Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Anvendelse av membran og Cell Wall selektiv fluorescerende fargestoffer for Live-Cell Imaging av trådformede sopp

Published: November 28, 2019 doi: 10.3791/60613
Automatic Translation
1, 1
1Department of Microbiology, University of Innsbruck

Summary

Vital fluorescerende fargestoffer er viktige verktøy for Live-celle Imaging analyser i moderne fungal cellebiologi. Dette papiret detaljer anvendelsen av etablerte og mindre kjente fluorescerende fargestoffer for sporing av plasma membran dynamikk, Endo-/exocytosis og cellevegg morphogenesis i trådformede sopp.

Abstract

Anvendelsen av membran og celle veggen selektive fluorescerende fargestoffer for Live-celle Imaging analyser av organelle dynamikk i fungal celler startet to ti år siden, og siden da fortsetter å bidra sterkt til vår forståelse av trådformede fungal Livsstil. Dette papiret gir en praktisk guide for utnyttelse av de to membran fargestoffer FM 1-43 og FM 4-64 og de fire celle veggen flekker Calcofluor White M2R, Solophenyl Flavine 7GFE 500, Pontamine fast Scarlet 48 og Kongo Red. Fokuset er på deres lave dose anvendelse for å konstatere en gjenstand-fri farging, deres co-Imaging egenskaper, og deres kvantitative evaluering. De presenterte metodene gjelder for alle trådformede sopp prøver som kan tilberedes på de beskrevne måter. De grunnleggende flekker tilnærminger kan tjene som utgangspunkt for tilpasninger til arter som kan kreve ulike dyrking forhold. Først, Biofysiske og biokjemiske egenskaper er vurdert som deres forståelse er avgjørende for å bruke disse fargestoffer som virkelig vitale fluorescerende flekker. Dernest er trinn-for-trinn protokoller presenteres som detalj utarbeidelse av ulike fungal prøvetyper for fluorescerende Live-celle Imaging. Til slutt illustrerer eksempel eksperimenter ulike tilnærminger til: (1) identifisere defekter i den spatio organiseringen av endocytose i genetisk mutanter, (2) forholdsvis karakterisere delte og distinkte co-lokalisering av GFP-merket mål proteiner i endocytic veien, (3) identifisere Morfogenetiske cellevegg defekter i en genetisk mutant, og (4) overvåke celle veggen kognitiv i sanntid.

Introduction

Tjue år siden, den måten som hyphal morphogenesis og den underliggende molekylære cellebiologi kan være i form av trådformede sopp ble revolusjonert ved anvendelse av membranen selektive fluorescerende "fei Mao Dye FM 4-641." Senere, til fordel for kitin-binding Dye Calcofluor White som Vital fluorescerende markør av fungal celle veggen dynamikk ble realisert2. Siden da har både fargestoffer og varianter derav blitt en iboende del av Live-celle Imaging analyser av organelle dynamikk i sopp, og fortsette å gi enestående innsikt i trådformede fungal livsstil. Dette papiret detaljer anvendelsen av etablerte og mindre kjente fluorescerende fargestoffer for sporing av plasma membran dynamikk, Endo-og exocytosis og cellevegg morphogenesis i trådformede sopp. Endocytose sporing analyser tillate ulike celle biologiske spørsmål knyttet til den generelle studien av endocytose skal håndteres3. For dette, lokalisering, hastighet og rekken av fargede rom på FM fargestoff tillegg er registrert av tid forfalle mikroskopi og kvantitativt sammenlignet mellom testet fungal stammer4. Cell Wall fargestoffer avgrense den ytre grensen av cellen og tillate sporing av Morfogenetiske hendelser, inkludert polarisert hyphal tips vekst2, hyphal forgrening5, hyphal Fusion6,7 og septum formasjon8. Videre Letter de kvantifisering av lokaliserte cellevegg deponering og identifisering av defekter under celle veggen kognitiv9. Fordi detaljert kunnskap om biokjemiske og Biofysiske egenskaper av noen fluorescerende markør er en grunnleggende forutsetning for sin vellykkede in vivo program, disse egenskapene er først oppsummert for de seks fargestoffer omtalt i denne artikkelen.

Membran selektive fargestoffer
FM (fei Mao) styryl fargestoffer er små amfifile molekyler som ikke kan passere gjennom, men reverserbart forbinder med den ytre pakningsvedlegget til lipid bilayer av biologiske membraner10. De er praktisk talt ikke-fluorescerende i vandig løsning, men blir intenst fluorescerende på plasma membran integrering, genererer utmerket signal-til-støy (S/N)-prosenter11. Disse egenskapene gjør dem ideelt egnet for visualisering av plasma membran og intracellulære organelle dynamikk, inkludert sporing av Endo-og exocytosis12. Grønn-fluorescerende FM 1-43 og rød-fluorescerende FM 4-64 er de to mest brukte fluorescerende membran markører for disse formålene. SynaptoGreen C4 og SynaptoRed C2 er generiske molekyler fra alternative leverandører som kan brukes om hverandre i stedet for FM 1-43 og FM 4-64, henholdsvis.

Styryl fargestoffer består av tre viktige strukturelle områder: (1) den lipofile halen som forenkler innsetting av fargestoffet i lipid bilayer, (2) fluoroforen kjerne som bestemmer Spectral egenskapene til fargestoffet og er konstituert av to aromatiske ringer koblet sammen med en til tre doble obligasjoner, og (3) positivt ladet hydrofile hode som hindrer fullstendig innsetting og gjennomtrengning av fargestoff gjennom membranen (figur 1a).

Jo lenger den lipofile halen, jo høyere er fargestoffet er hydrofobisiteten og dermed bindende affinitet til membranen, men den nedre er dens vannløselighet og membran de-flekker rate. Følgelig, forskjellige FM fargevarianter produserer ulike flekker dynamikk og mønstre. Den høyere hydrofobisiteten til den C4-ensidige FM-1-43 gir et sterkere og mer stabilt fluorescens signal ved plasma membraner og interne organeller raskere enn den korteste C2 FM-4-64, når den påføres ved ekvimolare konsentrasjoner (figur 2).

Viktigere, den konstante og høye foreningen/dissosiasjon priser på både FM fargestoffer11 med gjennomsnittlig oppbevaringstid på 1-6 s per individuelle fargestoff molekyl13 Reduser sjansene for lokaliserte avbrudd av membran funksjon, for eksempel gjennom modifisering av membran flytende eller tvunget permanent interaksjon av membran proteiner. Dette er trolig den viktigste grunnen til at disse molekylene kan brukes som vitale fargestoffer. Likevel, FM Dye konsentrasjoner over 50 μm er giftig for sopp og planteceller2,14, og bevis fra by-2 tobakk protoplasts indikerer at mer enn 20 μM FM fargestoff føre til plasma membran metning14. Derfor er det ikke tilrådelig å overskride denne grensen, spesielt på grunn av det faktum at utmerket bildebehandling er oppnådd med så lite som 2 – 5 μM15,16.

Spesielt er de Spectral egenskapene til FM fargestoffer varierer sterkt avhengig av den spesielle membran mikromiljøet (gjennomgått14). Generelt, eksitasjon og utslipp Spectra av FM fargestoffer i ren løsningsmiddel løsninger (som vanligvis gitt i produktinformasjonen) avvike betydelig fra det i cellulære miljøer og kan, i de fleste tilfeller, ikke direkte konsulteres for å velge Live-Cell Imaging innstillinger. Den eksitasjon/utslipp Maxima av FM 1-43 og FM 4-64, for eksempel, blir blå-forskjøvet med 37/46 NM og 43/64 NM, henholdsvis når bundet til fungal membraner i forhold til sine løsninger i metanol (tabell 1).

Den banebrytende Fundamentals for bruk av FM 4-64 og FM 1-43 for sporing av plasma membran, Endo-/exocytosis og organelle dynamikk, inkludert Spitzenkörper og mitokondrier, har allerede blitt grundig dokumentert for et bredt spekter av trådformede fungal arter tidligere2,4,17,18,19. Anbefalte bildeinnstillinger for både FM fargestoffer som fungerer i ulike trådformede sopp arter er avbildet i figur 1B. Tekniske begrensninger av tilgjengelig utstyr eller spesielle cellulære og eksperimentelle forhold, som for eksempel kultur medium, pH eller temperatur, kan imidlertid kreve noen tilpasninger. Heldigvis, FM fargestoffer operere over et bredt Spectral Range, og svært god tenkelig resultater oppnås ved spennende FM 1-43 med 514 NM eller FM 4-64 med 488 NM. De optimale bildeinnstillingene må derfor fastsettes individuelt for hver prøve type og tiltenkte bruk.

Den betydelige Stoke ' s Skift av mer enn 135 NM i FM 4-64 gir utmerket, samtidig co-Imaging med fluorophores emitting grønt lys; Dette er ofte utnyttet for å evaluere intracellulære lokalisering dynamikk av grønne fluorescerende protein (GFP)-merket Fusion proteiner i forhold til plasma membranen og endocytic Pathway9,20.

Cell vegg-selektive fargestoffer
Calcofluor White M2R (CFW), også markedsført som fluorescerende Brightener 28, er sannsynligvis den mest kjente fluorescerende fargestoff som brukes til å flekk celleveggene av bakterier, sopp, alger, høyere planter og insekter. Opprinnelig brukt som optisk Whitening agent i papir, tekstil og vaskemiddel industrien, sine fordeler for den kliniske diagnosen fungal infeksjoner ble realisert tidlig på21,22. Fordi CFW Hesiod irreversibelt inn i begynnende kitin kjeden det forstyrrer normal kitin microfibril forsamlingen under celle veggen kognitiv dermed generere celle veggen stress23. Dette i sin tur utløser en cellevegg skade reparasjon mekanisme som fører til lokalt forsterket celle veggen avsetning som følge av Glukan og kitin syntase aktivisering24,25. Dette fenomenet kan oppstå med noen fargestoff som opererer ved stabilt binding til celle veggen polymerer, er konsentrasjon-avhengig og er mest merkbar på hyphal tips som representerer de mest produktive voksende og dermed mest følsomme deler av mycel (Figur 3). En omfattende oppsummering av molekylær maskineri som reagerer på cellevegg skade har nylig blitt gitt26.

Overdose fargestoff i kombinasjon med Phototoksisitet kan føre til rask cellelyse av hyphal rom (film 1). Likevel, økt følsomhet for fargestoff konsentrasjoner som er "vitale" i den ville typen kan utnyttes til å identifisere defekter i cellevegg biosyntesen av gen tap-av-funksjon mutanter9. For CFW og Kongo rød (CR), en annen tekstil fargestoff også kjent som direkte rød 28 og ansatt som α-og β-kitin-spesifikk cellevegg flekk for sopp og insekter27,28, terskel konsentrasjoner som sterkt induserer kitin synthases har blitt bestemt med > 60 μM CFW og > 70 μM CR, henholdsvis mens konsentrasjoner <15 μM av enten fargestoff ikke endre eller hemme soppvekst29,30,31. Hickey et al. plasserte denne terskel konsentrasjonen for CFW ved 25 μM2. Derfor er det tilrådelig å bruke farge konsentrasjoner ≤ 5 μM til å ekskludere stress relaterte gjenstander og sikre bruk av disse molekylene som virkelig "vitale fluorescerende fargestoffer"2,32. Dette gjelder like Solophenyl Flavine 7GFE 500 (SPF) og Pontamine fast Scarlet 4B (PFS), synonymt med direkte Yellow 86 og Direct Red 23, henholdsvis to andre nyttige celle veggen fargestoffer som søknad om sopp har blitt rapportert for første gang mer enn et ti år siden33. Men til tross for deres bemerkelsesverdige Spectral egenskaper34,35, har bruken av begge fargestoffer siden da vært svært begrenset36,37. Som tidligere vist for 1,5 μM CFW2, 2 μM SPF er tilstrekkelig til å løse celle veggen dynamikk under native forhold med svært høy Temporal oppløsning (film 2). De samme resultatene kan fås med 2 μM CR eller PFS.

Sammen utgjør disse fire fargestoffer, CFW, SPF, PFS og CR, et sett med cellevegg-selektive fluorescerende markører som dekker nesten hele det synlige utslipps lyset spektrum (400 – 700 NM) benyttet på moderne fluorescerende mikroskop (Figur 4). Den betydelige økningen i fluorescens intensitet ved binding til Cell Wall polymerer er iboende til alle fire og genererer gode S/N-prosenter. Dette i sin tur tillater å holde fargestoff konsentrasjoner og eksitasjon lys intensitet svært lav og gjør det mulig å utføre celle veggen flekker som "lav dose" Live-celle Imaging teknikk2. Fordi disse cellevegg fargestoffer er plasma membran ugjennomtrengelig, de samtidig fungere som levende/døde flekker. Spesielt på grunn av deres ekstremt brede utslipps lys Spectra, noen begrensninger om co-Imaging egenskaper av CFW og SPF med andre fluorophores må nøye vurderes.

Protocol

1. utarbeidelse av sopp prøver

  1. Fungal pre-kulturer
    1. Vaksinere ønsket belastning på en passende solid agar medium, slik som potet druesukker agar (PDA) for Trichoderma atroviride eller Vogel ' s minimal medium (VMM) for Neurospora crassa. Legg til et passende markeringsmerke når du arbeider med transformant stammer.
    2. Ruge den pre-kulturen ved organismen optimale temperatur. For eksempel, T. atroviride ved 25 ° c og N. Crassa ved 30 ° c, og 12 h/12 h lys/mørke sykluser til en sporulating mycel har utviklet men ennå ikke nådd kanten av platen. På en standard størrelse Petri parabolen (9,2 cm Ø), dette tar Wild-type T. atroviride på 4-6 dagers gjennomsnitt, mens N. crassa Wild type når dette stadiet etter 3-4 dager i gjennomsnitt.
  2. Dyrking av sopp kolonier
    1. Ved hjelp av en steril skalpell, kuttet en liten 3 mm x 3 mm agar blokk bærer ikke-sporulating mycel fra kolonien kanten av pre-kulturen.
    2. Plasser agar blokken i midten av en frisk solid medium plate for å vaksinere den eksperimentelle kulturen.
    3. Ruge den eksperimentelle kulturen i henhold til utviklingsfasen ment å bli undersøkt. For eksempel, den ville-type T. atroviride krever 20-22 timer ved 25 ° c i mørket for å utvikle kolonier av ca 2 cm diameter på PDA, mens vill-type N. crassa når koloni diameter på ca 4 cm etter 14-16 h av Inkubasjons ved 30 ° c i mørket på VMM.
      Merk: Inkubasjons i mørket hindrer dannelse av pigmenter som kan innføre autofluorescence. For at fjerne medium miljøet fluorescens fra det eksperimentelle kulturen, ombytte agar med 1,5% w/v av en gjennomsiktig solidifying agent (se bordet av materialer), og alle innviklet medium med en definerte minimal medium.
  3. Dyrking av solide germling kulturer
    1. Bruk 5 mL steril fysiologisk saltoppløsning (0,9% w/v NaCl) for å høste conidial sporer fra pre-kulturen plate og samle den resulterende spore suspensjonen i en 15 mL skrue cap tube.
    2. Bland spore suspensjonen godt ved energisk virvlingen og deretter filtrere den over en 1 cm x 5 cm stripe av sterilt filter stoff (se tabell over materialer) lett stappet inn i en 1 ml pipette TIP (både montert og autoklaveres forhånd) til en frisk steril tube.
    3. Bestemme spore tetthet med en celle telling kammer og forberede en 1 x 107 celler/ml spore suspensjon med fysiologisk saltløsning.
      Merk: spore fjæringen kan oppbevares ved 4 ° c i opptil to uker.
    4. Klargjør en standard størrelse Petri rett (9,2 cm Ø) med 20 mL fast medium og tilsett 15-20 sterile glassperler (3 mm Ø) på toppen.
    5. Pipetter 200 μL av spore-fjæringen på medium platen og fordele cellene jevnt over hele platen ved å riste forsiktig. Samle glass perlene i et beger med 70% etanol for gjenbruk.
    6. Ruge den eksperimentelle kulturen i henhold til utviklingsfasen ment å bli undersøkt. For eksempel krever T. atroviride Wild- typen 5 – 6 timer ved 25 ° c i mørket for å utvikle conidial GERMLINGS på PDA, mens N. crassa Wild-typen utvikler conidial germlings etter 3 – 4 timer med Inkubasjons ved 30 ° c i mørket på VMM.
      NOTE: for at fjerne alle medium miljøet fluorescens fra det eksperimentelle kulturen, ombytte agar med 1,5% w/v av en gjennomsiktig solidifying agent, og alle innviklet medium med en definerte minimal medium.
  4. Dyrking av flytende germling kulturer
    1. Fyll 190 μL av flytende kultur medium inn i hver brønn av en 8-brønn kamret mikro-Slide.
    2. Tilsett 10 μL av en 1 x 107 celler/ml spore løsning (utarbeidet i trinn 1.4.1-1.4.3) og bland ved forsiktig pipettering opp-og-ned et par ganger. Det resulterende totale antall celler er 1 x 105 per brønn.
    3. Ruge den eksperimentelle kulturen i henhold til utviklingsfasen ment å bli undersøkt. For eksempel, Wild type T. atroviride krever 5-6 h ved 25 ° c i mørket for å utvikle conidial germlings i potet druesukker BULJONG (pdb), mens den ville typen N. crassa utvikler conidial germlings etter 3-4 h av Inkubasjons ved 30 ° c i mørket i flytende VMM.

2. utarbeidelse av Dye arbeider løsninger

  1. For å garantere full løselighet av hver fargestoff, forberede 2 mM lager løsninger i dimethyl sulfoxide (DMSO) ved å legge til riktig mengde (se nøyaktige vekter i tabell 1) til 1 ml 100% DMSO og bland godt av virvlingen.
    FORSIKTIG: Sørg for å ta DMSO fra en septum-forseglet flaske; Det bør være en klar gjennomsiktig væske. Ved kontakt med luft, blir DMSO brun-sannsynligvis på grunn av oksidasjon av spor urenheter-og kan negativt påvirke cellevekst eller fargestoff flekker.
  2. Filteret sterilisere lager løsningen gjennom et sprøyte membran filter på 0,2 μm til en frisk, steril 1,5 mL reaksjons slange. For å minimere fargestoff bleking, Pakk røret i aluminiumsfolie.
    Merk: fargestoff lager løsningen kan aliquoted i mindre volumer for å unngå tine/fryse sykluser, og oppbevares ved 4 ° c i flere måneder.
  3. Klargjør en væske arbeids løsning på 20 μM ved oppløsning av 2 μL farge lager oppløsning i 198 μL av sterilt destillert vann i et friskt, sterilt 1,5 mL reaksjons rør. For å minimere fargestoff bleking, Pakk røret i aluminiumsfolie.
    Merk: Dye arbeider løsning bør tilberedes fersk på dagen av eksperimentet.
  4. Under prøve montering (se pkt. 3) vil farge arbeids løsningen bli Standardly fortynnet 1:10, noe som resulterer i en endelig farge konsentrasjon på 2 μM og 0,1% w/v endelig DMSO-konsentrasjon.
    Merk: valg av ulike fortynning faktorer ved å endre Volumforholdet mellom Dye arbeider løsning og montering væske, gjør det mulig å enkelt tilpasse den ønskede endelige fargestoff konsentrasjon.
    FORSIKTIG: for å unngå uønskede effekter på grunn av fargestoff eller DMSO-toksisitet, bør fortynningsfaktoren ikke falle under 1:4 for å oppnå maksimale endelige konsentrasjoner av 5 μM fargestoff og 0,4% w/v DMSO. Høyere fargestoff konsentrasjoner vil raskt mette systemet og forhindre pålitelig signal kvantifisering, mens mer enn 0,5% w/v (≥ 62,5 mM) DMSO kan svekke celle utvikling38.

3. prøve forberedelser for mikroskopi

  1. Mount prøver fra fungal kolonier (trinn 1,2) eller solid germling kulturer (trinn 1,3) av invertert agar blokken metoden.
    1. Hold en ren 24 mm x 60 mm glass deksel slip (#1 = 0.13-0.16 mm tykkelse) klar og tilsett 18 μL av flytende minimal medium (VMM eller M9) eller fysiologisk saltløsning på midten.
    2. Tilsett 2 μL av farge løsningen 20 μM med 18 μL væske og bland godt ved å pipettering opp og ned flere ganger, samtidig som man unngår produksjon av luftbobler.
      Merk: Når du arbeider med flere prøver, er det tilrådelig å forberede en mester blanding av væske-Dye løsning for alle for å sikre lik fargestoff konsentrasjon gjennom eksperimentet.
    3. Med en ren skalpell, Skjær ut en 15 mm x 15 mm prøve fra periferien av kolonien eller solid germling kultur og plassere den vertikalt ved siden av medium drop på dekselet slip.
    4. Ved hjelp av skalpell for å støtte den øvre kanten av blokken og en finger for å holde baksiden av blokken på plass, sakte senke siden bærer mycel eller germlings på væsken. Prøven er nå klar for overføring til mikroskop fasen.
      FORSIKTIG: det er viktig å gjøre dette langsomt og svært forsiktig for å minimere mekanisk belastning på cellene og for å unngå luftbobler blir fanget mellom prøve og cover slip.
  2. Monter væsken germling kulturer fra trinn 1,4.
    Merk: de fleste praktisk, flytende germling kulturer i kamret mikro-brønn lysbilder kan overføres direkte og videre manipuleres på mikroskopet scenen.
    1. Tilsett 22 μL av farge arbeider løsning til 200 μL av flytende medium for å resultere i standard endelige konsentrasjoner av 2 μM fargestoff og 0,1% w/v DMSO.
      Merk: flytende germling kulturer har den store fordelen at fluorescerende fargestoffer (eller andre kjemikalier, slik som hemmere) kan legges til et hvilket som helst ønsket tidspunkt av eksperimentet, også under innspillingen. I så fall må spesiell forsiktighet tas for å administrere væsken synker svært langsomt for å ikke forstyrre cellene. System vibrasjoner og Brownske bevegelse kan allerede innføre noen celle bevegelse.

4. live-celle mikroskopi

  1. Juster de grunnleggende innstillingene for bilde anskaffelse. Følgende bilde anskaffelses innstillinger gjør det mulig å fange opp farge dynamikk i individuelle hyfer og gjelder for begge de følgende analysene:
    1. Påfør 5 – 10% laser effekt på 20% av den fulle utgangseffekten på enheten.
    2. Bruk en plan Apo 60x-63x glyserol eller vann nedsenking mål med en høy numerisk blenderåpning ≥ 1,2.
    3. Begrens bilde anskaffelses området til omrisset av hyfer ved å angi en bildestørrelse på 1024 x 256 piksler og ved å bruke en optisk zoomfaktor på 2 – 3.
    4. Bruk toveis skanning med 400 Hz. Juster pinhole størrelse til 1 luftig enhet.
    5. Sett gevinsten av de mest følsomme detektoren til 100%.
    6. For tids runder innspilling, start image oppkjøpet med ett bilde hver 15 s for å tillate rimelig Temporal oppløsning uten å produsere fargestoff bleking eller Foto stress.
    7. For 3D-opptak setter du øvre og nedre romlig grense til grensen av hyfer og plass optiske seksjoner 1 μm fra hverandre for å gi rimelig romlig oppløsning.
      Merk: på grunn av den raske veksten av hyfer, har høy romlig oppløsning i Z-aksen ofte blitt ofret for høy Temporal oppløsning i X/Y-aksen eller den andre veien rundt. Bare svært moderne konfokalmikroskopi laserskanning mikroskop er raske nok til å tilfredsstille begge krav.
  2. Endocytose opptak analyser
    1. Rådfør deg med figur 1 og tabell 1 for å finne de beste eksitasjon/utslipps innstillingene for FM 1-43 og/eller FM 4-64 som er tilgjengelig på mikroskopi systemet, og juster deretter.
      Merk: med den anbefalte 2 μM konsentrasjon, innlemmelse av FM fargestoff i plasma membranen er Instant i normale friske celler. Hele prosessen fra første plasma membran farging til fargestoff utseende i rørformede vakuoler er vanligvis ferdig innen 30-45 min ved romtemperatur. Øke FM farge konsentrasjon øker S/N-ratio og dermed produserer høyere kontrast bilder raskere. Imidlertid, den likeledes setter fart i opp merkingen forarbeide gjør den flere vanskelig å skille ut det kronologisk rad av organelle flekk.
    2. Start bildeopptak ved hjelp av ovennevnte anbefalte grunnleggende bilde anskaffelses innstillinger og evaluere resultatene.
    3. Optimaliser innstillingene for bildeinnhenting til den romlige og timelige oppløsningen som kreves for å fange opp aspektet ved plasma membranen eller den endocytose dynamikken eksperimentet er fokusert på.
    4. For eksempel, for å fange svært rask dynamikk i X/Y, redusere den generelle bildestørrelsen, bildet bare ett fokal plan og øke skanningen hastigheten til 1 FPS. Hvis du vil ha høyere oppløsning i Z-aksen, reduserer du oppløsningen i X/Y, reduserer bildestørrelsen og reduserer avstanden mellom optiske inndelinger til 0,5 μm.
  3. Dynamikk for cellevegg
    1. Rådfør deg med Figur 4 og tabell 1 for å finne de beste eksitasjon/utslipps innstillingene for brukt cellevegg fargestoff som er tilgjengelig på mikroskopi systemet og juster deretter.
      Merk: på grunn av deres brede utslipp Spectra, CFW og SPF er ikke godt egnet for samtidig co-Imaging med andre fluorophores, overveiende GFP. Noen restriksjoner gjelder også for sekvensiell bildebehandling tilnærminger med disse fargestoffer, og dermed må optimaliseres individuelt.
    2. Start bildeopptak ved hjelp av ovennevnte anbefalte grunnleggende bilde anskaffelses innstillinger og evaluere resultatene.
      Merk: med den anbefalte 2 μM konsentrasjon, inkorporering av fargestoff inn i celle veggen er ikke nødvendigvis umiddelbar, men rimelig rask. Hele prosessen med septum formasjon, for eksempel, tar i gjennomsnitt ca 5-7 min ved romtemperatur20. Øke celle veggen fargestoff konsentrasjon øker S/N-ratio og dermed produserer høyere kontrast bilder raskere. Men det også raskt introduserer gjenstander på grunn av indusert celle veggen skade reparasjon.
    3. Optimaliser bilde anskaffelses innstillingene til den romlige og timelige oppløsningen som kreves for å fange opp aspektet ved cellevegg morphogenesis eksperimentet er fokusert på, som beskrevet i punkt 4.2.3.

Representative Results

Kvantitativ bildeanalyse
I tillegg til "bare" visualisere cellulære prosesser, gjør live-celle Imaging for å trekke ut kvantitativ informasjon fra de innspilte data. Generelt er kvantitativ bildeanalyse et komplekst emne hvis riktig diskusjon er langt utover omfanget av denne artikkelen, derfor er leseren henvist til dedikerte lærebøker og artikler39,40,41. Likevel er noen grunnleggende retningslinjer knyttet til følgende eksempel data gitt. Flere viktige forutsetninger må oppfylles for å tillate bilde kvantifisering, inkludert: (1) definert molarities av fluorescerende fargestoffer må brukes på alle prøver for å muliggjøre nøyaktig relativ sammenligning; (2) bilde anskaffelses innstillinger må justeres på en måte som utslipps lys detektorer aldri blir mettet, ellers vil maksimal intensitet kuttes av; (3) bilde oppkjøpet innstillinger må være fast i løpet av en sammenhengende eksperimentell sett, ellers kunstig intensitet endringer er innført; (4) bildedata må lagres i en informasjons-lossless filformat sammen med meta-informasjon som inneholder alle instrument innstillinger; og (5) bildeanalyse bør begrenses til minimalt antall innlegg behandlingstrinn som kreves for å trekke ut ønsket kvantitativ informasjon.

Vanligvis definerte standarder som ville tillate absolutt kvantifisering av innspilte signaler er ikke tilgjengelig i den levende cellen. Således, i sin enkleste form, er kvantitativ bildeanalyse avhengig av relativ sammenligning av piksel intensitet i samme bilde eller mellom ulike bilder som er tatt opp med identiske innstillinger. Produsentens mikroskop kontrollprogramvare inkluderer normalt grunnleggende verktøy for bilde etterbehandling og kvantitativ analyse, eller kan oppgraderes med tilleggsfunksjoner for bilde segmentering, terskelverdi, ratio Imaging, etc. Flere åpen kildekode bildebehandling plattformer, forskjellig egnet for ulike typer Imaging data, er tilgjengelig, inkludert ImageJ (https://imagej.net; https://imagej.nih.gov/ij/), isete (http://icy.bioimageanalysis.org/), CMEIAS Bioimage informatikk (http://cme.msu.edu/cmeias/) og Wimasis (https://www.wimasis.com/en/).

De presenterte eksempeldataene ble behandlet og analysert ved hjelp av ImageJ-plattformen. Kort, bestemte regioner i cellen, for eksempel hyphal spissen Apex eller septa, er merket med betydelig området utvalg verktøy, og intensiteten av alle inneholdt piksler er avlesning med programvaren implementert "måleverktøy". Intensiteten data fra kontroller og eksperimentelle prøver er overført til en regnearkfil, matematisk analysert og utarbeidet som graf. Ytterligere detaljer kan finnes i de siterte opprinnelige publikasjonene.

Eksempel data 1: FM 4-64 opptak analyser
Fungal prøvene ble dyrket som kolonier (trinn 1,2) og montert av den omvendte agar blokken metoden (trinn 3,1). Den endelige konsentrasjonen av FM 4-64 var 1,67 μM. Imaging innstillinger: HCX PL APO 63x/1.3 NA glyserol nedsenking objektiv på en invertert konfokalmikroskopi laserskanning mikroskop (se tabell over materialer); FM 4-64 eksitasjon ved 488 NM og utslipp på 600 – 700 NM; ett bilde hvert minutt i opptil 150 min. FM 4-64 opptak analyser identifiserte defekter i spatio-Temporal organisering av endocytose i gen sletting og gen overexpressing mutanter av fungal-spesifikke Sur7-familien protein 2 (Sfp2) av T. atroviride9 (figur 5).

Eksempel data 2: FM 4-64 co-farging av fluorescerende Fusion proteiner rettet mot endocytic rom
Fungal prøvene ble dyrket som kolonier (trinn 1,2) og montert av den omvendte agar blokken metoden (trinn 3,1). Den endelige konsentrasjonen av FM-4-64 var 2 μM. bildeinnstillinger: CFI-plan Apo VC 60x/1.2 NA XC vann nedsenking objektiv på et invertert konfokalmikroskopi laserskanning mikroskop (se tabell over materialer); GFP eksitasjon på 488 NM og utslipp på 500-530 NM, FM 4-64 eksitasjon på 488 NM og utslipp på 600 – 700 NM, og lyse felt med overført lys detektor, alle samtidig; en ramme hver 15 s for opp til 15 min. FM4-64 co-farging ble brukt til å relatere den subcellulære fordelingen av de to forbedrede grønne fluorescerende protein (EGFP)-Tagged transmembrane proteiner Sfp2 og Gpr1 til endocytic veien i T. atroviride (figur 6, film 3, film 4).

Eksempel data 3: FM 4-64 co-farging for identifisering av Morfogenetiske forskjeller
Fungal prøvene ble dyrket som kolonier (trinn 1,2) og montert av den omvendte agar blokken metoden (trinn 3,1). Den endelige konsentrasjonen av FM 4-64 var 2 μM. Imaging innstillinger: plan Apochromat 63x/1.4 NA olje nedsenking objektiv på et invertert konfokalmikroskopi laserskanning mikroskop (se tabell over materialer); GFP eksitasjon på 488 NM og utslipp til 505-550 NM, FM 4-62 eksitasjon på 488 NM og utslipp på 574-691 NM, og lyse felt med overført lys detektor, alle samtidig; ett bilde hver 8,5 s i opptil 15 min. FM4-64 co-farging lov til å relatere subcellulære lokalisering dynamikken i fluorescensmerkete merket BUD-6 polarisome kompleks protein for å endosome smugling-avhengige prosesser, slik som dannelsen av septa og polarisert hyphal spissen vekst, og preget forskjeller i subcellulære organisasjon og hyphal arkitektur mellom vill type og mutant stammer av N. crassa (figur 7, film 5).

Eksempel data 4: cellevegg flekker avslører Morfogenetiske forskjeller
Fungal prøvene ble dyrket som kolonier (trinn 1,2) og montert av den omvendte agar blokken metoden (trinn 3,1). Endelige konsentrasjoner av 2 μM CFW, 20 μM SPF og 100 μM CR ble brukt. Bildeinnstillinger: CFI-plan Apo VC 60x/1.2 NA XC vann nedsenking objektiv på et invertert konfokalmikroskopi laserskanning mikroskop (se tabell over materialer); CFW og SPF eksitasjon ved 405 NM og utslipp på 430 – 470 NM, CR eksitasjon ved 543 NM og utslipp på 580 – 620 NM. De ulike samspill egenskaper av CFW, SPF og CR med celle veggen polymerer markere Morfogenetiske forskjeller mellom Δsfp2 mutant og den ville typen stamme av T. atroviride9. Økende cellevegg stress påført av forhøyede fargestoff konsentrasjoner skjer raskere og mer uttalt i mutant i forhold til den ville typen. I tillegg, de samme bildene tillater å kvantifisere Morfogenetiske forskjeller om hyphal diameter og septal avstand mellom begge stammer (Figur 8).

Eksempel data 5: sanntidsovervåkning av cellevegg biosyntesen
Germlings ble dyrket som flytende kultur (trinn 1,4) i 8-brønn kamret mikro-lysbilder (trinn 3,2). Den endelige CFW konsentrasjonen var 0,12 μM. Imaging innstillinger: CFI plan Apo VC 60x/1.2 NA XC vann nedsenking objektiv på en invertert konfokalmikroskopi laserskanning mikroskop; CFW eksitasjon ved 405 NM og utslipp ved 420 – 470 NM; ett bilde hver 20 s i opptil 35 min. Den svært lave CFW konsentrasjonen hindrer metning av celle veggen med fargestoff molekyler og tillater kvantitativ sanntids overvåking av celle veggen biosyntesen. Dette avslører at deponering av nye celle veggen materialet ikke er ensartet, men reagerer svært raskt til lokaliserte fysiske påkjenninger som følge av den relative forskyvning av en celle på celle-celle-vedlegg før germling fusjon i N. crassa (figur 9, film 6).

Figure 1
Figur 1: biokjemiske og Biofysiske egenskaper av FM fargestoffer. (A) kjemiske strukturer av FM 1-43/SynaptoGreen C4 og FM 4-64/SynaptoRed C2. (B) absorpsjon og utslipp Spectra av både FM fargestoffer, kledde med de optimale bildeinnstillinger for membran-bundet fargestoffer i trådformede sopp: 445-495 NM blått lys vil opphisse FM 1-43 med 100-80% effektivitet, mens 488 NM på en Argon laser vil opphisse fargestoff med 91% effektivitet. På grunn av den blå-Shift på membran binding (*), er det optimale deteksjonsområdet for FM 1-43-utslipp mellom 520 – 590 NM. På samme måte er de optimale bildeinnstillingene for FM 4-64 i sopp er 471 – 541 NM (100 – 80% effektivitet) ved bruk av en polykromatisk eksitasjon lyskilde eller 514 NM (99% effektivitet) ved bruk av en Argon-laser, og 650 – 750 NM for påvisning av lys deteksjon. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: samtidig co-Imaging av fm 1-43 og fm 4-64. En ekvimolare blanding av begge fargestoffer ble tilsatt til en flytende germling kultur av N. crassa som gir en endelig konsentrasjon på 10 μM. Ved 25 min etter fargestoff tillegg, FM 1-43 har farget plasma membranen og allerede akkumulert i interne membraner, inkludert sterkt farget mitokondrier (m), men i stor grad unntatt vacuolar membraner (v), og er mer enn åtte ganger sterkere sammenlignet med FM 4-64 (gjennomsnittlig fluorescens intensitet 176 til 21, henholdsvis), hvis lavere hydrofobisiteten/høyere hydrofiliteten bremser ned sin internalisering hastighet fører til en lengre bolig tid på plasma membranen. Scale bar = 10 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: celle veggen stress-indusert deponering av celle veggen polymerer på spissen Apex innebærer ofte celle autolyse. Hyfer av T. atroviride uttrykker cytoplasmatiske GFP ble beiset med 10 ΜM SOLOPHENYL Flavine 7GFE 500 (SPF) og avbildet umiddelbart ved montering. Ikke-stresset hyfer (a), understreket hyfer med litt økt Glukan/kitin deponering på Apex og progresjon autolyse (b), og tungt stresset hyfer med uttalt apikale Glukan/kitin cap (stjerne) og Terminal autolyse (c) tydelig av det totale tapet av GFP fluorescens og omfattende vacuolization. Scale bar = 10 μm. Se film 1 for heltid kurs sekvens. Merk at de tre hyfer var faktisk plassert ved siden av hverandre. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: biokjemiske og Biofysiske egenskaper av celle veggen selektive fargestoffer. Kjemiske funksjoner gitt er at av natrium salter av hvert fargestoff. Absorpsjon og utslipp Spectra tilsvarer de i cellulære miljøer. Indikert monokromatisk laser eksitasjon linjer (skrevet i farger), polykromatisk eksitasjon områder som gjelder for epifluorescence mikroskop, og utslipps lys deteksjon områder er de som er anbefalt for Imaging i trådformede sopp. To laser eksitasjon linjer indikeres når begge fungerer like godt. (*) Utslipps spekteret av cellevegg-bundet PFS er betydelig mer rød-forskjøvet enn tidligere bemerket33, men resulterer i svært gode S/N-prosenter med lavere fargestoff konsentrasjoner enn brukt før. Hele spekteret av CR er for tiden utilgjengelig, derav at Nilen rød (CAS no: 7385-67-3) vises som den nærmeste kampen. Detaljert informasjon om Spectral egenskapene til CR kan bli funnet andre steder42. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: påvirkning av Sfp2 på endocytic opptaket av FM4-64. Tre påfølgende viktige stadier av FM farge opptak er lett merkbar i vill type (WT). Stage jeg: eksklusive plasma membran farging, scene II: første opptreden av FM fargestoff i endocytic blemmer, og scenen III: eksklusive farging av endocytic blemmer og endomembranes. Ekvivalente farge mønstre vises på det tidligste tidspunktet for utseendet. I forhold til T. atroviride Wild type, endocytose er litt akselerert i sfp2 over-uttrykker mutant (OEsfp2), mens farge opptak er dramatisk forsinket i sfp2 sletting mutant (Δsfp2). For eksempel oppstår fargestoff opptak i plasma membranen kjapt i OEsfp2 , men tar 2 min i vill type; og fullstendig internalisering av FM fargestoff fra plasma membranen oppstår 10x raskere i OEsfp2 sammenlignet med Δsfp2. Vektstenger = 5 μm. Figuren er gjengitt fra Atanasova et al.9 i avtale med Creative Commons License (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: co-farging av EGFP-merket membran proteiner med FM 4-64 forenkler differensiering av distinkte subcellulære lokalisering dynamikk i T. atroviride. (A) de fire-transmembrane domene protein Sfp2 co-lokaliseres med FM4-64 merket organeller, inkludert plasma membranen og Septa, den Spitzenkörper (SPK, pil) og presumable rørformede vakuoler. (B) GPCR-lignende syv-transmembrane protein Gpr1 co-LOKALISERES med FM4-64 til samme organeller som Sfp2, bortsett fra SPK. skala barer, 10 μm. Se film 3 og film 4 for heltidskurs sekvenser. Figuren er blitt modifisert fra Atanasova et al.9 i overensstemmelse med Creative Commons License. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7: FM 4-64 farging skiller Δbud-6 mutant fra vill type, og lokaliseres bud-6 på septal ringen. (A) FM 4-64 farging av hyfer av N. crassa Wild type (pilene indikerer Septa; pilspisser indikerer SPK). (B) Septa og SPK er fraværende i ∆bud-6. Vektstenger, 50 μm. (C og D) nærbilde av hyphal Apex og subapex av vill type (c) og ∆bud-6 (D). SPK (pilspissen) skiller i vill type, men ikke ∆bud-6. Parenteser indikerer at den kjernefysiske ekskluderings sonen ikke er etablert i ∆bud-6. Skala bars = 5 μm. (E) bud-6-GFP rekruttering til begynnende septation stedet foregående plasma membran invagination (pilspisser) og tilhørende septal innsnevring. Vektstenger = 5 μm. Se film 5a og Movie 5B for fullstendige tid kurs sekvenser. Figur er gjengitt med modifikasjoner fra Lichius et al.16 i avtale med Creative Commons License. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 8
Figur 8: sletting av sfp2 endrer deponering mønster av cellevegg materiale og påvirker hyphal Morphogenesis av T. atroviride. (A) CFW og SPF flekker avslører økt cellevegg deponering i Δsfp2 (piler) i forhold til den ville typen (WT). CR farging induserer omfattende spissen hevelse bare i Δsfp2 (pilspisser). Skala bars = 10 μm. (B) Morfogenetiske defekter i Δsfp2 inkluderer betydelig reduserte septal avstander (Δsfp2 = 26,0 μm, vill type = 85 μm; n = 60; ANOVA pr < 2 − 16) og mindre hyphal diametere (∆sfp2 = 5,6 μm, vill type = 12,6 μm; n = 100; ANOVA pr < 2 − 16). (C) økt fargestoff fluorescens i spissen Apex sammenlignet med subapex. Scale bar = 5 μm. (D) intensitet-kodet 3D overflate tomt på (C). (E) kvantifisering av relative fluorescens intensitet i Δsfp2 og Wild type (n = 55). Figuren er gjengitt fra Atanasova et al.9 i overensstemmelse med Creative Commons License. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 9
Figur 9: sanntidsovervåkning av cellevegg biosyntesen. (A) Conidial anastomose Tube (cat) fusjon mellom Germlings av N. crassa. Fysisk kontakt blir synlig ved germling Moment respons (21 – 28 min.). Intensitet fargekodet CFW fluorescens indikerer regioner med liten (mørk blå) og intens (gul) celle veggen deponering. Den opprinnelige unstained homing TIP (pilspissen), innskudd ny cellevegg materiale på spissen kontakt og i området opplever den største fysiske stress (pil). Scale bar = 5 μm. Se film 6 for full tid kurs sekvens. Figur gjengitt fra38 med tillatelse. (B) projeksjon av (A) indikerer fire sirkulære områder der fluorescens intensitet ble målt. Scale bar = 5 μm. (C) handlingen i de angitte regionene som viser den raske økningen i lokaliserte cellevegg biosyntesen som svar på fysisk stress (Cat 1, pil). I bakterie røret (GT) og spore kroppen (conidium), celle veggen biosyntesen øker jevnt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Movie 1
Film 1: Dye-indusert cellevegg stress. 10 μM SPF (cyan) ble lagt til T. atroviride hyfer uttrykker cytoplasmatiske GFP (magenta). Omfattende spissen flekker oppstår umiddelbart, etterfulgt av den raske lyse av hyphal rom innen 2 min; tydelig ved forsvinningen av GFP fluorescens. Vennligst klikk her for å laste ned denne filmen.

Movie 2
Film 2: Vital SPF farging. 2 μM SPF (cyan) tillater å spore spissen vekst av T. atroviride hyfer med høy romlig og tidsmessig oppløsning uten å indusere celle veggen stress gjenstander på spissen Apex. Vennligst klikk her for å laste ned denne filmen.

Movie 3
Film 3: FM 4-64 co-farging av Sfp2-GFP. Co-farging av T. atroviride uttrykke Sfp2-mEGFP (grønn) med 1,67 μM FM 4-64 (rød) avslører overlappende og distinkt lokalisering av membranen protein med endocytic veien. Vennligst klikk her for å laste ned denne filmen.

Movie 4
Film 4: FM 4-64 co-farging av Gpr1-GFP. Co-farging av T. atroviride uttrykke Gpr1-mEGFP (grønn) med 1,67 μM FM 4-64 (rød) avslører overlappende og distinkt lokalisering av membranen protein med endocytic veien. Vennligst klikk her for å laste ned denne filmen.

Movie 5
Film 5: FM 4-64 co-farging av bud-6-GFP. (5a) co-farging av N. crassa uttrykker bud-6-GFP (grønn) med 2 μM FM 4-64 (rød) tillate sporing av bud-6 dynamikk under septum formasjon i forhold til den tilhørende plasma membran invagination. (5B) beskjæres og flette bilde av (5A). Vennligst klikk her for å laste ned Movie 5a
Vennligst klikk her for å laste ned Movie 5B.

Movie 6
Film 6: sanntidsovervåkning av cellevegg biosyntesen. N. crassa GERMLINGS uttrykker mak-1-GFP (grønn) var co-beiset med 0,12 μM CFW (blå) for å avdekke lokaliserte celle veggen KOGNITIV under Cat-mediert germling fusjon. Merk at det er noen blø gjennom av CFW signal i GFP kanaler, illustrerer at SPF eller CR er bedre valg som sekvensiell og samtidig co-Imaging fargestoffer for GFP, henholdsvis. Vennligst klikk her for å laste ned denne filmen.

Tabell 1: egenskaper for membran og cellevegg selektive fluorescerende fargestoffer. * = mg/mL verdier korrigert for redusert renhet/Dye innhold for å resultere equimolarity i alle løsninger; n.i.a. = ingen informasjon tilgjengelig. Vennligst klikk her for å laste ned denne tabellen.

Discussion

Denne artikkelen fortsetter banebrytende arbeid som etablerte bruk av ulike fluorescerende fargestoffer som vitale organelle markører for trådformede sopp i begynnelsen av 2000-tallet2,4,43, og forsøker å diskutere photophysical og celle biologiske egenskaper FM fargestoffer og valgt cellevegg fargestoffer i større detalj enn før. Spesielt med hensyn til uønskede cellulære effekter, slik som membran metning eller cellevegg skade, som oppstår over visse farge konsentrasjoner. Det som tidligere har blitt betraktet som ikke-giftig på cellenivå er nå betraktet som giftig på molekylnivå. Selv om disse effektene kan være svært subtile og ikke direkte tydelig av åpenbare endringer i organelle eller celle atferd, alle mulige forstyrrelser av Dye anvendelse enn visualisering må minimeres for etterforskningen av innfødte molekylær funksjon. Heldigvis, forbedret følsomhet og Quantum effektivitet av moderne detektorer, slik som silisium skred PHOTODIODE detektorer (si-APD)44 eller Airyscan området detektor45, lette bruken av enda lavere Dye mengder enn før. Et annet viktig mål for artikkelen er å eksempler på co-Imaging egenskaper av disse fargestoffer med andre fluorophores, viktigst, de av GFP som mest brukte fluorescerende protein i biologi. Dette skal hjelpe utformingen av Imaging eksperimenter som tar sikte på å relatere den subcellulære lokalisering dynamikken i fluorescerende Fusion proteiner til de av fungal celle veggen, plasma membranen eller Endo-og exocytosis veien etc.

Imaging under naturlige og stressfrie forhold er nøkkelen for erverv av pålitelige data. Noen praktiske hensyn vedrørende kultur medium og prøve utarbeidelse sikte på å gi et utgangspunkt for å finne de optimale forhold som tillater gjenstand-fri, lang tid observasjon av sunne, trykklette celler med høyest S/N-ratio mulig for en gitt prøve. Det er ingen universell måte å oppnå pålitelige og meningsfulle Imaging resultater. Det er iboende den tilnærmingen som biologisk variasjon av prøven, subjektivitet og forventningene til microscopist, samt bilde etterbehandling har betydelig innflytelse på datainnsamling og tolkning, henholdsvis. Derfor, den praktiske opplevelsen av microscopist, hennes/hans intime kunnskap om cellen biologi av soppen under etterforskning, samt dyktige prøve forberedelser for å skape forhold som "naturlige" og uforstyrret som mulig i en lab innstilling, er avgjørende for å anskaffe og evaluere bildedata som sannferdig reflekterer studert cellulære fenomener. Som en tommelfingerregel, forekomsten av uønskede bivirkninger av fluorescerende fargestoffer, alt fra den subtile og dermed ikke åpenbart synlig aktivering av plasma membran eller celle veggen re-modellering stress respons trasé til enkel cytotoksisk induksjon av celle autolyse, kan bare være sikkert forhindret ved å bruke lave farge konsentrasjoner ≤ 2 μM.

Anvendelsen av fluorescerende fargestoffer er enkel, men deres særegenheter er dårlig karakterisert. En viktig styrke ved å bruke fluorescerende fargestoffer er preparativ enkelhet av eksperimentelle protokoller. Dyrking og prøvetaking av soppen, tilsetning av fargestoff (er), og montering på mikroskopet scenen er (med praksis) grei. Justering av de grunnleggende bildeinnstillingene, inkludert eksitasjon og utslipps bølgelengder, eksponeringstider, tids kurs innstillinger etc., følger enkle Biofysiske regler for mikroskopet og biologiske regler for de brukte fluorescerende fargestoffer inne i cellene. Tabell 1 har til hensikt å støtte identifisering av de mest egnede fargestoff eller fargestoff kombinasjon for eksperimentering. Videre er fluorescerende fargestoffer rimelig priset, lett tilgjengelig med pålitelig høy kvalitet og dermed sikre svært reproduserbar søknad.

To store restriksjoner for å bruke membran eller celle veggen selektive fluorescerende fargestoffer er (ofte) begrenset kunnskap om deres presise flekker egenskaper, som i de fleste tilfeller er ikke-spesifikke på organelle og molekylær nivå, og deres konsentrasjon-avhengige uønskede bivirkninger. FM fargestoffer er spesifikke for lipid bilayers deltar i Endo-og exocytosis. Men presist som subcellulære organeller blir suksessivt merket under testet forholdene er ikke umiddelbart tydelig og krever sammenligning av ulike FM fargestoff varianter, og co-merking med ekstra organelle-spesifikke markører. Preferansen for FM 1-43 for mitokondrie membraner, i forhold til FM 4-64, er ett eksempel. Cell Wall selektive fargestoffer vise varierende spesifisitet for de tre store polymerer av fungal celle veggen. CFW antas å være en ikke-spesifikk flekk for β-betaglukaner og kitin, er SPF antas å være mest selektiv for β-1, 4-betaglukaner, og CR antas å være svært selektiv for α-og β-chitins. Informasjon om bindende spesifisitet av PFS til sopp cellevegg polysakkarider er for øyeblikket ikke tilgjengelig. I hvilket forhold som fungal celle veggen polymer er mest effektivt merket på en gitt fargestoff konsentrasjon i fungal arter under etterforskning er ikke lett besvart, og anvendelsen av detaljerte målinger ervervet in vitro eller in vivo i andre organismer eller andre fungal arter må vurderes svært nøye. Dessverre er denne informasjonen sparsom og svært spredt i litteraturen35,42,46. Nyere poster som ville følge på tidligere studier33 å gi ny innsikt i den presise flekker egenskapene til kjennetegnet fargestoffer spesielt i sopp er for øyeblikket ikke tilgjengelig.

Imaging-kontroller er avgjørende for å evaluere farge mønstre og cellulære responser nøyaktig. Sannsynligvis den mest utfordrende delen, er imidlertid å vite cellen biologi av soppen så godt at de registrerte endringene i subcellulære lokalisering av membran og celle veggen selektive fluorescerende fargestoffer, endringer i cellulær arkitektur eller hyphal vekstmønster kan eksklusivt og trygt være relatert til den tiltenkte effekten av eksperimentell behandling. For dette er det avgjørende å ha gode kontroller sammen med alle nye Live-celle Imaging eksperiment. Disse inkluderer ubehandlet vill type som negativ bildebehandling kontroll for å utelukke bakgrunnen autofluorescence og detektor støy fra ervervet bildet, og å ha en morfologiske komparator når du arbeider med mutanter. Videre, en positiv bildebehandling kontroll, for eksempel en stamme som uttrykker GFP eller RFP i cytoplasma eller en annen velkjent fluorescerende markør protein, er viktig å sette eksitasjon lys intensiteten til den nødvendige minimum og har en celle vitalitet kontroll. Når disse kontrollene er satt, bruk av fluorescerende fargestoffer er ikke begrenset til visualisering oppgaver bare, men deres konsentrasjon-avhengige flekker dynamikk, samt konsentrasjon-avhengige bivirkninger kan være analytisk utnyttet; for eksempel, for kvantitativt overvåking celle veggen biosyntesen i sanntid eller for identifisering av mutant-spesifikke fenotyper i mottakelighet analysene47.

Forbedret fremtidige programmer er avhengig av en detaljert funksjonell analyse av fargestoff flekker egenskaper. En stor pågående utfordring er å ytterligere forbedre og automatisere kvantitative bildeanalyser for å fremme funksjonell evaluering av subcellulære dynamikk av membran og celle veggen selektive fluorescerende fargestoffer i trådformede sopp. For denne, omfattende, kvantitative co-lokalisering studier av disse fargestoffer med kjente organelle og celle veggen polymer markører i kombinasjon med mutant stammer mangelfull i bestemte transportveier eller som mangler spesifikke strukturelle komponenter er først nødvendig. Flere endocytose markører for sammenlignende analyser med fm fargestoffer er tilgjengelig48,49, og med hensyn til fortsatt dårlig karakterisert bindende særegenheter av celle veggen fargestoffer i sopp, anvendelsen av fluorescensmerkete-merket Glukan-spesifikke antistoffer50 kan gi en mulighet til å løse dette problemet.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser og ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Takk er på grunn av den tyrolske Science Fund (TWF) for å gi stipend #256524 til AL, til Wien Science and Technology Fund (WWTF) for å gi stipend #LS13-086 til SZ, og til publisering fondet ved Universitetet i Innsbruck for å støtte åpen tilgang publikasjon. Forfatterne også takke Institutt for zoology ved Universitetet i Innsbruck for å gi Leica TCS SP5 II konfokalmikroskopi laserskanning mikroskop.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BRAND cell counting chamber Merck BR718005 Thoma format
Calcofluor White M2R Merck/Sigma-Aldrich F3543 cell wall dye
CFI Plan Apo VC 60x/1.2 NA XC WI Nikon MRD07602 water immersion objective
CFI Plan Apo VC 60x/1.2 NA XC WI Nikon MRD07602 water immersion objective
Congo Red Merck/Sigma-Aldrich C6277 cell wall dye
Dimethyl sulfoxide VWR 8,36,73,230 organic solvent
Eclipse TE2000-E with C1 scanning unit Nikon custom configuration inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 2 and 4
Eclipse TE2000-U with Bio-Rad Radiance 2100 scannig unit Nikon custom configuration inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 5
FM 1-43 Merck/Sigma-Aldrich S6814 membrane dye
FM 4-64 Merck/Sigma-Aldrich S6689 membrane dye
Glass beads Rettberg 1340691030 3 mm glass beads
Glass cover slips Thermo Fisher Scientific BB02400600A113MNT0 24 x 60 # 1 glass cover slips
HCX PL APO 63x/1.3 NA Glyc Leica 15506353 glycerol immersion objective
LSM 510 Meta Zeiss custom configuration inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 3
M9 Minimal Medium Merck/Sigma-Aldrich M6030 generic fungal growth medium
Micro-slide 8-well ibidi 80826 ibiTreat #1.5 polymer coverslip
Miracloth Merck/Millipore 475855-1R polyester filtration material
Petri dish Sarstedt 8,21,472 92 x 16 mm culture dish w/o cams
Phytagel Merck/Sigma-Aldrich P8169 transparent gelling agent
Plan Apochromat 63x/1.4 NA Oil DIC Zeiss 440762-9904-000 oil immersion objective
Pontamine Fast Scarlet 4B Merck/Sigma-Aldrich 212490 cell wall dye
Potato Dextrose Agar (PDA) BD Difco 213400 fungal growth medium for T. atroviride
Potato Dextrose Broth (PDB) BD Difco 254920 fungal growth medium for T. atroviride
Reaction tube Sarstedt 72,706 1.5 mL SafeSeal tube
Scalpel B.Braun 5518016 Cutfix sterile scalpel #23
Screw cap tube Sarstedt 6,25,54,502 15 mL polypropylene tube
Solophenyl Flavine 7GFE 500 CIBA 1485385V6 cell wall dye
SynaptoGreen C4 Biotum 70020 membrane dye
SynaptoRed C2 Biotum 70021 membrane dye
Syringe membrane filter Thermo Fisher Scientific 723-9945 0.45 µm SFCA syringe filter
TCS SP5 II Leica custom configuration inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 1
Vogel's Minimal Medium (VMM) FGSC Fungal Genetics Stock Centre fungal growth medium for N. crassa

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Read, N. D., Fischer, S., Parton, R. M. Imaging Spitzenkörper, pH and calcium dynamics in growing fungal hyphae. Pesticide Science. 54 (2), 179-181 (1998).
  2. Hickey, P. C., Swift, S. R., Roca, M. G., Read, N. D. Live-cell imaging of filamentous fungi using vital fluorescent dyes and confocal microscopy. Microbial Imaging. , Elsevier. 63-87 (2004).
  3. Jelínková, A., et al. Probing plant membranes with FM dyes: tracking, dragging or blocking. The Plant Journal. 61 (5), 883-892 (2010).
  4. Fischer-Parton, S., et al. Confocal microscopy of FM4-64 as a tool for analysing endocytosis and vesicle trafficking in living fungal hyphae. Journal of Microscopy. 198 (3), 246-259 (2000).
  5. Harris, S. D. Branching of fungal hyphae: regulation, mechanisms and comparison with other branching systems. Mycologia. 100 (6), 823-832 (2008).
  6. Roca, M. G., Arlt, J., Jeffree, C. E., Read, N. D. Cell biology of conidial anastomosis tubes in Neurospora crassa. Eukaryotic Cell. 4 (5), 911-919 (2005).
  7. Becker, Y., et al. The fungal cell-wall integrity MAPK cascade is crucial for hyphal network formation and maintenance of restrictive growth of Epichloë festucae in symbiosis with Lolium perenne. Molecular Plant-Microbe Interactions. 28 (1), 69-85 (2015).
  8. Justa-Schuch, D., Heilig, Y., Richthammer, C., Seiler, S. Septum formation is regulated by the RHO4-specific exchange factors BUD3 and RGF3 and by the landmark protein BUD4 in Neurospora crassa. Molecular Microbiology. 76 (1), 220-235 (2010).
  9. Atanasova, L., et al. The Gpr1-regulated Sur7 family protein Sfp2 is required for hyphal growth and cell wall stability in the mycoparasite Trichoderma atroviride. Scientific Reports. 8 (1), 12064 (2018).
  10. Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. Journal of Neuroscience. 12 (2), 363-375 (1992).
  11. Wu, Y., Yeh, F. L., Mao, F., Chapman, E. R. Biophysical characterization of styryl dye-membrane interactions. Biophysical Journal. 97 (1), 101-109 (2009).
  12. Betz, W. J., Mao, F., B, S. C. Imaging exocytosis and endocytosis. Current Opinion in Neurobiology. 6, 365-371 (1996).
  13. Hoopmann, P., Rizzoli, S. O., Betz, W. J. Imaging synaptic vesicle recycling by staining and destaining vesicles with FM dyes. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (1), 77-83 (2012).
  14. Bolte, S., et al. FM-dyes as experimental probes for dissecting vesicle trafficking in living plant cells. Journal of Microscopy. 214, Pt 2 159-173 (2004).
  15. Riquelme, M., et al. Spitzenkorper localization and intracellular traffic of green fluorescent protein-labeled CHS-3 and CHS-6 chitin synthases in living hyphae of Neurospora crassa. Eukayotic Cell. 6 (10), 1853-1864 (2007).
  16. Lichius, A., Yáñez-Gutiérrez, M. E., Read, N. D., Castro-Longoria, E. Comparative live-cell imaging analyses of SPA-2, BUD-6 and BNI-1 in Neurospora crassa reveal novel features of the filamentous fungal polarisome. PloS one. 7 (1), 30372 (2012).
  17. Peñalva, M. A. Tracing the endocytic pathway of Aspergillus nidulans with FM4-64. Fungal Genetics and Biology. 42 (12), 963-975 (2005).
  18. Dijksterhuis, J., Molenaar, D. Vesicle trafficking via the Spitzenkörper during hyphal tip growth in Rhizoctonia solani. Antonie van Leeuwenhoek. 103 (4), 921-931 (2013).
  19. Hickey, P. C., Read, N. D. Imaging living cells of Aspergillus in vitro. Medical Mycology. 47, 110-119 (2009).
  20. Delgado-Álvarez, D. L., Bartnicki-García, S., Seiler, S., Mouriño-Pérez, R. R. Septum development in Neurospora crassa: the septal actomyosin tangle. PLoS One. 9 (5), 96744 (2014).
  21. Hageage, G. J., Harrington, B. J. Use of Calcofluor White in clinical mycology. Laboratory Medicine. 15 (2), 109-112 (1984).
  22. Monheit, J. E., Cowan, D. F., Moore, D. G. Rapid detection of fungi in tissues using Calcofluor White and fluorescence microscopy. Archives of Pathology and Laboratory. 108 (8), 616-618 (1984).
  23. Herth, W., Schnepf, E. The fluorochrome Calcofluor White binds oriented to structural polysaccharide fibrils. Protoplasma. 105 (1-2), 129-133 (1980).
  24. Elorza, M. V., Rico, H., Sentandreu, R. Calcofluor White alters the assembly of chitin fibrils in Saccharomyces cerevisiae and Candida albicans cells. Journal of General Microbiology. 129 (5), 1577-1582 (1983).
  25. Lagorce, A., et al. Genome-wide analysis of the response to cell wall mutations in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Journal of Biological Chemistry. 278 (22), 20345-20357 (2003).
  26. Sanz, A. B., García, R., Rodríguez-Peña, J. M., Arroyo, J. The CWI Pathway: regulation of the transcriptional adaptive response to cell wall stress in yeast. Journal of Fungi. 4 (1), (2017).
  27. Slifkin, M., Cumbie, R. Congo Red as a fluorochrome for the rapid detection of fungi. Journal of Clinical Microbiology. 26 (5), 827-830 (1988).
  28. Michels, J., Büntzow, M. Assessment of Congo Red as a fluorescence marker for the exoskeleton of small crustaceans and the cuticle of polychaetes. Journal of Microscopy. 238 (2), 95-101 (2010).
  29. Pancaldi, S., Poli, F., Dall'Olio, G., Vannini, G. L. Morphological anomalies induced by Congo Red in Aspergillus niger. Archives of Microbiology. 137 (3), 185-187 (1984).
  30. Roncero, C., Durán, A. Effect of Calcofluor White and Congo Red on fungal cell wall morphogenesis: in vivo activation of chitin polymerization. Journal of Bacteriology. 163 (3), 1180-1185 (1985).
  31. Kopeck, M., Gabriel, M. The influence of Congo Red on the cell wall and (1,3)- β-d-glucan microfibril biogenesis in Saccharomyces cerevisiae. Archives of Microbiology. 158 (2), 115-126 (1992).
  32. Heilmann, C. J., et al. Surface stress induces a conserved cell wall stress response in the pathogenic fungus Candida albicans. Eukayotic Cell. 12 (2), 254-264 (2013).
  33. Hoch, H. C., Galvani, C. D., Szarowski, D. H., Turner, J. N. Two new fluorescent dyes applicable for visualization of fungal cell walls. Mycologia. 97 (3), 580-588 (2005).
  34. Liesche, J., Ziomkiewicz, I., Schulz, A. Super-resolution imaging with Pontamine Fast Scarlet 4BS enables direct visualization of cellulose orientation and cell connection architecture in onion epidermis cells. BMC Plant Biology. 13, 226 (2013).
  35. Ursache, R., Andersen, T. G., Marhavý, P., Geldner, N. A protocol for combining fluorescent proteins with histological stains for diverse cell wall components. The Plant Journal. 93 (2), 399-412 (2018).
  36. Knight, N. L., Sutherland, M. W. A rapid differential staining technique for Fusarium pseudograminearum in cereal tissues during crown rot infections. Plant Pathology. 60 (6), 1140-1143 (2011).
  37. Fajardo-Somera, R. A., et al. Dissecting the function of the different chitin synthases in vegetative growth and sexual development in Neurospora crassa. Fungal Genetics and Biology. 75, 30-45 (2015).
  38. Lichius, A. Cell Fusion in Neurospora crassa. , The University of Edinburgh. Edinburgh (UK). Doctor of Philosophy (Ph.D.) (2010).
  39. Chen, W., Li, W., Dong, X., Pei, J. A Review of Biological Image Analysis. Current Bioinformatisc. 13 (4), 337-343 (2018).
  40. Live cell imaging: A laboratory manual. Goldman, R. D., Swedlow, J., Spector, D. L. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2010).
  41. Eliceiri, K. W., et al. Biological imaging software tools. Nature methods. 9 (7), 697-710 (2012).
  42. Zemanek, G., Jagusiak, A., Chłopaś, K., Piekarska, B., Stopa, B. Congo Red fluorescence upon binding to macromolecules - a possible explanation for the enhanced intensity. Bio-Algorithms and Med-Systems. 13 (2), 1187 (2017).
  43. Hickey, P. C., Jacobson, D. J., Read, N. D., Louise Glass, N. Live-cell imaging of vegetative hyphal fusion in Neurospora crassa. Fungal Genetics and Biology. 37 (1), 109-119 (2002).
  44. Hamamatsu Si APD - high sensitivity photodiodes having an internal gain mechanism: Avalanche photodiode selection guide 2019. , Available from: https://www.hamamatsu.com/resources/pdf/ssd/si_apd_kapd0001e.pdf (2019).
  45. Huff, J. The Airyscan detector from ZEISS: confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution. Nature Methods. 12, 1205 (2015).
  46. Thomas, J., Idris, N. A., Collings, D. A. Pontamine Fast Scarlet 4B bifluorescence and measurements of cellulose microfibril angles. Journal of Microscopy. 268 (1), 13-27 (2017).
  47. Ram, A. F. J., Klis, F. M. Identification of fungal cell wall mutants using susceptibility assays based on Calcofluor White and Congo Red. Nature Protocols. 1 (5), 2253-2256 (2006).
  48. Toshima, J. Y., et al. Spatial dynamics of receptor-mediated endocytic trafficking in budding yeast revealed by using fluorescent alpha-factor derivatives. Proceedings of the National Academy of Science of the USA. 103 (15), 5793-5798 (2006).
  49. Kilaru, S., Schuster, M., Latz, M., Guo, M., Steinberg, G. Fluorescent markers of the endocytic pathway in Zymoseptoria tritici. Fungal Genetics and Biology. 79, 150-157 (2015).
  50. Fu, C., Tanaka, A., Free, S. J. Neurospora crassa 1,3-α-glucan synthase, AGS-1, is required for cell wall biosynthesis during macroconidia development. Microbiology. 160, Pt 8 1618-1627 (2014).

Tags

Biologi fluorescerende vitale fargestoffer Live-celle Imaging trådformede sopp Trichoderma atroviride Neurospora crassa celle veggen flekker plasma membran farging endocytose sporing konfokalmikroskopi laserskanning mikroskopi kvantitativ bildeanalyser
Anvendelse av membran og Cell Wall selektiv fluorescerende fargestoffer for Live-Cell Imaging av trådformede sopp
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lichius, A., Zeilinger, S.… More

Lichius, A., Zeilinger, S. Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi. J. Vis. Exp. (153), e60613, doi:10.3791/60613 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter