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Biology

फिलामेंडस कवक के लाइव-सेल इमेजिंग के लिए झिल्ली और सेल वॉल चयनात्मक फ्लोरोसेंट रंगों का आवेदन

Published: November 28, 2019 doi: 10.3791/60613
Automatic Translation
1, 1
1Department of Microbiology, University of Innsbruck

Summary

आधुनिक फंगल सेल जीव विज्ञान में लाइव-सेल इमेजिंग विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण फ्लोरोसेंट रंग आवश्यक उपकरण हैं। यह पेपर प्लाज्मा झिल्ली गतिशीलता, एंडो/एक्सोसाइटोसिस और फिलामेंटल कवक में सेल वॉल मॉर्फोजेनेसिस पर नज़र रखने के लिए स्थापित और कम ज्ञात फ्लोरोसेंट रंगों के आवेदन का विवरण देता है।

Abstract

कवक कोशिकाओं में ऑर्गेनेल गतिशीलता के लाइव-सेल इमेजिंग विश्लेषण के लिए झिल्ली और सेल दीवार चयनात्मक फ्लोरोसेंट रंगों का अनुप्रयोग दो दशक पहले शुरू हुआ था और तब से फिलामेंट्रस फंगल की हमारी समझ में बहुत योगदान देना जारी है जीवन शैली. यह पेपर दो झिल्ली रंगों एफएम 1-43 और एफएम 4-64 और चार सेल वॉल दाग Calcofluor व्हाइट M2R, सोलोफेनाइल फ्लेवाइन 7GFE 500, पोंटामाइन फास्ट स्कार्लेट 48 और कांगो रेड के उपयोग के लिए एक व्यावहारिक गाइड प्रदान करता है। ध्यान उनके कम खुराक आवेदन पर है कलाकृतियों मुक्त धुंधला, उनके सह इमेजिंग गुणों, और उनके मात्रात्मक मूल्यांकन का पता लगाने के लिए । प्रस्तुत किए गए तरीके सभी फिलामेंस फंगल नमूनों पर लागू होते हैं जिन्हें वर्णित तरीकों से तैयार किया जा सकता है। मौलिक धुंधला दृष्टिकोण प्रजातियों के लिए रूपांतरों के लिए शुरू अंक के रूप में काम कर सकते है कि विभिंन खेती की स्थिति की आवश्यकता हो सकती है । सबसे पहले, जैव भौतिक और जैव रासायनिक गुणों की समीक्षा की जाती है क्योंकि इन रंगों को वास्तव में महत्वपूर्ण फ्लोरोसेंट दाग के रूप में उपयोग करने के लिए उनकी समझ आवश्यक है। दूसरे, कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल प्रस्तुत किए जाते हैं जो फ्लोरोसेंट लाइव-सेल इमेजिंग के लिए विभिन्न फंगल नमूना प्रकारों की तैयारी का विस्तार करते हैं। अंत में, उदाहरण प्रयोग विभिन्न दृष्टिकोणों को दर्शाते हैं: (1) आनुवंशिक म्यूटेंट में एंडोसाइटोसिस के स्थानिक-लौकिक संगठन में दोषों की पहचान करें, (2) तुलनात्मक रूप से एफएफपी-लेबल वाले लक्ष्य प्रोटीन के साझा और विशिष्ट सह-स्थानीयकरण की विशेषता है एंडोसाइटिक मार्ग में, (3) एक आनुवंशिक उत्परिवर्ती में मॉर्फोजेनेटिक सेल दीवार दोषों की पहचान करता है, और (4) वास्तविक समय में सेल वॉल बायोजेनेसिस की निगरानी करता है।

Introduction

बीस साल पहले, जिस तरह से हाइफाल मॉर्फोजेनेसिस और अंतर्निहित आणविक कोशिका जीव विज्ञान को तंतु में कल्पना की जा सकती है, झिल्ली चयनात्मक फ्लोरोसेंट फी माओ दयो एफएम 4-641के आवेदन से क्रांतिकारी बदलाव किया गया था। बाद में, फंगल सेल वॉल डायनामिक्स के महत्वपूर्ण फ्लोरोसेंट मार्कर के रूप में चिटिन-बाइंडिंग डे कैल्कोफ्लोर व्हाइट का लाभ2का एहसास हुआ। तब से, दोनों रंगों और उसके वेरिएंट कवक में ऑर्गेनेल गतिशीलता के लाइव-सेल इमेजिंग विश्लेषण का एक अंतर्निहित हिस्सा बन गए हैं, और फिलामेंटल फंगल जीवन शैली में अभूतपूर्व अंतर्दृष्टि प्रदान करना जारी रखते हैं। यह पेपर प्लाज्मा झिल्ली गतिशीलता, एंडो और एक्सोसाइटोसिस और फिलामेंटल कवक में सेल वॉल मॉर्फोजेनेसिस पर नज़र रखने के लिए स्थापित और कम ज्ञात फ्लोरोसेंट रंगों के आवेदन का विवरण देता है। एंडोसाइटोसिस ट्रैकिंग परखों से एंडोसाइटोसिस के सामान्य अध्ययन से संबंधित विभिन्न सेल जैविक प्रश्नों को संबोधित करने की अनुमति देता है। इसके लिए, एफएम डीवाई जोड़ पर दागडिब्बों के स्थानीयकरण, गति और उत्तराधिकार को परीक्षण कवक उपभेदों4के बीच की तुलना में समय चूक माइक्रोस्कोपी और मात्रात्मक रूप से दर्ज किया जाता है। सेल वॉल रंग कोशिका की बाहरी सीमा को चित्रित करते हैं और ध्रुवीकृत हाइफाल टिप ग्रोथ2,हाइफाल ब्रांचिंग5,हाइफाल फ्यूजन6,7 और पट निर्माण8सहित मॉर्फोजेनेटिक घटनाओं की ट्रैकिंग की अनुमति देते हैं। इसके अलावा, वे स्थानीयकृत सेल दीवार जमाव और सेल वॉल बायोजेनेसिस9के दौरान दोषों की पहचान की मात्रा की सुविधा प्रदान करते हैं । क्योंकि किसी भी फ्लोरोसेंट मार्कर के जैव रासायनिक और जैव भौतिक गुणों का विस्तृत ज्ञान वीवो एप्लिकेशन में सफल होने के लिए एक मौलिक शर्त है, इन विशेषताओं को पहले इस लेख में चित्रित छह रंगों के लिए संक्षेप में संक्षेप में बताया गया है।

झिल्ली चुनिंदा रंग
एफएम (फी माओ) स्टाइलिल रंग छोटे एम्फीफिलिक अणु हैं जो जैविक झिल्ली10के लिपिड बाइलेयर के बाहरी पत्रक के साथ गुजर नहीं सकते हैं। वे जलीय समाधान में लगभग गैर-फ्लोरोसेंट हैं, लेकिन प्लाज्मा झिल्ली एकीकरण पर तीव्रता से फ्लोरोसेंट बन जाते हैं, जिससे उत्कृष्ट सिग्नल-टू-शोर (एस/एन)अनुपात11पैदा होता है। ये गुण उन्हें प्लाज्मा झिल्ली और इंट्रासेलुलर ऑर्गेनेल गतिशीलता की कल्पना करने के लिए आदर्श रूप से अनुकूल बनाते हैं, जिसमें एंडो और एक्सोसाइटोसिस12की ट्रैकिंग शामिल है। ग्रीन फ्लोरोसेंट एफएम 1-43 और लाल फ्लोरोसेंट एफएम 4-64 इन प्रयोजनों के लिए दो सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल फ्लोरोसेंट झिल्ली मार्कर हैं । SynaptoGreen C4 और SynaptoRed C2 वैकल्पिक आपूर्तिकर्ताओं से जेनेरिक अणु है कि एक दूसरे के बजाय एफएम 1-43 और एफएम 4-64, क्रमशः इस्तेमाल किया जा सकता है ।

स्टाइलिल रंगों में तीन प्रमुख संरचनात्मक क्षेत्र शामिल हैं: (1) लिपोफिलिक पूंछ जो लिपिड बाइलेयर में रंग के सम्मिलन की सुविधा प्रदान करती है, (2) फ्लोरोफोर कोर जो रंग के स्पेक्ट्रल गुणों को निर्धारित करता है और एक से तीन डबल बांड से जुड़े दो सुगंधित छल्ले द्वारा गठित किया जाता है, और (3) सकारात्मक आवेशित हाइड्रोफिलिक सिर जो झिल्ली(चित्रा 1ए)के माध्यम से रंग के पूर्ण सम्मिलन और परमीशन को रोकता है।

लिपोफिलिक पूंछ जितनी लंबी होगी, उतनी ही अधिक रंग की हाइड्रोफोबिसिटी होती है और इस प्रकार झिल्ली के लिए आत्मीयता बाध्यकारी होती है, लेकिन कम इसकी पानी की घुलनशीलता और झिल्ली डी-धुंधला दर होती है। नतीजतन, विभिन्न एफएम रंग वेरिएंट अलग धुंधला गतिशीलता और पैटर्न का उत्पादन। C4-पूंछ वाले एफएम 1-43 का उच्च हाइड्रोफोबिसिटी प्लाज्मा झिल्ली और आंतरिक ऑर्गेनेल्स पर एक मजबूत और अधिक स्थिर फ्लोरेसेंस संकेत प्रदान करता है, जब समानरूपर सांद्रता(चित्रा 2)पर लागू किया जाता है।

महत्वपूर्ण बात यह है कि दोनों एफएम रंगों की निरंतर और उच्च संघ/विसोशन दरें1-6 एस प्रति व्यक्तिगत रंग अणु13 के औसत प्रतिधारण समय के साथ झिल्ली के कार्य के स्थानीयव्यवधान के लिए संभावना को कम करती हैं, उदाहरण के लिए, झिल्ली तरलता के संशोधन या झिल्ली प्रोटीन की जबरन स्थायी बातचीत के माध्यम से । यह शायद महत्वपूर्ण कारण है कि इन अणुओं को महत्वपूर्ण रंगों के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। फिर भी, 50 माइक्रोन से ऊपर एफएम रंग सांद्रता फंगल और पौधे की कोशिकाओं2,14के लिए विषाक्त हैं, और BY-2 तंबाकू प्रोटॉपस्ट से सबूत इंगित करता है कि 20 से अधिक μM एफएम डाया प्लाज्मा झिल्ली संतृप्ति14के लिए सीसा । इस प्रकार, इस सीमा से अधिक न होने की सलाह दी जाती है, विशेष रूप से इस तथ्य को देखते हुए कि उत्कृष्ट इमेजिंग को 2-5 माइक्रोएम15,16के साथ प्राप्त किया गया है।

विशेष रूप से, एफएम रंगों के स्पेक्ट्रल गुण विशेष झिल्ली माइक्रोएनवायरमेंट (समीक्षा किए गए14)के आधार पर बहुत भिन्न होते हैं। आम तौर पर, शुद्ध विलायक समाधानों में एफएम रंगों का उत्तेजना और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा (जैसा कि आमतौर पर उत्पाद जानकारी में प्रदान किया जाता है) सेलुलर वातावरण में उससे काफी भिन्न होता है और ज्यादातर मामलों में, लाइव-सेल इमेजिंग सेटिंग्स का चयन करने के लिए सीधे परामर्श नहीं किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, एफएम 1-43 और एफएम 4-64 का उत्तेजना/उत्सर्जन मैक्सिमा क्रमशः 37/46 एनएम और 43/64 एनएम द्वारा नीला-स्थानांतरित हो जाता है, जब मेथनॉल(तालिका 1)में उनके समाधानों की तुलना में फंगल झिल्ली से बंधे होते हैं ।

स्पिटजेनकोपर और माइटोकॉन्ड्रिया सहित प्लाज्मा झिल्ली, एंडो-/एक्सोसाइटोसिस और ऑर्गेनेल गतिशीलता को ट्रैक करने के लिए एफएम 4-64 और एफएम 1-43 के उपयोग के लिए जमीन तोड़ने वाले बुनियादी सिद्धांतों को पहले से ही2,4,17,18,19के लिए व्यापक रूप से प्रलेखित किया गया है । विभिन्न फिलामेंडफंगल प्रजातियों में काम करने वाले दोनों एफएम रंगों के लिए अनुशंसित इमेजिंग सेटिंग्स को चित्रा 1 Bमें चित्रित किया गया है। उपलब्ध उपकरणों या विशेष सेलुलर और प्रयोगात्मक स्थितियों की तकनीकी सीमाएं, जैसे संस्कृति माध्यम, पीएच या तापमान, हालांकि, कुछ अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। सौभाग्य से, एफएम रंग एक विस्तृत स्पेक्ट्रल रेंज पर काम करते हैं, और बहुत अच्छे इमेजिंग परिणाम रोमांचक एफएम 1-43 द्वारा 514 एनएम या एफएम 4-64 के साथ 488 एनएम के साथ प्राप्त किए जाते हैं। नतीजतन, इष्टतम इमेजिंग सेटिंग्स प्रत्येक नमूना प्रकार और इच्छित आवेदन के लिए व्यक्तिगत रूप से निर्धारित किया जाना चाहिए।

एफएम 4-64 के 135 एनएम से अधिक के काफी स्टोक बदलाव से उत्कृष्ट, एक साथ सह-इमेजिंग की अनुमति मिलती है, फ्लोरोफोरस हरी रोशनी उत्सर्जित करते हैं; यह अक्सर ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) की इंट्रासेलर लोकलाइजेशन गतिशीलता का मूल्यांकन करने के लिए शोषण किया जाता है - प्लाज्मा झिल्ली और एंडोसाइटिक पाथवे9,20के सापेक्ष फ्यूजन प्रोटीन लेबल .

सेल वॉल-चयनात्मक रंग
कैल्कोफ्लोर व्हाइट M2R (CFW), भी फ्लोरोसेंट ब्राइटनर 28 के रूप में विपणन, शायद सबसे प्रसिद्ध फ्लोरोसेंट रंग बैक्टीरिया, कवक, शैवाल, उच्च पौधों और कीड़ों की कोशिका दीवारों दाग करने के लिए इस्तेमाल किया जाता है । प्रारंभ में कागज, कपड़ा और डिटर्जेंट उद्योग में ऑप्टिकल व्हाइटनिंग एजेंट के रूप में उपयोग किया जाता है, फंगल संक्रमणों के नैदानिक निदान के लिए इसके लाभ21,22को जल्दी महसूस किए गए थे। क्योंकि सीएफडब्ल्यू नवजात चिटिन श्रृंखला में अपरिवर्तनीय रूप से विभाजित होजाता है , यह कोशिका दीवार बायोजेनेसिस के दौरान सामान्य चिटिन माइक्रोफिब्रिल असेंबली को परेशान करता है जिससे सेल वॉल स्ट्रेस23पैदा होता है । यह एक सेल दीवार क्षति मरम्मत तंत्र को ट्रिगर करता है जिससे ग्लूकन और चिटिन सिंथाज सक्रियण24,25के परिणामस्वरूप स्थानीय रूप से बढ़ गई सेल दीवार जमाव हो जाती है । यह घटना किसी भी रंग के साथ हो सकती है जो कोशिका दीवार पॉलिमर के लिए स्थिर रूप से बाध्यकारी द्वारा संचालित होती है, एकाग्रता पर निर्भर है और हाइवहल युक्तियों पर सबसे अधिक ध्यान देने योग्य है जो सबसे उर्वर बढ़ते हुए और इस प्रकार माइसेलियम(चित्रा 3)के सबसे संवेदनशील हिस्सों का प्रतिनिधित्व करते हैं। कोशिका दीवार क्षति का जवाब देने वाली आणविक मशीनरी का एक व्यापक सारांश हाल ही में26प्रदान किया गया है ।

फोटोटॉक्सिकिटी के साथ संयोजन में अधिक मात्रा में रंग हाइफाल डिब्बों(मूवी 1)के तेजी से सेल lysis के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । फिर भी, जंगली प्रकार में "महत्वपूर्ण" रंगसांद्रता के प्रति संवेदनशीलता में वृद्धि का दोहन जीन हानि-कार्य म्यूटेंट9के सेल वॉल बायोसिंथेसिस में दोषों की पहचान करने के लिए किया जा सकता है। CFW और कांगो रेड (सीआर) के लिए, एक अन्य कपड़ा रंगक जिसे डायरेक्ट रेड 28 के रूप में भी जाना जाता है और कवक और कीड़ों के लिए α-और चिटिन-विशिष्ट सेल दीवार दाग के रूप में नियोजित किया गया है, जो27,28,दहलीज सांद्रता है जो ताइन सिंथाज़ को दृढ़ता से प्रेरित करता है और जीटी; क्रमशः 60 माइक्रोन सीएफडब्ल्यू और 70 माइक्रोन सीआर, जबकि सांद्रता और 15माइक्रोन या तो रंग ने फंगल विकास29,30,31को नहीं बदला या बाधित नहीं किया। हिक्की एट अल. 25 μM2पर CFW के लिए इस दहलीज एकाग्रता रखा । इसलिए, तनाव से संबंधित कलाकृतियों को बाहर करने और इन अणुओं का उपयोग वास्तव में "महत्वपूर्ण फ्लोरोसेंट रंगों"2,32के रूप में सुनिश्चित करने के लिए रंगसांत 5 μM का उपयोग करने की सलाह दी जाती है। यह समान रूप से सोलोफेनाइल फ्लेवाइन 7GFE 500 (एसपीएफ) और पोंटामाइन फास्ट स्कार्लेट 4बी (पीएफएस) पर लागू होता है, जो क्रमशः प्रत्यक्ष पीले 86 और प्रत्यक्ष लाल 23 का पर्याय है, दो अन्य उपयोगी सेल वॉल रंगों, जिनकी कवक के लिए आवेदन पहली बार एक दशक से अधिक समय पहले33के लिए सूचित किया गया है। लेकिन उनके उल्लेखनीय स्पेक्ट्रल गुणों34,35के बावजूद तब से दोनों रंगों का उपयोग बहुत सीमित36,37रहा है . जैसा कि पहले 1.5 माइक्रोन सीएफडब्ल्यू2के लिए दिखाया गया था, 2 माइक्रोन एसपीएफ बहुत उच्च अस्थायी संकल्प(मूवी 2)के साथ देशी परिस्थितियों में सेल दीवार गतिशीलता को हल करने के लिए पर्याप्त हैं। यही परिणाम 2 माइक्रोन सीआर या पीएफएस के साथ प्राप्त किए जा सकते हैं।

साथ में, इन चार रंगों, CFW, एसपीयू, पीएफ, पीएफएस और सीआर, सेल वॉल-चुनिंदा फ्लोरोसेंट मार्कर का एक सेट शामिल है जो आधुनिक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप(चित्रा 4)पर उपयोग किए जाने वाले लगभग पूर्ण दृश्यमान उत्सर्जन प्रकाश स्पेक्ट्रम (400-700 एनएम) को कवर करता है। सेल की दीवार बहुलक के लिए बाध्यकारी पर फ्लोरेसेंस तीव्रता में महत्वपूर्ण वृद्धि सभी चार के लिए अंतर्निहित है और उत्कृष्ट एस/एन अनुपात उत्पन्न करता है । यह बदले में रंग सांद्रता रखने के लिए और प्रकाश तीव्रता बहुत कम उत्तेजना और सेल दीवार "कम खुराक" लाइव सेल इमेजिंग तकनीक2के रूप में धुंधला प्रदर्शन करने की अनुमति देता है । क्योंकि इन सेल दीवार रंगप्लाज झिल्ली अभेद्य हैं, वे एक साथ रहते है/ विशेष रूप से, उनके अत्यंत व्यापक उत्सर्जन प्रकाश स्पेक्ट्रा के कारण, अन्य फ्लोरोफोरस के साथ सीएफडब्ल्यू और एसपीएफ के सह-इमेजिंग गुणों के बारे में कुछ सीमाओं पर सावधानीपूर्वक विचार किए जाने की आवश्यकता है।

Protocol

1. फंगल नमूनों की तैयारी

  1. फंगल प्री-संस्कृतियां
    1. न्यूरोस्पोरा क्रैसा के लिए ट्राइकोडर्मा एट्रोवीराइड या वोगेल के न्यूनतम माध्यम (वीएमएम) के लिए आलू डेक्सट्रोज एगर (पीडीए) जैसे उचित ठोस आगर माध्यम पर वांछित तनाव को टीका लगाएं। ट्रांसफॉर्मेंट उपभेदों के साथ काम करते समय एक उपयुक्त चयन मार्कर जोड़ें।
    2. जीव के इष्टतम तापमान पर पूर्व संस्कृति को इनक्यूबेट करें। उदाहरण के लिए, टी atroviride 25 डिग्री सेल्सियस और एन crassa पर 30 डिग्री सेल्सियस पर, और 12 h/12 h प्रकाश/अंधेरे चक्र जब तक एक sporulating mycelium विकसित किया है, लेकिन अभी तक थाली के किनारे तक नहीं पहुंचा । एक मानक आकार पेट्री डिश (9.2 सेमी ø) पर, यह 4-6 दिनों के औसत पर जंगली प्रकार टी एट्रोविराइड लेता है, जबकि एन क्रेसा जंगली प्रकार औसतन 3-4 दिनों के बाद इस चरण तक पहुंचता है।
  2. फंगल कॉलोनियों की खेती
    1. बाँझ स्केलपेल का उपयोग करके, प्री-कल्चर के कॉलोनी किनारे से नॉन-स्पूलिंग माइसेलियम ले जाने वाले एक छोटे से 3 मिमी x 3 मिमी आगर ब्लॉक को काट दें।
    2. प्रायोगिक संस्कृति को टीका लगाने के लिए एक ताजा ठोस मध्यम प्लेट के केंद्र में आगर ब्लॉक रखें।
    3. जांच के उद्देश्य से विकास के चरण के अनुसार प्रायोगिक संस्कृति को इनक्यूबेट करें। उदाहरण के लिए, जंगली प्रकार के टी एट्रोविराइड को पीडीए पर लगभग 2 सेमी व्यास की उपनिवेशों को विकसित करने के लिए अंधेरे में 25 डिग्री सेल्सियस पर 20-22 घंटे की आवश्यकता होती है, जबकि जंगली प्रकार एन क्रैसा वीएमएम पर अंधेरे में 30 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन के 14-16 घंटे के बाद लगभग 4 सेमी के कॉलोनी व्यास तक पहुंचता है।
      नोट: अंधेरे में ऊष्मायन पिगमेंट के गठन को रोकता है जो ऑटोफ्लोरेसेंस लागू कर सकता है। प्रायोगिक संस्कृति से मध्यम पृष्ठभूमि फ्लोरेसेंस को खत्म करने के लिए, आगर को पारदर्शी जमना एजेंट के 1.5% w/v (सामग्री की तालिकादेखें), और एक परिभाषित न्यूनतम माध्यम के साथ किसी भी जटिल माध्यम के साथ प्रतिस्थापित करें।
  3. ठोस अंकुरण संस्कृतियों की खेती
    1. प्री-कल्चर प्लेट से कोनिडायल बीजाणुओं को काटने के लिए बाँझ शारीरिक नमक समाधान (0.9% w/v NaCl) के 5 मिलील का उपयोग करें और 15 मिलील स्क्रू कैप ट्यूब में परिणामी बीजाणु निलंबन एकत्र करें।
    2. जोरदार भंवर द्वारा बीजाणु निलंबन को अच्छी तरह से मिलाएं और बाद में इसे बाँझ फिल्टर कपड़े की 1 सेमी x 5 सेमी पट्टी पर फ़िल्टर करें (सामग्री की तालिकादेखें) हल्के से 1 mL पिपेट टिप में भरवां (दोनों इकट्ठे और ऑटोक्लेव पहले से) एक ताजा बाँझ ट्यूब में।
    3. एक सेल गिनती कक्ष के साथ बीजाणु घनत्व निर्धारित करें और शारीरिक नमक समाधान के साथ एक 1 x 107 कोशिकाओं/mL बीजाणु निलंबन तैयार करते हैं ।
      नोट- बीजाणु निलंबन को दो सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है।
    4. ठोस माध्यम के 20 मीटर के साथ एक मानक आकार पेट्री डिश (9.2 सेमी ø) तैयार करें और शीर्ष पर 15-20 बाँझ ग्लास मोती (3 मिमी ø) जोड़ें।
    5. मध्यम प्लेट पर बीजाणु निलंबन के पिपेट 200 माइक्रोन और समान रूप से कोमल मिलाते हुए पूरी थाली में कोशिकाओं को वितरित करते हैं। पुन: उपयोग के लिए 70% इथेनॉल के साथ एक बीकर में कांच मोतियों को इकट्ठा करें।
    6. जांच के उद्देश्य से विकास के चरण के अनुसार प्रायोगिक संस्कृति को इनक्यूबेट करें। उदाहरण के लिए, टी एट्रोविराइड जंगली प्रकार को पीडीए पर कोनिडायल जर्मलिंग विकसित करने के लिए अंधेरे में 25 डिग्री सेल्सियस पर 5-6 घंटे की आवश्यकता होती है, जबकि एन क्रेसा जंगली प्रकार वीएमएम पर अंधेरे में 30 डिग्री सेल्सियस पर 3-4 घंटे के ऊष्मायन के बाद शंकुयुक्त अंकुरण विकसित करता है।
      नोट: प्रयोगात्मक संस्कृति से किसी भी मध्यम पृष्ठभूमि फ्लोरेसेंस को खत्म करने के लिए, आगर को पारदर्शी जमना एजेंट के 1.5% w/v और परिभाषित न्यूनतम माध्यम के साथ किसी भी जटिल माध्यम से बदलें।
  4. तरल अंकुरण संस्कृतियों की खेती
    1. 8-अच्छी तरह से कक्षित माइक्रो-स्लाइड के प्रत्येक कुएं में तरल संस्कृति माध्यम के 1 9 0 माइक्रोल भरें।
    2. 1 x 107 कोशिकाओं/mL बीजाणु समाधान (चरण 1.4.1-1.4.3 में तैयार) के 10 μL जोड़ें और धीरे से पाइपिंग द्वारा मिश्रण-और नीचे कई बार । कोशिकाओं की परिणामी कुल संख्या 1 x 105 प्रति अच्छी तरह से है।
    3. जांच के उद्देश्य से विकास के चरण के अनुसार प्रायोगिक संस्कृति को इनक्यूबेट करें। उदाहरण के लिए, जंगली प्रकार टी एट्रोविराइड को आलू डेक्सट्रोज शोरबा (पीडीबी) में कोनिडायल जर्मलिंग विकसित करने के लिए अंधेरे में 25 डिग्री सेल्सियस पर 5-6 घंटे की आवश्यकता होती है, जबकि जंगली प्रकार एन क्रेसा तरल वीएमएम में अंधेरे में 30 डिग्री सेल्सियस पर 3-4 घंटे के ऊष्मायन के बाद शंकुयुक्त अंकुरण विकसित करता है।

2. डाया काम समाधान की तैयारी

  1. प्रत्येक डाइई की पूर्ण घुलनशीलता की गारंटी देने के लिए, उचित राशि जोड़कर डिमेथिल सल्फासऑक्साइड (डीएमएसओ) में 2 एमएम स्टॉक समाधान तैयार करें (तालिका 1में सटीक वजन देखें) 100% DMSO के 1 mL और भंवर द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण।
    सावधानी: एक पट सील बोतल से DMSO लेने के लिए सुनिश्चित करें; यह एक स्पष्ट पारदर्शी तरल होना चाहिए। हवा के संपर्क में आने पर, डीएमएसओ भूरा हो जाता है - शायद ट्रेस अशुद्धियों के ऑक्सीकरण के कारण - और सेल विकास या रंग धुंधला को नकारात्मक रूप से प्रभावित कर सकता है।
  2. फिल्टर एक ताजा बाँझ 1.5 मिलीग्राम प्रतिक्रिया ट्यूब में 0.2 माइक्रोन सिरिंज झिल्ली फिल्टर के माध्यम से स्टॉक समाधान बंध्याकरण। रंगी ब्लीचिंग को कम करने के लिए, एल्यूमीनियम पन्नी में ट्यूब लपेटें।
    नोट: रंग स्टॉक समाधान को विगलन/फ्रीजिंग चक्र से बचने के लिए छोटे वॉल्यूम में बहाया जा सकता है, और कई महीनों तक 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है ।
  3. एक ताजा बाँझ 1.5 मिलीग्राम प्रतिक्रिया ट्यूब में बाँझ आसुत पानी के 198 μL में डाइ स्टॉक समाधान के 2 μL भंग करके एक 20 μM जलीय रंगे काम समाधान तैयार करें। रंगी ब्लीचिंग को कम करने के लिए, एल्यूमीनियम पन्नी में ट्यूब लपेटें।
    नोट- प्रयोग के दिन डाबी वर्किंग सॉल्यूशन को हौसले से तैयार करना चाहिए।
  4. नमूना बढ़ते के दौरान (धारा 3 देखें), रंग काम समाधान मानक रूप से पतला हो जाएगा 1:10, 2 μM और ०.१% w/v अंतिम DMSO एकाग्रता के एक अंतिम रंग एकाग्रता में जिसके परिणामस्वरूप ।
    नोट: बस रंग काम समाधान और बढ़ते तरल के बीच मात्रा अनुपात को बदलने के द्वारा विभिन्न कमजोर पड़ने कारकों का चयन, आसानी से वांछित अंतिम रंग एकाग्रता अनुकूल करने की अनुमति देता है ।
    सावधानी: अवांछित प्रभाव ों को रोकने के लिए, रंग े या DMSO विषाक्तता के कारण, कमजोर पड़ने का कारक 1:4 के तहत नहीं आना चाहिए ताकि 5 माइक्रोन डीईई और 0.4% w/v DMSO की अधिकतम अंतिम सांद्रता हो। उच्च रंग सांद्रता जल्दी से प्रणाली को संतृप्त करेगी और विश्वसनीय सिग्नल क्वांटिफिकेशन को रोकेगी, जबकि 0.5% से अधिक w/v (62.5 mM) DMSO सेल विकास38को ख़राब कर सकता है।

3. माइक्रोस्कोपी के लिए नमूना तैयारी

  1. उल्टे आगर ब्लॉक विधि द्वारा कवक कालोनियों (चरण 1.2) या ठोस अंकुरण संस्कृतियों (चरण 1.3) से माउंट नमूने।
    1. एक साफ रखें 24 मिमी x 60 मिमी ग्लास कवर स्लिप (#1 = 0.13-0.16 मिमी मोटाई) तैयार करें और केंद्र पर तरल न्यूनतम मध्यम (वीएमएम या एम9) या शारीरिक नमक समाधान के 18 माइक्रोन जोड़ें।
    2. तरल के 18 μL के लिए 20 μM रंग े काम समाधान के 2 μL जोड़ें और हवा बुलबुले के उत्पादन से बचने के दौरान, कई बार ऊपर और नीचे पाइपिंग द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण ।
      नोट: कई नमूनों के साथ काम करते समय, पूरे प्रयोग में समान रंग एकाग्रता सुनिश्चित करने के लिए सभी के लिए तरल-रंगे समाधान का मास्टर मिश्रण तैयार करने की सलाह दी जाती है।
    3. एक साफ स्केलपेल के साथ, कॉलोनी या ठोस अंकुरण संस्कृति की परिधि से 15 मिमी x 15 मिमी का नमूना काट लें और इसे कवर स्लिप पर मध्यम बूंद के बगल में खड़ी रखें।
    4. ब्लॉक के ऊपरी किनारे का समर्थन करने के लिए स्केलपेल का उपयोग करना और ब्लॉक के पीछे की ओर रखने के लिए उंगली, धीरे-धीरे तरल पर माइसेलियम या जर्मलिंग ले जाने वाले पक्ष को कम करें। नमूना अब माइक्रोस्कोप चरण पर हस्तांतरण के लिए तैयार है ।
      सावधानी: कोशिकाओं पर यांत्रिक तनाव को कम करने और नमूना और कवर स्लिप के बीच फंसे होने वाले हवा के बुलबुले से बचने के लिए इसे धीरे-धीरे और बहुत सावधानी से करना आवश्यक है।
  2. 1.4 चरण से तरल अंकुरण संस्कृतियों माउंट।
    नोट: सबसे आसानी से, कक्षित माइक्रो-वेल स्लाइड में तरल अंकुरण संस्कृतियों को सीधे स्थानांतरित किया जा सकता है और माइक्रोस्कोप चरण पर आगे हेरफेर किया जा सकता है।
    1. 2 μM रंग और 0.1% w/v DMSO के मानक अंतिम सांद्रता में परिणाम के लिए तरल माध्यम के 200 μL के लिए रंग काम समाधान के 22 μL जोड़ें ।
      नोट: तरल अंकुरण संस्कृतियों को बड़ा लाभ होता है कि फ्लोरोसेंट रंगों (या अन्य रसायनों, जैसे अवरोधक) को रिकॉर्डिंग के दौरान भी प्रयोग के किसी भी वांछित समय बिंदु पर जोड़ा जा सकता है। उस मामले में, कोशिकाओं को परेशान न करने के लिए तरल बूंदों को बहुत धीरे-धीरे प्रशासित करने के लिए विशेष सावधानी बरती जानी चाहिए। सिस्टम कंपन और ब्राउनियन गति पहले से ही कुछ सेल आंदोलन शुरू कर सकती है।

4. लाइव-सेल माइक्रोस्कोपी

  1. बुनियादी छवि अधिग्रहण सेटिंग्स को समायोजित करें। निम्नलिखित छवि अधिग्रहण सेटिंग्स व्यक्तिगत हाइफे में धुंधला गतिशीलता पर कब्जा करने की अनुमति देती हैं और निम्नलिखित दोनों परस ों पर लागू होती हैं
    1. डिवाइस की फुल आउटपुट पावर का 20% की 5-10% लेजर पावर लगाएं।
    2. एक उच्च संख्यात्मक एपर्चर के साथ एक योजना एपीओ 60x-63x ग्लाइसेरोल या पानी विसर्जन उद्देश्य का उपयोग करें 1.2।
    3. छवि अधिग्रहण क्षेत्र को 1024 x 256 पिक्सल का छवि आकार सेट करके और 2-3 के ऑप्टिकल जूम फैक्टर का उपयोग करके हाइफे की रूपरेखा तक सीमित करें।
    4. 400 हर्ट्ज के साथ बाइडायरेक्शनल स्कैनिंग का इस्तेमाल करें पिनहोल साइज को 1 हवादार यूनिट में एडजस्ट करें।
    5. सबसे संवेदनशील डिटेक्टर का लाभ 100% तक सेट करें।
    6. समय गोद रिकॉर्डिंग के लिए, एक फ्रेम के साथ छवि अधिग्रहण शुरू हर 15 एस रंगविदार विरंजन या फोटो तनाव का उत्पादन किए बिना उचित लौकिक संकल्प की अनुमति देने के लिए ।
    7. 3 डी रिकॉर्डिंग के लिए, उचित स्थानिक समाधान की अनुमति देने के लिए हाइफे और स्पेस ऑप्टिकल सेक्शन 1 माइक्रोन की सीमा तक ऊपरी और निचली स्थानिक सीमा निर्धारित करें।
      नोट: हाइफे के तेज विकास के कारण, जेड धुरी में उच्च स्थानिक संकल्प अक्सर एक्स/वाई धुरी या दूसरे रास्ते में उच्च लौकिक संकल्प के लिए बलिदान किया गया है । केवल बहुत आधुनिक कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप दोनों मांगों को पूरा करने के लिए काफी तेजी से कर रहे हैं।
  2. एंडोसाइटोसिस तेज परख
    1. माइक्रोस्कोपी सिस्टम पर उपलब्ध एफएम 1-43 और/या एफएम 4-64 के लिए सर्वश्रेष्ठ उत्तेजना/उत्सर्जन सेटिंग्स की पहचान करने और तदनुसार समायोजित करने के लिए चित्रा 1 और तालिका 1 से परामर्श करें ।
      नोट: अनुशंसित 2 μM एकाग्रता के साथ, प्लाज्मा झिल्ली में एफएम रंग का समावेश सामान्य स्वस्थ कोशिकाओं में तत्काल है। ट्यूबलर vacuoles में रंगउपस्थिति के लिए प्रारंभिक प्लाज्मा झिल्ली धुंधला से पूरी प्रक्रिया आमतौर पर कमरे के तापमान पर 30-45 मिनट के भीतर पूरा हो जाता है । एफएम डाइ एकाग्रता बढ़ाने से एस/एन-अनुपात बढ़ जाता है और इस प्रकार उच्च विपरीत छवियों को जल्दी पैदा करता है । हालांकि, यह लेबलिंग प्रक्रिया को भी गति देता है जिससे ऑर्गेनेल धुंधला के कालक्रम उत्तराधिकार में अंतर करना अधिक कठिन हो जाता है।
    2. उपरोक्त अनुशंसित बुनियादी छवि अधिग्रहण सेटिंग्स का उपयोग करके इमेज रिकॉर्डिंग शुरू करें और परिणामों का मूल्यांकन करें।
    3. प्लाज्मा झिल्ली या एंडोसाइटोसिस गतिशीलता के पहलू पर कब्जा करने के लिए आवश्यक स्थानिक और लौकिक संकल्प के लिए छवि अधिग्रहण सेटिंग्स का अनुकूलन करें प्रयोग पर केंद्रित है।
    4. उदाहरण के लिए, एक्स/वाई में बहुत तेज गतिशीलता को पकड़ने के लिए, समग्र छवि आकार को कम करने, केवल एक फोकल प्लेन छवि और स्कैनिंग दर को 1 एफपीएस तक बढ़ाना । जेड एक्सिस में उच्च संकल्प के लिए, X/Y में संकल्प को कम करें, छवि आकार को कम करें और ऑप्टिकल वर्गों के बीच की दूरी को 0.5 माइक्रोन तक कम करें।
  3. सेल वॉल गतिशीलता
    1. माइक्रोस्कोपी सिस्टम पर उपलब्ध एप्लाइड सेल वॉल डाये के लिए बेस्ट एक्सटॉमेंट/एमिशन सेटिंग की पहचान करने और तदनुसार एडजस्ट करने के लिए फिगर 4 और टेबल 1 से परामर्श करें ।
      नोट: उनके व्यापक उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के कारण, CFW और एसपीएफ अन्य फ्लोरोफोरस, मुख्य रूप से GFP के साथ एक साथ सह-इमेजिंग के लिए अच्छी तरह से अनुकूल नहीं हैं। कुछ प्रतिबंध इन रंगों के साथ अनुक्रमिक इमेजिंग दृष्टिकोण के लिए भी लागू होते हैं, और इस प्रकार व्यक्तिगत रूप से अनुकूलित किया जाना चाहिए।
    2. उपरोक्त अनुशंसित बुनियादी छवि अधिग्रहण सेटिंग्स का उपयोग करके इमेज रिकॉर्डिंग शुरू करें और परिणामों का मूल्यांकन करें।
      नोट: अनुशंसित 2 μM एकाग्रता के साथ, सेल की दीवार में रंगे का समावेश जरूरी तत्काल नहीं है, लेकिन काफी तेजी से। उदाहरण के लिए, पट गठन की पूरी प्रक्रिया कमरे के तापमान20पर औसतन लगभग 5-7 न्यूनतम लेती है। सेल वॉल डाइ एकाग्रता बढ़ाने से एस/एन-अनुपात बढ़ जाता है और इस प्रकार उच्च विपरीत छवियां जल्दी पैदा होती हैं । हालांकि, यह प्रेरित सेल दीवार क्षति मरम्मत के कारण तेजी से कलाकृतियों का परिचय भी देता है।
    3. सेल वॉल मॉर्फोजेनेसिस के पहलू पर कब्जा करने के लिए आवश्यक स्थानिक और लौकिक संकल्प के लिए छवि अधिग्रहण सेटिंग्स का अनुकूलन करें प्रयोग पर केंद्रित है, जैसा कि धारा 4.2.3 में उल्लिखित है।

Representative Results

मात्रात्मक छवि विश्लेषण
सेलुलर प्रक्रियाओं की कल्पना करने के अलावा, लाइव-सेल इमेजिंग रिकॉर्ड किए गए डेटा से मात्रात्मक जानकारी निकालने की अनुमति देता है। आम तौर पर, मात्रात्मक छवि विश्लेषण एक जटिल विषय है जिसकी उचित चर्चा इस लेख के दायरे से कहीं अधिक है, इसलिए, पाठक को समर्पित पाठ्यपुस्तकों और अनुच्छेद39,40,41को संदर्भित किया जाता है। फिर भी, निम्नलिखित उदाहरण डेटा से जुड़े कुछ बुनियादी दिशानिर्देश प्रदान किए जाते हैं। छवि मात्रा की अनुमति देने के लिए कई महत्वपूर्ण आवश्यकताओं को पूरा किया जाना चाहिए, जिसमें शामिल हैं: (1) फ्लोरोसेंट रंगों की परिभाषित मोलिरिटी को सटीक सापेक्ष तुलना की अनुमति देने के लिए सभी नमूनों पर लागू किया जाना चाहिए; (2) छवि अधिग्रहण सेटिंग्स को इस तरह से समायोजित किया जाना चाहिए कि उत्सर्जन प्रकाश डिटेक्टरों को कभी संतृप्त नहीं किया जाता है, अन्यथा अधिकतम तीव्रता काट दी जाती है; (3) छवि अधिग्रहण सेटिंग्स एक सुसंगत प्रयोगात्मक सेट के दौरान तय रहना चाहिए, अन्यथा कृत्रिम तीव्रता परिवर्तन शुरू किए जाते हैं; (4) छवि डेटा को सभी साधन सेटिंग्स वाले मेटा जानकारी के साथ सूचना-हानिरहित फ़ाइल प्रारूप में सहेजा जाना चाहिए; और (5) छवि विश्लेषण वांछित मात्रात्मक जानकारी निकालने के लिए आवश्यक पोस्ट प्रोसेसिंग चरणों की न्यूनतम संख्या तक सीमित होना चाहिए।

आमतौर पर, परिभाषित मानक जो रिकॉर्ड किए गए संकेतों के पूर्ण परिमाणीकरण की अनुमति देंगे, जीवित कोशिका में उपलब्ध नहीं हैं। इस प्रकार, अपने सरलतम रूप में, मात्रात्मक छवि विश्लेषण एक ही छवि के भीतर या समान सेटिंग्स के साथ दर्ज विभिन्न छवियों के बीच पिक्सेल तीव्रता की सापेक्ष तुलना पर निर्भर करता है। निर्माता के माइक्रोस्कोप नियंत्रण सॉफ्टवेयर में सामान्य रूप से छवि पोस्ट-प्रोसेसिंग और मात्रात्मक विश्लेषण के लिए बुनियादी उपकरण शामिल हैं, या छवि विभाजन, थ्रेसहोल्डिंग, अनुपात इमेजिंग आदि के लिए अतिरिक्त कार्यों के साथ अपग्रेड किया जा सकता है। विभिन्न प्रकार के इमेजिंग डेटा के लिए अलग-अलग उपयुक्त कई ओपन सोर्स इमेज प्रोसेसिंग प्लेटफॉर्म उपलब्ध हैं, जिनमें इमेजजे (https://imagej.net; https://imagej.nih.gov/ij/), बर्फीले (http://icy.bioimageanalysis.org/), सीएमईआईएएस बायोइमेज इन्फॉर्मेटिक्स (http://cme.msu.edu/cmeias/) और विमासिस (https://www.wimasis.com/en/) शामिल हैं।

प्रस्तुत उदाहरण डेटा को इमेजजे प्लेटफॉर्म का उपयोग करके संसाधित और विश्लेषण किया गया था। संक्षेप में, सेल में विशिष्ट क्षेत्र, जैसे हाइफाल टिप शीर्ष या सेप्टा, बड़े आकार के क्षेत्र चयन उपकरणों के साथ चिह्नित किए जाते हैं, और सभी निहित पिक्सेल की तीव्रता को "मापने वाले उपकरण" सॉफ्टवेयर के साथ रीडआउट किया जाता है। नियंत्रण और प्रयोगात्मक नमूनों से तीव्रता डेटा एक स्प्रेडशीट फ़ाइल में स्थानांतरित किया जाता है, गणितीय विश्लेषण और ग्राफ के रूप में तैयार किया जाता है । अधिक जानकारी उद्धृत मूल प्रकाशनों में पाया जा सकता है ।

उदाहरण डेटा 1: एफएम 4-64 तेज परख
फंगल नमूनों की खेती कॉलोनियों (चरण 1.2) के रूप में की गई थी और उल्टे आगर ब्लॉक विधि (चरण 3.1) द्वारा घुड़सवार किया गया था। एफएम 4-64 की अंतिम एकाग्रता 1.67 माइक्रोन थी इमेजिंग सेटिंग्स: एचसीएक्स पीएल एपीओ 63x/1.3 एनए ग्लिसरॉल विसर्जन उद्देश्य पर एक उल्टे कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप (सामग्री की तालिकादेखें); एफएम 4-64 488 एनएम पर उत्तेजना और 600-700 एनएम पर उत्सर्जन; 150 मिनट तक के लिए हर मिनट एक फ्रेम एफएम 4-64 तेज परखजीन हटाने में एंडोसाइटोसिस के स्थानिक-लौकिक संगठन में दोषों की पहचान की और जीन टी atroviride9 (चित्रा 5)के कवक विशिष्ट Sur7-परिवार प्रोटीन 2 (Sfp2) के म्यूटेंट overexpressing ।

उदाहरण डेटा 2: एफएम 4-64 सह फ्लोरोसेंट संलयन प्रोटीन के धुंधला एंडोसाइटिक डिब्बों के लिए लक्षित
फंगल नमूनों की खेती कॉलोनियों (चरण 1.2) के रूप में की गई थी और उल्टे आगर ब्लॉक विधि (चरण 3.1) द्वारा घुड़सवार किया गया था। एफएम 4-64 की अंतिम एकाग्रता 2 μM. इमेजिंग सेटिंग्स: CFI योजना एपीओ कुलपति 60x/1.2 एनए XC पानी विसर्जन उद्देश्य एक उल्टे confocal लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप पर था (सामग्री की मेजदेखें); जीएफपी 500-530 एनएम पर 488 एनएम और उत्सर्जन, एफएम 4-64 पर उत्तेजना और 600-700 एनएम पर उत्सर्जन, और संचारित प्रकाश डिटेक्टर के साथ उज्ज्वल क्षेत्र, सभी एक साथ; 15 मिन तक के लिए हर 15 एस एक फ्रेम। FM4-64 सह-धुंधला को दो बढ़े हुए हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (ईजीएफपी) के उपकोशिकीय वितरण से संबंधित करने के लिए नियोजित किया गया था- टैग ट्रांसमेब्रेन्म प्रोटीन एसएफपी 2 और जीपीआर1 टी एट्रोविराइड (चित्रा 6, मूवी 3, मूवी 4)में एंडोसाइटिक मार्ग पर।

उदाहरण डेटा 3: एफएम 4-64 सह रूपात्मक मतभेदों की पहचान के लिए धुंधला
फंगल नमूनों की खेती कॉलोनियों (चरण 1.2) के रूप में की गई थी और उल्टे आगर ब्लॉक विधि (चरण 3.1) द्वारा घुड़सवार किया गया था। एफएम 4-64 की अंतिम एकाग्रता 2 μM. इमेजिंग सेटिंग्स: योजना Apochromat 63x/1.4 एनए तेल विसर्जन उद्देश्य एक उल्टे confocal लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप पर था (सामग्री की मेजदेखें); जीएफपी 505-550 एनएम पर 488 एनएम और उत्सर्जन, एफएम 4-62 उत्तेजना पर 488 एनएम और 574-691 एनएम पर उत्सर्जन, और संचारित प्रकाश डिटेक्टर के साथ उज्ज्वल क्षेत्र, सभी एक साथ; 15 मिन तक के लिए हर 8.5 एस एक फ्रेम। FM4-64 सह धुंधला करने के लिए फ्लोरोसेंटी लेबल BUD-6 polarisome जटिल प्रोटीन के उपसेलुलर स्थानीयकरण गतिशीलता से संबंधित करने की अनुमति दी अंतःक्रियापर निर्भर प्रक्रियाओं, जैसे सेप्टा और ध्रुवीकृत हाइफाल टिप विकास के गठन के रूप में, और उपकोशिकी संगठन और जंगली प्रकार और एन क्रेसा(चित्रा 7मूवी, मूवी 5)के उत्परिवर्ती उपभेदों के बीच सम्मोहन वास्तुकला में मतभेदों की विशेषता ।

उदाहरण डेटा 4: सेल वॉल धुंधला रूपोजेनेटिक मतभेदों का पता चलता है
फंगल नमूनों की खेती कॉलोनियों (चरण 1.2) के रूप में की गई थी और उल्टे आगर ब्लॉक विधि (चरण 3.1) द्वारा घुड़सवार किया गया था। 2 माइक्रोन सीएफडब्ल्यू, 20 माइक्रोन एसपीएफ और 100 माइक्रोन सीआर की अंतिम सांद्रता का उपयोग किया गया था। इमेजिंग सेटिंग्स: CFI योजना एपीओ कुलपति 60x/1.2 एनए एक्ससी पानी विसर्जन उद्देश्य एक उल्टे confocal लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप पर (सामग्री की मेजदेखें); सीएफडब्ल्यू और एसपीएफ 405 एनएम पर और 430-470 एनएम पर उत्सर्जन, 543 एनएम पर सीआर उत्तेजना और 580-620 एनएम पर उत्सर्जन। सेल वॉल पॉलिमर के साथ सीएफडब्ल्यू, एसपीएफ और सीआर के विभिन्न इंटरैक्शन गुणटी एट्रोविराइड9के उत्परिवर्ती और जंगली प्रकार के तनाव के बीच मॉर्फोजेनेटिक मतभेदों को उजागर करते हैं। ऊंचा रंग सांद्रता द्वारा दिए गए सेल दीवार तनाव में वृद्धि जंगली प्रकार की तुलना में उत्परिवर्ती में तेज और अधिक स्पष्ट होता है। इसके अलावा, एक ही छवियां दोनों उपभेदों(चित्रा 8)के बीच हाइफाल व्यास और सेप्टल दूरी के बारे में रूपोजेनेटिक मतभेदों को निर्धारित करने की अनुमति देती हैं।

उदाहरण डेटा 5: सेल वॉल बायोसिंथेसिस की वास्तविक समय निगरानी
8-अच्छी तरह से कक्षित माइक्रो-स्लाइड (चरण 3.2) में तरल संस्कृति (चरण 1.4) के रूप में अंकुरण की खेती की गई थी। अंतिम CFW एकाग्रता 0.12 μM. इमेजिंग सेटिंग्स: CFI योजना एपीओ कुलपति 60x/1.2 एनए XC पानी विसर्जन उद्देश्य एक उल्टे confocal लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप पर था; 420-470 एनएम पर 405 एनएम और उत्सर्जन पर CFW उत्तेजना; 35 मिन तक के लिए हर 20 एस एक फ्रेम। बहुत कम CFW एकाग्रता रंग अणुओं के साथ सेल की दीवार के संतृप्ति को रोकता है और सेल वॉल बायोसिंथेसिस की मात्रात्मक वास्तविक समय निगरानी की अनुमति देता है। इससे पता चलता है कि नई सेल दीवार सामग्री का जमाव एक समान नहीं है, लेकिन एन क्रैसा(चित्रा 9, मूवी 6)में अंकुरण संलयन से पहले सेल-सेल लगाव पर एक कोशिका के सापेक्ष विस्थापन के परिणामस्वरूप स्थानीयकृत शारीरिक तनावों का बहुत तेजी से जवाब देता है।

Figure 1
चित्रा 1: एफएम रंगों के जैव रासायनिक और जैव भौतिक गुण। }एफएम 1-43/सिनैप्टोग्रीन C4 और एफएम 4-64/SynaptoRed C2 की रासायनिक संरचनाएं । (ख)एफएम रंगों के अवशोषण और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा, फिलामेंटरकवक कवक में झिल्ली से बंधे रंगों के लिए इष्टतम इमेजिंग सेटिंग्स के साथ मढ़ा: 445-495 एनएम नीली रोशनी 100-80% दक्षता के साथ एफएम 1-43 उत्तेजित होगा, जबकि एक Argon लेजर के ४८८ एनएम ९१% दक्षता के साथ dye उत्तेजित होगा । झिल्ली बाध्यकारी (*) पर नीले बदलाव के कारण, एफएम 1-43 उत्सर्जन की इष्टतम पहचान रेंज 520-590 एनएम के बीच है। इसी तरह, कवक में एफएम 4-64 के लिए इष्टतम इमेजिंग सेटिंग्स 471-541 एनएम (100-80% दक्षता) हैं जब एक आर्गन लेजर का उपयोग करते समय पॉलीक्रोमेटिक उत्तेजना प्रकाश स्रोत या 514 एनएम (99% दक्षता) का उपयोग करते समय, और उत्सर्जन प्रकाश का पता लगाने के लिए 650-750 एनएम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: एफएम 1-43 और एफएम 4-64 की एक साथ सह इमेजिंग । दोनों रंगों का एक समतुल्य मिश्रण एन क्रैसा की एक तरल अंकुरण संस्कृति में जोड़ा गया था जो 10 माइक्रोन की अंतिम एकाग्रता पैदा करता था। रंग के अलावा के बाद 25 मिन में, एफएम 1-43 प्लाज्मा झिल्ली दाग दिया है और पहले से ही आंतरिक झिल्ली में जमा, जिसमें दृढ़ता से दाग ित माइटोकॉन्ड्रिया (एम) शामिल हैं, लेकिन मोटे तौर पर वैक्यूलर झिल्ली (v) को छोड़कर, और एफएम 4-64 (औसत फ्लोरेसेंस तीव्रता क्रमशः, 176 से 21) की तुलना में आठ गुना से अधिक मजबूत है), जिसका कम हाइड्रोफोबिसिटी/उच्च हाइड्रोफिलसिटी प्लाज्मा झिल्ली में लंबे समय तक निवास करने के लिए अग्रणी अपनी आंतरिककरण दर को धीमा कर देता है। स्केल बार = 10 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: सेल वॉल तनाव-टिप शीर्ष पर सेल वॉल बहुलक के बयान प्रेरित अक्सर सेल ऑटोलिसिस जरूरत पर जोर देता है । टी atroviride के Hyphae साइटोप्लाज्मिक GFP व्यक्त 10 μM Solophenyl Flavine 7GFE ५०० (एसपीएफ) के साथ दाग रहे थे और बढ़ते पर तुरंत छवि । गैर-तनावग्रस्त हाइफे (क), शीर्ष पर थोड़ा बढ़ा ग्लूकन/चिटिन बयान के साथ हाइफे पर बल दिया और ऑटोलाइसिस (बी) की प्रगति, और स्पष्ट एपिकल ग्लूकन/चिटिन कैप (तारांकन) और टर्मिनल ऑटोलाइसिस (सी) के साथ भारी तनावग्रस्त हाइफे एफएफपी फ्लोरेसेंस और व्यापक vacuolization के कुल नुकसान से स्पष्ट है । स्केल बार = 10 माइक्रोन। पूर्णकालिक पाठ्यक्रम अनुक्रम के लिए मूवी 1 देखें । ध्यान दें कि तीनों हाइफे वास्तव में एक दूसरे के बगल में स्थित थे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: सेल वॉल चयनात्मक रंगों के जैव रासायनिक और जैव भौतिक गुण। दी गई रासायनिक विशेषताएं प्रत्येक रंग के सोडियम लवण के हैं। अवशोषण और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा सेलुलर वातावरण में उन लोगों के अनुरूप है। इंगित मोनोक्रोमेटिक लेजर उत्तेजना लाइनें (रंग में लिखी गई), एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के लिए लागू पॉलीक्रोमेटिक उत्तेजना पर्वतमाला, और उत्सर्जन प्रकाश का पता लगाने वाली श्रेणियां तंतु कवक में इमेजिंग के लिए अनुशंसित हैं। दो लेजर उत्तेजना लाइनों संकेत दिया जाता है जब दोनों समान रूप से अच्छी तरह से काम करते हैं । (*) सेल वॉल-बाउंड पीएफएस का उत्सर्जन स्पेक्ट्रम पहले से विख्यात३३की तुलना में काफी अधिक लाल-स्थानांतरित हो गया है, हालांकि, जिसके परिणामस्वरूप पहले की तुलना में कम रंग सांद्रता के साथ बहुत अच्छा एस/एन-अनुपात है । सीआर का पूरा स्पेक्ट्रम वर्तमान में अनुपलब्ध है, इसलिए नील लाल (कैस नंबर: 7385-67-3) को निकटतम मैच के रूप में दिखाया गया है । सीआर के स्पेक्ट्रल गुणों के बारे में विस्तृत जानकारी कहीं और42पाई जा सकती है . कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: FM4-64 के एंडोसाइटिक तेज पर Sfp2 का प्रभाव । एफएम रंगे तेज के लगातार तीन प्रमुख चरण जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) में आसानी से प्रत्यक्ष होते हैं। स्टेज I: अनन्य प्लाज्मा झिल्ली धुंधला, चरण द्वितीय: एंडोसाइटिक वेसिकल्स में एफएम डी की पहली उपस्थिति, और चरण III: एंडोसाइटिक वेसिकल्स और एंडोम्मेम्ब्रेन ्स का अनन्य धुंधला। समकक्ष धुंधला पैटर्न उनकी उपस्थिति के शुरुआती समय बिंदु पर दिखाए जाते हैं। टी एट्रोविराइड जंगली प्रकार की तुलना में, एफएफपी 2 ओवर-एक्सप्रेसिंग म्यूटेंट (ओईएसएफपी2)में एंडोसाइटोसिस थोड़ा त्वरित होता है, जबकि sfp2 हटाने वाले उत्परिवर्ती (Τsfp2)में साडाई तेज नाटकीय रूप से देरी होती है। उदाहरण के लिए, प्लाज्मा झिल्ली में रंग का तेज ओईएसएफपी 2 में तुरंत होता है लेकिन जंगली प्रकार में 2 मिन लेता है; और प्लाज्मा झिल्ली से एफएम डाबी का पूरा इंटरनलाइजेशन 10x तेजी से OEsfp2 में होता हैSfp2की तुलना में . स्केल बार = 5 μm। क्रिएटिव कॉमन्स लाइसेंस (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/) के साथ समझौतेमें एटानासोवा एट अल 9 से चित्रा पुन: पेश किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: एफएम 4-64 के साथ EGFP लेबल झिल्ली प्रोटीन का सह-धुंधला टी atrovirideमें अलग उपकोशिकीस्थानीय गतिशीलता के भेदभाव की सुविधा । (A)चार-ट्रांसमेब्रेनियर डोमेन प्रोटीन एसएफपी2 एफएम 4-64 लेबल ऑर्गेनेल्स के साथ सह-स्थानीयता करता है, जिसमें प्लाज्मा झिल्ली और सेप्टा, स्पिटजेनकोपर (एसपीके; तीर) और संभवतः ट्यूबलर वैक्यूल्स शामिल हैं । (ख)जीपीसीआर की तरह सात ट्रांसमेब्रेनप्रोटीन जीपीआर1 ने एसएफपी 2 के समान ऑर्गेनेल्स को एफएफ4-64 के साथ सह-स्थानीयकृत किया। पूर्णकालिक पाठ्यक्रम दृश्यों के लिए मूवी 3 और मूवी 4 देखें । क्रिएटिव कॉमन्स लाइसेंस के साथ समझौते में एटानासोवा एट अल9 से इस आंकड़े को संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7: एफएम 4-64 धुंधला अंतरजंगली प्रकार से 6 उत्परिवर्ती, और सेप्टल रिंग में BUD-6 स्थानीयकरण । (क)एफएम 4-64 एन crassa जंगली प्रकार के हाइफे का धुंधला (तीर सेप्टा का संकेत देते हैं; तीर सिर Spk का संकेत देते हैं) । (ख)सेप्टा और पीकेकली-6में अनुपस्थित हैं । स्केल बार, 50 माइक्रोन (सी और डी)जंगली प्रकार (सी) और 'कली-6 (डी) के हाइफाल शीर्ष और उपशीर्ष के क्लोज-अप। Spk (arrowhead) जंगली प्रकार में अंतर लेकिन नहीं ,कली-6। कोष्ठकसेसंकेत मिलता है कि परमाणु अपवर्जन क्षेत्र की स्थापना नहीं की गई है । स्केल बार = 5 μm.(ई)BUD-6-GFP भर्ती प्लाज्मा झिल्ली इनवेजाइनेशन (तीरसिर) से पहले प्रारंभिक सेप्टेशन साइट के लिए और सेप्टल कसना के साथ । स्केल बार = 5 μm। पूरा समय पाठ्यक्रम दृश्यों के लिए फिल्म 5a और फिल्म 5b देखें । क्रिएटिव कॉमन्स लाइसेंस के साथ समझौते में लिचियस एट अल.16 से संशोधनों के साथ चित्रा पुन: पेश किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 8
चित्रा 8: एसएफपी 2 का विलोपन सेल वॉल सामग्री के जमाव पैटर्न को बदलता है और टी एट्रोवीराइड के हाइफाल मॉर्फोजेनेसिस को प्रभावित करता है। (ए)CFW और एसपीएफ धुंधला जंगली प्रकार (wt) की तुलना मेंSfp2 (तीर) में वृद्धि हुई सेल दीवार बयान से पता चलता है । सीआर धुंधला केवलsfp2 (arrowheads) में व्यापक टिप सूजन लाती है। स्केल बार = 10 माइक्रोन.(बी)एसएफपी 2 में मॉर्फोजेनेटिक दोषों में काफी कम सेप्टल दूरियां (26.0 माइक्रोन, जंगली प्रकार = 85 माइक्रोन; एन = 60; ANOVA Pr & 2−16) और छोटे हाइफाल व्यास (,sfp2 = 5.6 μm, जंगली प्रकार = 12.6 μm; n = 100; ANOVA Pr < 2−16) । (ग)उपशीर्ष की तुलना में टिप शीर्ष में बढ़ी हुई डाया फ्लोरेसेंस में वृद्धि हुई है । स्केल बार = 5 μm.(डी)तीव्रता-कोडित 3 डी सतह साजिश (सी) । (ई)स्एफपी 2 और जंगली प्रकार (एन = 55) में सापेक्ष फ्लोरेसेंस तीव्रता का परिमाणीकरण। क्रिएटिव कॉमन्स लाइसेंस के साथ समझौतेमें एटानासोवा एट अल 9 से चित्रा को पुन: पेश किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 9
चित्रा 9: सेल वॉल बायोसिंथेसिस की रियल टाइम मॉनिटरिंग। (A) एन क्रेसाके अंकुरण के बीच कोनिडायल एनास्टोमोसिस ट्यूब (कैट) फ्यूजन । अंकुरित टॉर्क प्रतिक्रिया (21-28 वर्ष) द्वारा शारीरिक संपर्क स्पष्ट हो जाता है। तीव्रता रंग-कोडित CFW फ्लोरेसेंस थोड़ा (गहरा नीला) और तीव्र (पीला) सेल दीवार बयान वाले क्षेत्रों को इंगित करता है। शुरू में अनदाग होमिंग टिप (तीरसिर), टिप संपर्क पर नई सेल दीवार सामग्री जमा करता है और सबसे बड़ा शारीरिक तनाव (तीर) का अनुभव करने वाले क्षेत्र में। स्केल बार = 5 माइक्रोन। पूर्णकालिक पाठ्यक्रम अनुक्रम के लिए मूवी 6 देखें । अनुमति के साथ38 से पुन: पेश किया गया चित्रा। (ख)चार परिपत्र क्षेत्रों का संकेत है जिसमें फ्लोरेसेंस तीव्रता को मापा गया था । स्केल बार = 5 माइक्रोन। (ग)संकेतित क्षेत्रों की साजिश शारीरिक तनाव (कैट 1, तीर) के जवाब में स्थानीयकृत सेल वॉल बायोसिंथेसिस में तेजी से वृद्धि दिखा रही है। रोगाणु ट्यूब (जीटी) और बीजाणु शरीर (कोनिडियम) में सेल वॉल बायोसिंथेसिस लगातार बढ़ता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Movie 1
फिल्म 1: उप प्रेरित सेल दीवार तनाव । 10 माइक्रोन एसपीएफ (सियान) को साइटोप्लाज्मिक जीएफपी (मजेंटा) व्यक्त करते हुए टी एट्रोविराइड हाइफे में जोड़ा गया था। व्यापक टिप धुंधला तुरंत होता है, 2 मिनट के भीतर हाइफाल डिब्बों के तेजी से lysis के बाद; जीएफपी फ्लोरेसेंस के गायब होने से स्पष्ट। कृपया इस फिल्म को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

Movie 2
फिल्म 2: महत्वपूर्ण एसपीएफ धुंधला । 2 μM एसपीएफ (सियान) टिप शीर्ष पर सेल दीवार तनाव कलाकृतियों को प्रेरित किए बिना उच्च स्थानिक और लौकिक संकल्प के साथ टी एट्रोविराइड हाइफे के टिप विकास को ट्रैक करने की अनुमति देता है। कृपया इस फिल्म को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

Movie 3
मूवी 3: एफएम 4-64 सह Sfp2-GFP के धुंधला । 1.67 माइक्रोएम एफएम 4-64 (लाल) के साथ Sfp2-mEGFP (ग्रीन) व्यक्त करने वाले टी एट्रोविराइड का सह-धुंधला करने से एंडोसाइटिक मार्ग के साथ झिल्ली प्रोटीन के ओवरलैपिंग और अलग स्थानीयकरण का पता चलता है। कृपया इस फिल्म को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

Movie 4
फिल्म 4: एफएम 4-64 सह Gpr1-GFP के धुंधला । 1.67 माइक्रोएम एफएम 4-64 (लाल) के साथ Gpr1-mEGFP (ग्रीन) व्यक्त टी atroviride के सह धुंधला एंडोसाइटिक मार्ग के साथ झिल्ली प्रोटीन के अतिव्यापी और अलग स्थानीयकरण प्रकट करते हैं। कृपया इस फिल्म को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

Movie 5
मूवी 5: एफएम 4-64 सह कली-6-GFP के धुंधला । (5a)एन क्रैसा व्यक्त करने वाले एन क्रेसा का सह-धुंधला 2 माइक्रोएम एफएम 4-64 (लाल) के साथ 2 माइक्रोन एफएम 4-64 (लाल) के साथ कली-6 गतिशीलता की ट्रैकिंग की अनुमति देता है। (5b)फसली और विलय छवि (5a) । कृपया मूवी 5a डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें
मूवी 5b डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

Movie 6
मूवी 6: सेल वॉल बायोसिंथेसिस की रियल टाइम मॉनिटरिंग। एन क्रैसा अंकुरण एमएके-1-जीएफपी (ग्रीन) को व्यक्त करने के लिए कैट-मध्यस्थित अंकुरण संलयन के दौरान स्थानीय सेल वॉल बायोजेनेसिस को प्रकट करने के लिए 0.12 माइक्रोएम सीएफडब्ल्यू (ब्लू) के साथ सह-दाग दिया गया था। ध्यान दें कि जीएफपी चैनलों में CFW सिग्नल के माध्यम से कुछ खून बह रहा है, यह दर्शाते हुए कि एसपीएफ या सीआर क्रमशः जीएफपी के लिए अनुक्रमिक और एक साथ सह-इमेजिंग रंगों के रूप में बेहतर विकल्प हैं। कृपया इस फिल्म को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

तालिका 1: झिल्ली और कोशिका दीवार चुनिंदा फ्लोरोसेंट रंगों के गुण। *= कम शुद्धता/रंगसामग्री के लिए ठीक किए गए एमजी/एमएल मूल्यों को सभी समाधानों में समानता का परिणाम है; n.i.a. = कोई जानकारी उपलब्ध नहीं है। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

यह लेख जमीन तोड़ने का काम जारी है कि 2000 के दशककेशुरू में फिलामेंटल कवक के लिए महत्वपूर्ण ऑर्गेनेल मार्कर के रूप में विभिन्न फ्लोरोसेंट रंगों के उपयोग की स्थापना2,4,43,और एफएम रंगों और चयनित सेल दीवार रंगों के फोटोभौतिक और सेल जैविक गुणों पर चर्चा करने का प्रयास पहले की तुलना में अधिक विस्तार से। विशेष रूप से अवांछित सेलुलर प्रभावों के संबंध में, जैसे झिल्ली संतृप्ति या सेल दीवार क्षति, जो कुछ रंग सांद्रता से ऊपर होती हैं। क्या पहले सेलुलर स्तर पर गैर विषाक्त माना जाता है अब आणविक स्तर पर विषाक्त माना जाता है । हालांकि ये प्रभाव बहुत सूक्ष्म हो सकते हैं और ऑर्गेनेल या सेल व्यवहार में स्पष्ट परिवर्तनों से सीधे स्पष्ट नहीं हो सकते हैं, लेकिन दृश्य के अलावा अन्य रंग के आवेदन के किसी भी संभावित हस्तक्षेप को देशी आणविक कार्य की जांच के लिए कम किया जाना चाहिए। सौभाग्य से, सिलिकॉन हिमस्खलन फोटोडायोड डिटेक्टरों (एसआई-एपीडी)44 या एयरिकस्कैन क्षेत्र डिटेक्टर45जैसे आधुनिक डिटेक्टरों की बेहतर संवेदनशीलता और क्वांटम दक्षता, पहले की तुलना में कम रंग की मात्रा के उपयोग को सुविधाजनक बनाता है। लेख का एक अन्य प्रमुख उद्देश्य अन्य फ्लोरोफोरस के साथ इन रंगों के सह-इमेजिंग गुणों का उदाहरण देना है, सबसे महत्वपूर्ण बात यह है कि जीव विज्ञान में सबसे अधिक बार उपयोग किए जाने वाले फ्लोरोसेंट प्रोटीन के रूप में जीएफपी के लोग। यह इमेजिंग प्रयोगों के डिजाइन में सहायता करना चाहिए जिसका उद्देश्य फ्लोरोसेंट फ्यूजन प्रोटीन की उप-सेलुलर स्थानीयकरण गतिशीलता को फंगल सेल दीवार, प्लाज्मा झिल्ली या एंडो-एंड एक्सोसाइटोसिस मार्ग आदि के लिए सहसंबंधित करना है।

प्राकृतिक और तनाव मुक्त स्थितियों के तहत इमेजिंग विश्वसनीय डेटा के अधिग्रहण के लिए महत्वपूर्ण है। संस्कृति माध्यम और नमूना तैयारी के बारे में कुछ व्यावहारिक विचार इष्टतम शर्तों है कि कलाकृतियों मुक्त, स्वस्थ, उच्चतम एस/एन अनुपात के साथ तनावग्रस्त कोशिकाओं के लंबे समय अवलोकन किसी भी दिए गए नमूने के लिए संभव खोजने के लिए एक प्रारंभिक बिंदु प्रदान करने का लक्ष्य है । विश्वसनीय और सार्थक इमेजिंग परिणाम प्राप्त करने का कोई सार्वभौमिक तरीका नहीं है। यह दृष्टिकोण के लिए अंतर्निहित है कि नमूना, व्यक्तिपरकता और माइक्रोस्कोपिस्ट की अपेक्षाओं की जैविक भिन्नता, साथ ही छवि पोस्ट प्रसंस्करण का क्रमशः डेटा अधिग्रहण और व्याख्या पर महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है। इसलिए, माइक्रोस्कोपिस्ट का व्यावहारिक अनुभव, जांच के तहत कवक के सेल जीव विज्ञान के बारे में उसका अंतरंग ज्ञान, साथ ही लैब सेटिंग में यथासंभव प्राकृतिक और अबाधित के रूप में स्थितियां बनाने के लिए कुशल नमूना तैयारी, इमेजिंग डेटा प्राप्त करने और मूल्यांकन करने के लिए सर्वोपरि है जो सच्चाई से अध्ययन की गई सेलुलर घटनाओं को दर्शाता है । अंगूठे के नियम के रूप में, फ्लोरोसेंट रंगों के अवांछित दुष्प्रभावों की घटना, सूक्ष्म से लेकर और इस प्रकार स्पष्ट रूप से प्लाज्मा झिल्ली या सेल दीवार की स्पष्ट रूप से दिखाई सक्रियता नहीं है, कोशिका ऑटोलिसिस के सरल साइटोटॉक्सिक प्रेरण के लिए तनाव प्रतिक्रिया रास्ते को फिर से मॉडलिंग करते हैं, केवल कम रंग की सांद्रता लागू करके सुरक्षित रूप से रोका जा सकता है ।

फ्लोरोसेंट रंगों का आवेदन सरल है, फिर भी उनकी विशिष्टताओं की खराब विशेषता है। फ्लोरोसेंट रंगों का उपयोग करने की एक प्रमुख ताकत प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल की तैयारी सादगी है। कवक की खेती और नमूना, रंग (एस) के अलावा, और माइक्रोस्कोप चरण पर बढ़ते (अभ्यास के साथ) सीधा हैं। मूल इमेजिंग सेटिंग्स का समायोजन, जिसमें उत्तेजना और उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य, एक्सपोजर टाइम, टाइम कोर्स सेटिंग्स आदि शामिल हैं, कोशिकाओं के अंदर इस्तेमाल किए गए फ्लोरोसेंट रंगों के माइक्रोस्कोप और जैविक नियमों के सरल बायोफिजिकल नियमों का पालन करते हैं। तालिका 1 प्रयोग के लिए सबसे उपयुक्त रंग या रंग संयोजन की पहचान का समर्थन करना चाहती है। इसके अलावा, फ्लोरोसेंट रंगों की उचित कीमत होती है, जो भरोसेमंद उच्च गुणवत्ता के साथ आसानी से उपलब्ध होती है और इस प्रकार अत्यधिक प्रजनन योग्य अनुप्रयोग सुनिश्चित करती है।

झिल्ली या सेल दीवार चयनात्मक फ्लोरोसेंट रंगों का उपयोग करने के दो प्रमुख प्रतिबंध उनके सटीक धुंधला गुणों का (अक्सर) सीमित ज्ञान हैं, जो ज्यादातर मामलों में ऑर्गेनेल और आणविक स्तर पर गैर-विशिष्ट हैं, और उनकी एकाग्रता-निर्भर अवांछित दुष्प्रभाव हैं। एफएम रंग इंडो-और एक्सोसाइटोसिस में भाग लेने वाले लिपिड बाइलेयर के लिए विशिष्ट हैं। हालांकि, ठीक है जो उपकोशिकीय ऑर्गेनेल्स परीक्षण शर्तों के तहत क्रमिक रूप से लेबल हो जाते हैं, तुरंत स्पष्ट नहीं है और इसके लिए विभिन्न एफएम डी वेरिएंट की तुलना और अतिरिक्त ऑर्गेनेल-विशिष्ट मार्कर के साथ सह-लेबलिंग की आवश्यकता होती है। एफएम 4-64 की तुलना में माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली के लिए एफएम 1-43 की वरीयता एक उदाहरण है। सेल वॉल चयनात्मक रंग कवक सेल दीवार के तीन प्रमुख बहुलकों के लिए अलग-अलग विशिष्टता प्रदर्शित करते हैं। CFW को ग्लूकान और चिटिन के लिए एक गैर-विशिष्ट दाग माना जाता है, एसपीएफ को 1,4-ग्लूकान के लिए सबसे चयनात्मक माना जाता है, और सीआर को α-और-chitins के लिए अत्यधिक चयनात्मक माना जाता है। कवक सेल दीवार पॉलीसैकराइड ्समें पीएफएस की बाध्यकारी विशिष्टता के बारे में जानकारी वर्तमान में उपलब्ध नहीं है। जांच के तहत कवक प्रजातियों में दिए गए रंग की एकाग्रता पर किस अनुपात में कवक कोशिका दीवार बहुलक को सबसे प्रभावी ढंग से लेबल किया जाता है, आसानी से उत्तर नहीं दिया जाता है, और अन्य जीवों या अन्य फंगल प्रजातियों में विट्रो या वीवो में प्राप्त विस्तृत मापके आवेदन पर बहुत सावधानी पूर्वक विचार किया जाना चाहिए। दुर्भाग्य से, यह जानकारी35,42,46साहित्य में विरल और अत्यधिक बिखरी हुई है। अधिक हाल के रिकॉर्ड है कि पिछले अध्ययन ों पर पालन करेंगे३३ विशेष रूप से कवक में विशेष रुप से प्रदर्शित रंगों के सटीक धुंधला गुणों में नई अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए वर्तमान में उपलब्ध नहीं हैं ।

धुंधला पैटर्न और सेलुलर प्रतिक्रियाओं का सही मूल्यांकन करने के लिए इमेजिंग नियंत्रण आवश्यक हैं। शायद सबसे चुनौतीपूर्ण हिस्सा है, हालांकि, कवक के सेल जीव विज्ञान को इतनी अच्छी तरह से जानना है कि झिल्ली और सेल दीवार चयनात्मक फ्लोरोसेंट रंगों के उपकोशिकीय स्थानीयकरण में दर्ज परिवर्तन, सेलुलर वास्तुकला या हाइफाल विकास पैटर्न में परिवर्तन विशेष रूप से और आत्मविश्वास से प्रायोगिक उपचार के अभीष्ट प्रभावों से संबंधित हो सकते हैं। इसके लिए, किसी भी नए लाइव-सेल इमेजिंग प्रयोग के साथ अच्छे नियंत्रण होना महत्वपूर्ण है। इनमें अधिग्रहीत छवि से पृष्ठभूमि ऑटोफ्लोरेसेंस और डिटेक्टर शोर को बाहर करने के लिए नकारात्मक इमेजिंग नियंत्रण के रूप में अनुपचारित जंगली प्रकार शामिल हैं, और म्यूटेंट के साथ काम करते समय एक रूपात्मक तुलनात्मक होना शामिल है। इसके अलावा, एक सकारात्मक इमेजिंग नियंत्रण, उदाहरण के लिए एक तनाव जो साइटोप्लाज्म या किसी अन्य प्रसिद्ध फ्लोरोसेंट मार्कर प्रोटीन में जीएफपी या आरएफपी को व्यक्त करता है, आवश्यक न्यूनतम उत्तेजना प्रकाश तीव्रता को सेट करने और सेल जीवन शक्ति नियंत्रण रखने के लिए आवश्यक है। एक बार जब ये नियंत्रण सेट हो जाते हैं, तो फ्लोरोसेंट रंगों का उपयोग केवल दृश्य कार्यों तक ही सीमित नहीं है, बल्कि उनकी एकाग्रता पर निर्भर धुंधला गतिशीलता, साथ ही एकाग्रता पर निर्भर दुष्प्रभावों का विश्लेषण किया जा सकता है; उदाहरण के लिए, वास्तविक समय में सेल वॉल बायोसिंथेसिस की मात्रात्मक निगरानी के लिए या संवेदनशीलता परख47में उत्परिवर्ती-विशिष्ट फेनोटाइप की पहचान के लिए।

बेहतर भविष्य के अनुप्रयोग ों रंग धुंधला गुणों के एक विस्तृत कार्यात्मक विश्लेषण पर निर्भर करते हैं । एक प्रमुख सतत चुनौती क्वांतिटेटिव इमेज विश्लेषणों को और बेहतर बनाना और स्वचालित करना है ताकि तंतु कवक में झिल्ली और सेल वॉल चयनात्मक फ्लोरोसेंट रंगों की उप-सेलुलर गतिशीलता के कार्यात्मक मूल्यांकन को आगे बढ़ाया जा सके। इसके लिए, विशेष परिवहन मार्गों में कमी वाले उत्परिवर्ती उपभेदों के संयोजन में ज्ञात ऑर्गेनेल और सेल वॉल बहुलक मार्कर के साथ इन रंगों के व्यापक, मात्रात्मक सह-स्थानीयकरण अध्ययनों की आवश्यकता होती है या जिनमें विशिष्ट संरचनात्मक घटकों की कमी होती है। एफएम रंगों के साथ तुलनात्मक विश्लेषण के लिए कई एंडोसाइटोसिस मार्कर48,49उपलब्ध हैं, और कवक में सेल वॉल रंगों की अभी भी खराब विशेषता बाध्यकारी विशिष्टताओं के संबंध में, फ्लोरोसेंट-लेबल ग्लूकन-विशिष्ट एंटीबॉडी50 का अनुप्रयोग इस मुद्दे को हल करने की संभावना प्रदान कर सकता है।

Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों और कुछ भी नहीं खुलासा किया है ।

Acknowledgments

धन्यवाद अल को अनुदान #256524 प्रदान करने के लिए टायरोलियन विज्ञान कोष (टीडब्ल्यूएफ) के कारण, वियना विज्ञान और प्रौद्योगिकी कोष (WWTF) को एसजेड को अनुदान #LS13-086 प्रदान करने के लिए, और ओपन एक्सेस प्रकाशन का समर्थन करने के लिए इंसब्रुक विश्वविद्यालय के प्रकाशन कोष के लिए है। लेखक ों ने लीका टीसीएस एसपी5 द्वितीय कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप प्रदान करने के लिए इंसब्रुक विश्वविद्यालय के जूलॉजी विभाग को भी धन्यवाद दिया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BRAND cell counting chamber Merck BR718005 Thoma format
Calcofluor White M2R Merck/Sigma-Aldrich F3543 cell wall dye
CFI Plan Apo VC 60x/1.2 NA XC WI Nikon MRD07602 water immersion objective
CFI Plan Apo VC 60x/1.2 NA XC WI Nikon MRD07602 water immersion objective
Congo Red Merck/Sigma-Aldrich C6277 cell wall dye
Dimethyl sulfoxide VWR 8,36,73,230 organic solvent
Eclipse TE2000-E with C1 scanning unit Nikon custom configuration inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 2 and 4
Eclipse TE2000-U with Bio-Rad Radiance 2100 scannig unit Nikon custom configuration inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 5
FM 1-43 Merck/Sigma-Aldrich S6814 membrane dye
FM 4-64 Merck/Sigma-Aldrich S6689 membrane dye
Glass beads Rettberg 1340691030 3 mm glass beads
Glass cover slips Thermo Fisher Scientific BB02400600A113MNT0 24 x 60 # 1 glass cover slips
HCX PL APO 63x/1.3 NA Glyc Leica 15506353 glycerol immersion objective
LSM 510 Meta Zeiss custom configuration inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 3
M9 Minimal Medium Merck/Sigma-Aldrich M6030 generic fungal growth medium
Micro-slide 8-well ibidi 80826 ibiTreat #1.5 polymer coverslip
Miracloth Merck/Millipore 475855-1R polyester filtration material
Petri dish Sarstedt 8,21,472 92 x 16 mm culture dish w/o cams
Phytagel Merck/Sigma-Aldrich P8169 transparent gelling agent
Plan Apochromat 63x/1.4 NA Oil DIC Zeiss 440762-9904-000 oil immersion objective
Pontamine Fast Scarlet 4B Merck/Sigma-Aldrich 212490 cell wall dye
Potato Dextrose Agar (PDA) BD Difco 213400 fungal growth medium for T. atroviride
Potato Dextrose Broth (PDB) BD Difco 254920 fungal growth medium for T. atroviride
Reaction tube Sarstedt 72,706 1.5 mL SafeSeal tube
Scalpel B.Braun 5518016 Cutfix sterile scalpel #23
Screw cap tube Sarstedt 6,25,54,502 15 mL polypropylene tube
Solophenyl Flavine 7GFE 500 CIBA 1485385V6 cell wall dye
SynaptoGreen C4 Biotum 70020 membrane dye
SynaptoRed C2 Biotum 70021 membrane dye
Syringe membrane filter Thermo Fisher Scientific 723-9945 0.45 µm SFCA syringe filter
TCS SP5 II Leica custom configuration inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 1
Vogel's Minimal Medium (VMM) FGSC Fungal Genetics Stock Centre fungal growth medium for N. crassa

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Lichius, A., Zeilinger, S. Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi. J. Vis. Exp. (153), e60613, doi:10.3791/60613 (2019).

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