluorescence microscopy. Archives of Pathology and Laboratory. 108 (8), 616-618 (1984).
- Herth, W., Schnepf, E. The fluorochrome Calcofluor White binds oriented to structural polysaccharide fibrils. Protoplasma. 105 (1-2), 129-133 (1980).
- Elorza, M. V., Rico, H., Sentandreu, R. Calcofluor White alters the assembly of chitin fibrils in Saccharomyces cerevisiae and Candida albicans cells. Journal of General Microbiology. 129 (5), 1577-1582 (1983).
- Lagorce, A., et al. Genome-wide analysis of the response to cell wall mutations in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Journal of Biological Chemistry. 278 (22), 20345-20357 (2003).
- Sanz, A. B., García, R., Rodríguez-Peña, J. M., Arroyo, J. The CWI Pathway: regulation of the transcriptional adaptive response to cell wall stress in yeast. Journal of Fungi. 4 (1), (2017).
- Slifkin, M., Cumbie, R. Congo Red as a fluorochrome for the rapid detection of fungi. Journal of Clinical Microbiology. 26 (5), 827-830 (1988).
- Michels, J., Büntzow, M. Assessment of Congo Red as a fluorescence marker for the exoskeleton of small crustaceans and the cuticle of polychaetes. Journal of Microscopy. 238 (2), 95-101 (2010).
- Pancaldi, S., Poli, F., Dall'Olio, G., Vannini, G. L. Morphological anomalies induced by Congo Red in Aspergillus niger. Archives of Microbiology. 137 (3), 185-187 (1984).
- Roncero, C., Durán, A. Effect of Calcofluor White and Congo Red on fungal cell wall morphogenesis: in vivo activation of chitin polymerization. Journal of Bacteriology. 163 (3), 1180-1185 (1985).
- Kopeck, M., Gabriel, M. The influence of Congo Red on the cell wall and (1,3)- β-d-glucan microfibril biogenesis in Saccharomyces cerevisiae. Archives of Microbiology. 158 (2), 115-126 (1992).
- Heilmann, C. J., et al. Surface stress induces a conserved cell wall stress response in the pathogenic fungus Candida albicans. Eukayotic Cell. 12 (2), 254-264 (2013).
- Hoch, H. C., Galvani, C. D., Szarowski, D. H., Turner, J. N. Two new fluorescent dyes applicable for visualization of fungal cell walls. Mycologia. 97 (3), 580-588 (2005).
- Liesche, J., Ziomkiewicz, I., Schulz, A. Super-resolution imaging with Pontamine Fast Scarlet 4BS enables direct visualization of cellulose orientation and cell connection architecture in onion epidermis cells. BMC Plant Biology. 13, 226 (2013).
- Ursache, R., Andersen, T. G., Marhavý, P., Geldner, N. A protocol for combining fluorescent proteins with histological stains for diverse cell wall components. The Plant Journal. 93 (2), 399-412 (2018).
- Knight, N. L., Sutherland, M. W. A rapid differential staining technique for Fusarium pseudograminearum in cereal tissues during crown rot infections. Plant Pathology. 60 (6), 1140-1143 (2011).
- Fajardo-Somera, R. A., et al. Dissecting the function of the different chitin synthases in vegetative growth and sexual development in Neurospora crassa. Fungal Genetics and Biology. 75, 30-45 (2015).
- Lichius, A. Cell Fusion in Neurospora crassa. , The University of Edinburgh. Edinburgh (UK). Doctor of Philosophy (Ph.D.) (2010).
- Chen, W., Li, W., Dong, X., Pei, J. A Review of Biological Image Analysis. Current Bioinformatisc. 13 (4), 337-343 (2018).
- Live cell imaging: A laboratory manual. Goldman, R. D., Swedlow, J., Spector, D. L. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2010).
- Eliceiri, K. W., et al. Biological imaging software tools. Nature methods. 9 (7), 697-710 (2012).
- Zemanek, G., Jagusiak, A., Chłopaś, K., Piekarska, B., Stopa, B. Congo Red fluorescence upon binding to macromolecules - a possible explanation for the enhanced intensity. Bio-Algorithms and Med-Systems. 13 (2), 1187 (2017).
- Hickey, P. C., Jacobson, D. J., Read, N. D., Louise Glass, N. Live-cell imaging of vegetative hyphal fusion in Neurospora crassa. Fungal Genetics and Biology. 37 (1), 109-119 (2002).
- Hamamatsu Si APD - high sensitivity photodiodes having an internal gain mechanism: Avalanche photodiode selection guide 2019. , Available from: https://www.hamamatsu.com/resources/pdf/ssd/si_apd_kapd0001e.pdf (2019).
- Huff, J. The Airyscan detector from ZEISS: confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution. Nature Methods. 12, 1205 (2015).
- Thomas, J., Idris, N. A., Collings, D. A. Pontamine Fast Scarlet 4B bifluorescence and measurements of cellulose microfibril angles. Journal of Microscopy. 268 (1), 13-27 (2017).
- Ram, A. F. J., Klis, F. M. Identification of fungal cell wall mutants using susceptibility assays based on Calcofluor White and Congo Red. Nature Protocols. 1 (5), 2253-2256 (2006).
- Toshima, J. Y., et al. Spatial dynamics of receptor-mediated endocytic trafficking in budding yeast revealed by using fluorescent alpha-factor derivatives. Proceedings of the National Academy of Science of the USA. 103 (15), 5793-5798 (2006).
- Kilaru, S., Schuster, M., Latz, M., Guo, M., Steinberg, G. Fluorescent markers of the endocytic pathway in Zymoseptoria tritici. Fungal Genetics and Biology. 79, 150-157 (2015).
- Fu, C., Tanaka, A., Free, S. J. Neurospora crassa 1,3-α-glucan synthase, AGS-1, is required for cell wall biosynthesis during macroconidia development. Microbiology. 160, Pt 8 1618-1627 (2014).
