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Immunology and Infection

In Vivo-Infektion mit Leishmania amazonensis zur Bewertung der Parasitenvirulenz bei Mäusen

Published: February 20, 2020 doi: 10.3791/60617
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Physiology, Institute of Bioscience, University of Sao Paulo

Summary

Hier stellen wir ein zusammengestelltes Protokoll zur Bewertung der Hautinfektion von Mäusen mit Leishmania amazonensisvor. Dies ist eine zuverlässige Methode zur Untersuchung der Virrulenz von Parasiten, die eine systemische Ansicht der Wirbeltier-Wirtsreaktion auf die Infektion ermöglicht.

Abstract

Leishmania spp. sind protozoische Parasiten, die Leishmanien verursachen, Krankheiten, die ein breites Spektrum klinischer Manifestationen von haut- bis viszeralen Läsionen darstellen. Derzeit sind schätzungsweise 12 Millionen Menschen weltweit mit Leishmania infiziert, und über 1 Milliarde Menschen sind von infektionsgefährdet. Leishmania amazonensis ist in Mittel- und Südamerika endemisch und führt in der Regel zur hautförmigen Form der Krankheit, die in einem Tiermodell direkt visualisiert werden kann. Daher sind L. amazonensis Stämme gute Modelle für kutane Leishmaniose-Studien, weil sie auch leicht in vitro kultiviert werden können. C57BL/6-Mäuse imitieren die l. amazonensisgetriebeneKrankheitsprogression, die beim Menschen beobachtet wurde, und gelten als eines der besten Mäusestämme modellieren für kutane Leishmaniose. Im Wirbeltierwirt bewohnen diese Parasiten Makrophagen trotz der Abwehrmechanismen dieser Zellen. Mehrere Studien verwenden In-vitro-Makrophagen-Infektionstests, um die Parasiteninfektiosität unter verschiedenen Bedingungen zu bewerten. Der In-vitro-Ansatz beschränkt sich jedoch auf ein isoliertes Zellsystem, das die Reaktion des Organismus außer Acht lässt. Hier stellen wir eine in vivo murinierte Infektionsmethode zusammen, die einen systemischen physiologischen Überblick über die Wirts-Parasiten-Wechselwirkung bietet. Das detaillierte Protokoll zur In-vivo-Infektion von C57BL/6-Mäusen mit L. amazonensis umfasst die Parasitendifferenzierung in infektiöse Amastigoten, Mäusefootpad-Kutane-Impfung, Läsionsentwicklung und Parasitenlastbestimmung. Wir schlagen diese etablierte Methode als die am besten geeignete Methode für physiologische Studien des Wirts Immun- und Stoffwechselreaktionen auf hautnahe Leishmaniose vor.

Introduction

Leishmanien sind weltweit weit verbreitete parasitäre Infektionskrankheiten, die in Entwicklungsländern eine wichtige Herausforderung darstellen und von der Weltgesundheitsorganisation1,2als eine der wichtigsten vernachlässigten Tropenkrankheiten anerkannt werden. Die Leishmanien sind durch haut-, schleimhaut- und/oder viszerale Manifestationen gekennzeichnet. Kutane Leishmaniose wird in der Regel durch L. amazonensis, L. mexicana, L. braziliensis, L. guyanensis, L. major, L. tropica und L. aethiopica3verursacht. Diese Form der Krankheit ist oft Selbstheilung beim Menschen aufgrund der Induktion der schützenden zellulären Immunantwort. Jedoch, die zelluläre Immunantwort kann fehlschlagen, und die Krankheit kann zu verbreiten cutaneous Leishmaniasisfortschreiten 4,5. Aufgrund der Vielfalt unter den Leishmanien-Arten und dem genetischen Hintergrund der Wirtszeit gibt es keinen Impfstoff6,7. Behandlungsmöglichkeiten sind auch begrenzt, da die meisten der derzeit verfügbaren Medikamente entweder teuer, toxisch und/oder kann langfristige Behandlung erfordern8,9. Außerdem gab es Berichte über Arzneimittelresistenz entogen gegen die verfügbaren Behandlungen10,11.

Der Erreger der Leishmanien ist der protozoische Parasit Leishmanien. Der Parasit stellt zwei verschiedene morphologische Formen in seinem Lebenszyklus dar: Promastigoten, die flagellated Form in Sandfliegen gefunden; und Amastigoten, die intrazelluläre Form, die in den parasitopholen Vakuolen des Säugetierwirts Makrophagen12,13gefunden wird. Die Fähigkeit von Amastigotes, trotz der Abwehrmechanismen der Makrophagen des Wirbeltierwirts einzudringen, zu überleben und zu replizieren, unterliegt vielen Studien14,15,16,17. Daher haben mehrere Forschungsgruppen In-vitro-Makrophagen-Infektionstests beschrieben, um die Auswirkungen spezifischer Umweltfaktoren sowie von Parasiten- und Wirtsgenen auf die Parasiteninfektiosität zu bewerten. Dieser Test bietet mehrere Vorteile, wie die Fähigkeit, Studien an ein Format mit hohem Durchsatz anzupassen, einen relativ kürzeren Zeitraum, um Ergebnisse zu erzielen, und eine geringere Anzahl von Labortieren, die18geopfert wurden. Die Ergebnisse von In-vitro-Assays sind jedoch begrenzt, da sie nicht immer in vivo-Studien14,19,20,21replizieren. In-vivo-Assays bieten einen systemischen physiologischen Überblick über die Wirts-Parasiten-Interaktion, die durch In-vitro-Assays nicht vollständig nachgeahmt werden kann. Zum Beispiel können immunologische Studien durch immunhistochemische Assays aus gesammelten Fußpolstergewebeabschnitten oder sogar von poplitealen Lymphknoten zur Analyse der wiedergewonnenen Immunzellen durchgeführt werden22.

Tiere werden oft als Modell für menschliche Krankheiten in der biologischen und biomedizinischen Forschung verwendet, um die zugrunde liegenden physiologischen Mechanismen der Krankheiten besser zu verstehen23. Im Falle der Leishmaniose beeinflussen die Route, der Ort oder die Dosis der Impfung das Krankheitsergebnis24,25,26,27. Darüber hinaus werden Anfälligkeit und Resistenz gegen die Infektion bei Menschen und Mäusen stark durch den genetischen Hintergrund des Wirts und Parasiten4,5,22,28,29,30,31reguliert. BALB/c-Mäuse sind sehr anfällig für L. amazonensis kutane Infektionen, die ein schnelles Krankheitsverlauf mit der Verbreitung der Parasiten an die Lymphknoten, Milz und Leber32zeigen. Da die Krankheit zu kutanen Metastasen fortschreiten kann, kann die Infektion tödlich sein. Im Gegensatz dazu entwickeln C57BL/6-Mäuse häufig chronische Läsionen mit anhaltenden Parasitenbelastungen in L. amazonensis-Infektions-Assays 33. Dabei wurde eine L. amazonensis-Infektion mit dieser speziellen Mausart als ein ausgezeichnetes Modell zur Untersuchung chronischer Formen der hautnaheleishmaniosen Beim Menschen angesehen, da sie das Krankheitsverlaufbesser imitiert als das BALB/c-Mäuseinfektionsmodell5,34.

Daher schlagen wir vor, dass die murine in vivo-Infektion eine nützliche Methode für Leishmanenvirulenz physiologische Studien für menschliche Krankheiten ist, die eine systemische Ansicht der Wirts-Parasiten-Interaktion ermöglichen. Bei der Begutachtung der etablierten Assays22präsentieren wir hier ein zusammengestelltes Schritt-für-Schritt-Protokoll der In-vivo-Infektion von C57BL/6-Mäusen mit L. amazonensis, das die Parasitendifferenzierung in axtische Amastigoten, Mäusefußpad-Hautimpfung, Läsionsentwicklung und Parasitenlastbestimmung umfasst. Dieses Protokoll kann an andere Mäusestämme und Leishmanienarten angepasst werden, die kutane Leishmanien verursachen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die hier vorgestellte Methode entscheidend für die Identifizierung neuerAnti-Leishmanie-Medikamentenziele und -impfstoffe sowie in physiologischen Studien des Wirts immun- und metabolische Reaktionen auf Leishmanien-Infektionen ist.

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Protocol

Alle experimentellen Verfahren wurden vom Tierpflege- und Verwendungsausschuss des Instituts für Biowissenschaften der Universität Von Sao Paulo (CEUA 342/2019) genehmigt und in Übereinstimmung mit den Empfehlungen und den Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren des Bundesstaates Sao Paulo (Lei Estadual 11.977, de 25/08/2005) und der brasilianischen Regierung (Lei Federal 11.794, de 08/10/2008). Alle in den Abschnitten 1-5 beschriebenen Schritte sollten aseptisch in laminaren Strömungsschränken durchgeführt werden. Persönliche Schutzausrüstung sollte beim Umgang mit lebenden Leishmanienparasiten eingesetzt werden.

1. In Vitro Differenzierung von L. amazonensis Promastigotes in Axenic Amastigotes15,20,35,36,37,38

HINWEIS: L. amazonensis (MHOM/BR/1973/M2269) (La) Parasit wurde in diesem Test verwendet. Je nach Studienzweck kann die infektiöse Parasitenform entweder durch Reinigung der metazyklischen Form unter Verwendung eines Dichtegradienten, wie zuvor beschrieben14, oder durch Differenzierung von Promastigoten in axtische Amastigoten nach folgendem Protokoll erhalten werden.

  1. Grow La promastigotes in einem 25 cm2 Zellkulturkolben mit 10 ml Medium für Promastigoten (pro-medium) (pH = 7,0).
  2. 3 Tage lang bei 25 °C inkubieren.
    HINWEIS: Verwenden Sie Promastigot-Kulturen, die in vitro weniger als 10x durchdrungen wurden, um den Verlust von Virulenz und Aneuploidie-Veränderungen von Parasiten39,40,41,42,43,44zu vermeiden.
  3. Pipette 5 ml logarithmische Wachstumsphase promastigote Kultur in einem neuen 25 cm2 Kolben.
  4. 5 ml Medium für axtische Amastigoten (ama-medium) hinzufügen (pH = 5,2).
  5. 3-4 Tage bei 34 °C inkubieren.
  6. Teilen Sie die Kultur auf, indem Sie mit ama-medium im Verhältnis 1:3 in einen neuen 25 cm2 Kolben verdünnen.
  7. 3-5 Tage bei 34 °C inkubieren.
    HINWEIS: Inkubieren Sie die axtischen Amastigoten für bis zu 5 Tage, da sie das Ende der Reifung37darstellen.

2. C57BL/6 Footpad Infektion mit L. amazonensis

HINWEIS: Weibliche C57BL/6-Mäuse (6-8 Wochen alt) wurden im Animal Center des Biomedizinischen Instituts der Universität von Sao Paulo gewonnen und gepflegt. Die Tiere erhielten Nahrung und Wasser ad libitum.

  1. Zählen Sie die Kultur der axtischen Amastigoten, indem Sie ein Aliquot der in PBS verdünnten Parasitensuspension in eine Neubauer-Kammer (d.h. Hämozytometer) übertragen. Zählen Sie die nicht flagellated Parasiten, die Amastigoten Formen darstellen.
    HINWEIS: Alternativ kann Trypan blue (1:1) verwendet werden, um die Anzahl der lebensfähigen Amastigoten zu zählen (d. h. solche, die nicht mit Trypan blue befleckt sind).
  2. Verdünnen Sie die axtischen Amastigoten in PBS entsprechend der gewünschten Inokulumdosis und der Anzahl der vorgesehenen Inokulume (1 x 106 axenic amastigotes in 50 l PBS wird empfohlen).
  3. Eine Tuberkulinspritze mit einer 27 G Nadel mit der vorbereiteten Parasitensuspension beladen.
  4. Anästhetisieren Sie eine C57BL/6 Maus mit 3-5% Isofluran, wie vom Johns Hopkins University Animal Care and Use Committee45empfohlen. Bewerten Sie die Anästhesietiefe, indem Sie die Reaktion der Maus auf eine Zehenklemme testen.
  5. Impfen Sie 50 l der homogenisierten Parasitensuspension (1 x 106 axen amastigotes oder die gewünschte Inokulumdosis) im Subplantargewebe des linken Hinterfußpads mit der zuvor geladenen Tuberkulinspritze (Schritt 2.3).

3. Mouse Footpad Lesion Entwicklung

  1. Messen Sie einmal pro Woche das Fortschreiten der Läsion, indem Sie die Dicke der linken (infizierten) und rechten (nicht infizierten) Fußpolster mit einem Bremssattel messen.
  2. Berechnen Sie wöchentlich die Differenz der Dicke zwischen dem linken und rechten Hinterfuß, um die Läsionsprogression zu bewerten.
  3. Zeichnen Sie die berechneten Unterschiede auf der Y-Achse und die Zeit der Infektion auf der X-Achse und berechnen Sie die statistische Signifikanz.
    HINWEIS: Gemäß den Empfehlungen der Tierpflege- und Einsatzausschüsse müssen Tiere geopfert werden, bevor die infizierte Läsion ulzeriert wird, da Hautgeschwüre zu einer sekundären Infektion führen können. Wie in Der Ergänzenden Abbildung 1dargestellt, dauert es etwa 10 Wochen, bis die Läsionen Anzeichen einer Ulzeration mit der Parasitendosis (106 axenatonische Amastigoten) und dem in diesem Protokoll verwendeten Wirtsstamm (C57BL/6) zeigen. Die Mäuse sollten für die Läsionsextraktion geopfert werden, bevor die Anzeichen einer Ulzeration beobachtet werden.

4. Mäuse Footpad Lesion Extraktion und Parasiten begrenzende Verdünnung

  1. Bereiten Sie eine 96-Well-Platte (flacher Boden) für den begrenzenden Verdünnungstest46,47 vor, indem Sie allen Brunnen 180 l Pro-Medium hinzufügen.
    HINWEIS: Verwenden Sie für jedes Tier vier Plattenbahnen (die Hälfte der Platte), die quadruplicate Assays darstellen (d. h. Tier 1 = Bahnen A-D; Tier 2 = Bahnen E-H).
  2. Fügen Sie 1 ml Pro-Medium in ein Glasgewebeschleifrohr pro Läsion und wiegen Sie das Rohr.
    HINWEIS: Das Rohr muss steril gehalten werden, so verwenden Sie einen sterilen Deckel und wiegen Sie das Rohr mit dem geschlossenen Deckel, wenn Sie außerhalb des laminaren Strömungsschranks wiegen.
  3. Opfern Sie das Tier in einerCO2-Kammer, entsprechend den Empfehlungen der Tierpflege- und Nutzungsausschüsse. Desinfizieren Sie das Tier, indem Sie mit 70% Ethanol sprühen.
  4. Verbrauchen Sie den Fuß des Tieres an ihm Fersen, um das infizierte Fußpolster zu extrahieren und sprühen 70% Ethanol auf dem Fußpolster für die Desinfektion. Sorgen Sie für die Sterilisation von Schere und Zange, indem Sie sie in 70% Ethanol getränkt halten.
  5. Legen Sie das infizierte Fußpolster in eine sterile Petrischale und sezieren Sie mit sterilen Zangen und einem Skalpell, um alle Weichgewebe zu sammeln. Entsorgen Sie die Knochen.
    HINWEIS: Es wird eine Gleichmäßigkeit im Abschnittsschritt empfohlen, um eine voreingenommene Geweberückgewinnung zu vermeiden.
  6. Übertragen Sie das gesammelte Gewebe mit Pro-Medium auf das Glasgewebeschleifrohr, und wiegen Sie das Rohr dann erneut, um das Läsionsgewicht zu bestimmen.
    HINWEIS: Vermeiden Sie es, die Zangen und das Skalpell direkt in das Medium zu legen, da kleine Volumina entfernt werden können, was zu einem unterschätzten Gewebegewicht führt. Das Gewicht der Läsion wird berechnet, indem das Gewicht des Schlauches, das Pro-Medium enthält, mit dem gesammelten Gewebe vom Gewicht des Rohres subtrahiert wird, das nur pro-medium enthält.
  7. Homogenisieren Sie das Gewebe 10x mit dem Schleifer für vollständige Gewebestörung.
  8. Lassen Sie das Gemisch für 10 min Sediment, dann sammeln 20 l des Überstandes.
  9. In der1. Spalte der 1. Spur der in Schritt 4.1 vorbereiteten1. Spur der 96-Wellplatte 20 l des Überstandes beladen. Wiederholen Sie dies für die nächsten drei Bahnen, um Quadruplizierungen für jedes Tier zu haben (d. h. für Tier 1 fügen Sie 20 L zu jedem Brunnen hinzu und kennzeichnen Sie A1, B1, C1 und D1).
  10. Homogenisieren Sie jeden Brunnen in der1. Säule 10x mit einer Mehrkanalpipette. Übertragen Sie dann 20 l der verdünnten Proben von der1. Spalte in die2. Spalte.
    HINWEIS: Es ist wichtig, jeden Brunnen 10x von einer Spalte zur nächsten zu homogenisieren.
  11. Wiederholen Sie Schritt 4.10 auf alle verbleibenden Spalten bis zur letzten Spalte(12.)und verwerfen Sie die letzten 20 L der verdünnten Probe.
    HINWEIS: Ändern Sie die Spitzen nach jeder Verdünnung, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden.
  12. Versiegeln Sie die Platten mit einer Folie und brüten Sie 7 Tage lang bei 25 °C in einer feuchten Kammer.

5. Läsion Parasiten Last Bestimmung

  1. Analysieren Sie die Platten nach 7 Tagen Inkubation mit einem invertierten Mikroskop, um den letzten parasitenhaltigen Brunnen für jede Spur zu bestimmen.
    HINWEIS: Es ist auch möglich, einen Hinweis auf das Wachstum der Parasiten oder die Zelldichte durch visuelle Analyse der Farbveränderungen und Trübung des Mediums zu haben.
  2. Berechnen Sie die Parasitengewebelast für jede Spur, indem Sie den Verdünnungsfaktor pro Läsionsgewicht dividieren.
    HINWEIS: Wenn Parasiten in einer bestimmten Spur nur in den Spalten 1-5 vorhanden sind (d. h. Brunnen A1-A5 sind positiv für das Parasitenwachstum), bedeutet dies, dass Spalte 5 nur 1 Parasiten enthielt, Spalte 4 10 Parasiten usw. in Vielfachen von zehn. Spalte 1 würde 104 Parasiten enthalten, was die Anzahl der Parasiten in den anfänglichen 20 l Desobtant (die nicht verdünnte Probe in Schritt 4.7) darstellt. Da diese 20 l mit 180 l Pro-Medium verdünnt wurden, enthielt das Anfangsrohr 5 x 105 Parasiten: (1 x 104) / (0,02 ml) = 5 x 105 Parasiten/1 ml. Dann kann die Parasitenbelastung in dieser Läsion berechnet werden, indem die Anfangskonzentration des Parasiten durch das Läsionsgewicht dividiert wird: (5 x 105) / Läsionsgewicht (siehe Schritt 4.6).
  3. Zeichnen Sie den Durchschnitt des quadruplizierten Ergebnisses für jedes Tier mit einer Log Y-Skala.

6. Statistische Analyse

  1. Stellen Sie die Daten als durchschnittliche Standardabweichung dar, bei der mindestens fünf Tiere pro Versuchsgruppe als Replikationen verwendet werden.
  2. Führen Sie statistische Analysen mit einem nicht gepaarten zweischwanzigen Test durch, wobei ein p-Wert < 0,05 als signifikant betrachtet wird.

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Representative Results

Leishmania protozoan Parasiten existieren in zwei Entwicklungsformen während ihres Lebenszyklus in wirbellosen und Wirbeltier wirte: Promastigoten, die proliferative Formen im Lumen der weiblichen Sandfliege gefunden; und Amastigoten, die proliferativen Formen, die in den parasitophorischen Vakuolen der Säugetier-Wirtszellen gefunden werden. Promastigoten haben einen langgestreckten Körper von etwa 1,5 m Breite und 20 m Länge, wobei ein Flagellum typischerweise aus der vorderen Extremität hervortritt. Amastigoten haben einen abgerundeten oder eiförmigen Körper mit einer Größe von 2-6 m Länge und 1,5-3 m Breite und besitzen ein unscheinbares Flagellum12,13 (Abbildung 1A). Während der Blutmahlzeit erwirbt der wirbellose Wirt, ein hämatophagos Insekt der Familie Psychodidae, Makrophagen, die mit Leishmania amastigotes infiziert sind. Sobald diese Zellen die Sandfliegen-Verdauungsröhre erreichen, werden Amastigoten freigesetzt und unterscheiden sich zu prozyklischen Promastigoten (Abbildung 1A). Diese Formen sind nicht infizierend und vermehren sich intensiv durch binäre Teilung und besiedeln das Verdauungsrohr des Insektenvektors. Die prozyklischen Formen unterscheiden sich dann zu metazyklischen Formen, einer infektiösen und schnelllebigen Form, die einen dünneren Körper und längliches Flagellum darstellt (Abbildung 1A). Die metazyklischen Formen dringen in die vorderen Teile der Speiseröhre und proventriculus der Sandfliege ein, so dass während der nächsten Blutmahlzeit die Regurgitation die Impfung dieser infizierenden Formen in einen neuen Wirbeltierwirt sicherstellt. In der Tegument des Wirbeltierwirts werden die Parasiten durch die Makrophagen phagozytosiert und differenzieren sich in Amastigoten innerhalb der parasitopholen Vakuole, wo sich die Amastigoten durch binäre Teilung vermehren und den Lebenszyklus von Leishmanie12,13vervollständigen.

Axenische Bedingungen können verschiedene Wirtsumgebungen in vitro simulieren und die Parasitenmorphologie und Lebensfähigkeit erhalten. Axenische Bedingungen für Amastigoten wurden zuvor beschrieben, indem die parasitophore Vakuole-Umgebung eines Makrophagens simuliert und promastigote in vitro in die Amastigotenform37ausgelöst wurden. Diese Bedingungen imitieren die saure Umgebung (pH = 5,5) und die erhöhte Temperatur der Wirbeltierwirte (34 °C). Abbildung 1B zeigt Promastigoten, die zu Amastigoten differenziert sind, indem sie diese Bedingungen in der Kultur ändern. Die Lebensfähigkeit dieser axtischen Amastigoten kann durch Trypan-Blaufärbung analysiert werden, eine Methode, die auf dem Prinzip basiert, dass lebende Zellen intakte Membranen besitzen, die bestimmte Farbstoffe ausschließen, während abgestorbene Zellen nicht48. Alternativ analysierten wir die Lebensfähigkeit von axtischen Amastigoten, die ihre Fähigkeit überprüfen, sich wieder in Promastigoten zu transformieren, wenn sie auf neutralen pH-Wert übertragen und bei 25 °C inkubiert werden (Abbildung 1B).

Hier schlagen wir eine In-vivo-Infektionsmethode vor, um die Virulenz verschiedener Leishmanienstämme zu bewerten. Abbildung 2A zeigt einen In-vivo-Infektionstest, der die Entwicklung der hautläusigen Läsion von C57BL/6-Mäuse-Fußpads zeigt, die mit Wildtyp (La-WT) und Leishmania Iron Regulator 1 Knockout (La-LIR1-/-) L. amazonensis gereinigte Metazykliken infiziert waren. LIR1 reguliert den intrazellulären Eisengehalt in Leishmanien, um den Eisenexport zu vermitteln und seine intrazelluläre Akkumulation auf toxische Werte14zu verhindern. Unter Beobachtung des Fortschreitens der Dickenunterschiede der infizierten und nicht infizierten Fußpolster konnten wir nachweisen, dass die La-LIR1-/- infizierten Mäuse kleinere Läsionen aufwies als La-WT-infizierteMäuse ( Abbildung2A). Diese Ergebnisse zeigten, dass LIR1 für L. amazonensis in vivo Virulenz unerlässlich ist. Dies zeigt die Bedeutung und Wirksamkeit dieser Methode bei der Beurteilung der Unterschiede von Leishmanien-getriebenenHautkrankheiten. Abbildung 2B zeigt die nicht infizierten (rechts) und infizierten (linken) Fußpolster und die Läsionsentwicklung 73 Tage nach der Infektion, was die Unterschiede in der Schwellung und läsionsprogression von La-WT und La-LIR1 -/- infizierten Mäusen zeigt.

Das Fortschreiten der Leishmanien-Infektion besteht nicht nur aus der Läsionsentwicklung, die die Entzündungsreaktion darstellt, sondern auch aus der intrazellulären Replikation des Parasiten. Um die Parasitenreplikation zu bewerten, wurde die Parasitenbelastung der Läsionen durch Extraktion der infizierten Läsion bestimmt, gefolgt von einem begrenzenden Verdünnungstest in einer 96-Well-Platte (Abbildung 3A). Abbildung 3B zeigt die Parasitenlastanalyse der Fußpadläsionen von La-WT und La-LIR1 -/- infizierten Mäusen nach 73 Tagen Infektion. Aus dem begrenzenden Verdünnungstest haben wir 106-malweniger Parasiten in der Läsion der La-LIR1 -/- infizierten Mäuse im Vergleich zu La -WT entdeckt, was zeigt, dass das Fehlen von LIR1 die intrazelluläre Replikation der Amastigoten14verhindert.

Einer der Vorteile der Bewertung sowohl der Läsionsentwicklung als auch der Parasitenbelastung besteht darin, mögliche Unterschiede der intrazellulären Parasitenreplikation und der Entzündungsreaktion des Wirts zu erkennen. Wir beobachteten Unterschiede zwischen diesen beiden Phänotypen mit dem Add-Back LIR1 (La-LIR1AB), dem La-LIR1-/- mit dem LIR1 ORF wieder in den ribosomalen Heuschreckeintegriert 14. Als La-LIR1AB in das Fußpad einer Maus injiziert wurde, beobachteten wir mittelgroße Läsionen im Vergleich zu La-LIR1-/- und La-WT-Infektionen,aber eine bemerkenswerte vollständige Parasitenlastrettung des La-WT-Phänotyps(Ergänzende Abbildung 2). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass La-LIR1AB Parasiten in der Lage waren, sich wie La-WT-Parasitenbei einer langfristigen In-vivo-Infektion zu replizieren. Allerdings war die Hetzreaktion der Maus nicht so stark wie La-WT-Infektionen, da die Läsionen deutlich kleiner waren.

Dabei erwies sich die hier beschriebene Methode als wesentlich für die Identifizierung und Charakterisierung eines L. amazonensis Virulenzfaktors, der für die erfolgreiche amastigote intrazelluläre Replikation und die Hautläsionsentwicklung bei den Säugetierwirten erforderlich ist.

Figure 1
Abbildung 1: Morphologie von L. amazonensis promastigotes und amastigotes. (A) Abbildungen der verschiedenen morphologischen Formen von Leishmanie:prozyklische promastigote, metazyklische Promastigote und Amastigote. Skalenbalken = 2 m. (B) Bilder von in vitro L. amazonensis Kulturen. In-vitro-Differenzierung von Promastigoten in axtische Amastigoten und von axtischen Amastigoten zurück zu Promastigoten durch Änderung des pH- und Temperaturverhältnisses, wie im Schritt-für-Schritt-Protokoll beschrieben. Die Bilder wurden mit einem invertierten Mikroskop aufgenommen. Skalenbalken = 50 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: LIR1 Knockout deutlich reduziert L. amazonensis in vivo Läsion Entwicklung. C57BL/6 Mäuse wurden im linken Hinterfußpad mit 106 gereinigten Metazykliken des L. amazonensis wild type (La-WT) und L. amazonensis LIR1 knockout (La-LIR1-/-) geimpft. (A) Footpad kutane Läsion Progression von La-WT und La-LIR1-/- infizierte Mäuse wöchentlich analysiert. Die Daten stellen den durchschnittlichen SEM des infizierten Fußpolsters dar, das durch nicht infizierte Fußpolsterdicke von fünf verschiedenen Mäusen in jeder Gruppe subtrahiert wird (angepasst von Laranjeira-Silva et al.14). (B) Bilder der nicht infizierten und infizierten Fußpolster von La-WTund La-LIR1-/- infizierte Mäuse, die die Unterschiede in der Schwellung 73 Tage Nachinfektion zeigen (angepasst von Laranjeira-Silva et al.14). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: LIR1 Knockout deutlich reduziert L. amazonensis in vivo intrazelluläre Replikation. (A) Eine Abbildung einer 96-Well-Platte, die die 10-fachen seriellen Verdünnungen des mit L. amazonensis wild type (La-WT) und LIR1 knockout (La-LIR1-/-) infizierten Fußpolstergewebe darstellt. Die Zeilen A-D stellen das Quadruplikat der seriellen Verdünnungen der La-WT-Fußpad-Läsionsprobe dar. Die Zeilen E-H stellen das Quadruplikat der seriellen Verdünnungen der La-LIR1-/--Fußpadläsionsprobe dar. Die verschiedenen Grauschattierungen stellen die beobachteten Zelldichten pro Brunnen dar (d. h., hellere Farbe bedeutet weniger Parasiten). Die rot markierten Brunnen stellen die letzten Brunnen dar, die Pro-Replikation Parasiten enthielten. (B) Parasitenbelastung in wiedergewonnenen Fußpolstergeweben von C57BL/6 Mäusen, die mit 106 gereinigten Metazykliken des L. amazonensis wild type (La-WT) und L. amazonensis LIR1 knockout (La-LIR1-/-) 73 Tage nach der Infektion infiziert sind. Die Daten stellen den Durchschnitt der Parasitenbelastung pro mg Gewebe von fünf verschiedenen Mäusen in jeder Gruppe dar (angepasst an Laranjeira-Silva et al.14). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Supplementary Figure 1
Ergänzende Abbildung 1: Hautgeschwür als Hinweis auf eine Sekundärinfektion. Repräsentative Bilder von C57BL/6 Mäusen Fußpads mit L. amazonensis Wildtyp(La-WT) infiziert 80 Tage nach der Infektion. Rote Pfeile weisen auf Anzeichen von Ulzeration hin, was darauf hinweist, dass das Experiment beendet werden sollte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Supplementary Figure 2
Ergänzende Abbildung 2: Die Rolle von LIR1 bei der In-vivo-Läsionsentwicklung und der intrazellulären Parasitenreplikation. C57BL/6 Mäuse wurden im linken Hinterfußpad mit 106 gereinigten Metazykliken von L. amazonensis wild type (La-WT), L. amazonensis LIR1 knockout (La-LIR1-/-) und L. amazonensis LIR1 add-back (La-LIR1AB) geimpft. (A) Footpad kutane Läsion Progression von La-WT, La-LIR1-/-und La-LIR1AB infizierten Mäusen wöchentlich analysiert. Die Daten stellen den durchschnittlichen SEM des infizierten Fußpolsters dar, das durch nicht infizierte Fußpolsterdicke von fünf verschiedenen Mäusen in jeder Gruppe subtrahiert wird (angepasst von Laranjeira-Silva et al.14). (B) Parasitenbelastung in wiedergewonnenen Fußpolstergeweben aus La-WT, La-LIR1-/-oder La-LIR1AB infizierten Mäusen, die 73 Tage nach der Infektion bestimmt wurden. Die Daten stellen den Durchschnitt der Parasitenbelastung pro mg Gewebe von fünf verschiedenen Mäusen in jeder Gruppe dar (angepasst an Laranjeira-Silva et al.14). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Der in diesem Protokoll beschriebene In-vivo-Infektionstest ermöglicht es jedem Forscher, in vivo kutane Leishmaniose unter Berücksichtigung der Wirts-Parasiten-Interaktion in einem systemischen Szenario zu bewerten. Diese Assays wurden von vielen Gruppen22,24,27,29,31,32,34,49 verwendet und hier haben wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zusammengestellt, um diese Methode zu standardisieren, während die Infrastruktureinschränkungen berücksichtigt werden, die einige Gruppen haben können. Dieses Protokoll kann auch verwendet werden, um die Virulenz von transgenen Leishmaniosen parasiten durch in vivo bioimaging50,51,52zu bewerten. Wie jedes andere experimentelle Verfahren hat dieser Test Einschränkungen und kritische Schritte, wie z. B. geschultes Personal, das bequem mit Mäusen arbeitet und Erfahrung in der Durchführung von Subplantar-Injektionen hat, um versehentliche Infektionen zu vermeiden. Die Standardisierung von Protokollen ist äußerst wichtig, um voreingenommene Ergebnisse zu vermeiden und vergleichbare Ergebnisse zwischen verschiedenen Forschungsgruppen zu erzielen.

Der Hauptvorteil der Verwendung von L. amazonensis als Modell für kutane Leishmanien liegt darin, dass die durch diese Art verursachte Fußpolsterläsion bei Mäusen leicht beurteilt werden kann. Die Schwellung des Fußpolsters, die durch die hier beschriebene Methode bestimmt wird, stellt die Summe von zwei Infektionsphänotypen dar: wirt entzündliche Reaktion und Parasitenreplikation. Beide Phänotypen können getrennt bewertet werden, indem die Methode der Parasitengewebebelastung, die die intrazelluläre Parasitenreplikation widerspiegelt, mit der Bestimmung des Progressionsders der Läsionsdicke assoziiert wird. Ein weiterer Vorteil ist, dass L. amazonensis' Promastigoten leicht in vitro kultiviert werden. In Anbetracht dieser, jede Forschungsgruppe kann diese Leishmanischen Arten nach ihren Bedürfnissen manipulieren. Die Ergebnisse aus L. amazonensis' Studien können dann mit anderen Leishmanien-Arten verglichen werden, um festzustellen, ob ein bestimmter Pfad evolutionär konserviert oder divergierendist 21,53,54.

Im natürlichen Zyklus tritt die Leishmanie-Übertragung auf den Wirbeltierwirt durch den Biss einer infizierten Sandfliege während der Blutmahlzeit auf. Die Sandfliege impft in der Regel ein paar hundert Leishmanie-metazyklische Promastigot-Formen im Speichel des Insekts. Bei experimentellen In-vivo-Infektionen ist die häufigste Impfstelle das Fußpolster des Tieres22. Intradermale Injektion in das Ohr oder intraperitoneale Injektion sind alternative Injektionsstellen, abhängig vom Studienzweck, da jede Stelle unterschiedliche phagozytische Zelltypen24,56präsentiert. Daher verwenden einige Forschungsgruppen laborinfizierte Sandfliegen, um die Ohrdermis des Tieres zu infizieren, um die natürliche Übertragung56,57,58,59nachzuahmen. Dieses Protokoll enthält jedoch einige Einschränkungen, wie die Erhaltung von Sandfliegenkolonien, die Einrichtungen erfordert, die für die meisten Forschungsgruppen nicht verfügbar sind.

Die ursprüngliche Arbeit, die in vivo C57BL/6 Infektion mit La-LIR1-/- beschreibt, hat gereinigte metazyklische Promastigoten formen14verwendet. Die genetische Manipulation von Leishmania kann jedoch entweder die Differenzierung der Promastigoten in axtische Amastigoten14 oder in metazyklische Infektiöse Formenbeeinträchtigen 20. Daher sollte der Forscher je nach Leishmanie-Stamm die am besten geeignete Methode bestimmen, um lebensfähige infektiöse Parasitenformen für ihre Studie zu erhalten. Das protokoll der axtischen Amastigoten, die von den hier beschriebenen Promastigoten unterscheiden, kann eine einfachere Alternative sein und in vielen Fällen vergleichbare Ergebnisse erzeugen19,20,35,37,38,64. Dieser Ansatz vermeidet den Einsatz anderer Methoden, die typischerweise zu geringeren Erträgen von infektiösen Parasiten führen, wie z. B. die Inkubation von Promastigoten mit spezifischen, aber nicht allgemein verfügbarenAntikörpern 65 für die reinigung von metazyklischen Promastigoten oder durch Dichtegradienten abhängig von der LPG-Expression der Metazyklik18,66. Die Effizienz des Differenzierungsprotokolls kann durch Die Bestimmung der Expressionsniveaus der Amastin-Familiengene64,67bewertet werden. Amastine sind Mitglieder einer konservierten Genfamilie, die während des Leishmanie-Lebenszyklus 68 differenziell moduliert werden und mit Parasitenvirulenz und Pathogenese67,69,70assoziiert sind. Andere Marker können auch verwendet werden, um Amastigot e von promastigote Formen zu unterscheiden. Zum Beispiel ist gp63 in Amastigoten nach unten reguliert, weil seine Rolle darin besteht, die Promastigoten vor den Verdauungsenzymen des Insekts zu schützen71.

Die Wahl des Mausstamms ist ein weiterer wichtiger Schritt, der bei der Entwicklung eines standardisierten In-vivo-Infektionsprotokolls berücksichtigt werden muss. Die Anfälligkeit und Resistenz gegen Leishmanien-Infektionen bei Mäusen werden hauptsächlich durch genetischen Hintergrund reguliert29,30,55. In diesem Protokoll wurde der C57BL/6-Stamm gewählt, weil seine Immunantwort auf L. amazonensis eng mit der gemischten Th1-Th2-Antwort beim Menschen72,73verwandt ist. Experimentelle murine Infektionen mit L. amazonensis wurden beschrieben, um moderate Läsionen bei C57BL/6 Mäusen im Vergleich zu anderen Mäusestämmen28,34,74zu verursachen. Je nach Parasitenstamm sind Unterschiede in der Läsionsgröße jedoch nur bei anfälligen Mäusestämmen, wie BALB/c36,nachweisbar. Der Zeitverlauf der Infektion muss auch berücksichtigt werden und korreliert mit dem gewählten Mäusestamm29,26,60,61,62,63,75. Ulzerierte Fußpolster sollten immer vermieden werden, da sie sekundäre Infektionen darstellen können und häufig bei langen Infektionsperioden beobachtet werden, insbesondere in Experimenten mit anfälligen Mäusestämmen. Die Zeit des Tages zu bezeichnen, um die Infektion zu beginnen, ist ein weiterer Schritt, der in Betracht gezogen werden muss. Wie in früheren Studien mit L. amazonensis gezeigt,beeinflusst die Tageszeit des Parasiten Inokulum die Läsionsentwicklung, da die Wirts-Parasiten-Interaktion in zirkadianer Weise durch das ziranfreigesetzte Melatonin während der dunklen Tageszeit75beeinflusst wird.

Der Hauptnachteil der In-vivo-Infektionsmethode besteht darin, dass das Experiment die Verwendung einer erheblichen Anzahl von Labortieren erfordert und länger dauert, um endgültige Ergebnisse im Vergleich zur In-vitro-Infektionsmethode18zu erhalten. Dieser letztgenannte Aspekt kann jedoch auch als Vorteil betrachtet werden, da die In-vivo-Ergebnisse den natürlichen Verlauf der Krankheitsprogression genauer widerspiegeln als die Ergebnisse einer In-vitro-Infektion. Noch wichtiger ist, dass die Ergebnisse der L. amazonensis in vivo Infektion nicht nur die vorübergehenden Veränderungen der Parasitenvirulenz widerspiegeln, sondern auch den systemischen Status des Gastgebers und aller seiner Spieler anerkennen. Unter Berücksichtigung der oben genannten Faktoren kann die in diesem Protokoll beschriebene Methode daher an spezifische experimentelle Erfordernisse zur Charakterisierung anderer Ziele und Behandlungen im Zusammenhang mit Virulenz angepasst werden, die neue Erkenntnisse für die Kontrolle der hautbedingten Leishmaniose ermöglichen.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Acknowledgments

Wir danken Prof. Dr. Niels Olsen Saraiva Cémara vom Tierzentrum des Instituts für Biomedizinische Wissenschaften der Universität von Sao Paulo für die Unterstützung und Prof. Dr. Silvia Reni Uliana für die Bereitstellung der Glasgewebemühle. Diese Arbeit wurde von der Sao Paulo Research Foundation (FAPESP - MFLS' Grant 2017/23933-3) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well plate Greiner bio-ne 655180 A flat-bottom plate for limiting dilution assay
adenine Sigma A8626 Supplement added to M199 cell culture media
caliper Mitutoyo 700-118-20 A caliper to measure the thickness of footpad
cell culture flask Corning 353014 A 25 cm2 volume cell culture flask to cultivate Leishmania parasite
centrifuge Eppendorf 5804R An equipament used for separating samples based on its density
CO2 incubator 34 °C Thermo Scientific 3110 An incubator for amastigotes differentiation
ethanol Merck K50237083820 A disinfectant for general items
fetal bovine serum Gibco 12657-029 Supplement added to M199 cell culture media
glass tissue grinder tube Thomas Scientific 3431 E04 A tube to collect and disrupt infected footpad tissue
glucose Synth G1008.01.AH Supplement added to M199 cell culture media
GraphPad Prism Software GraphPad A software used to plot the data and calculate statistical significance
hemin Sigma H-2250 Supplement added to M199 cell culture media
HEPES Promega H5303 Supplement added to M199 cell culture media
incubator 25 °C Fanem 347CD An incubator for promastigotes cultivation
inverted microscope Nikon TMS An equipament used to visual analyze the promastigote and amastigote cultures
isoflurane An inhalant anesthetics for mice (3-5%)
laminar flow cabinet Veco VLFS-09 A biosafety cabinet used for aseptical work area
M199 cell culture media Gibco 31100-035 A cell culture media for Leishmania cultivation
microcentrifuge tube Axygen MCT150C A microtube used for sample collection, processing and storage
multichanel pipette Labsystems F61978 A multichannel pipette used for limiting dilution assay
NaHCO3 Merck 6329 Supplement added to M199 cell culture media
NaOH Sigma S8045 Supplement added to M199 cell culture media
Neubauer chamber HBG 2266 A hemocytometer to count the parasite suspension
optical microscope Nikon E200 An optical equipament used to count parasite
parafilm Bemis 349 A flexible and resistant plastic to seal the plate
penicillin/streptomycin Gibco 15140122 Supplement added to M199 cell culture media
Petri dishes TPP 93100 A sterile dish to dissect the footpad tissue
pipetman kit Gilson F167360 A micropipette kit containing four pipettors (P2 P20 P200 P1000)
scale Quimis BG2000 An equipament used to weigh collected footpad lesions
scalpel Solidor 10237580026 A scalpel to cut and collect footpad tissue
serological pipette 10 mL Nest 327001 A sterile pipette used for transfering mililiter volumes
tips Axygen A pipette tip used for transfering microliter volumes
Trypan blue Gibco 15250-061 A dye used to count viable parasites
trypticase peptone Merck Supplement added to M199 cell culture media
tuberculin syringe BD 305945 A syringe with 27G needle to inoculate the parasite suspension

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Immunologie und Infektion Ausgabe 156 C57BL/6 Mäuse Entzündungsreaktion Parasitenbelastung Läsionsentwicklung Hautinfektion axtische Amastigoten
In Vivo-Infektion mit <em>Leishmania amazonensis</em> zur Bewertung der Parasitenvirulenz bei Mäusen
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Aoki, J. I., Hong, A., Zampieri, R.… More

Aoki, J. I., Hong, A., Zampieri, R. A., Floeter-Winter, L. M., Laranjeira-Silva, M. F. In Vivo Infection with Leishmania amazonensis to Evaluate Parasite Virulence in Mice. J. Vis. Exp. (156), e60617, doi:10.3791/60617 (2020).

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