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Biology

Anwendung von Membran- und Zellwandselektiven Fluoreszenzfarbstoffen für die Live-Zell-Bildgebung von filamentösen Pilzen

Published: November 28, 2019 doi: 10.3791/60613
Automatic Translation
1, 1
1Department of Microbiology, University of Innsbruck

Summary

Vitale Fluoreszenzfarbstoffe sind wesentliche Werkzeuge für livezellbildende Analysen in der modernen Pilzzellbiologie. Dieses Papier beschreibt die Anwendung etablierter und weniger bekannter Fluoreszenzfarbstoffe zur Verfolgung der Plasmamembrandynamik, Endo-/Exozytose und Zellwandmorphogenese in fadenförmigen Pilzen.

Abstract

Die Anwendung von Membran- und Zellwandselektiven Fluoreszenzfarbstoffen für livezellbildende Analysen der Organellendynamik in Pilzzellen begann vor zwei Jahrzehnten und trägt seitdem wesentlich zu unserem Verständnis des fadenförmigen Pilzes bei. Lebensstil. Dieses Papier bietet eine praktische Anleitung für die Verwendung der beiden Membranfarbstoffe FM 1-43 und FM 4-64 und die vier Zellwandflecken Calcofluor White M2R, Solophenyl Flavine 7GFE 500, Pontamine Fast Scarlet 48 und Congo Red. Der Schwerpunkt liegt auf ihrer niedrig dosierten Anwendung, um artefaktfreie Färbung, ihre Co-Imaging-Eigenschaften und ihre quantitative Bewertung zu ermitteln. Die vorgestellten Methoden gelten für alle fadenförmigen Pilzproben, die auf die beschriebene Weise hergestellt werden können. Die grundlegenden Färbeansätze können als Ausgangspunkte für Anpassungen an Arten dienen, die unterschiedliche Anbaubedingungen erfordern könnten. Erstens werden biophysikalische und biochemische Eigenschaften überprüft, da ihr Verständnis für die Verwendung dieser Farbstoffe als wirklich lebenswichtige fluoreszierende Flecken unerlässlich ist. Zweitens werden Schritt-für-Schritt-Protokolle vorgestellt, die die Vorbereitung verschiedener Pilzprobentypen für die fluoreszierende Livezellbildgebung detailliert beschreiben. Schließlich veranschaulichen Beispielexperimente verschiedene Ansätze: (1) Identifizieren von Defekten in der räumlich-zeitlichen Organisation der Endozytose bei genetischen Mutanten, (2) vergleichen die gemeinsame und ausgeprägte Kolokalisierung von GFP-markierten Zielproteinen im endozytischen Weg (3) morphogenetische Zellwanddefekte in einer genetischen Mutante identifizieren und (4) die Zellwandbiogenese in Echtzeit überwachen.

Introduction

Vor zwanzig Jahren wurde die Art und Weise, wie die Hyphalmorphogenese und die zugrunde liegende Molekularzellbiologie in fadenförmigen Pilzen visualisiert werden konnten, durch die Anwendung des membranselektiven fluoreszierenden Fei Mao Farbstoffs FM 4-641revolutioniert. Später wurde der Nutzen des Chitin-bindenden Farbstoffs Calcofluor White als vitaler fluoreszierender Marker der Pilzzellwanddynamik realisiert2. Seitdem sind sowohl Farbstoffe als auch Varianten davon zu einem inhärenten Bestandteil der livezellbildnenden Analysen der Organellendynamik bei Pilzen geworden und liefern nach wie vor beispiellose Einblicke in den fadenförmigen Pilzlebensstil. Dieses Papier beschreibt die Anwendung etablierter und weniger bekannter Fluoreszenzfarbstoffe zur Verfolgung der Plasmamembrandynamik, Endo- und Exozytose und Zellwandmorphogenese in fadenförmigen Pilzen. Endozytose-Tracking-Assays ermöglichen es, verschiedene zellbiologische Fragen im Zusammenhang mit der allgemeinen Studie der Endozytose zu behandeln3. Dazu werden die Lokalisierung, Geschwindigkeit und Abfolge von gebeizten Fächern nach FM-Farbstoffzugabe durch Zeitraffermikroskopie aufgezeichnet und quantitativ zwischen den getesteten Pilzstämmen4verglichen. Zellwandfarbstoffe abgrenzen die äußere Grenze der Zelle und ermöglichen die Verfolgung morphogenetischer Ereignisse, einschließlich polarisiertes Hypahypospitzenwachstum2, Hyphenverzweigung5, Hyphalfusion6,7 und Septumbildung8. Darüber hinaus erleichtern sie die Quantifizierung der lokalisierten Zellwandabscheidung und die Identifizierung von Defekten bei der Zellwandbiogenese9. Da detaillierte Kenntnisse der biochemischen und biophysikalischen Eigenschaften eines Fluoreszenzmarkers eine Grundvoraussetzung für seine erfolgreiche In-vivo-Anwendung sind, werden diese Eigenschaften zunächst für die sechs farbstoffe In-Vivo-Anwendungen zusammengefasst.

Membranselektive Farbstoffe
FM (Fei Mao) Styrylfarbstoffe sind kleine amphiphile Moleküle, die nicht durchgehen können, aber reversibel mit der äußeren Packungsbeilage der Lipid-Doppelschicht biologischer Membranen10assoziieren. Sie sind praktisch nicht fluoreszierend in wässriger Lösung, werden aber bei der Integration der Plasmamembran intensiv fluoreszierend und erzeugen hervorragende Signal-Rausch-Verhältnisse (S/N)-Verhältnisse11. Diese Eigenschaften machen sie ideal geeignet für die Visualisierung von Plasmamembran und intrazelluläre Organelle Dynamik, einschließlich Tracking von Endo- und Exozytose12. Die grünfluoreszierenden FM 1-43 und die rotfluoreszierende FM 4-64 sind die beiden am häufigsten verwendeten fluoreszierenden Membranmarker für diese Zwecke. SynaptoGreen C4 und SynaptoRed C2 sind generische Moleküle von alternativen Anbietern, die austauschbar anstelle von FM 1-43 bzw. FM 4-64 verwendet werden können.

Styrylfarbstoffe umfassen drei wichtige Strukturbereiche: (1) den lipophilen Schwanz, der das Einführen des Farbstoffs in die Lipid-Bilayer erleichtert, (2) den Fluorophorkern, der die spektralen Eigenschaften des Farbstoffs bestimmt und durch zwei aromatische Ringe besteht, die durch ein bis drei Doppelbindungen verbunden sind, und (3) den positiv geladenen hydrophilen Kopf, der eine vollständige Insertion und Permeation des Farbstoffs durch die Membran verhindert (Abbildung 1A).

Je länger der lipophile Schwanz, desto höher ist die Hydrophobie des Farbstoffs und damit die Bindungsaffinität zur Membran, aber je geringer seine Wasserlöslichkeit und Membranentfärbungsrate. Folglich erzeugen verschiedene FM-Farbstoffvarianten unterschiedliche Färbedynamiken und Muster. Die höhere Hydrophobie des C4-tailed FM 1-43 bietet ein stärkeres und stabileres Fluoreszenzsignal an Plasmamembranen und inneren Organellen schneller als der kürzere C2-tailed FM 4-64, wenn er bei Äquimolarenkonzentrationen angewendet wird (Abbildung 2).

Wichtig ist, dass die konstanten und hohen Assoziations-/Dissoziationsraten beider FM-Farbstoffe11 mit durchschnittlichen Retentionszeiten von 1–6 s pro einzelnem Farbstoff13 die Chancen für eine lokalisierte Störung der Membranfunktion verringern, beispielsweise durch die Modifikation der Membranfluidität oder die erzwungene permanente Interaktion von Membranproteinen. Dies ist wahrscheinlich der Hauptgrund, warum diese Moleküle als lebenswichtige Farbstoffe verwendet werden können. Dennoch sind FM-Farbstoffkonzentrationen über 50 m toxisch für Pilz- und Pflanzenzellen2,14, und Hinweise aus BY-2-Tabakprotoplasten deuten darauf hin, dass mehr als 20 M FM-Farbstoff zu einer Plasmamembransättigungführen 14. Daher ist es ratsam, diese Grenze nicht zu überschreiten, zumal eine hervorragende Bildgebung mit nur 2 –5 'M15,16erreicht wurde.

Insbesondere variieren die spektralen Eigenschaften von FM-Farbstoffen stark je nach der jeweiligen Membran-Mikroumgebung (geprüft14). Im Allgemeinen unterscheiden sich Anregungs- und Emissionsspektren von FM-Farbstoffen in reinen Lösungsmittellösungen (wie in der Regel in den Produktinformationen angegeben) erheblich von denen in zellulären Umgebungen und können in den meisten Fällen nicht direkt bei der Auswahl von Live-Zell-Bildgebungseinstellungen konsultiert werden. Die Anregungs-/Emissionsmaxima von FM 1-43 und FM 4-64 werden beispielsweise um 37/46 nm bzw. 43/64 nm blau verschiebt, wenn sie im Vergleich zu ihren Lösungen in Methanol an Pilzmembranen gebunden sind (Tabelle 1).

Die bahnbrechenden Grundlagen für den Einsatz von FM 4-64 und FM 1-43 zur Verfolgung von Plasmamembran, Endo-/Exozytose und Organelle-Dynamik, einschließlich Spitzenkörper und Mitochondrien, sind bereits umfassend für eine Vielzahl von fadenförmigen Pilzarten bisher2,4,17,18,19dokumentiert. Empfohlene Bildgebungseinstellungen für beide FM-Farbstoffe, die in verschiedenen fadenförmigen Pilzarten wirken, sind in Abbildung 1Bdargestellt. Technische Einschränkungen der verfügbaren Ausrüstung oder bestimmte zelluläre und experimentelle Bedingungen, wie Kulturmedium, pH-Wert oder Temperatur, können jedoch einige Anpassungen erfordern. Glücklicherweise arbeiten FM-Farbstoffe über einen weiten Spektralbereich, und sehr gute Bildgebungsergebnisse werden durch spannende FM 1-43 mit 514 nm oder FM 4-64 mit 488 nm erreicht. Daher müssen die optimalen Bildeinstellungen für jeden Probentyp und jede vorgesehene Anwendung individuell festgelegt werden.

Die beachtliche Stokes Verschiebung von mehr als 135 nm FM 4-64 ermöglicht eine ausgezeichnete, gleichzeitige Co-Imaging mit Fluorophoren, die grünes Licht aussenden; Dies wird häufig genutzt, um die intrazelluläre Lokalisationsdynamik von grünen fluoreszierenden Proteinen (GFP)-markierten Fusionsproteinen relativ zur Plasmamembran und dem endozytären Weg9,20zu bewerten.

Zellwandselektive Farbstoffe
Calcofluor White M2R (CFW), auch als Fluoreszenzaufheller 28 vermarktet, ist wahrscheinlich der bekannteste Fluoreszenzfarbstoff, der verwendet wird, um die Zellwände von Bakterien, Pilzen, Algen, höheren Pflanzen und Insekten zu färben. Ursprünglich als optisches Aufhellungsmittel in der Papier-, Textil- und Waschmittelindustrie verwendet, wurde der nutzen für die klinische Diagnose von Pilzinfektionen früh am21,22realisiert. Da CFW irreversibel in die entstehende Chitinkette einsteigt, stört es die normale Chitin-Mikrofibril-Montage während der Zellwandbiogenese und erzeugt so Zellwandspannung23. Dies wiederum löst einen Reparaturmechanismus für Zellwände aus, der zu einer lokal erhöhten Zellwandabscheidung als Folge der Glucan- und Chitin-Synthase-Aktivierung24,25führt. Dieses Phänomen kann bei jedem Farbstoff auftreten, der durch stabile Bindung an Zellwandpolymere arbeitet, konzentrationsabhängig ist und am deutlichsten an Hyphaumspitzen auftritt, die die produktivsten wachsenden und damit empfindlichsten Teile des Myzels darstellen (Abbildung 3). Eine umfassende Zusammenfassung der molekularen Maschinerie, die auf Zellwandschäden reagiert, wurde vor kurzem 26 zur Verfügunggestellt.

Überdosierte Farbstoffe in Kombination mit Phototoxizität können zu einer schnellen Zelllyse von Hyphenfächern führen (Film 1). Nichtsdestotrotz kann eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber Farbstoffkonzentrationen, die im wilden Typ "vital" sind, genutzt werden, um Defekte in der Zellwandbiosynthese von Genverlust-von-Funktions-Mutanten9zu identifizieren. Für CFW und Congo Red (CR), ein weiterer Textilfarbstoff, auch bekannt als Direct Red 28 und verwendet als - und -chitin-spezifische Zellwandfleck für Pilze und Insekten27,28, Wurden Schwellenkonzentrationen, die stark chitin Synthasen induzieren, mit > 60 M CFW bzw. > 70 M CR, während die Konzentrationen von15 m entweder Farbstoff das Pilzwachstum nicht verändert enden oder hemmten29,30,31. Hickey et al. bezifferten diese Schwellenkonzentration für CFW auf 25 m2. Daher ist es ratsam, Farbstoffkonzentrationen von 5 m zu verwenden, um stressbedingte Artefakte auszuschließen und sicherzustellen, dass diese Moleküle als wirklich "vitale Fluoreszenzfarbstoffe"2,32verwendet werden. Dies gilt gleichermaßen für Solophenyl Flavine 7GFE 500 (SPF) und Pontamin Fast Scarlet 4B (PFS), synonym für Direct Yellow 86 bzw. Direct Red 23, zwei weitere nützliche Zellwandfarbstoffe, deren Anwendung für Pilze erstmals vor mehr als einem Jahrzehnt berichtet wurde33. Aber trotz ihrer bemerkenswerten spektralen Eigenschaften34,35, die Verwendung beider Farbstoffe ist seitdem sehr begrenzt36,37. Wie bereits für 1,5 m CFW2gezeigt, reichen 2 M SPF aus, um die Zellwanddynamik unter nativen Bedingungen mit sehr hoher zeitlicher Auflösung zu lösen (Film 2). Die gleichen Ergebnisse können mit 2 M CR oder PFS erzielt werden.

Zusammen bilden diese vier Farbstoffe CFW, SPF, PFS und CR eine Reihe von zellwandselektiven Fluoreszenzmarkern, die fast das gesamte sichtbare Emissionslichtspektrum (400–700 nm) abdecken, das auf modernen Fluoreszenzmikroskopen verwendet wird (Abbildung 4). Die signifikante Erhöhung der Fluoreszenzintensität bei Bindung an Zellwandpolymere ist allen vier inhärent und erzeugt hervorragende S/N-Verhältnisse. Dies wiederum ermöglicht es, die Farbkonzentrationen und die Anregungslichtintensität sehr gering zu halten und ermöglicht die Durchführung von Zellwandfärbung als "niedrig dosierte" Live-Zell-Bildgebungstechnik2. Da diese Zellwandfarbstoffe plasmamembranundurchlässig sind, fungieren sie gleichzeitig als lebende/tote Flecken. Insbesondere aufgrund ihrer extrem großen Emissionslichtspektren müssen einige Einschränkungen hinsichtlich der Co-Imaging-Eigenschaften von CFW und SPF mit anderen Fluorophoren sorgfältig geprüft werden.

Protocol

1. Herstellung von Pilzproben

  1. Pilzvorkulturen
    1. Impfen Sie die gewünschte Belastung eines geeigneten soliden Agarmediums, wie Z.B. Kartoffeldextrose Agar (PDA) für Trichoderma-Atrovidid oder Vogels Minimal Medium (VMM) für Neurospora crassa. Fügen Sie eine geeignete Auswahlmarkierung hinzu, wenn Sie mit transformierenden Stämmen arbeiten.
    2. Inkubieren Sie die Vorkultur bei der optimalen Temperatur des Organismus. Zum Beispiel T. Atroviride bei 25 °C und N. crassa bei 30 °C und 12 h/12 h helle/dunkle Zyklen, bis sich ein sporierendes Myzel entwickelt hat, aber noch nicht den Rand der Platte erreicht hat. Bei einer Petrischale in Standardgröße (9,2 cm) nimmt dies den Wildtyp T. atroviride im Durchschnitt von 4 bis 6 Tagen, während der N. crassa wild type diese Stufe nach durchschnittlich 3–4 Tagen erreicht.
  2. Kultivierung von Pilzkolonien
    1. Schneiden Sie mit einem sterilen Skalpell einen kleinen 3 mm x 3 mm Agarblock mit nicht sporenförmigem Myzel vom Kolonierand der Vorkultur.
    2. Platzieren Sie den Agarblock in der Mitte einer frischen massiven Mittelplatte, um die experimentelle Kultur zu impfen.
    3. Inkubieren Sie die experimentelle Kultur entsprechend dem Entwicklungsstadium, das untersucht werden soll. So benötigt der Wilde-Typ T. atroviride 20–22 Stunden bei 25 °C im Dunkeln, um Kolonien von etwa 2 cm Durchmesser auf PDA zu entwickeln, während der Wildetyp N. crassa nach 14–16 h Inkubation bei 30 °C im Dunkeln auf VMM Koloniedurchmesser von etwa 4 cm erreicht.
      HINWEIS: Die Inkubation im Dunkeln verhindert die Bildung von Pigmenten, die eine Autofluoreszenz einleiten könnten. Um die mittlere Hintergrundfluoreszenz aus der experimentellen Kultur zu eliminieren, ersetzen Sie Agar durch 1,5 % w/v eines transparenten Erstarrungsmittels (siehe Materialtabelle)und jedes komplexe Medium durch ein definiertes minimales Medium.
  3. Kultivierung fester Keimkulturen
    1. Verwenden Sie 5 ml sterile physiologische Salzlösung (0,9% w/v NaCl), um Konidialsporen von der Vorkulturplatte zu ernten und die resultierende Sporensuspension in einem 15 ml Schraubverschlussrohr zu sammeln.
    2. Mischen Sie die Sporenaufhängung gut durch kräftiges Wirbeln und filtern Sie sie anschließend über einen 1 cm x 5 cm langen Streifen sterilen Filtergewebes (siehe Materialtisch)leicht in eine 1 ml Pipettenspitze (sowohl montiert als auch autoklaviert) in ein frisches steriles Rohr.
    3. Bestimmen Sie die Sporendichte mit einer Zellzählkammer und bereiten Sie eine 1 x 107 Zellen/ml Sporensuspension mit physiologischer Salzlösung vor.
      HINWEIS: Die Sporensuspension kann bis zu zwei Wochen bei 4 °C gehalten werden.
    4. Bereiten Sie eine Standard-Petrischale (9,2 cm) mit 20 ml festem Medium vor und fügen Sie 15–20 sterile Glasperlen (3 mm) oben hinzu.
    5. Pipette 200 l der Sporensuspension auf die mittlere Platte und verteilt die Zellen durch sanftes Schütteln gleichmäßig über die gesamte Platte. Sammeln Sie die Glasperlen in einen Becher mit 70% Ethanol zur Wiederverwendung.
    6. Inkubieren Sie die experimentelle Kultur entsprechend dem Entwicklungsstadium, das untersucht werden soll. Zum Beispiel benötigt der T. atroviride Wildtyp 5–6 h bei 25 °C im Dunkeln, um Konidialkeime auf PDA zu entwickeln, während der N. crassa wild Typ nach 3-4 h Inkubation bei 30 °C im Dunkeln auf VMM Konidialkeime entwickelt.
      ANMERKUNG: Um jegliche fluoreszenz mittlere Hintergrunddaten aus der experimentellen Kultur zu eliminieren, ersetzen Sie Agar durch 1,5 % w/v eines transparenten Erstarrungsmittels und jedes komplexe Medium durch ein definiertes minimales Medium.
  4. Kultivierung flüssiger Keimkulturen
    1. Füllen Sie 190 l flüssiges Kulturmedium in jeden Brunnen eines 8-well-kammerförmigen Mikroschlittens.
    2. Fügen Sie 10 l einer 1 x 107 Zellen/ml Sporenlösung (in den Schritten 1.4.1–1.4.3) hinzu und mischen Sie sie, indem Sie ein paar Mal sanft nach oben und unten pipetieren. Die resultierende Gesamtzahl der Zellen beträgt 1 x 105 pro Bohrkörper.
    3. Inkubieren Sie die experimentelle Kultur entsprechend dem Entwicklungsstadium, das untersucht werden soll. So benötigt der Wildetyp T. atroviride 5–6 h bei 25 °C im Dunkeln, um in Kartoffeldextrosebrühe (PDB) Konidialkeime zu entwickeln, während der wilde Typ N. crassa nach 3–4 h Inkubation bei 30 °C in der Dunkelheit in flüssigem VMM Konidialkeime entwickelt.

2. Vorbereitung von Farbstoffbearbeitungslösungen

  1. Um die volle Löslichkeit jedes Farbstoffs zu gewährleisten, bereiten Sie 2 mM Stofflösungen in Dimethylsulfoxid (DMSO) vor, indem Sie die entsprechende Menge (siehe genaue Gewichte in Tabelle 1)auf 1 ml 100% DMSO hinzufügen und durch Wirbelgut vermischen.
    VORSICHT: Achten Sie darauf, den DMSO aus einer septumversiegelten Flasche zu entnehmen; es sollte eine klare transparente Flüssigkeit sein. Bei Kontakt mit Luft wird DMSO braun – wahrscheinlich aufgrund der Oxidation von Spurenunreinheiten – und kann sich negativ auf das Zellwachstum oder die Färbefärbung auswirken.
  2. Filter sterilisieren die Stammlösung durch einen 0,2 m Spritzenmembranfilter in ein frisches steriles 1,5 ml Reaktionsrohr. Um die Farbstoffbleiche zu minimieren, wickeln Sie das Rohr in Aluminiumfolie.
    HINWEIS: Die Farbstoffstofflösung kann in kleinere Volumina eingepfert werden, um Auftau-/Gefrierzyklen zu vermeiden, und mehrere Monate bei 4 °C gehalten werden.
  3. Bereiten Sie eine wässrige Lösung für wässrige Farbstoffe von 20 m vor, indem Sie 2 l Farbstammlösung in 198 l sterilen destillierten Wassers in einem frischen sterilen 1,5 ml Reaktionsrohr auflösen. Um die Farbstoffbleiche zu minimieren, wickeln Sie das Rohr in Aluminiumfolie.
    HINWEIS: Die Farbstoffarbeitslösung sollte am Tag des Experiments frisch zubereitet werden.
  4. Während der Probenmontage (siehe Abschnitt 3) wird die Farbstoffarbeitslösung standardmäßig 1:10 verdünnt, was zu einer Endfarbstoffkonzentration von 2 m und 0,1% w/v End-DMSO-Konzentration führt.
    HINWEIS: Die Wahl verschiedener Verdünnungsfaktoren durch einfaches Ändern des Volumenverhältnisses zwischen Farbstoffarbeitslösung und Montageflüssigkeit ermöglicht eine einfache Anpassung der gewünschten Endfarbstoffkonzentration.
    VORSICHT: Um unerwünschte Wirkungen durch Farbstoff- oder DMSO-Toxizität zu vermeiden, sollte der Verdünnungsfaktor nicht unter 1:4 fallen, um maximale Endkonzentrationen von 5 m Farbstoff und 0,4 % w/v DMSO zu erzielen. Höhere Farbkonzentrationen sättigen das System schnell und verhindern eine zuverlässige Signalquantifizierung, während mehr als 0,5 % w/v (ca. 62,5 mM) DMSO die Zellentwicklung beeinträchtigen können38.

3. Probenvorbereitung für die Mikroskopie

  1. Mountproben aus Pilzkolonien (Schritt 1.2) oder festen Keimkulturen (Schritt 1.3) nach der invertierten Agarblock-Methode.
    1. Halten Sie einen sauberen 24 mm x 60 mm Glasdeckel (#1 = 0,13–0,16 mm Dicke) bereit und fügen Sie 18 l flüssiges Minimalmedium (VMM oder M9) oder physiologische Salzlösung in die Mitte.
    2. Fügen Sie der 20-Mm-Farblösung 2,5 Km der Flüssigkeit hinzu und mischen Sie sie gut, indem Sie mehrmals nach oben und unten pfeifen und gleichzeitig die Produktion von Luftblasen vermeiden.
      HINWEIS: Bei der Arbeit mit mehreren Proben ist es ratsam, eine Master-Mischung aus Flüssigfarbstofflösung für alle vorzubereiten, um eine gleiche Farbstoffkonzentration während des gesamten Experiments zu gewährleisten.
    3. Mit einem sauberen Skalpell eine 15 mm x 15 mm Probe aus der Peripherie der Kolonie oder der festen Keimkultur herausschneiden und vertikal neben dem mittleren Tropfen auf den Deckelschlupf legen.
    4. Mit dem Skalpell, um die obere Kante des Blocks zu unterstützen und einen Finger, um die Rückseite des Blocks an Ort und Stelle zu halten, langsam senken Sie die Seite tragen das Myzel oder Keime auf die Flüssigkeit. Die Probe ist nun bereit für den Transfer auf die Mikroskopstufe.
      VORSICHT: Es ist wichtig, dies langsam und sehr sorgfältig zu tun, um die mechanische Belastung der Zellen zu minimieren und zu vermeiden, dass Luftblasen zwischen Probe und Abdeckungsschlupf gefangen werden.
  2. Montieren Sie die flüssigen Keimkulturen aus Schritt 1.4.
    HINWEIS: Am bequemsten können flüssige Keimkulturen in kammerförmigen Mikrobrunnenschlitten direkt übertragen und auf der Mikroskopstufe weiter manipuliert werden.
    1. Fügen Sie 22 l Farbstoff-Arbeitslösung zu 200 l flüssigem Medium hinzu, um Standard-Endkonzentrationen von 2 M Farbstoff und 0,1 % w/v DMSO zu erzielen.
      HINWEIS: Flüssige Keimkulturen haben den großen Vorteil, dass Fluoreszenzfarbstoffe (oder andere Chemikalien, wie Inhibitoren) zu jedem gewünschten Zeitpunkt des Experiments, auch während der Aufzeichnung, zugesetzt werden können. In diesem Fall ist besonders darauf zu achten, dass die Flüssigkeitstropfen sehr langsam verabreicht werden, um die Zellen nicht zu stören. Systemschwingungen und Brownsche Bewegung könnten bereits einige Zellbewegungen einführen.

4. Live-Zell-Mikroskopie

  1. Passen Sie die grundlegenden Einstellungen für die Bildaufnahme an. Die folgenden Bildaufnahmeeinstellungen ermöglichen die Erfassung von Färbedynamiken in einzelnen Hyhasen und sind auf die beiden folgenden Assays anwendbar.
    1. Wenden Sie 5–10% Laserleistung von 20% der vollen Ausgangsleistung des Geräts an.
    2. Verwenden Sie ein Plan Apo 60x–63x Glycerin oder Wasser Immersion objektiv mit einer hohen numerischen Blende bei 1,2.
    3. Beschränken Sie den Bildaufnahmebereich auf die Umrisslinie des Hyphen, indem Sie eine Bildgröße von 1024 x 256 Pixel festlegen und einen optischen Zoomfaktor von 2–3 verwenden.
    4. Verwenden Sie bidirektionales Scannen mit 400 Hz. Passen Sie die Lochgröße auf 1 Luftige Einheit an.
    5. Stellen Sie die Verstärkung des empfindlichsten Detektors auf 100 % ein.
    6. Für die Zeitrundenaufnahme beginnen Sie mit der Bildaufnahme mit einem Frame alle 15 s, um eine angemessene zeitliche Auflösung zu ermöglichen, ohne Eine Farbbleichung oder Fotobeanspruchung zu erzeugen.
    7. Legen Sie für die 3D-Aufnahme die obere und untere räumliche Grenze auf die Grenze der hyphenischen und raumoptischen Abschnitte 1 m auseinander, um eine angemessene räumliche Auflösung zu ermöglichen.
      HINWEIS: Aufgrund des schnellen Wachstums von Hyphen wurde eine hohe räumliche Auflösung in der Z-Achse oft für eine hohe zeitliche Auflösung in der X/Y-Achse oder umgekehrt geopfert. Nur sehr moderne konfokale Laserscanmikroskope sind schnell genug, um beide Anforderungen zu erfüllen.
  2. Endozytose-Aufnahme-Assays
    1. In Abbildung 1 und Tabelle 1 finden Sie die besten Anregungs-/Emissionseinstellungen für FM 1-43 und/oder FM 4-64, die auf dem Mikroskopiesystem verfügbar sind, und passen Sie entsprechend an.
      HINWEIS: Mit der empfohlenen Konzentration von 2 M ist die Aufnahme von FM-Farbstoff in die Plasmamembran in normalen gesunden Zellen sofort erfolgt. Der gesamte Prozess von der anfänglichen Plasmamembranfärbung bis zum Farbstoffaussehen in röhrenförmigen Vakuolen wird in der Regel innerhalb von 30–45 min bei Raumtemperatur abgeschlossen. Die Erhöhung der FM-Farbstoffkonzentration erhöht das S/N-Verhältnis und erzeugt dadurch schneller kontrastreichere Bilder. Es beschleunigt jedoch auch den Etikettierungsprozess, was es schwieriger macht, die chronologische Abfolge der Organellenfärbung zu unterscheiden.
    2. Starten Sie die Bildaufzeichnung mit den oben empfohlenen grundlegenden Bildaufnahmeeinstellungen und werten Sie die Ergebnisse aus.
    3. Optimieren Sie die Einstellungen für die Bildaufnahme auf die räumliche und zeitliche Auflösung, die erforderlich ist, um den Aspekt der Plasmamembran oder Endozytosedynamik zu erfassen, auf die sich das Experiment konzentriert.
    4. Um beispielsweise eine sehr schnelle Dynamik in X/Y zu erfassen, die Gesamtbildgröße zu verringern, nur eine Fokusebene abzubilden und die Scanrate auf 1 fps zu erhöhen. Verringern Sie bei höherer Auflösung in der Z-Achse die Auflösung in X/Y, verringern Sie die Bildgröße und verringern Sie den Abstand zwischen optischen Abschnitten auf 0,5 m.
  3. Zellwanddynamik
    1. In Abbildung 4 und Tabelle 1 finden Sie die besten Anregungs-/Emissionseinstellungen für den auf dem Mikroskopiesystem verfügbaren aufgebrachten Zellwandfarbstoff und passen Sie entsprechend an.
      HINWEIS: Aufgrund ihrer breiten Emissionsspektren eignen sich CFW und SPF nicht gut für die gleichzeitige Ko-Imaging mit anderen Fluorophoren, vorwiegend GFP. Einige Einschränkungen gelten sogar für sequenzielle Bildgebungsansätze mit diesen Farbstoffen und müssen daher individuell optimiert werden.
    2. Starten Sie die Bildaufzeichnung mit den oben empfohlenen grundlegenden Bildaufnahmeeinstellungen und werten Sie die Ergebnisse aus.
      HINWEIS: Bei der empfohlenen Konzentration von 2 M ist die Aufnahme von Farbstoff in die Zellwand nicht unbedingt sofort, sondern einigermaßen schnell. Der gesamte Prozess der Septumbildung, zum Beispiel, dauert im Durchschnitt etwa 5–7 min bei Raumtemperatur20. Die Erhöhung der Zellwandfarbstoffkonzentration erhöht das S/N-Verhältnis und erzeugt dadurch schneller kontrastreichere Bilder. Es führt jedoch auch schnell Artefakte aufgrund von induzierten Zellwandschäden Reparatur.
    3. Optimieren Sie die Einstellungen für die Bildaufnahme auf die räumliche und zeitliche Auflösung, die erforderlich ist, um den Aspekt der Zellwandmorphogenese zu erfassen, auf den sich das Experiment konzentriert, wie in Abschnitt 4.2.3 beschrieben.

Representative Results

Quantitative Bildanalyse
Neben der "nur" Visualisierung zellulärer Prozesse ermöglicht die Live-Zell-Bildgebung das Extrahieren quantitativer Informationen aus den aufgezeichneten Daten. Im Allgemeinen ist die quantitative Bildanalyse ein komplexes Thema, dessen richtige Diskussion weit über den Rahmen dieses Artikels hinausgeht, daher wird der Leser auf spezielle Lehrbücher und Artikel39,40,41verwiesen. Dennoch werden einige grundlegende Richtlinien im Zusammenhang mit den folgenden Beispieldaten bereitgestellt. Es müssen mehrere entscheidende Voraussetzungen erfüllt sein, um eine Bildquantifizierung zu ermöglichen, darunter: (1) Definierte Molizitäten von Fluoreszenzfarbstoffen müssen auf alle Proben angewendet werden, um einen genauen relativen Vergleich zu ermöglichen; (2) Die Einstellungen für die Bildaufnahme müssen so eingestellt werden, dass die Emissionslichtdetektoren nie gesättigt sind, da andernfalls maximale Intensitäten abgeschnitten werden; (3) Die Einstellungen für die Bildaufnahme müssen im Laufe eines kohärenten Versuchssatzes festgelegt bleiben, da andernfalls künstliche Intensitätsänderungen eingeführt werden. (4) Bilddaten müssen in einem informationsverlustfreien Dateiformat zusammen mit den Metainformationen gespeichert werden, die alle Geräteeinstellungen enthalten; und (5) Die Bildanalyse sollte auf die minimale Anzahl von Nachbearbeitungsschritten beschränkt werden, die erforderlich sind, um die gewünschten quantitativen Informationen zu extrahieren.

Normalerweise sind definierte Standards, die eine absolute Quantifizierung aufgezeichneter Signale ermöglichen würden, in der lebenden Zelle nicht verfügbar. Daher beruht die quantitative Bildanalyse in ihrer einfachsten Form auf dem relativen Vergleich von Pixelintensitäten innerhalb desselben Bildes oder zwischen verschiedenen Bildern, die mit identischen Einstellungen aufgenommen wurden. Die Mikroskopsteuerungssoftware des Herstellers enthält in der Regel grundlegende Werkzeuge für die Bildnachbearbeitung und quantitative Analyse oder kann mit zusätzlichen Funktionen für Bildsegmentierung, Schwellenwertierung, Verhältnisbildgebung usw. aufgerüstet werden. Es stehen mehrere Open-Source-Bildverarbeitungsplattformen zur Verfügung, die sich unterschiedlich für verschiedene Bilddatentypen eignen, darunter ImageJ (https://imagej.net; https://imagej.nih.gov/ij/), eisig (http://icy.bioimageanalysis.org/), CMEIAS Bioimage Informatics (http://cme.msu.edu/cmeias/) und Wimasis (https://www.wimasis.com/en/).

Die vorgestellten Beispieldaten wurden mit der ImageJ-Plattform verarbeitet und analysiert. Kurz gesagt, bestimmte Bereiche in der Zelle, wie die Hyphalspitze Spitze oder Septa, sind mit großen Flächenauswahlwerkzeugen markiert, und die Intensität aller enthaltenen Pixel wird mit dem softwareimplementierten "Messwerkzeug" ausgelesen. Die Intensitätsdaten aus Steuerelementen und experimentellen Proben werden in eine Tabellenkalkulation übertragen, mathematisch analysiert und als Graph vorbereitet. Weitere Einzelheiten sind den zitierten Originalveröffentlichungen zu zu finden.

Beispieldaten 1: FM 4-64 Aufnahme-Assays
Pilzproben wurden als Kolonien (Schritt 1.2) angebaut und nach der invertierten Agarblockmethode (Schritt 3.1) montiert. Die Endkonzentration von FM 4-64 betrug 1,67 m. Bildgebende Einstellungen: HCX PL APO 63x/1.3 NA Glycerin-Tauchobjektiv auf einem invertierten konfokalen Laserscanmikroskop (siehe Tabelle der Materialien); FM 4-64 Anregung bei 488 nm und Emission bei 600–700 nm; ein Frame pro Minute für bis zu 150 min. FM 4-64 Aufnahme-Assays identifizierten Defekte in der räumlich-zeitlichen Organisation der Endozytose bei der Gendeletion und Genüberexpression von Mutanten des pilzspezifischen Sur7-Familienproteins 2 (Sfp2) von T. Atroviride9 (Abbildung 5).

Beispieldaten 2: FM 4-64 Co-Färbung von fluoreszierenden Fusionsproteinen, die auf endozytische Kompartimente ausgerichtet sind
Pilzproben wurden als Kolonien (Schritt 1.2) angebaut und nach der invertierten Agarblockmethode (Schritt 3.1) montiert. Die Endkonzentration von FM 4-64 betrug 2 m. Bildgebungseinstellungen: CFI Plan Apo VC 60x/1.2 NA XC Wassertauchziel auf einem invertierten konfokalen Laserscanmikroskop (siehe Tabelle der Materialien); GFP-Anregung bei 488 nm und Emission bei 500–530 nm, FM 4-64 Anregung bei 488 nm und Emission bei 600–700 nm und Hellfeld mit Durchlichtdetektor, alle gleichzeitig; ein Rahmen alle 15 s für bis zu 15 min. FM4-64 Co-Färbung wurde verwendet, um die subzelluläre Verteilung der beiden verbesserten grünen fluoreszierenden Proteine (EGFP)-getaggttransmembrane Proteine Sfp2 und Gpr1 auf den endozytischen Weg in T. atroviride (Abbildung 6, Film 3, Film 4).

Beispieldaten 3: FM 4-64 Co-Färbung zur Identifizierung morphogenetischer Unterschiede
Pilzproben wurden als Kolonien (Schritt 1.2) angebaut und nach der invertierten Agarblockmethode (Schritt 3.1) montiert. Die Endkonzentration von FM 4-64 betrug 2 m. Bildgebende Einstellungen: Plan Apochromat 63x/1.4 NA-Öl-Tauchobjektiv auf einem invertierten konfokalen Laserscanmikroskop (siehe Materialtabelle); GFP-Anregung bei 488 nm und Emission bei 505–550 nm, FM 4-62 Anregung bei 488 nm und Emission bei 574–691 nm und Hellfeld mit Durchlichtdetektor, alle gleichzeitig; ein Frame alle 8,5 s für bis zu 15 min. FM4-64 Co-Färbung erlaubt, um die subzelluläre Lokalisationsdynamik von fluoreszierend markierten BUD-6 Polarisome komplexe Protein zu endosome trafficking-abhängigen Prozessen, wie die Bildung von Septa und polarisierte Hyphal-Spitzenwachstum, und charakterisiertUnterschiede in der subzellulären Organisation und Hyvat-Architektur zwischen wildartigen und mutierten Stämmen von N. crasa Abbildung (7, Film 5).

Beispieldaten 4: Zellwandfärbung zeigt morphogenetische Unterschiede
Pilzproben wurden als Kolonien (Schritt 1.2) angebaut und nach der invertierten Agarblockmethode (Schritt 3.1) montiert. Es wurden Endkonzentrationen von 2 M CFW, 20 M SPF und 100 M CR verwendet. Bildgebungseinstellungen: CFI Plan Apo VC 60x/1.2 NA XC Wassertauchziel auf einem invertierten konfokalen Laserscanmikroskop (siehe Materialtabelle); CFW- und SPF-Erregung bei 405 nm und Emission bei 430–470 nm, CR-Anregung bei 543 nm und Emission bei 580–620 nm. Die unterschiedlichen Wechselwirkungseigenschaften von CFW, SPF und CR mit Zellwandpolymeren unterstreichen morphogenetische Unterschiede zwischen demSfp2-Mutanten und dem Wildtyp-Stamm von T. Atroviride9. Zunehmende Zellwandbelastung durch erhöhte Farbstoffkonzentrationen tritt schneller und ausgeprägter in der Mutanten im Vergleich zum wilden Typ. Darüber hinaus ermöglichen die gleichen Bilder die Quantifizierung morphogenetischer Unterschiede in Bezug auf Denkstrichdurchmesser und Septumabstand zwischen beiden Stämmen (Abbildung 8).

Beispieldaten 5: Echtzeitüberwachung der Zellwandbiosynthese
Keime wurden als flüssige Kultur (Schritt 1.4) in 8-well-kammerierten Mikrorutschen (Schritt 3.2) angebaut. Die endgültige CFW-Konzentration betrug 0,12 m. Bildgebungseinstellungen: CFI Plan Apo VC 60x/1.2 NA XC Wassertauchobjektiv auf einem invertierten konfokalen Laserscanmikroskop; CFW-Erregung bei 405 nm und Emission bei 420–470 nm; ein Rahmen alle 20 s für bis zu 35 min. Die sehr niedrige CFW-Konzentration verhindert die Sättigung der Zellwand mit Farbstoffmolekülen und ermöglicht eine quantitative Echtzeitüberwachung der Zellwandbiosynthese. Dies zeigt, dass die Ablagerung von neuem Zellwandmaterial nicht einheitlich ist, sondern sehr schnell auf lokalisierte physikalische Belastungen reagiert, die sich aus der relativen Verschiebung einer Zelle auf Zell-Zell-Anhaftung vor der Keimfusion in N. crassa ergeben (Abbildung 9, Film 6).

Figure 1
Abbildung 1: Biochemische und biophysikalische Eigenschaften von FM-Farbstoffen. (A) Chemische Strukturen von FM 1-43/SynaptoGreen C4 und FM 4-64/SynaptoRed C2. (B) Absorptions- und Emissionsspektren beider FM-Farbstoffe, überlagert mit den optimalen Bildgebungseinstellungen für membrangebundene Farbstoffe in fadenförmigen Pilzen: 445–495 nm blaues Licht wird FM 1-43 mit 100–80% Effizienz anregen, während 488 nm eines Argon-Lasers den Farbstoff mit 91% Effizienz anregen. Durch die Blauverschiebung bei Membranbindung (*) liegt der optimale Erfassungsbereich der FM 1-43 Emission zwischen 520–590 nm. Ebenso sind die optimalen Bildgebungseinstellungen für FM 4-64 bei Pilzen 471–541 nm (100–80% Wirkungsgrad) bei Verwendung einer polychromatischen Anregungslichtquelle oder 514 nm (99% Effizienz) bei Verwendung eines Argon-Lasers und 650–750 nm für die Emissionslichtdetektion. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Gleichzeitige Co-Imaging von FM 1-43 und FM 4-64. Eine äquimomolare Mischung beider Farbstoffe wurde einer flüssigen Keimkultur von N. crassa zugesetzt, die eine Endkonzentration von 10 m ergab. Bei 25 min nach Färbezugabe FM 1-43 hat die Plasmamembran gefärbt und sich bereits in internen Membranen angesammelt, einschließlich stark gefärbter Mitochondrien (m), aber weitgehend ohne Vakuummembranen (v), und ist mehr als achtmal stärker als FM 4-64 (durchschnittliche Fluoreszenzintensitäten 176 bis 21), deren niedrigere Hydrophobizität/höhere Hydrophilie ihre Internalisierungsrate verlangsamt, was zu einer längeren Wohnzeit am Plasma führt. Maßstabsleiste = 10 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Die zellwandbedingte Spannungsinduzierte Ablagerung von Zellwandpolymeren an der Spitze des Spitzenteils führt häufig zu einer Zellautolyse. Hyphae von T. Atrovirid exezierenden zytoplasmischen GFP wurden mit 10 M Solophenyl Flavine 7GFE 500 (SPF) gefärbt und sofort nach der Montage abgebildet. Nicht-gestresste Hyphae (a), gestresste Hyphae mit leicht erhöhter Glucan/Chitin-Abscheidung an der Spitze und fortschreitender Autolyse (b) und stark beanspruchter Hyphae mit ausgeprägter apikaler Glucan/Chitin-Kappe (Sternchen) und terminaler Autolyse (c), die durch den Totalverlust der GFP-Fluoreszenz und der extensiven Vakuolisierung sichtbar wird. Skalenbalken = 10 m. Siehe Film 1 für die Vollzeit-Kurssequenz. Beachten Sie, dass sich die drei Hyphen tatsächlich nebeneinander befanden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Biochemische und biophysikalische Eigenschaften von zellwandselektiven Farbstoffen. Die chemischen Merkmale sind die natriumsalze jedes Farbstoffs. Absorptions- und Emissionsspektren entsprechen denen in zellulären Umgebungen. Indizierte monochromatische Laseranregungslinien (in Farbe geschrieben), polychromatische Anregungsbereiche, die für Epifluoreszenzmikroskope gelten, und Emissionslichtdetektionsbereiche sind diejenigen, die für die Bildgebung in fadenförmigen Pilzen empfohlen werden. Zwei Laseranregungslinien werden angezeigt, wenn beide gleich gut funktionieren. (*) Das Emissionsspektrum von zellwandgebundenem PFS ist jedoch deutlich rotverschiebbarer als bisher33, was zu sehr guten S/N-Verhältnissen mit niedrigeren Farbstoffkonzentrationen führt als bisher. Das gesamte CR-Spektrum ist derzeit nicht verfügbar, daher wird das von Nile Red (CAS-Nr.: 7385-67-3) als das nächste Spiel angezeigt. Detaillierte Informationen zu den spektralen Eigenschaften von CR finden Sie an anderer Stelle42. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Einfluss von Sfp2 auf die endozytische Aufnahme von FM4-64. Drei aufeinander folgende Schlüsselstufen der FM-Farbaufnahme sind in der wilden Art (wt) leicht zu erkennen. Stufe I: exklusive Plasmamembranfärbung, Stufe II: erstes Auftreten von FM-Farbstoff in endozytischen Vesikeln und Stufe III: exklusive Färbung von endozytischen Vesikeln und Endomembranen. Äquivalente Färbemuster werden zum frühesten Zeitpunkt ihres Erscheinens angezeigt. Im Vergleich zum Wilden Typ T. atroviride wird die Endozytose im sfp2-Überausdrucksmutanten (OEsfp2) leicht beschleunigt, währendsich die Farbaufnahme im sfp2-Löschmutant dramatisch verzögert . Zum Beispiel tritt die Farbaufnahme in die Plasmamembran sofort in OEsfp2 auf, dauert aber 2 min in der Wilden; und vollständige Internalisierung des FM-Farbstoffs aus der Plasmamembran erfolgt 10x schneller in OEsfp2 im Vergleich zusfp2. Skalenbalken = 5 m. Die Abbildung wird von Atanasova et al.9 in Übereinstimmung mit der Creative Commons License (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/) reproduziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 6
Abbildung 6: Die Co-Färbung von EGFP-markierten Membranproteinen mit FM 4-64 erleichtert die Differenzierung einer ausgeprägten subzellulären Lokalisationsdynamik in T. Atroviride. (A) Das Vier-Transmembran-Domänenprotein Sfp2 lokalisiert mit FM4-64-markierten Organellen, einschließlich der Plasmamembran und Septa, des Spitzenkörpers (Spk; Pfeil) und vermutlicher röhrenförmiger Vakuole. (B) Das GPCR-ähnliche Sieben-Transmembran-Protein Gpr1 lokalisiert mit FM4-64 mit den gleichen Organellen wie Sfp2, mit Ausnahme der Spk.-Skala-Bars, 10 m. Siehe Film 3 und Film 4 für Vollzeit-Kurssequenzen. Die Figur wurde von Atanasova et al.9 in Übereinstimmung mit der Creative Commons Lizenz geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 7
Abbildung 7: FM 4-64 Färbung unterscheidet dieBud-6-Mutation von wilder Art und lokalisiert BUD-6 am Septalring. (A) FM 4-64 Färbung von Hyphen des N. crassa wild Typs (Pfeile zeigen Septa an; Pfeilspitzen zeigen die Spk). (B) Septa und Spk fehlen inder Bud-6. Schuppenstäbe, 50 m (C und D) Nahaufnahme der Hyphenspitze und der Subapex-Schriftart (C) und derKnospe-6 (D). Spk (Pfeilspitze) unterscheidet sich in der wild-Typ, aber nicht ,bud-6. Klammern weisen auf die nukleare Ausschlusszone hin, die nicht inder Bud-6festgelegt ist. Skalenstäbe = 5 m (E) BUD-6-GFP Rekrutierung an die beginnende Septationsstelle vor der Plasmamembraninvagination (Pfeilspitzen) und der begleitenden Septumverengung. Skalenbalken = 5 m. Vollständige Zeitverlaufssequenzen finden Sie unter Movie 5a und Movie 5b. Die Figur wurde mit Änderungen von Lichius et al.16 in Übereinstimmung mit der Creative Commons License reproduziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 8
Abbildung 8: Das Löschen von sfp2 verändert das Ablagerungsmuster von Zellwandmaterial und wirkt sich auf die Hyphalmorphogenese von T. Atroviride aus. (A) CFW- und SPF-Färbung zeigt eine erhöhte Zellwandabscheidung insfp2 (Pfeile) im Vergleich zum Wildtyp (wt). CR-Färbung induziert eine ausgedehnte Spitzenschwellung nur beisfp2 (Pfeilspitzen). Skalenstäbe = 10 m (B) Morphogenetische Defekte insfp2 enthalten signifikant reduzierte Septalabstände (sfp2 = 26,0 m, Wildtyp = 85 m; n = 60; ANOVA Pr < 2-16) und kleinere Hyphaldurchmesser(sfp2 = 5,6 m, Wildtyp = 12,6 m; n = 100; ANOVA Pr < 2 x 16). (C) Erhöhte Farbstofffluoreszenz in der Spitze der Spitze im Vergleich zum Subapex. Skala bar = 5 m. (D) Intensitätscodiertes 3D-Oberflächendiagramm von (C). (E) Quantifizierung der relativen Fluoreszenzintensitäten insfp2 und Wildtyp (n = 55). Die Figur wurde von Atanasova et al.9 in Übereinstimmung mit der Creative Commons License reproduziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 9
Abbildung 9: Echtzeitüberwachung der Zellwandbiosynthese. (A) Konidiale Anastomoseröhre (CAT) Fusion zwischen Keimen von N. crassa. Der physikalische Kontakt wird durch die Keimmomentanreaktion (21–28 min) sichtbar. Die farbcodierte CFW-Fluoreszenz zeigt Regionen mit geringer (dunkelblauer) und intensiver (gelber) Zellwandabscheidung an. Die zunächst unbefleckte Homing-Spitze (Pfeilspitze) deponiert neues Zellwandmaterial beim Spitzenkontakt und im Bereich, der die größte körperliche Belastung (Pfeil) erlebt. Skalenbalken = 5 m. Siehe Film 6 für die Vollzeit-Kurssequenz. Abbildung von38 mit Genehmigung reproduziert. (B) Projektion von (A) mit Vier kreisförmigen Regionen, in denen Fluoreszenzintensitäten gemessen wurden. Skalenbalken = 5 m. (C) Darstellung der angegebenen Regionen, die den raschen Anstieg der lokalisierten Zellwandbiosynthese als Reaktion auf körperliche Belastung zeigen (CAT 1, Pfeil). Im Keimröhrchen (GT) und im Sporenkörper (Kondium) nimmt die Zellwandbiosynthese stetig zu. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Movie 1
Film 1: Dye-induzierte Zellwandspannung. T. Atrovidrid-Hyphae, der zytoplasmatisches GFP (Magenta) exzeichnet, wurden 10 M SPF (Cyan) zugesetzt. Umfangreiche Spitzenfärbung tritt sofort auf, gefolgt von der schnellen Lyse von Hyphalfächern innerhalb von 2 min; das Verschwinden der GFP-Fluoreszenz. Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.

Movie 2
Film 2: Vital SPF Färbung. 2 M SPF (Cyan) ermöglichen es, das Spitzenwachstum von T. Atroviride-Hyphae mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung zu verfolgen, ohne Zellwandspannungsartefakte an der Spitze der Spitze zu induzieren. Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.

Movie 3
Film 3: FM 4-64 Co-Färbung von Sfp2-GFP. Die Co-Färbung von T. Atrovirid, die Sfp2-mEGFP (grün) mit 1,67 M FM 4-64 (rot) exzeicht, zeigt die überlappende und deutliche Lokalisation des Membranproteins mit dem endozytischen Weg. Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.

Movie 4
Film 4: FM 4-64 Co-Färbung von Gpr1-GFP. Die Co-Färbung von T. Atrovidid, die Gpr1-mEGFP (grün) mit 1,67 M FM 4-64 (rot) exzeicht, zeigt die überlappende und deutliche Lokalisation des Membranproteins mit dem endozytischen Weg. Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.

Movie 5
Film 5: FM 4-64 Co-Färbung von BUD-6-GFP. (5a) Co-Färbung von N. crassa, die BUD-6-GFP (grün) mit 2 M FM 4-64 (rot) exezieren, ermöglichen die Verfolgung der BUD-6-Dynamik während der Septumbildung relativ zur zugehörigen Plasmamembran-Invagination. (5b) Beschnittenes und zusammenführendes Bild von (5a). Bitte klicken Sie hier, um Movie 5a herunterzuladen
Bitte klicken Sie hier, um Movie 5b herunterzuladen.

Movie 6
Film 6: Echtzeit-Überwachung der Zellwand-Biosynthese. N. crassa Keime, die MAK-1-GFP (grün) exexzieren, wurden mit 0,12 'M CFW (blau) ko-gefärbt, um lokalisierte Zellwandbiogenese während der CAT-vermittelten Keimfusion zu enthüllen. Beachten Sie, dass das GFW-Signal in die GFP-Kanäle eingeblutet wird, was zeigt, dass SPF bzw. CR als sequenzielle und gleichzeitige Co-Imaging-Farbstoffe für GFP besser sind. Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.

Tabelle 1: Eigenschaften von Membran- und Zellwandselektiven Fluoreszenzfarbstoffen. * = mg/ml-Werte, die für den reduzierten Reinheits-/Farbstoffgehalt korrigiert werden, um in allen Lösungen Äquimolarität zu erzielen; n.i.a. = keine Informationen verfügbar. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Discussion

Dieser Artikel setzt die bahnbrechende Arbeit fort, die die Verwendung verschiedener fluoreszierender Farbstoffe als lebenswichtige Organelle-Marker für fadenförmige Pilze in den frühen 2000er Jahren2,4,43, und versucht, die photophysikalischen und zellbiologischen Eigenschaften von FM-Farbstoffen und ausgewählten Zellwandfarbstoffen detaillierter als zuvor zu diskutieren. Vor allem im Hinblick auf unerwünschte zelluläre Effekte, wie Membransättigung oder Zellwandschäden, die oberhalb bestimmter Farbstoffkonzentrationen auftreten. Was bisher auf zellulärer Ebene als ungiftig galt, gilt heute auf molekularer Ebene als toxisch. Auch wenn diese Effekte sehr subtil sein können und nicht direkt durch offensichtliche Veränderungen des Organellen- oder Zellverhaltens erkennbar sind, müssen mögliche Interferenzen der Farbstoffanwendung außer der Visualisierung für die Untersuchung der nativen molekularen Funktion minimiert werden. Glücklicherweise erleichtern eine verbesserte Empfindlichkeit und Quanteneffizienz moderner Detektoren wie Siliziumlawinenphotodiodendetektoren (Si-APDs)44 oder des Airyscan-Bereichsdetektors45den Einsatz noch geringerer Farbstoffmengen als bisher. Ein weiteres wichtiges Ziel des Artikels ist es, die Co-Imaging-Eigenschaften dieser Farbstoffe mit anderen Fluorophoren zu veranschaulichen, vor allem mit denen von GFP als dem am häufigsten verwendeten fluoreszierenden Protein in der Biologie. Dies sollte die Entwicklung von bildgebenden Experimenten unterstützen, die darauf abzielen, die subzelluläre Lokalisationsdynamik von fluoreszierenden Fusionsproteinen mit denen der Pilzzellwand, der Plasmamembran oder des Endo- und Exozytosewegs usw. zu korrelieren.

Die Bildgebung unter natürlichen und stressfreien Bedingungen ist der Schlüssel für die Erfassung zuverlässiger Daten. Einige praktische Überlegungen zur Kulturmedium- und Probenvorbereitung zielen darauf ab, einen Ausgangspunkt für die Suche nach optimalen Bedingungen zu schaffen, die eine artefaktfreie Langzeitbeobachtung gesunder, unbestressedr Zellen mit dem höchsten S/N-Verhältnis für jede gegebene Probe ermöglichen. Es gibt keine universelle Möglichkeit, zuverlässige und aussagekräftige Bildgebungsergebnisse zu erzielen. Dem Ansatz ist inhärent, dass die biologische Variation der Probe, subjektivität und Erwartungen des Mikroskops sowie die Bildnachbearbeitung einen erheblichen Einfluss auf die Datenerfassung bzw. -interpretation haben. Daher sind die praktische Erfahrung des Mikroskops, sein intimes Wissen über die Zellbiologie des untersuchten Pilzes sowie die geschickte Probenvorbereitung, um bedingungen so "natürlich" und ungestört wie möglich in einem Laborzustell zu schaffen, von größter Bedeutung für den Erwerb und die Auswertung von bildgebenden Daten, die die untersuchten zellulären Phänomene wahrheitsgemäß widerspiegeln. Als Faustregel gilt, dass das Auftreten unerwünschter Nebenwirkungen von Fluoreszenzfarbstoffen, die von der subtilen und damit nicht offensichtlich sichtbaren Aktivierung von Plasmamembran- oder Zellwand-Remodellierungs-Stressreaktionswegen bis hin zur einfachen zytotoxischen Induktion der Zellautolyse reichen, nur durch die Anwendung niedriger Farbstoffkonzentrationen von 2 bis 2 M sicher verhindert werden kann.

Die Anwendung von Fluoreszenzfarbstoffen ist einfach, aber ihre Besonderheiten sind schlecht charakterisiert. Eine wesentliche Stärke der Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen ist die präparative Einfachheit der experimentellen Protokolle. Die Kultivierung und Probenahme des Pilzes, die Zugabe des Farbstoffs und die Montage auf der Mikroskopbühne sind (mit der Praxis) einfach. Die Einstellung der grundlegenden bildgebenden Einstellungen, einschließlich Anregungs- und Emissionswellenlängen, Belichtungszeiten, Zeitverlaufseinstellungen usw., folgt einfachen biophysikalischen Regeln des Mikroskops und biologischen Regeln der verwendeten Fluoreszenzfarbstoffe in den Zellen. Tabelle 1 soll die Identifizierung der am besten geeigneten Farbstoff- oder Farbstoffkombination für Experimente unterstützen. Darüber hinaus sind Fluoreszenzfarbstoffe preisgünstig, mit zuverlässiger hoher Qualität leicht erhältlich und sorgen so für eine hochreproduzierbare Anwendung.

Zwei wesentliche Einschränkungen bei der Verwendung von Membran- oder Zellwandselektive Fluoreszenzfarbstoffe sind die (oft) begrenzte Kenntnis ihrer genauen Färbeeigenschaften, die in den meisten Fällen auf Organelle- und Molekularebene unspezifisch sind, und ihre konzentrationsabhängigen unerwünschten Nebenwirkungen. FM-Farbstoffe sind spezifisch für Lipid-Doppelschichten, die an Endo- und Exozytose teilnehmen. Welche subzellulären Organellen unter den getesteten Bedingungen sukzessive gekennzeichnet werden, ist jedoch nicht sofort ersichtlich und erfordert den Vergleich verschiedener FM-Farbstoffvarianten und eine Co-Kennzeichnung mit zusätzlichen organelle-spezifischen Markern. Die Präferenz von FM 1-43 für mitochondriale Membranen, im Vergleich zu FM 4-64, ist ein Beispiel. Zellwandselektive Farbstoffe zeigen unterschiedliche Spezifität für die drei Hauptpolymere der Pilzzellwand. ES wird angenommen, dass CFW ein unspezifischer Fleck für die Glucane und Chitins ist, SPF gilt als am selektivesten für die -1,4-Glucane, und CR wird als sehr selektiv für die Chitine von . Informationen zur Bindungsspezifität von PFS an Pilzzellwandpolysaccharide liegen derzeit nicht vor. Welches Verhältnis welches Pilzzellwandpolymer bei einer bestimmten Farbstoffkonzentration bei den untersuchten Pilzarten am effektivsten gekennzeichnet ist, lässt sich nicht leicht beantworten, und die Anwendung detaillierter Messungen, die in vitro oder in vivo bei anderen Organismen oder anderen Pilzarten erworben wurden, muss sehr sorgfältig geprüft werden. Leider ist diese Information spärlich und stark verstreut in der Literatur35,42,46. Neuere Aufzeichnungen, die auf früheren Studien33 folgen würden, um neue Einblicke in die genauen Färbeeigenschaften der vorgestellten Farbstoffe speziell in Pilzen zu liefern, sind derzeit nicht verfügbar.

Bildgebende Kontrollen sind wichtig, um Färbemuster und zelluläre Reaktionen genau zu bewerten. Der wohl schwierigste Teil ist jedoch, die Zellbiologie des Pilzes so gut zu kennen, dass die aufgezeichneten Veränderungen in der subzellulären Lokalisation von Membran- und Zellwandselektiven, Veränderungen in der zellulären Architektur oder Hyphalwachstumsmuster ausschließlich und selbstbewusst mit den beabsichtigten Wirkungen der experimentellen Behandlung in Verbindung gebracht werden können. Dazu ist es wichtig, neben jedem neuen Live-Zell-Bildgebungsexperiment auch gute Kontrollen zu haben. Dazu gehören der unbehandelte Wildtyp als negative Bildgebungskontrolle, um Hintergrundautofluoreszenz und Detektorrauschen aus dem erfassten Bild auszuschließen und einen morphologischen Vergleicher zu haben, wenn man mit Mutanten arbeitet. Darüber hinaus ist eine positive Bildgebungskontrolle, z. B. ein Stamm, der GFP oder RFP im Zytoplasma ausdrückt, oder ein anderes bekanntes fluoreszierendes Markerprotein unerlässlich, um die Anregungslichtintensität auf das erforderliche Minimum einzustellen und eine Zellvitalitätskontrolle zu haben. Sobald diese Kontrollen festgelegt sind, beschränkt sich die Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen nicht nur auf Visualisierungsaufgaben, sondern ihre konzentrationsabhängige Färbedynamik sowie konzentrationsabhängige Nebenwirkungen können analytisch genutzt werden; zum Beispiel zur quantitativen Überwachung der Zellwandbiosynthese in Echtzeit oder zur Identifizierung mutierter phänospezifischer Phänotypen in Anfälligkeits-Assays47.

Verbesserte zukünftige Anwendungen hängen von einer detaillierten funktionellen Analyse der Färbeeigenschaften ab. Eine große herausforderung besteht darin, quantitative Bildanalysen weiter zu verbessern und zu automatisieren, um die funktionelle Bewertung der subzellulären Dynamik von Membran- und Zellwandselektiven fluoreszierenden Farbstoffen in fadenförmigen Pilzen voranzutreiben. Dazu werden umfangreiche, quantitative Kolokalisierungsstudien dieser Farbstoffe mit bekannten Organelle- und Zellwandpolymermarkern in Kombination mit mutierten Stämmen benötigt, die in bestimmten Transportwegen mangelhaft sind oder an spezifischen Strukturkomponenten fehlen. Mehrere Endozytosemarker für vergleichende Analysen mit FM-Farbstoffen stehen48,49, und in Bezug auf die noch schlecht charakterisierten Bindungsspezifitäten von Zellwandfarbstoffen in Pilzen könnte die Anwendung fluoreszierend markierter Glucan-spezifische Antikörper50 eine Möglichkeit bieten, dieses Problem anzugehen.

Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen und nichts zu offenbaren haben.

Acknowledgments

Dank geht an den Tiroler Wissenschaftsfonds (TWF) für die Gewährung #256524 an AL, an den Wiener Wissenschafts- und Technologiefonds (WWTF) für die Gewährung #LS13-086 an die SZ und an den Publikationsfonds der Universität Innsbruck für die Unterstützung der Open-Access-Publikation. Die Autoren danken auch der Klinik für Zoologie der Universität Innsbruck für die Bereitstellung des konfokalen Laserscanmikroskops Leica TCS SP5 II.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BRAND cell counting chamber Merck BR718005 Thoma format
Calcofluor White M2R Merck/Sigma-Aldrich F3543 cell wall dye
CFI Plan Apo VC 60x/1.2 NA XC WI Nikon MRD07602 water immersion objective
CFI Plan Apo VC 60x/1.2 NA XC WI Nikon MRD07602 water immersion objective
Congo Red Merck/Sigma-Aldrich C6277 cell wall dye
Dimethyl sulfoxide VWR 8,36,73,230 organic solvent
Eclipse TE2000-E with C1 scanning unit Nikon custom configuration inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 2 and 4
Eclipse TE2000-U with Bio-Rad Radiance 2100 scannig unit Nikon custom configuration inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 5
FM 1-43 Merck/Sigma-Aldrich S6814 membrane dye
FM 4-64 Merck/Sigma-Aldrich S6689 membrane dye
Glass beads Rettberg 1340691030 3 mm glass beads
Glass cover slips Thermo Fisher Scientific BB02400600A113MNT0 24 x 60 # 1 glass cover slips
HCX PL APO 63x/1.3 NA Glyc Leica 15506353 glycerol immersion objective
LSM 510 Meta Zeiss custom configuration inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 3
M9 Minimal Medium Merck/Sigma-Aldrich M6030 generic fungal growth medium
Micro-slide 8-well ibidi 80826 ibiTreat #1.5 polymer coverslip
Miracloth Merck/Millipore 475855-1R polyester filtration material
Petri dish Sarstedt 8,21,472 92 x 16 mm culture dish w/o cams
Phytagel Merck/Sigma-Aldrich P8169 transparent gelling agent
Plan Apochromat 63x/1.4 NA Oil DIC Zeiss 440762-9904-000 oil immersion objective
Pontamine Fast Scarlet 4B Merck/Sigma-Aldrich 212490 cell wall dye
Potato Dextrose Agar (PDA) BD Difco 213400 fungal growth medium for T. atroviride
Potato Dextrose Broth (PDB) BD Difco 254920 fungal growth medium for T. atroviride
Reaction tube Sarstedt 72,706 1.5 mL SafeSeal tube
Scalpel B.Braun 5518016 Cutfix sterile scalpel #23
Screw cap tube Sarstedt 6,25,54,502 15 mL polypropylene tube
Solophenyl Flavine 7GFE 500 CIBA 1485385V6 cell wall dye
SynaptoGreen C4 Biotum 70020 membrane dye
SynaptoRed C2 Biotum 70021 membrane dye
Syringe membrane filter Thermo Fisher Scientific 723-9945 0.45 µm SFCA syringe filter
TCS SP5 II Leica custom configuration inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 1
Vogel's Minimal Medium (VMM) FGSC Fungal Genetics Stock Centre fungal growth medium for N. crassa

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References

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Lichius, A., Zeilinger, S.… More

Lichius, A., Zeilinger, S. Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi. J. Vis. Exp. (153), e60613, doi:10.3791/60613 (2019).

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