Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

I Vivo Infektion med Leishmania amazonensis at evaluere parasit virulens i mus

Published: February 20, 2020 doi: 10.3791/60617
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Physiology, Institute of Bioscience, University of Sao Paulo

Summary

Her præsenterer vi en samlet protokol til at evaluere den kutane infektion af mus med Leishmania amazonensis. Dette er en pålidelig metode til at studere parasit virulens, så en systemisk opfattelse af hvirveldyr vært reaktion på infektionen.

Abstract

Leishmania spp. er protozoiske parasitter, der forårsager leishmaniases, sygdomme, der præsenterer et bredt spektrum af kliniske manifestationer fra kutane til viscerallæsioner. I øjeblikket, 12 millioner mennesker skønnes at være smittet med Leishmania på verdensplan og over 1 milliard mennesker lever med risiko for infektion. Leishmania amazonensis er endemisk i Central-og Sydamerika og fører normalt til kutanform af sygdommen, som kan være direkte visualiseret i et dyr model. Derfor l. amazonensis stammer er gode modeller for kutan leishmaniasis undersøgelser, fordi de også er let dyrkes in vitro. C57BL/6 mus efterligner L. amazonensis-drevetsygdomsprogression observeret hos mennesker og betragtes som en af de bedste mus stammer model for kutan leishmaniasis. I hvirveldyr vært, disse parasitter bebor makrofager på trods af forsvarsmekanismer af disse celler. Flere undersøgelser bruger in vitro makrofag infektion assays at evaluere parasitten infektiviet under forskellige betingelser. In vitro-metoden er imidlertid begrænset til et isoleret cellesystem, der ser bort fra skadegørerens respons. Her udarbejder vi en in vivo murine infektion metode, der giver en systemisk fysiologisk oversigt over host-parasit interaktion. Den detaljerede protokol for in vivo infektion af C57BL/6 mus med L. amazonensis omfatter parasit differentiering i infektiøse amastigotes, mus footpad kutan vaccination, læsion udvikling, og parasit belastning bestemmelse. Vi foreslår denne veletablerede metode som den mest hensigtsmæssige metode til fysiologiske undersøgelser af værtens immun- og metaboliske reaktioner på kutan leishmaniasis.

Introduction

Leishmaniases er verdensomspændende parasitære smitsomme sygdomme , der repræsenterer vigtige udfordringer i udviklingslandene og er anerkendt som en af de vigtigste forsømte tropiske sygdomme af Verdenssundhedsorganisationen1,2. Leishmaniases er kendetegnet ved kutane, slimhinde, og / eller visceral manifestationer. Kutan leishmaniasis er normalt forårsaget af L. amazonensis, L. mexicana, L. braziliensis, L. guyanensis, L. major, L. tropica og L. aethiopica3. Denne form for sygdommen er ofte selvhelbredende hos mennesker på grund af induktion af beskyttende cellulære immunrespons. Men, cellulære immunrespons kan mislykkes, og sygdommen kan udvikle sig til at formidlecutan leishmaniasis4,5. Der findes ingen vaccine på grund af mangfoldigheden blandt leishmaniaarter og er vært for genetiske baggrunde6,7. Behandlingsmuligheder er også begrænset, da de fleste af de aktuelt tilgængelige lægemidler er enten dyre, giftige og/eller kan kræve langtidsbehandling8,9. Desuden har der været rapporter om resistens over for lægemidler mod de tilgængelige behandlinger10,11.

Det forårsagende middel af leishmaniases er den protozoiske parasit Leishmania. Parasitten præsenterer to forskellige morfologiske former i sin livscyklus: promastigotes, den flagellated form findes i sandfluer; og amastigotes, den intracellulære form findes i parasitophorous vakuoler af pattedyr vært makrofager12,13. Amastigotes evne til at invadere, overleve, og kopiere på trods af forsvarsmekanismer hvirveldyr værtens makrofager er underlagt mange undersøgelser14,15,16,17. Derfor har flere forskergrupper beskrevet in vitro makrofag infektion assays at vurdere virkningen af specifikke miljømæssige faktorer, samt parasit og vært gener på parasitten infectivity. Denne analyse giver flere fordele, såsom evnen til at tilpasse undersøgelser til en høj gennemløb format, relativt kortere periode for at opnå resultater, og reduceret antal laboratoriedyr ofret18. Resultaterne af in vitro-analyser er dog begrænsede , fordi de ikke altid replikerer in vivo-undersøgelser14,19,20,21. In vivo-analyser giver et systemisk fysiologisk overblik over værtsparasittens interaktion, som ikke kan efterlignes fuldt ud af in vitro-analyser. For eksempel kan immunologiske undersøgelser udføres gennem immunhistokemiske analyser fra indsamlede fodpad væv sektioner eller endda fra popliteal lymfeknuder til analyse af de genvundne immunceller22.

Dyr bruges ofte som model for sygdomme hos mennesker i biologisk og biomedicinsk forskning for bedre at forstå de underliggende fysiologiske mekanismer i sygdommene23. I tilfælde af leishmaniasis påvirker ruten, stedet eller dosis af podning sygdomsresultatet24,25,26,27. Endvidere er modtagelighed og modstandsdygtighed over for infektion hos mennesker og mus stærkt reguleret af værtens genetiske baggrund og parasit4,5,22,28,29,30,31. BALB/c mus er meget modtagelige for L. amazonensis kutan infektion, der viser en hurtig sygdomsprogression med parasitternes formidling til lymfeknuder, milt, og lever32. Da sygdommen kan udvikle sig til kutane metastaser, infektionen kan være dødelig. I modsætning hertil udvikler C57BL/6 mus ofte kroniske læsioner med vedvarende parasitbelastninger i L. amazonensisinfektion analyser33. Derved, L. amazonensis infektion med denne særlige musearter er blevet betragtet som en fremragende model til at studere kroniske former for kutan leishmaniasis hos mennesker, fordi det efterligner sygdommen progression bedre end BALB / c mus infektion model5,34.

Derfor foreslår vi, at murine in vivo infektion er en nyttig metode til Leishmania virulens fysiologiske undersøgelser, der gælder for sygdomme hos mennesker, så et systemisk billede af host-parasit interaktion. Revisiting veletablerede analyser22, vi præsenterer her en samlet trin-for-trin protokol af in vivo infektion af C57BL/6 mus med L. amazonensis, der omfatter parasitten differentiering i aksoniske amastigotes, mus footpad kutan vaccination, læsion udvikling, og parasit belastning bestemmelse. Denne protokol kan tilpasses andre mus stammer og Leishmania arter, der forårsager kutane leishmaniases. Afslutningsvis, den metode, der præsenteres her er afgørende for at identificere nyeanti-Leishmania narkotika mål og vacciner, samt i fysiologiske undersøgelser af værten immun og metaboliske reaktioner på Leishmania infektion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle forsøgsprocedurer blev godkendt af Animal Care and Use Committee ved Institute of Bioscience ved Universitetet i São Paulo (CEUA 342/2019), og blev gennemført i overensstemmelse med anbefalingerne og politikkerne for pleje og anvendelse af laboratoriedyr i São Paulo State (Lei Estadual 11.977, de 25/08/2005) og den brasilianske regering (Lei Federal 11.794, de 08/10/2008). Alle trin, der er beskrevet i afsnit 1-5, skal udføres aseptisk inde i laminarflowskabe. Personlige værnemidler bør udnyttes under håndtering af levende Leishmania parasitter.

1. In Vitro Differentiering af L. amazonensis Promastigotes i Axenic Amastigotes15,20,35,36,37,38

BEMÆRK: L. amazonensis (MHOM/BR/1973/M2269) (La)parasit blev brugt i denne analyse. Afhængigt af undersøgelsens formål, den infektiøse parasit form kan opnås enten ved rensning af den metacykliske form ved hjælp af en tæthed gradient, som tidligere beskrevet14, eller ved differentiering af promastigotes i aksoniske amastigotes, i henhold til følgende protokol.

  1. Grow La promastigotes i en 25 cm2 celle kultur kolbe indeholdende 10 ml medium for promastigotes (pro-medium) (pH = 7,0).
  2. Inkuber ved 25 °C i 3 dage.
    BEMÆRK: Brug promastigote kulturer, der blev passage in vitro mindre end 10x for at undgå tab af virulens og aneuploidy ændringer af parasitter39,40,41,42,43,44.
  3. Pipette 5 ml logaritmisk vækstfase promastigote kultur i en ny 25 cm2 kolbe.
  4. Tilføj 5 ml medium til aksoniske amastigotes (ama-medium) (pH = 5,2).
  5. Inkuber ved 34 °C i 3-4 dage.
  6. Del kulturen ved at fortynde med ama-medium i et forhold på 1:3 i en ny 25 cm2 kolbe.
  7. Inkuber ved 34 °C i 3-5 dage.
    BEMÆRK: Inkuberaksen amastigotes i op til 5 dage, da det repræsenterer slutningen af modning37.

2. C57BL/6 Footpad Infektion med L. amazonensis

BEMÆRK: Kvindelige C57BL/6 mus (6-8 uger gamle) blev opnået og vedligeholdt på Animal Center ved Biomedical Sciences Institute ved University of São Paulo. Dyr modtog mad og vand ad libitum.

  1. Tæl kulturen i aksoniske amastigoter ved at overføre en aliquot af parasitsuspensionen fortyndet i PBS til et Neubauer kammer (dvs. hæmocytometer). Tæl de ikke-flagellaterede parasitter, som repræsenterer amastigotes former.
    BEMÆRK: Alternativt kan Trypan blue (1:1) bruges til at tælle antallet af levedygtige amastigotes (dvs. dem, der ikke er plettet med Trypan blå).
  2. Aksoniske amastigoter i PBS i henhold til den ønskede inoculumdosis og antallet af inoculums tilsigtet (1 x 106 aksoniske amastigoter i 50 μL PBS anbefales).
  3. Læg en tuberkulinsprøjte med en 27 G-nål med den forberedte parasitaffjedring.
  4. Bedøve en C57BL/6 mus ved hjælp af 3-5% isofluran, som anbefalet af Johns Hopkins University Animal Care and Use Committee45. Vurder bedøvelsesdybden ved at teste musens reaktion på en tåknivspids.
  5. Vaccinere 50 μL af den homogeniserede parasitsuspension (1 x 106 aksoniske amastigoter eller den ønskede inoculumdosis) i subplantarvævet i venstre bagfjerding ved hjælp af den tidligere ladede tuberkulinsprøjte (trin 2.3).

3. Udvikling af musfootpad læsion

  1. Mål udviklingen af læsionen en gang om ugen ved at måle tykkelsen af venstre (inficeret) og højre (ikke-inficerede) fodpuder ved hjælp af en kaliper.
  2. Beregn forskellen på tykkelsen mellem venstre og højre bagsidepads ugentligt for at evaluere læsionsprogression.
  3. Afbilde de beregnede forskelle på Y-aksen og tidspunktet for infektion på X-aksen og beregne den statistiske signifikans.
    BEMÆRK: I overensstemmelse med dyrepleje- og brugsudvalgenes anbefalinger skal dyrene ofres, før den inficerede læsion bliver ulcereret, fordi hudsår kan føre til sekundær infektion. Som vist i supplerende figur 1tager det ca. 10 uger, før læsionerne viser tegn på ulceration med parasitdosis (106 aksoniske amastigoter) og værtsstamme (C57BL/6), der anvendes i denne protokol. Musene bør ofres til ekstraktion, før der observeres tegn på ulceration.

4. Mus Footpad Læsion Udvinding og parasit begrænse fortynding

  1. Der fremstilles en 96 brøndplade (flad bund) til den begrænsende fortyndingsanalyse46,47 ved tilsætning af 180 μL pro-medium til alle brønde.
    BEMÆRK: Brug fire pladebaner (halvdelen af pladen) for hvert dyr, der repræsenterer firdoblingsanalyser (dvs. dyr 1 = vognbane A-D; dyr 2 = baner E-H).
  2. Tilsæt 1 ml pro-medium i et glasvæv slibmaskine rør per læsion og veje røret.
    BEMÆRK: Røret skal holdes sterilt, så brug et sterilt låg, og røret vejes med det lukkede låg, hvis det vejer uden for laminarflowskabet.
  3. Ofret dyret i et CO2 kammer efter dyrepleje- og brugsudvalgenes anbefalinger. Desinficere dyret ved sprøjtning med 70% ethanol.
  4. Punktafgifter dyrets fod i hælene for at udtrække den inficerede footpad og spray 70% ethanol på footpad for desinfektion. Sørg for sterilisering af saks og pincet ved at holde dem gennemblødt i 70% ethanol.
  5. Placer den inficerede footpad i en steril Petri skål og dissekere ved hjælp af sterile pincet og en skalpel til at indsamle alle bløde væv. Kassér knoglerne.
    BEMÆRK: Ensartethed i dissektionstrinnet anbefales for at undgå forudindtaget vævsgenvinding.
  6. Overfør det indsamlede væv til glasvævskværnrøret med pro-medium, og afvejes derefter røret igen for at bestemme læsionsvægten.
    BEMÆRK: Undgå at placere pincet og skalpel direkte ind i mediet, da små mængder kan fjernes, hvilket resulterer i en undervurderet vævsvægt. Læsionens vægt beregnes ved at trække vægten af det rør, der indeholder pro-medium, fra vægten af rør, der kun indeholder pro-medium.
  7. Homogeniser vævet 10x ved hjælp af kværnen for fuldstændig væv afbrydelse.
  8. Blandingen sedimenter i 10 minutter, og opsamles derefter 20 μL af supernatantet.
  9. Overnatanten lastes i 1st-kolonnen på 1st banen på den 96 brøndplade, der er fremstillet i trin 4.1. Gentag dette for de næste tre baner at have firdoblet for hvert dyr (dvs. for dyr 1 tilsættes 20 μL til hver brønd og mærke A1, B1, C1 og D1).
  10. Homogeniser hver brønd i 1st kolonne 10x ved hjælp af en multikanalpipette. Overfør derefter 20 μL af de fortyndede prøver fra1. kolonne til2.
    BEMÆRK: Det er vigtigt at homogenisere hver brønd 10x fra den ene kolonne til den næste.
  11. Trin 4.10 gentages til alle resterende kolonnerindtil den sidste kolonne (12. ) og den endelige 20 μL af fortyndet prøve kasseres.
    BEMÆRK: Skift spidserne efter hver fortynding for at undgå krydskontaminering.
  12. Forsegle pladerne med en film og inkuberved 25 °C i 7 dage i et fugtigt kammer.

5. Bestemmelse af læsionsparasitbelastning

  1. Analysér pladerne efter 7 dages inkubation ved hjælp af et omvendt mikroskop for at bestemme den sidste parasitholdige brønd for hver vognbane.
    BEMÆRK: Det er også muligt at have en indikation af væksten af parasitter, eller celletæthed, ved visuel analyse af farveændringer og turbiditet af mediet.
  2. Beregn parasitvævbelastningen for hver vognbane ved at dividere fortyndingsfaktoren pr. læsionsvægt.
    BEMÆRK: I en bestemt vognbane, hvis parasitter kun er til stede i kolonne 1-5 (dvs. brønde A1-A5 er positive for parasitvækst), betyder det, at kolonne 5 indeholdt kun 1 parasit, kolonne 4 indeholdt 10 parasitter, og så videre, i multipla af ti. Kolonne 1 indeholder 104 parasitter, som repræsenterer antallet af parasitter i den oprindelige 20 μL supernatant (den ikke-fortyndede prøve i trin 4.7). Da denne 20 μL blev fortyndet med 180 μL pro-medium, indeholdt det oprindelige rør 5 x 105 parasitter: (1 x 104) / (0,02 ml) = 5 x 105 parasitter/1 ml. Derefter kan parasitten belastning i denne læsion beregnes ved at dividere den oprindelige koncentration af parasitten ved læsionvægt: (5 x 105)/ læsion vægt (se trin 4.6).
  3. Der afbildes gennemsnittet af det firdoblet resultat for hvert dyr med en brænde-Y-skala.

6. Statistisk analyse

  1. Anfør dataene som gennemsnitlig ± standardafvigelse ved hjælp af mindst fem dyr pr. forsøgsgruppe som replikater.
  2. Udfør statistisk analyse ved hjælp af uparret tosidede test, ibetragtning af en p værdi < 0,05 som signifikant.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Leishmania protozoparasitter findes i to udviklingsmæssige former i løbet af deres livscyklus i hvirvelløse dyr og hvirveldyr værter: promastigotes, de promastigotes, de promastigotes, de promastigoter, de promastigoter, de promastigoter, de promastiske former findes i lumen af den kvindelige sandflue; og amastigotes, de proliferatformer, der findes i de parasitophorøse vakuoler i pattedyrs værtsceller. Promastigotes har en aflang krop på ca. 1,5 μm bred og 20 μm lang, med et flagellum typisk på vej ud af den anterior ekstremitet. Amastigotes har en afrundet eller ovoid krop, der spænder i størrelse fra 2-6 μm i længden og 1,5-3 μm i bredden, og har en inapparent flagellum12,13 (figur 1A). Under blodmåltidet den hvirvelløse vært, en hæmatophagøs insekt i familien Psychodidae, erhverver makrofager inficeret med Leishmania amastigotes. Når disse celler når sandflue fordøjelsesrøret, amastigotes frigives og differentiere til procykliske promastigotes(figur 1A). Disse former er noninfective og formere sig intensivt ved binær division og kolonisere fordøjelsesrøret af insektvektoren. De procykliske former derefter differentiere til metacykliske former, en infektiøs og hurtig bevægelse form, præsentere en tyndere krop og aflange flagellum (Figur 1A). De metacykliske former invaderer de anteriordele af spiserøret og proventriculus af sandflue, således at under sit næste blodmåltid, regurgitation sikrer vaccination af disse inficerende former i en ny hvirveldyr vært. I tegument af hvirveldyr vært, parasitter er fagocytosed af makrofager og differentiere i amastigotes inde i parasitophorous vakuoler, hvor amastigotes formere sig med binære division og fuldføre livscyklus Leishmania12,13.

Aksoniske forhold kan simulere forskellige værtsmiljøer in vitro, opretholde parasitmorfologi og levedygtighed. Aksoniske betingelser for amastigotes blev tidligere beskrevet simulere rasteren s parasitophorous vacuole miljø og udløser promastigote in vitro differentiering i amastigote form37. Disse betingelser efterligner det sure miljø (pH = 5,5) og den øgede temperatur af hvirveldyr værter (34 °C). Figur 1B illustrerer promastigotes differentieret til amastigotes ved at ændre disse betingelser i kulturen. Levedygtigheden af disse axenic amastigotes kan analyseres af Trypan blå farvning, en metode baseret på princippet om, at levende celler besidder intakte membraner, der udelukker visse farvestoffer, mens døde celler ikke48. Alternativt analyserede vi levedygtigheden af aksoniske amastigoter, der verificerede deres evne til at omdanne tilbage til promastigotes, når de overføres til neutral pH og inkuberes ved 25 °C (figur 1B).

Her foreslår vi en in vivo infektion metode til at vurdere virulens af forskellige Leishmania stammer. Figur 2A repræsenterer en in vivo infektion assay, der viser kutanlæsi udvikling af C57BL/6 mus footpads, der var inficeret med vilde type (La-WT) og Leishmania Iron Regulator 1 knockout (La-LIR1-/-) L. amazonensis renset metacyklics. LIR1 regulerer intracellulære jernniveauer i Leishmania mægle jern eksport og forhindre sin intracellulære ophobning til giftige niveauer14. Idet vi observerede udviklingen i tykkelsesforskellene i de inficerede vs. ikke-inficerede fodpuder, var vi i stand til at påvise, at La-LIR1-/- inficerede mus præsenterede mindre læsioner end La-WT-inficeredemus ( figur2A). Disse resultater viste, at LIR1 er afgørende for L. amazonensis in vivo virulence. Dette viser betydningen og effekten af denne metode i vurderingen af forskellene i Leishmania-drevetkutane sygdomme. Figur 2B illustrerer de ikke-inficerede (højre) og inficerede (venstre) fodpuder og læsionsudvikling 73 dage efter infektion, hvilket viser forskellene i hævelse og læsionsprogression af La-WT og La-LIR1-/- inficerede mus.

Udviklingen af Leishmania infektionbestår ikke kun af læsion udvikling, som repræsenterer den inflammatoriske respons, men også parasittens intracellulære replikation. For at vurdere parasitreplikationen blev parasitten spåner ved at udvinde den inficerede læsion efterfulgt af en begrænsende fortyndingsanalyse i en 96 brøndplade (figur 3A). Figur 3B viser parasittenbelastningsanalyse af mundpadlæsioner fra La-WT og La-LIR1-/- inficerede mus efter 73 dages infektion. Fra den begrænsende fortyndingassay, opdaget vi 106-fold færre parasitter i læsionen af La-LIR1-/- inficerede mus i forhold til La-WT, afslører, at fravær af LIR1 forhindrer intracellulære replikation af amastigotes14.

En af fordelene ved at evaluere både læsion udvikling og parasit belastning er at opdage mulige forskelle i parasitintracellulære replikation og værten inflammatoriske respons. Vi observerede forskelle mellem disse to fænotyper ved hjælp af add-back LIR1 (La-LIR1AB), som er La-LIR1-/- med LIR1 ORF integreret tilbage i ribosomal locus14. Da La-LIR1AB blev injiceret i en mus fodpude, observerede vi mellemliggende læsioner sammenlignet med La-LIR1-/- og La-WT infektioner, men en bemærkelsesværdig fuld parasit belastning redning af La-WTfænotype (Supplerende figur 2). Disse resultater viser, at La-LIR1AB parasitter var i stand til at replikere som La-WTparasitter i en langsigtet in vivo infektion. Men musen inflammatoriske respons var ikke så forværret som La-WT infektioner, fordi læsioner var betydeligt mindre.

Derved viste metoden sig at være afgørende for identifikation og karakterisering af en L. amazonensis virulensfaktor, der kræves for den vellykkede amastigote intracellulære replikation og kutanlæsi udvikling i pattedyr værter.

Figure 1
Figur 1: Morfologi af L. amazonensis promastigotes og amastigotes. (A) Illustrationer af de forskellige morfologiske former for Leishmania: procyklisk promastigote, metacyklisk promastigote og amastigote. Skalastang = 2 μm. (B) Billeder af in vitro L. amazonensis kulturer. In vitro differentiering af promastigotes i aksoniske amastigotes, og af aksoniske amastigotes tilbage til promastigotes ved at ændre pH og temperaturforhold, som beskrevet i trin-for-trin protokol. Billederne blev taget ved hjælp af et omvendt mikroskop. Skalastang = 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: LIR1 knockout reducerer markant L. amazonensis in vivo læsionudvikling. C57BL/6 mus blev vaccineret i venstre bagside pad med 106 renset metacyklics af L. amazonensis vilde type (La-WT) og L. amazonensis LIR1 knockout (La-LIR1-/-). (A) Footpad kutanlæsi progression af La-WT og La-LIR1-/- inficerede mus analyseret ugentligt. Dataene repræsenterer den gennemsnitlige ± SEM af den inficerede footpad trukket fra ikke-inficeret footpad tykkelse fra fem forskellige mus i hver gruppe (tilpasset fra Laranjeira-Silva et al.14). (B) Billeder af de ikke-inficerede og inficerede fodpuder i La-WT og La-LIR1-/- inficerede mus, der viser forskellene i hævelse 73 dages efterinfektion (tilpasset fra Laranjeira-Silva et al.14). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: LIR1 knockout reducerer markant L. amazonensis in vivo intracellulær replikation. (A) En illustration af en 96 brøndplade, der repræsenterer de 10x-lerielle fortyndinger af det genvundne fodpudevæv, der er inficeret med L. amazonensis-vildtype (La-WT) og LIR1 knockout (La-LIR1-/-). Række A-D repræsenterer firdoblingen af de serielle fortyndinger af læsionprøven La-WT-footpad. Rækker E-H repræsenterer firdoblingen af de serielle fortyndinger af la-LIR1-/--footpad læsionsprøven. De forskellige nuancer af grå repræsenterer de observerede celle tætheder pr brønd (dvs. lysere farve betyder færre parasitter). Brøndene markeret med rødt repræsenterer de sidste brønde, der indeholdt parasitter pr replikat. (B) Parasitbelastning i genvundet fodpudevæv af C57BL/6 mus inficeret med 106 renset metacyklik af L. amazonensis vild type (La-WT) og L. amazonensis LIR1 knockout (La-LIR1-/-) bestemmes 73 dage efter infektion. Dataene repræsenterer gennemsnittet af parasitbelastningen pr. mg væv fra fem forskellige mus i hver gruppe (tilpasset fra Laranjeira-Silva et al.14). Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplementary Figure 1
Supplerende figur 1: Hudsår som tegn på en sekundær infektion. Repræsentative billeder af C57BL/6 mus footpads inficeret med L. amazonensis vild type (La-WT) taget 80 dage efterinfektion. Røde pile peger på tegn på ulceration, hvilket indikerer, at forsøget skal afsluttes. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplementary Figure 2
Supplerende figur 2: LIR1's rolle i udviklingen af in vivo læsion og intracellulær parasitreplikation. C57BL/6 mus blev vaccineret i venstre bagside pad med 106 renset metacyklics af L. amazonensis vild type (La-WT), L. amazonensis LIR1 knockout (La-LIR1-/-), og L. amazonensis LIR1 add-back (La-LIR1AB). (A) Footpad kutanlæsi progression af La-WT, La-LIR1-/-og La-LIR1AB inficerede mus analyseret ugentligt. Dataene repræsenterer den gennemsnitlige ± SEM af den inficerede footpad trukket fra ikke-inficeret footpad tykkelse fra fem forskellige mus i hver gruppe (tilpasset fra Laranjeira-Silva et al.14). (B) Parasitbelastning i genvundet fodpudevæv fra La-WT, La-LIR1-/-eller La-LIR1AB-inficerede mus bestemt 73 dage efter infektion. Dataene repræsenterer gennemsnittet af parasitbelastningen pr. mg væv fra fem forskellige mus i hver gruppe (tilpasset fra Laranjeira-Silva et al.14). Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In vivo infektion assay beskrevet i denne protokol giver enhver forsker til at evaluere in vivo kutan leishmaniasis overvejer vært-parasit interaktion i et systemisk scenario. Disse analyser er blevet brugt af mange grupper22,24,27,29,31,32,34,49 og her har vi udarbejdet en trinvis protokol til at standardisere denne metode, samtidig med at de infrastrukturbegrænsninger, som nogle grupper kan have. Denne protokol kan også anvendes til at evaluere virulens af transgene Leishmania-parasitter ved in vivo bioimaging50,51,52. Som enhver anden eksperimentel procedure, denne analyse har begrænsninger og kritiske skridt til at udføre, såsom kræver uddannet personale, der er komfortable at arbejde med mus og har erfaring med at udføre subplantar injektioner for at undgå utilsigtede infektioner. Standardisering af protokoller er yderst vigtigt for at undgå partiske resultater og for at skabe sammenlignelige resultater mellem forskellige forskningsgrupper.

Den største fordel ved at bruge L. amazonensis som model for kutane leishmaniases er fordi footpad læsion forårsaget af denne art let kan vurderes i mus. Hævelsen af footpad bestemt af den metode, der er beskrevet her repræsenterer summen af to infektion fænotyper: vært inflammatorisk respons og parasit replikation. Begge fænotyper kan evalueres separat ved at knytte parasitten væv belastning metode, der afspejler parasit intracellulære replikation med bestemmelse af læsiontykkelse progression. En anden fordel er, at L. amazonensis' promastigotes let dyrkes in vitro. I betragtning af disse, kan enhver forskningsgruppe manipulere denne Leishmania arter i henhold til deres behov. Resultaterne fra L. amazonensis' undersøgelser kan derefter sammenlignes med andre Leishmania arter for at afgøre , om en bestemt vej er evolutionært bevaret eller divergerende21,53,54.

I den naturlige cyklus, Leishmania transmission til hvirveldyr vært opstår ved bid af en inficeret sand flyve under blodmåltidet. Sandet flyve normalt podes et par hundrede Leishmania metacykliske promastigote former i insektets spyt. Ved eksperimentelle in vivo-infektioner er det hyppigste sted for vaccination dyrets fodpude22. Intradermal injektion i øret eller intraperitoneal injektion er alternative steder for podning afhængigt af undersøgelsenformål, fordi hvert websted præsenterer forskellige fagocytiske celletyper24,56. Derfor bruger nogle forskningsgrupper laboratorieinficerede sandfluer til at inficere dyrets øredermis til at efterligne den naturlige transmission56,57,58,59. Denne protokol indeholder dog nogle begrænsninger, såsom vedligeholdelse af sandfluekolonier, som kræver faciliteter, der ikke er tilgængelige for de fleste forskningsgrupper.

Det oprindelige værk, der beskriver in vivo C57BL/6 infektion med La-LIR1-/- har brugt renset metacykliske promastigotes danner14. Men, Leishmania genetisk manipulation kan forringe enten promastigotes 'differentiering i aksoniske amastigotes14 eller i metacykliske infektiøse former20. Derfor, afhængigt af Leishmania stamme, forskeren bør bestemme den mest hensigtsmæssige metode til at opnå levedygtige infektiøse parasit former for deres undersøgelse. Protokollen af aksoniske amastigotes differentieret fra promastigote kulturer beskrevet her kan være et lettere alternativ, der producerer sammenlignelige resultater i mange tilfælde19,20,35,37,38,64. Denne fremgangsmåde undgår brug af andre metoder, der typisk resulterer i lavere udbytter af infektiøse parasitter, såsom inkuberende promastigoter med specifikke, men ikke bredt tilgængelige antistoffer65 for metacyklisk promastigotes rensning, eller ved tæthed gradient afhængig af metacyklics 'LPG udtryk18,66. Differentieringsprotokollens effektivitet kan vurderes ved at bestemme ekspressionsniveauerne for amastinfamiliegener64,67. Amastiner er medlemmer af en bevaret genfamilie, der er differentieret moduleret under Leishmania livscyklus68 og er forbundet med parasit virulence og patogenese67,69,70. Andre markører kan også bruges til at skelne amastigote fra promastigote former. For eksempel er gp63 downregulated i amastigotes, fordi dens rolle er at beskytte promastigotes fra insektets fordøjelsesenzymer71.

Valget af musen stamme er et andet kritisk skridt, der skal overvejes, når de udvikler en standardiseret in vivo infektion protokol. Modtagelighed og modstandsdygtighed over for Leishmania-infektion hos mus reguleres hovedsageligt af genetisk baggrund29,30,55. I denne protokol blev C57BL/6-stammen valgt, fordi dens immunrespons på L. amazonensis er tæt forbundet med den blandede Th1-Th2 respons hos mennesker72,73. Eksperimentelle murineinfektioner med L. amazonensis er blevet beskrevet for at forårsage moderate læsioner i C57BL/6 mus sammenlignet med andre mus stammer28,34,74. Men afhængigt af parasitten stamme, forskelle i læsionstørrelse er kun påviselige i modtagelige mus stammer, ligesom BALB/c36. Det er også nødvendigt at overveje tidsforløbet for infektion og korrelerer med den valgte musstamme29,26,61,62,63,75. Sårige fodpuder bør altid undgås, da det kan repræsentere sekundære infektioner og er ofte observeret i lange perioder med infektion, især i forsøg med modtagelige mus stammer. At udpege tidspunktet på dagen for at starte infektionen er endnu et skridt, der skal overvejes. Som det fremgår af tidligere undersøgelser med L. amazonensis, påvirker tidspunktet på dagen for parasitten i nok læsion udvikling, fordi host-parasit interaktion påvirkes i en døgnrytmen måde af pinealisk frigivet melatonin i den mørke tid af dag75.

Den største ulempe ved in vivo-infektionsmetoden er, at forsøget kræver brug af et betydeligt antal laboratoriedyr og tager længere tid at opnå endelige resultater sammenlignet med in vitro-infektionsmetoden18. Dette sidstnævnte aspekt kan imidlertid også betragtes som en fordel, da in vivo-resultaterne afspejler det naturlige tidsforløb for sygdomsprogression mere præcist end resultaterne fra in vitro-infektion. Endnu vigtigere, resultaterne fra L. amazonensis in vivo infektion kan ikke kun afspejler de forbigående ændringer i parasit virulens, men anerkender også den systemiske status for værten og alle dens spillere. I betragtning af de mange faktorer, der er nævnt ovenfor, kan den metode, der er beskrevet i denne protokol, derfor tilpasses til at opfylde specifikke eksperimentelle behov for karakterisering af andre mål og behandlinger i forbindelse med virulens, der giver mulighed for ny indsigt for kutan leishmaniasis kontrol.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke prof. Dr. Niels Olsen Saraiva Câmara fra Animal Center of the Biomedical Sciences Institute ved Universitetet i São Paulo for støtte og prof. Dr. Silvia Reni Uliana for at give glasvæv slibemaskine. Dette arbejde blev støttet af Sao Paulo Research Foundation (FAPESP - MFLS' tilskud 2017/23933-3).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well plate Greiner bio-ne 655180 A flat-bottom plate for limiting dilution assay
adenine Sigma A8626 Supplement added to M199 cell culture media
caliper Mitutoyo 700-118-20 A caliper to measure the thickness of footpad
cell culture flask Corning 353014 A 25 cm2 volume cell culture flask to cultivate Leishmania parasite
centrifuge Eppendorf 5804R An equipament used for separating samples based on its density
CO2 incubator 34 °C Thermo Scientific 3110 An incubator for amastigotes differentiation
ethanol Merck K50237083820 A disinfectant for general items
fetal bovine serum Gibco 12657-029 Supplement added to M199 cell culture media
glass tissue grinder tube Thomas Scientific 3431 E04 A tube to collect and disrupt infected footpad tissue
glucose Synth G1008.01.AH Supplement added to M199 cell culture media
GraphPad Prism Software GraphPad A software used to plot the data and calculate statistical significance
hemin Sigma H-2250 Supplement added to M199 cell culture media
HEPES Promega H5303 Supplement added to M199 cell culture media
incubator 25 °C Fanem 347CD An incubator for promastigotes cultivation
inverted microscope Nikon TMS An equipament used to visual analyze the promastigote and amastigote cultures
isoflurane An inhalant anesthetics for mice (3-5%)
laminar flow cabinet Veco VLFS-09 A biosafety cabinet used for aseptical work area
M199 cell culture media Gibco 31100-035 A cell culture media for Leishmania cultivation
microcentrifuge tube Axygen MCT150C A microtube used for sample collection, processing and storage
multichanel pipette Labsystems F61978 A multichannel pipette used for limiting dilution assay
NaHCO3 Merck 6329 Supplement added to M199 cell culture media
NaOH Sigma S8045 Supplement added to M199 cell culture media
Neubauer chamber HBG 2266 A hemocytometer to count the parasite suspension
optical microscope Nikon E200 An optical equipament used to count parasite
parafilm Bemis 349 A flexible and resistant plastic to seal the plate
penicillin/streptomycin Gibco 15140122 Supplement added to M199 cell culture media
Petri dishes TPP 93100 A sterile dish to dissect the footpad tissue
pipetman kit Gilson F167360 A micropipette kit containing four pipettors (P2 P20 P200 P1000)
scale Quimis BG2000 An equipament used to weigh collected footpad lesions
scalpel Solidor 10237580026 A scalpel to cut and collect footpad tissue
serological pipette 10 mL Nest 327001 A sterile pipette used for transfering mililiter volumes
tips Axygen A pipette tip used for transfering microliter volumes
Trypan blue Gibco 15250-061 A dye used to count viable parasites
trypticase peptone Merck Supplement added to M199 cell culture media
tuberculin syringe BD 305945 A syringe with 27G needle to inoculate the parasite suspension

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alvar, J., et al. Leishmaniasis worldwide and global estimates of its incidence. PloS One. 7 (5), e35671 (2012).
  2. Ashford, R. W. The leishmaniases as emerging and reemerging zoonoses. International Journal for Parasitololy. 30 (12-13), 1269-1281 (2000).
  3. Burza, S., Croft, S. L., Boelaert, M. Leishmaniasis. Lancet. 392 (10151), 951-970 (2018).
  4. Scorza, B. M., Carvalho, E. M., Wilson, M. E. Cutaneous Manifestations of Human and Murine Leishmaniasis. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), e1296 (2017).
  5. Afonso, L. C., Scott, P. Immune responses associated with susceptibility of C57BL/10 mice to Leishmania amazonensis. Infection and Immunity. 61 (7), 2952-2959 (1993).
  6. Khamesipour, A., Rafati, S., Davoudi, N., Maboudi, F., Modabber, F. Leishmaniasis vaccine candidates for development: a global overview. Indian Journal of Medical Research. 123 (3), 423-438 (2006).
  7. Kumar, R., Engwerda, C. Vaccines to prevent leishmaniasis. Clinical & Translational Immunology. 3 (3), e13 (2014).
  8. Murray, H. W., Berman, J. D., Davies, C. R., Saravia, N. G. Advances in leishmaniasis. Lancet. 366 (9496), 1561-1577 (2005).
  9. Hotez, P. J., Bottazzi, M. E., Franco-Paredes, C., Ault, S. K., Periago, M. R. The neglected tropical diseases of Latin America and the Caribbean: a review of disease burden and distribution and a roadmap for control and elimination. PLoS Neglected Tropical Diseases. 2 (9), e300 (2008).
  10. Croft, S. L., Sundar, S., Fairlamb, A. H. Drug resistance in leishmaniasis. Clinical Microbiology Reviews. 19 (1), 111-126 (2006).
  11. Ponte-Sucre, A., et al. Drug resistance and treatment failure in leishmaniasis: A 21st century challenge. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (12), e0006052 (2017).
  12. Teixeira, D. E., et al. The cell biology of Leishmania: how to teach using animations. PLoS Pathogens. 9 (10), e1003594 (2013).
  13. Sunter, J., Gull, K. Shape, form, function and Leishmania pathogenicity: from textbook descriptions to biological understanding. Open Biology Journal. 7 (9), 170165 (2017).
  14. Laranjeira-Silva, M. F., et al. A MFS-like plasma membrane transporter required for Leishmania virulence protects the parasites from iron toxicity. PLoS Pathogens. 14 (6), e1007140 (2018).
  15. Aoki, J. I., et al. L-arginine availability and arginase activity: Characterization of amino acid permease 3 in Leishmania amazonensis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (10), e0006025 (2017).
  16. Probst, C. M., et al. A comparison of two distinct murine macrophage gene expression profiles in response to Leishmania amazonensis infection. BMC Microbiology. 12, 22 (2012).
  17. Dillon, L. A., et al. Simultaneous transcriptional profiling of Leishmania major and its murine macrophage host cell reveals insights into host-pathogen interactions. BMC Genomics. 16, 1108 (2015).
  18. Sarkar, A., Khan, Y. A., Laranjeira-Silva, M. F., Andrews, N. W., Mittra, B. Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites. Journal of Visualized Experiments. (133), e57486 (2018).
  19. Mittra, B., Laranjeira-Silva, M. F., Miguel, D. C., Perrone Bezerra de Menezes, J., Andrews, N. W. The iron-dependent mitochondrial superoxide dismutase SODA promotes. The Journal of Biological Chemistry. 292 (29), 12324-12338 (2017).
  20. Flannery, A. R., Huynh, C., Mittra, B., Mortara, R. A., Andrews, N. W. LFR1 ferric iron reductase of Leishmania amazonensis is essential for the generation of infective parasite forms. The Journal of Biological Chemistry. 286 (26), 23266-23279 (2011).
  21. Laranjeira-Silva, M. F., Zampieri, R. A., Muxel, S. M., Beverley, S. M., Floeter-Winter, L. M. Leishmania amazonensis arginase compartmentalization in the glycosome is important for parasite infectivity. PloS One. 7 (3), e34022 (2012).
  22. Sacks, D. L., Melby, P. C. Animal models for the analysis of immune responses to leishmaniasis. Current Protocols in Immunology. , (1998).
  23. Andersen, M. L., Winter, L. M. F. Animal models in biological and biomedical research - experimental and ethical concerns. Anais da Academia Brasileira de Ciências. 91, e20170238 (2019).
  24. Ribeiro-Gomes, F. L., et al. Site-dependent recruitment of inflammatory cells determines the effective dose of Leishmania major. Infection and Immunity. 82 (7), 2713-2727 (2014).
  25. Mahmoudzadeh-Niknam, H., Khalili, G., Abrishami, F., Najafy, A., Khaze, V. The route of Leishmania tropica infection determines disease outcome and protection against Leishmania major in BALB/c mice. The Korean Journal of Parasitology. 51 (1), 69-74 (2013).
  26. Oliveira, D. M., et al. Evaluation of parasitological and immunological parameters of Leishmania chagasi infection in BALB/c mice using different doses and routes of inoculation of parasites. Parasitology Research. 110 (3), 1277-1285 (2012).
  27. Côrtes, D. F., et al. Low and high-dose intradermal infection with Leishmania major and Leishmania amazonensis in C57BL/6 mice. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 105 (6), 736-745 (2010).
  28. Blackwell, J. M., et al. Genetics and visceral leishmaniasis: of mice and man. Parasite Immunology. 31 (5), 254-266 (2009).
  29. Loeuillet, C., Bañuls, A. L., Hide, M. Study of Leishmania pathogenesis in mice: experimental considerations. Parasites & Vectors. 9, 144 (2016).
  30. Alexander, J., Brombacher, F. T Helper1/T Helper2 Cells and Resistance/Susceptibility to Leishmania Infection: Is This Paradigm Still Relevant? Frontiers in Immunology. 3, 80 (2012).
  31. Sacks, D., Noben-Trauth, N. The immunology of susceptibility and resistance to Leishmania major in mice. Nature Reviews Immunology. 2 (11), 845-858 (2002).
  32. Bogdan, C., et al. Experimental Cutaneous Leishmaniasis: Mouse Models for Resolution of Inflammation Versus Chronicity of Disease. Methods in Molecular Biology. 1971, 315-349 (2019).
  33. Jones, D. E., Ackermann, M. R., Wille, U., Hunter, C. A., Scott, P. Early enhanced Th1 response after Leishmania amazonensis infection of C57BL/6 interleukin-10-deficient mice does not lead to resolution of infection. Infection and Immunity. 70 (4), 2151-2158 (2002).
  34. Velasquez, L. G., et al. Distinct courses of infection with Leishmania (L.) amazonensis are observed in BALB/c, BALB/c nude and C57BL/6 mice. Parasitology. 143 (6), 692-703 (2016).
  35. de Menezes, J. P., et al. Leishmania infection inhibits macrophage motility by altering F-actin dynamics and the expression of adhesion complex proteins. Cellular Microbiology. 19 (3), 1266 (2017).
  36. Mittra, B., et al. A Trypanosomatid Iron Transporter that Regulates Mitochondrial Function Is Required for Leishmania amazonensis Virulence. PLoS Pathogens. 12 (1), e1005340 (2016).
  37. Zilberstein, D., Nitzan Koren, R. Host-Free Systems for Differentiation of Axenic Leishmania. Methods in Molecular Biology. 1971, 1-8 (2019).
  38. Zilberstein, D., Shapira, M. The role of pH and temperature in the development of Leishmania parasites. Annual Review of Microbiology. 48, 449-470 (1994).
  39. Dumetz, F., et al. Modulation of Aneuploidy in Leishmania donovani during adaptation to different in vitro and in vivo environments and its impact on gene expression. MBio. 8 (3), e00599-e00517 (2017).
  40. Sinha, R., et al. Genome Plasticity in Cultured Leishmania donovani: Comparison of Early and Late Passages. Frontiers in Microbiology. 9, 1279 (2018).
  41. Magalhães, R. D., et al. Identification of differentially expressed proteins from Leishmania amazonensis associated with the loss of virulence of the parasites. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (4), e2764 (2014).
  42. Lei, S. M., Romine, N. M., Beetham, J. K. Population changes in Leishmania chagasi promastigote developmental stages due to serial passage. Journal of Parasitology. 96 (6), 1134-1138 (2010).
  43. Ali, K. S., Rees, R. C., Terrell-Nield, C., Ali, S. A. Virulence loss and amastigote transformation failure determine host cell responses to Leishmania mexicana. Parasite Immunology. 35 (12), 441-456 (2013).
  44. Rebello, K. M., et al. Leishmania (Viannia) braziliensis: influence of successive in vitro cultivation on the expression of promastigote proteinases. Experimental Parasitology. 126 (4), 570-576 (2010).
  45. Johns Hopkins Animal Care and Use Program. , The Johns Hopkins University Animal Care and Use Committee. http://web.jhu.edu/animalcare/index.html (2019).
  46. Titus, R. G., Marchand, M., Boon, T., Louis, J. A. A limiting dilution assay for quantifying Leishmania major in tissues of infected mice. Parasite Immunology. 7 (5), 545-555 (1985).
  47. Lima, H. C., Bleyenberg, J. A., Titus, R. G. A simple method for quantifying Leishmania in tissues of infected animals. Parasitology Today. 13 (2), 80-82 (1997).
  48. Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. , (1997).
  49. Sacks, D., Kamhawi, S. Molecular aspects of parasite-vector and vector-host interactions in leishmaniasis. Annual Review of Microbiology. 55, 453-483 (2001).
  50. Reimão, J. Q., et al. Parasite burden in Leishmania (Leishmania) amazonensis-infected mice: validation of luciferase as a quantitative tool. Journal of Microbiological Methods. 93 (2), 95-101 (2013).
  51. Buckley, S. M., et al. In vivo bioimaging with tissue-specific transcription factor activated luciferase reporters. Scientific Reports. 5, 11842 (2015).
  52. Thalhofer, C. J., et al. In vivo imaging of transgenic Leishmania parasites in a live host. Journal of Visualized Experiments. (41), e1980 (2010).
  53. Roberts, S. C., et al. Arginase plays a pivotal role in polyamine precursor metabolism in Leishmania. Characterization of gene deletion mutants. The Journal of Biological Chemistry. 279 (22), 23668-23678 (2004).
  54. Boitz, J. M., et al. Arginase Is Essential for Survival of Leishmania donovani Promastigotes but Not Intracellular Amastigotes. Infection and Immunity. 85 (1), e00554 (2017).
  55. Rosas, L. E., et al. Genetic background influences immune responses and disease outcome of cutaneous L. mexicana infection in mice. International Immunology. 17 (10), 1347-1357 (2005).
  56. Belkaid, Y., et al. Development of a natural model of cutaneous leishmaniasis: powerful effects of vector saliva and saliva preexposure on the long-term outcome of Leishmania major infection in the mouse ear dermis. Journal of Experimental Medicine. 188 (10), 1941-1953 (1998).
  57. Titus, R. G., Ribeiro, J. M. Salivary gland lysates from the sand fly Lutzomyia longipalpis enhance Leishmania infectivity. Science. 239 (4845), 1306-1308 (1988).
  58. Lima, H. C., Titus, R. G. Effects of sand fly vector saliva on development of cutaneous lesions and the immune response to Leishmania braziliensis in BALB/c mice. Infection and Immunity. 64 (12), 5442-5445 (1996).
  59. Theodos, C. M., Ribeiro, J. M., Titus, R. G. Analysis of enhancing effect of sand fly saliva on Leishmania infection in mice. Infection and Immunity. 59 (5), 1592-1598 (1991).
  60. Kaur, S., et al. Effect of dose and route of inoculation on the generation of CD4+ Th1/Th2 type of immune response in murine visceral leishmaniasis. Parasitology Research. 103 (6), 1413-1419 (2008).
  61. Rolão, N., Melo, C., Campino, L. Influence of the inoculation route in BALB/c mice infected by Leishmania infantum. Acta Tropica. 90 (1), 123-126 (2004).
  62. Kébaïer, C., Louzir, H., Chenik, M., Ben Salah, A., Dellagi, K. Heterogeneity of wild Leishmania major isolates in experimental murine pathogenicity and specific immune response. Infection and Immunity. 69 (8), 4906-4915 (2001).
  63. Baldwin, T. M., Elso, C., Curtis, J., Buckingham, L., Handman, E. The site of Leishmania major infection determines disease severity and immune responses. Infection and Immunity. 71 (12), 6830-6834 (2003).
  64. Aoki, J. I., et al. RNA-seq transcriptional profiling of Leishmania amazonensis reveals an arginase-dependent gene expression regulation. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (10), e0006026 (2017).
  65. Pinto-da-Silva, L. H., et al. The 3A1-La monoclonal antibody reveals key features of Leishmania (L) amazonensis metacyclic promastigotes and inhibits procyclics attachment to the sand fly midgut. International Journal for Parasitology. 35 (7), 757-764 (2005).
  66. Spath, G. F., Beverley, S. M. A lipophosphoglycan-independent method for isolation of infective Leishmania metacyclic promastigotes by density gradient centrifugation. Experimental Parasitology. 99 (2), 97-103 (2001).
  67. Aoki, J. I., Laranjeira-Silva, M. F., Muxel, S. M., Floeter-Winter, L. M. The impact of arginase activity on virulence factors of Leishmania amazonensis. Current Opinion in Microbiology. 52, 110-115 (2019).
  68. Jackson, A. P. The evolution of amastin surface glycoproteins in trypanosomatid parasites. Molecular Biology and Evolution. 27 (1), 33-45 (2010).
  69. Rochette, A., et al. Characterization and developmental gene regulation of a large gene family encoding amastin surface proteins in Leishmania spp. Molecular and Biochemical Parasitology. 140 (2), 205-220 (2005).
  70. Rochette, A., Raymond, F., Corbeil, J., Ouellette, M., Papadopoulou, B. Whole-genome comparative RNA expression profiling of axenic and intracellular amastigote forms of Leishmania infantum. Molecular and Biochemical Parasitology. 165 (1), 32-47 (2009).
  71. Schneider, P., Rosat, J. P., Bouvier, J., Louis, J., Bordier, C. Leishmania major: differential regulation of the surface metalloprotease in amastigote and promastigote stages. Experimental Parasitology. 75 (2), 196-206 (1992).
  72. Ji, J., Sun, J., Qi, H., Soong, L. Analysis of T helper cell responses during infection with Leishmania amazonensis. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 66 (4), 338-345 (2002).
  73. Ji, J., Sun, J., Soong, L. Impaired expression of inflammatory cytokines and chemokines at early stages of infection with Leishmania amazonensis. Infection and Immunity. 71 (8), 4278-4288 (2003).
  74. Felizardo, T. C., Toma, L. S., Borges, N. B., Lima, G. M., Abrahamsohn, I. A. Leishmania (Leishmania) amazonensis infection and dissemination in mice inoculated with stationary-phase or with purified metacyclic promastigotes. Parasitology. 134 (12), 1699-1707 (2007).
  75. Laranjeira-Silva, M. F., Zampieri, R. A., Muxel, S. M., Floeter-Winter, L. M., Markus, R. P. Melatonin attenuates Leishmania (L.) amazonensis infection by modulating arginine metabolism. Journal of Pineal Research. 59 (4), 478-487 (2015).

Tags

Immunologi og infektion C57BL/6 mus inflammation respons parasit belastning læsion udvikling kutan infektion aksoniske amastigotes
I Vivo Infektion med <em>Leishmania amazonensis</em> at evaluere parasit virulens i mus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Aoki, J. I., Hong, A., Zampieri, R.… More

Aoki, J. I., Hong, A., Zampieri, R. A., Floeter-Winter, L. M., Laranjeira-Silva, M. F. In Vivo Infection with Leishmania amazonensis to Evaluate Parasite Virulence in Mice. J. Vis. Exp. (156), e60617, doi:10.3791/60617 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter