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Immunology and Infection

Infezione in vivo con Leishmania amazonensis per valutare la virulenza dei parassiti nei topi

Published: February 20, 2020 doi: 10.3791/60617
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Physiology, Institute of Bioscience, University of Sao Paulo

Summary

Qui, presentiamo un protocollo compilato per valutare l'infezione cutanea dei topi con Leishmania amazonensis. Questo è un metodo affidabile per studiare la virulenza dei parassiti, consentendo una visione sistemica della risposta dell'ospite vertebrato all'infezione.

Abstract

Leishmania spp. sono parassiti protozoi che causano leishmaniosi, malattie che presentano un ampio spettro di manifestazioni cliniche da lesioni cutanee a lesioni viscerali. Attualmente, si stima che 12 milioni di persone siano infettate dalla Leishmania in tutto il mondo e oltre 1 miliardo di persone viva a rischio di infezione. La leishmania amazonensis è endemica in America centrale e meridionale e di solito porta alla forma cutanea della malattia, che può essere visualizzata direttamente in un modello animale. Pertanto, i ceppi di L. amazonensis sono buoni modelli per gli studi di leishmaniosi cutanea perché sono anche facilmente coltivati in vitro. I topi C57BL/6 imitano la progressione della malattia guidata da L. amazonensisosservata nell'uomo e sono considerati uno dei migliori modelli di ceppi di topi per la leishmaniosi cutanea. Nell'ospite dei vertebrati, questi parassiti abitano i macrofagi nonostante i meccanismi di difesa di queste cellule. Diversi studi utilizzano saggi di infezione da macrofagio in vitro per valutare l'infettività del parassita in diverse condizioni. Tuttavia, l'approccio in vitro è limitato a un sistema cellulare isolato che ignora la risposta dell'organismo. Qui, compiliamo un metodo di infezione murina in vivo che fornisce una panoramica fisiologica sistemica dell'interazione ospite-parassita. Il protocollo dettagliato per l'infezione in vivo di topi C57BL/6 con L. amazonensis comprende la differenziazione dei parassiti in amastigoti infettivi, intorpidimento cutaneo dei topi, sviluppo della lesione e determinazione del carico di parassiti. Proponiamo questo metodo consolidato come il metodo più adeguato per gli studi fisiologici delle risposte immunitarie e metaboliche dell'ospite alla leishmaniosi cutanea.

Introduction

Le leishmaniosi sono malattie infettive parassitarie prevalenti in tutto il mondo che rappresentano importanti sfide nei paesi in via di sviluppo e sono riconosciute come una delle più importanti malattie tropicali trascurate dall'Organizzazione Mondiale della Sanità1,2. Le leishmaniasi sono caratterizzate da manifestazioni cutanee, mucose e/o viscerali. Cutaneous leishmaniosi è di solito causata da L. amazonensis, L. mexicana, L. braziliensis, L. guyanensis, L. major, L. tropica e L. aethiopica3. Questa forma della malattia è spesso auto-guarigione negli esseri umani a causa dell'induzione della risposta immunitaria cellulare protettiva. Tuttavia, la risposta immunitaria cellulare può fallire e la malattia può progredire nella diffusione della leishmaniosi cutanea diffusa4,5. Non esiste un vaccino disponibile a causa della diversità tra le specie di Leishmania e ospitare le provenienze genetiche6,7. Le opzioni di trattamento sono anche limitate in quanto la maggior parte dei farmaci attualmente disponibili sono costosi, tossici e/o possono richiedere un trattamento a lungo termine8,9. Inoltre, ci sono state segnalazioni di resistenza ai farmaci contro i trattamenti disponibili10,11.

L'agente causale delle leishmaniosi è il parassita protozoo Leishmania. Il parassita presenta due forme morfologiche distinte nel suo ciclo di vita: i promastigoti, la forma flagellata trovata nelle libellule; e amastigoti, la forma intracellulare trovata nei vacuoli parassitoforo dei macrofagi ospiti dei mammiferi12,13. La capacità degli amastigoti di invadere, sopravvivere e replicarsi nonostante i meccanismi di difesa dei macrofagi dell'ospite vertebrato sono soggette a molti studi14,15,16,17. Di conseguenza, diversi gruppi di ricerca hanno descritto i saggi di infezione da macrofagio in vitro per valutare l'impatto di specifici fattori ambientali, nonché i geni parassiti e ospiti sull'infettività dei parassiti. Questo test presenta diversi vantaggi, come la capacità di adattare gli studi a un formato ad alta produttività, un periodo di tempo relativamente più breve per ottenere risultati e un numero ridotto di animali da laboratorio sacrificati18. Tuttavia, i risultati dei test in vitro sono limitati perché non sempre replicano studi in vivo14,19,20,21. I saggi in vivo forniscono una panoramica fisiologica sistemica dell'interazione ospite-parassita, che non può essere completamente imitata da analisi in vitro. Ad esempio, gli studi immunologici possono essere eseguiti attraverso saggi immunohistochimici da sezioni di tessuto del piede raccolte o anche da linfonodi poplylitali per l'analisi delle cellule immunitarie recuperate22.

Gli animali sono spesso utilizzati come modello per le malattie umane nella ricerca biologica e biomedica per comprendere meglio i meccanismi fisiologici sottostanti delle malattie23. Nel caso della leishmaniosi, il percorso, il sito o la dose di inoculazione influenzano l'esito della malattia24,25,26,27. Inoltre, la suscettibilità e la resistenza all'infezione nell'uomo e nei topi sono altamente regolate dagli sfondi genetici dell'ospite e del parassita4,5,22,28,29,30,31. I topi BALB/c sono altamente sensibili all'infezione cutanea di L. amazonensis, mostrando una rapida progressione della malattia con la diffusione dei parassiti ai linfonodi, alla milza e al fegato32. Poiché la malattia può progredire verso metastasi cutanee, l'infezione può essere fatale. Al contrario, i topi C57BL/6 spesso sviluppano lesioni croniche con carichi di parassiti persistenti nei saggi dell'infezione da L. amazonensis 33. Di conseguenza, l'infezione da L. amazonensis con questa particolare specie di topi è stata considerata un ottimo modello per studiare le forme croniche di leishmaniosi cutanea negli esseri umani, perché imita la progressione della malattia meglio del modellodiinfezione dei topi BALB/c 5,34.

Quindi, proponiamo che l'infezione murina in vivo sia un metodo utile per gli studi fisiologici della virulenza Leishmania applicabili alla malattia umana, consentendo una visione sistemica dell'interazione ospite-parassita. Rivisitando i saggi consolidati22, presentiamo qui un protocollo graduale compilato dell'infezione in vivo di topi C57BL/6 con L. amazonensis che comprende la differenziazione del parassita in amastigoti assici, topi pedana cutanea inoculazione, sviluppo delle lesioni, determinazione del carico di parassiti. Questo protocollo può essere adattato ad altri ceppi di topi e specie di Leishmania che causano leishmanie cutanee. In conclusione, il metodo qui presentato è fondamentale per identificare nuovi bersagli e vaccinianti-Leishmania, nonché negli studi fisiologici delle risposte immunitarie e metaboliche dell'ospite all'infezione da Leishmania.

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Protocol

Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dall'Animal Care and Use Committee presso l'Istituto di Bioscienze dell'Università di San Paolo (CEUA 342/2019) e sono state condotte in conformità con le raccomandazioni e le politiche per la cura e l'uso degli animali da laboratorio dello Stato di San Paolo (Lei Estadual 11.977, 25/08/2005) e il governo brasiliano (Lei Federal 11.794, de 08/10/2008). Tutti i passaggi descritti nelle sezioni da 1 a 5 devono essere eseguiti apartire aquanto in armadi a flusso laminare. Le attrezzature di protezione personale dovrebbero essere utilizzate durante la manipolazione di parassiti della Leishmania vivi.

1. Differenziazione in Vitro di L. amazonensis Promastigotes in Amastigotes axenic15,20,35,36,37,38

NOTA: in questo saggio è stato utilizzato l'uso del parassita L. amazonensis (MHOM/BR/1973/M2269) (La). A seconda dello scopo dello studio, la forma di parassita infettiva può essere ottenuta sia attraverso la purificazione della forma metaclica utilizzando un gradiente di densità, come descritto in precedenza14, o differenziando i promastigoti in amastigoti assici, secondo il seguente protocollo.

  1. Coltivare I promastigoti in un flacone di coltura cellulare 25 cm2 contenente 10 mL di mezzo per promastigotes (pro-medio) (pH - 7,0).
  2. Incubare a 25 gradi centigradi per 3 giorni.
    NOTA: Utilizzare colture promastigote che sono state passaggiate in vitro meno di 10x per evitare la perdita di virulenza e cambiamenti di aneuploidia dei parassiti39,40,41,42,43,44.
  3. Pipette 5 mL di fase di crescita logaritmica della coltura promastigote in un nuovo flacone di 25 cme 2.
  4. Aggiungere 5 mL di mezzo per amastigotes axeni (ama-medio) (pH - 5,2).
  5. Incubare a 34 gradi centigradi per 3-4 giorni.
  6. Dividere la coltura diluindo con ama-medium ad un rapporto di 1:3 in un nuovo pallone da 25 cm2.
  7. Incubare a 34 gradi centigradi per 3-5 giorni.
    NOTA: Incubare gli amastigoti axenic fino a 5 giorni, in quanto rappresenta la fine della maturazione37.

2. C57BL/6 Footpad Infezione con L. amazonensis

NOTA: I topi C57BL/6 femminili (6-8 settimane) sono stati ottenuti e mantenuti presso l'Animal Center dell'Istituto di Scienze Biomediche dell'Università di San Paolo. Gli animali hanno ricevuto cibo e acqua al libitum.

  1. Contare la cultura degli amastigoti axenic trasferendo una sospensione parassita diluita in PBS a una camera di Neubauer (cioè emocitometro). Contare i parassiti non flagellati, che rappresentano forme di amastigotes.
    NOTA: In alternativa, Trypan blu (1:1) può essere utilizzato per il conteggio del numero di amastigotes vitali (cioè quelli non macchiati di blu Trypan).
  2. Diluire gli amastigoti axenic in PBS in base alla dose di inoculum desiderata e si raccomanda il numero di inoculum (1 x 106 amastigotes axenici in 50 - L di PBS).
  3. Caricare una siringa di tubercolina con un ago da 27 G con la sospensione parassita preparata.
  4. Anestesizzare un topo C57BL/6 utilizzando 3-5% isoflurane, come raccomandato da Johns Hopkins University Animal Care and Use Committee45. Valutare la profondità anestetica testando la risposta del mouse a un pizzico di punta.
  5. Inoculare 50 L della sospensione del parassita omogeneizzato (1 x 106 amastigotes axenic o la dose di inoculum desiderata) nel tessuto subplanare del piede posteriore sinistro, utilizzando la siringa di tubercolina precedentemente caricata (passaggio 2.3).

3. Sviluppo della lesione del piede del mouse

  1. Misurare la progressione della lesione una volta alla settimana misurando lo spessore delle pedane sinistra (infetto) e destra (non infettate) utilizzando una pinza.
  2. Calcolare la differenza di spessore tra i piedi posteriori sinistro e destro settimanale per valutare la progressione della lesione.
  3. Tracciare le differenze calcolate sull'asse Y e il tempo dell'infezione sull'asse X e calcolare la significatività statistica.
    NOTA: Secondo le raccomandazioni dei Comitati per la cura degli animali e l'uso, gli animali devono essere sacrificati prima che la lesione infetta diventi ulcerata, perché le ulcere cutanee possono portare a infezioni secondarie. Come mostrato nella Figura supplementare 1, ci vogliono circa 10 settimane perché le lesioni presentino segni di ulcerazione con la dose parassitaria (106 amastigoti assici) e ceppo ospite (C57BL/6) utilizzato in questo protocollo. I topi devono essere sacrificati per l'estrazione della lesione prima che si osservino i segni di ulcerazione.

4. Topi Footpad Lesion Extraction and Parasite Limiting Diluizione

  1. Preparare una piastra di 96 pozze (fondo piatto) per il diluizione limitante46,47 aggiungendo 180 -L di pro-medio a tutti i pozzetti.
    NOTA: Utilizzare quattro corsie di piastra (metà della piastra) per ogni animale, che rappresentano i saggi quadruplicati (cioè, animale 1 - corsie A-D; animale 2 - corsie E-H).
  2. Aggiungere 1 mL di pro-medio in un tubo di smerigliatrice di tessuto di vetro per lesione e pesare il tubo.
    NOTA: Il tubo deve essere mantenuto sterile, in modo da utilizzare un coperchio sterile e pesare il tubo con il coperchio chiuso, se pesa all'esterno dell'armadio a flusso laminare.
  3. Sacrificare l'animale in una camera di CO2, seguendo le raccomandazioni dei Comitati per la cura e l'uso degli animali. Disinfettare l'animale spruzzando con il 70% di etanolo.
  4. Accisa il piede dell'animale alle talloni per estrarre il piede infetto e spruzzare 70% di etanolo sul piede per la disinfezione. Garantire la sterilizzazione delle forbici e delle pinze mantenendole imbevute del 70% di etanolo.
  5. Posizionare il pedonale infetto in una parabola Petri sterile e dissezionare usando pinze sterili e un bisturi per raccogliere tutti i tessuti molli. Scartare le ossa.
    NOTA: L'uniformità nella fase di dissezione è consigliata per evitare il recupero dei tessuti di parte.
  6. Trasferire i tessuti raccolti al tubo di smerigliatrice del tessuto di vetro con pro-medio, quindi pesare nuovamente il tubo per determinare il peso della lesione.
    NOTA: Evitare di posizionare le pinze e il bisturi direttamente nel mezzo, in quanto piccoli volumi possono essere rimossi, con conseguente sottovalutazione del peso del tessuto. Il peso della lesione viene calcolato sottraendo il peso del tubo contenente pro-medio con il tessuto raccolto dal peso del tubo contenente solo pro-medio.
  7. Omogeneizzare il tessuto 10x utilizzando la smerigliatrice per la rottura completa dei tessuti.
  8. Lasciare sedimentare la miscela per 10 min, quindi raccogliere 20 .
  9. Caricare 20 -L del supernatante nella colonna 1st della corsia 1st della 96 piastra ben preparato al passo 4.1. Ripetere questa operazione per le tre corsie successive per avere quadruplicati per ogni animale (ad esempio, per l'animale 1 aggiungere 20 L a ciascun pozzo e etichettare A1, B1, C1 e D1).
  10. Omogeneizzare ogni pozzo nella colonna 1st 10x utilizzando una pipetta multicanale. Quindi, trasferire 20 l dei campioni diluiti dalla colonna 1st alla colonna 2nd.
    NOTA: È importante omogeneizzare ogni pozzo 10x da una colonna all'altra.
  11. Ripetere il passaggio 4.10 in tutte lecolonne rimanenti fino all'ultima colonna (12th ) ed eliminare gli ultimi 20 l del campione diluito.
    NOTA: Modificare le punte dopo ogni diluizione per evitare contaminazioni incrociate.
  12. Sigillare le piastre con un film e incubare a 25 gradi centigradi per 7 giorni in una camera umida.

5. Determinazione del carico del parassita della lesione

  1. Analizzare le piastre dopo 7 giorni di incubazione utilizzando un microscopio invertito per determinare l'ultimo pozzo contenente parassiti per ogni corsia.
    NOTA: È anche possibile avere un'indicazione della crescita dei parassiti, o densità cellulare, attraverso l'analisi visiva dei cambiamenti di colore e della torbidità del mezzo.
  2. Calcolare il carico del tessuto reitino per ogni corsia dividendo il fattore di diluizione per peso della lesione.
    NOTA: In una corsia specifica, se i parassiti sono presenti solo nelle colonne 1-5 (cioè, i pozzi A1-A5 sono positivi per la crescita dei parassiti), ciò significa che la colonna 5 conteneva solo 1 parassita, la colonna 4 conteneva 10 parassiti e così via, in multipli di dieci. La colonna 1 contiene 104 parassiti, che rappresenta il numero di parassiti nei 20 - L iniziali di supernatante (il campione non diluito nel passaggio 4.7). Poiché questo 20 l è stato diluito con 180 gradi L di pro-medio, il tubo iniziale conteneva 5 x 105 parassiti: (1 x 104) / (0,02 mL) - 5 x 105 parassiti/1 mL. Quindi, il carico del parassita in tale lesione può essere calcolato dividendo la concentrazione iniziale del parassita per il peso della lesione: (5 x 105) / peso della lesione (vedi passo 4.6).
  3. Tracciare la media del risultato quadruplicato per ogni animale con una scala Y del tronco.

6. Analisi statistiche

  1. Rappresentano i dati come media: deviazione standard utilizzando almeno cinque animali per gruppo sperimentale come repliche.
  2. Eseguire l'analisi statistica utilizzando un test a due code non accoppiato, considerando significativo un valore p < 0,05.

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Representative Results

I parassiti della Leishmania protozoi esistono in due forme di sviluppo durante il loro ciclo di vita invertebrati e ospiti di vertebrati: promastigoti, le forme proliferanti che si trovano nel lume della landanella femmina; e amastigoti, le forme proliferanti che si trovano nei vacuoli parassofosi delle cellule ospiti dei mammiferi. I promastigoti hanno un corpo allungato di circa 1,5 m di larghezza e di 20 m di larghezza, con un flagello che emerge tipicamente dall'estremità anteriore. Gli amastigoti hanno un corpo arrotondato o ovoide di dimensioni comprese tra 2 e 6 m e 1,5-3 m di larghezza, e possiedono un flagello inapparente12,13 (Figura 1A). Durante la farina di sangue l'ospite invertebrato, un insetto ematofago della famiglia Psychodidae, acquisisce macrofagi infettati da Leishmania amastigotes. Una volta che queste cellule raggiungono il tubo digestivo della mosca sandfly, gli amastigoti vengono rilasciati e si differenziano in promastigoti prociclici (Figura 1A). Queste forme sono non infettive e si moltiplicano intensamente per divisione binaria e colonizzano il tubo digestivo del vettore di insetti. Le forme procicliche si differenziano quindi alle forme metacicliche, una forma infettiva e in rapido movimento, presentando un corpo più sottile e flagello allungato (Figura 1A). Le forme metacicliche invadono le parti anteriori dell'esofago e il collatricolo della lucciola, in modo che durante il suo prossimo pasto di sangue, il rigurgito garantisca l'inoculazione di queste forme che infettano in un nuovo ospite vertebrato. Nel tegument dell'ospite vertebrato, i parassiti sono fagocitosed dai macrofagi e si differenziano in amastigoti all'interno dei vacuole parasinfoco, dove gli amastigoti si moltiplicano per divisione binaria e completano il ciclo di vita della Leishmania12,13.

Le condizioni di axenic possono simulare diversi ambienti host in vitro, mantenendo la morfologia e la vitalità dei parassiti. Le condizioni assoniche per gli amastigoti sono state descritte in precedenza simulando l'ambiente vacuolo parassofago di un macrofago e innescando la differenziazione del promastigote in vitro nella forma amastigote37. Queste condizioni imitano l'ambiente acido (pH 5,5) e l'aumento della temperatura degli ospiti vertebrati (34 gradi centigradi). La figura 1B illustra i promastigoti differenziati dagli amastigoti modificando queste condizioni nella cultura. La fattibilità di questi amastigoti assici può essere analizzata dalla colorazione blu Trypan, un metodo basato sul principio che le cellule vive possiedono membrane intatte che escludono alcuni coloranti, mentre le cellule morte non48. In alternativa, abbiamo analizzato la fattibilità degli amastigoti axenic verificando la loro capacità di trasformarsi di nuovo in procmastigoti quando vengono trasferiti a pH neutro e incubati a 25 gradi centigradi (Figura 1B).

Qui proponiamo un metodo di infezione in vivo per valutare la virulenza di diversi ceppi di Leishmania. Figura 2A rappresenta un saggio di infezione in vivo che mostra lo sviluppo di lesioni cutanee di C57BL/6 piedi di topi che sono stati infettati con tipo selvaggio (La-WT) e Leishmania Iron Regulator 1 knockout (La-LIR1-/- L. amazonensis purificato metacicliche. LIR1 regola i livelli di ferro intracellulare in Leishmania mediando l'esportazione di ferro e impedendo il suo accumulo intracellulare a livelli tossici14. Osservando la progressione delle differenze di spessore dei pedaggi infetti rispetto a quelli non infetti, siamo stati in grado di dimostrare che i topi infetti La-LIR1-/- presentavano lesioni minori rispetto ai topi infetti La-WT (Figura 2A). Tali risultati hanno rivelato che LIR1 è essenziale per la virulenza in vivo di L. amazonensis. Ciò dimostra l'importanza e l'efficacia di questo metodo nella valutazione delle differenze delle malattie cutanee guidate dalla Leishmania. La figura 2B illustra le pedane non infette (a destra) e infette (sinistra) e lo sviluppo delle lesioni 73 giorni dopo l'infezione, mostrando le differenze nel gonfiore e nella progressione delle lesioni dei topi la-WTe La-LIR1 -/- infetti.

La progressione dell'infezione da Leishmania consiste non solo nello sviluppo della lesione, che rappresenta la risposta infiammatoria, ma anche dalla replicazione intracellulare del parassita. Per valutare la replicazione dei parassiti, il carico di parassiti delle lesioni è stato determinato estraendo la lesione infetta, seguita da un'espressione di diluizione limitante in una piastra di 96 pozze (Figura 3A). La figura 3B mostra l'analisi del carico di parassiti delle lesioni del pedone dei topi infetti La-WT e La-LIR1-/- dopo 73 giorni di infezione. Dal saggio di diluizione limitante, abbiamo rilevato 106-fold fewer parasites in the lesion of the La-LIR1-/- infected mices in confronto a La-WT, rivelando che l'assenza di LIR1 impedisce la replicazione intracellulare degli amastigoti14.

Uno dei vantaggi della valutazione dello sviluppo della lesione e del carico di parassiti è rilevare possibili differenze tra la replicazione intracellulare dei parassiti e la risposta infiammatoria dell'ospite. Abbiamo osservato differenze tra questi due fenotipi utilizzando l'add-back LIR1 (La-LIR1AB), che è il La-LIR1-/- con il LIR1 ORF integrato nel locus ribolosomi14. Quando La-LIR1AB è stato iniettato nel piede di un topo, abbiamo osservato lesioni di dimensioni intermedie rispetto alleinfezioni La -LIR1-/- e La-WT, ma un notevole salvataggio completo del carico di parassiti del fenotipo La-WT (Figura supplementare 2). Questi risultati indicano che i parassiti La-LIR1AB sono stati in grado di replicarsi come i parassiti La-WTin un'infezione in vivo a lungo termine. Tuttavia, la risposta infiammatoria del topo non è stata esacerbata come le infezioni da La-WT perché le lesioni erano significativamente più piccole.

Di conseguenza, il metodo qui descritto è stato indicato come essenziale per l'identificazione e la caratterizzazione di un fattore di virulenza L. amazonensis necessario per la riuscita replicazione intracellulare dell'amastigote e lo sviluppo di lesioni cutanee negli ospiti dei mammiferi.

Figure 1
Figura 1: Morfologia di L. amazonensis promastigotes e amastigotes. (A) Illustrazioni delle diverse forme morfologiche della Leishmania: promastigote prociclica, promastigote metacicliche e amastigote. Barra della scala: 2 m. (B) Immagini di culture in vitro L. amazonensis. Differenziazione in vitro dei promastigoti in amastigoti axenici, e di amastigotes axenic back a promastigotes cambiando le condizioni di pH e temperatura, come descritto nel protocollo passo-passo. Le foto sono state scattate con un microscopio invertito. Barra della scala: 50 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: L'eliminazione di LIR1 riduce notevolmente lo sviluppo della lesione in vivo di L. amazonensis. I topi C57BL/6 sono stati inoculati nella pedana posteriore sinistra con 106 metacicliche purificate di tipo l. amazonensis selvaggio (La-WT) e L. amazonensis LIR1 knockout (La-LIR1-/-). (A) Progressione di lesione cutanea del piede di lesione cutanea di La-WTe La-LIR1-/- topi infetti analizzati settimanalmente. I dati rappresentano la media : SEM del pedana infetto sottratto dallo spessore del pediatra non infettato da cinque topi diversi in ogni gruppo (adattati da Laranjeira-Silva et al.14). (B) Immagini dei pedani non infetti e infetti di La-WT e La-LIR1-/- i topi infetti che mostrano le differenze nel gonfiore 73 giorni dopo l'infezione (adattato da Laranjeira-Silva et al.14). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: L'eliminazione di LIR1 riduce notevolmente la replica intracellulare di L. amazonensis in vivo. (A) Illustrazione di una piastra da 96 che rappresenta le diluizioni seriali 10 volte dei tessuti recuperati del footpad infettati da L. amazonensis wild type (La-WT) e LIR1 knockout (La-LIR1-/-). Le righe A-D rappresentano il quadruplicato delle diluizioni seriali del campione di lesione Del piede La-WT- pad. Le righe E-H rappresentano il quadruplicato delle diluizioni seriali del campione di lesione La-LIR1-/--footpad. Le diverse tonalità di grigio rappresentano le densità di cellule osservate per bene (cioè, il colore più chiaro significa meno parassiti). I pozzi evidenziati in rosso rappresentano gli ultimi pozzi che contenevano parassiti per replica. (B) Carico di parassiti nei tessuti recuperati dei topi C57BL/6 infettati da 106 metaciclici purificati di tipo L. amazonensis selvaggio (La-WT) e L. amazonensis LIR1 knockout (La-LIR1-/-) hanno determinato 73 giorni dopo l'infezione. I dati rappresentano la media del carico di parassiti per mg di tessuto da cinque diversi topi in ogni gruppo (adattato da Laranjeira-Silva et al.14). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Supplementary Figure 1
Figura supplementare 1: L'ulcera cutanea come indicativa di un'infezione secondaria. Immagini rappresentative di C57BL/6 topi pedane infettate con L. amazonensis tipo selvaggio (La-WT) preso 80 giorni post-infezione. Le frecce rosse indicano segni di ulcerazione, che indicano che l'esperimento deve essere terminato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Supplementary Figure 2
Figura 2 supplementare: Il ruolo di LIR1 sullo sviluppo della lesione in vivo e sulla replica dei parassiti intracellulari. I topi C57BL/6 sono stati inoculati nella pedana posteriore sinistra con 106 metacicliche purificate di tipo l. amazonensis selvaggio (La-WT), L. amazonensis LIR1 knockout (La-LIR1-/-) e L. amazonensis LIR1 add-back (La-LIR1AB). (A) Progressione di lesione cutanea del footpad di La-WT, La -LIR1-/-e La-LIR1AB infettati topi analizzati settimanalmente. I dati rappresentano la media : SEM del pedana infetto sottratto dallo spessore del pediatra non infettato da cinque topi diversi in ogni gruppo (adattati da Laranjeira-Silva et al.14). (B) Carico di parassiti nei tessuti recuperati della pedana da La-WT, La-LIR1-/-o La-LIR1AB topi infetti ha determinato 73 giorni di post-infezione. I dati rappresentano la media del carico di parassiti per mg di tessuto da cinque diversi topi in ogni gruppo (adattato da Laranjeira-Silva et al.14). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

L'analisi dell'infezione in vivo descritta in questo protocollo consente a qualsiasi ricercatore di valutare la leishmaniosi cutanea in vivo considerando l'interazione ospite-parassita in uno scenario sistemico. Questi saggi sono stati utilizzati da molti gruppi22,24,27,29,31,32,34,49 e qui abbiamo compilato un protocollo passo-passo per standardizzare questo metodo, considerando le limitazioni dell'infrastruttura che alcuni gruppi possono avere. Questo protocollo può essere utilizzato anche per valutare la virulenza dei parassiti transgenici della Leishmania dabioimagingin vivo 50,51,52. Come qualsiasi altra procedura sperimentale, questo saggio ha limitazioni e passaggi critici da eseguire, ad esempio richiedendo personale addestrato che si radica a lavorare con i topi e hanno esperienza nell'esecuzione di iniezioni subplantar per evitare infezioni accidentali. La standardizzazione dei protocolli è estremamente importante per evitare risultati parziali e per produrre risultati comparabili tra i diversi gruppi di ricerca.

Il vantaggio principale dell'utilizzo di L. amazonensis come modello per leishmaniasi cutanee è perché la lesione del pedaggio causato da questa specie può essere facilmente valutata nei topi. Il gonfiore del footpad determinato dal metodo qui descritto rappresenta la somma di due fenotipi dell'infezione: la risposta infiammatoria dell'ospite e la replicazione dei parassiti. Entrambi i fenotipi possono essere valutati separatamente associando il metodo di carico del tessuto parassita che riflette la replicazione intracellulare del parassita con la determinazione della progressione dello spessore della lesione. Un altro vantaggio è che i promastigoti di L. amazonensissono facilmente coltivati in vitro. Considerando questi, qualsiasi gruppo di ricerca può manipolare questa specie di Leishmania in base alle loro esigenze. I risultati degli studi di L. amazonensispossono poi essere confrontati con altre specie di Leishmania per determinare se un percorso specifico è conservato evolutivamente o divergente21,53,54.

Nel ciclo naturale, la trasmissione della Leishmania all'ospite vertebrato avviene dal morso di una mosca di sabbia infetta durante la farina di sangue. La mosca della sabbia di solito inocula alcune centinaia di forme di promastigote metacicliche della Leishmania nella saliva dell'insetto. Nelle infezioni sperimentali in vivo, il sito più frequente di inoculazione è il piede dell'animale22. L'iniezione intradermica nell'orecchio o l'iniezione intraperitoneale sono siti alternativi di inoculazione a seconda dello scopo dello studio perché ogni sito presenta diversi tipi di cellule fagocidiche24,56. Pertanto, alcuni gruppi di ricerca utilizzano mosche di sabbia infettate da laboratorio per infettare il mal di orecchio dell'animale per imitare la trasmissione naturale56,57,58,59. Tuttavia, questo protocollo presenta alcune restrizioni, come la manutenzione delle colonie di mosche di sabbia, che richiede strutture non disponibili per la maggior parte dei gruppi di ricerca.

Il lavoro originale che descrive l'infezione in vivo C57BL/6 con La-LIR1-/- ha utilizzato promastigoti metaciclici purificati forma14. Tuttavia, la manipolazione genetica della Leishmania può compromettere la differenziazione dei promastigoti in amastigoti axenici14 o in forme infettive metacicliche20. Quindi, a seconda del ceppo Leishmania, il ricercatore dovrebbe determinare il metodo più adeguato per ottenere forme di parassiti infettivi vitali per il loro studio. Il protocollo degli amastigoti axenic differenziati dalle culture promastigote qui descritte può essere un'alternativa più facile, producendo risultati comparabili in molti casi19,20,35,37,38,64. Questo approccio evita l'uso di altri metodi che tipicamente si traducono in rese inferiori di parassiti infettivi, come l'incubazione di promastigoti con anticorpi specifici ma non ampiamente disponibili65 per la purificazione prociclica, o dal gradiente di densità dipendente dall'espressione GPL18,66. L'efficienza del protocollo di differenziazione può essere valutata determinando i livelli di espressione dei geni amastin-family64,67. Gli amastini sono membri di una famiglia genica conservata che sono modulati in modo differenziale durante il ciclo di vita della Leishmania 68 e sono associati alla virulenza dei parassiti e alla patogenesi67,69,70. Altri marcatori possono anche essere utilizzati per distinguere le forme di amastigote da promastigote. Ad esempio, gp63 è downregolato negli amastigoti, perché il suo ruolo è quello di proteggere i promastigoti dagli enzimi digestivi dell'insetto71.

La scelta della deformazione del topo è un altro passo fondamentale da considerare quando si sviluppa un protocollo standardizzato di infezione in vivo. La suscettibilità e la resistenza all'infezione da Leishmania nei topi sono regolate principalmente da un background genetico29,30,55. In questo protocollo, il ceppo C57BL/6 è stato scelto perché la sua risposta immunitaria a L. amazonensis è strettamente correlata alla risposta mista Th1-Th2 in esseri umani72,73. Infezioni da murine sperimentali con L. amazonensis sono stati descritti per causare lesioni moderate in C57BL/6 topi rispetto ad altri ceppi di topi28,34,74. Tuttavia, a seconda del ceppo di parassiti, le differenze nella dimensione della lesione sono rilevabili solo nei ceppi di topi suscettibili, come BALB/c36. Anche il corso temporale dell'infezione deve essere considerato e correlato al ceppo di topi prescelto29,26,60,61,62,63,75. Le pedane ulcerate dovrebbero sempre essere evitate in quanto possono rappresentare infezioni secondarie e sono spesso osservate in lunghi periodi di infezione, soprattutto negli esperimenti con ceppi di topi suscettibili. Designare l'ora del giorno per iniziare l'infezione è un altro passo da considerare. Come dimostrato in studi precedenti con L. amazonensis, il tempo del giorno di inoculum parassita influisce sullo sviluppo della lesione perché l'interazione ospite-parassita è influenzata in modo circadiano dalla melatonina pineale rilasciata durante il periodo buio del giorno75.

Lo svantaggio principale del metodo di infezione in vivo è che l'esperimento richiede l'uso di un numero sostanziale di animali da laboratorio e richiede più tempo per ottenere risultati finali rispetto al metodo di infezione in vitro18. Tuttavia, quest'ultimo aspetto può anche essere considerato come un vantaggio poiché i risultati in vivo riflettono il corso temporale naturale della progressione della malattia in modo più accurato rispetto ai risultati ottenuti dall'infezione in vitro. Ancora più importante, i risultati dell'infezione da L. amazonensis in vivo non possono solo riflettere i cambiamenti transitori nella virulenza dei parassiti, ma riconoscono anche lo stato sistemico dell'ospite e di tutti i suoi giocatori. Pertanto, considerando i diversi fattori menzionati in precedenza, il metodo descritto in questo protocollo può essere adattato per soddisfare specifiche esigenze sperimentali di caratterizzazione di altri obiettivi e trattamenti relativi alla virulenza, consentendo nuove intuizioni per il controllo cutaneo della leishmaniosi.

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Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Acknowledgments

Ringraziamo la prof.ssa Niels Olsen Saraiva Camara dell'Animal Center dell'Istituto di Scienze Biomediche dell'Università di San Paolo per il supporto e la prof.ssa Silvia Reni Uliana per aver fornito il macinino di tessuto di vetro. Questo lavoro è stato sostenuto da Sao Paulo Research Foundation (FAPESP - sovvenzione 2017/23933-3).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well plate Greiner bio-ne 655180 A flat-bottom plate for limiting dilution assay
adenine Sigma A8626 Supplement added to M199 cell culture media
caliper Mitutoyo 700-118-20 A caliper to measure the thickness of footpad
cell culture flask Corning 353014 A 25 cm2 volume cell culture flask to cultivate Leishmania parasite
centrifuge Eppendorf 5804R An equipament used for separating samples based on its density
CO2 incubator 34 °C Thermo Scientific 3110 An incubator for amastigotes differentiation
ethanol Merck K50237083820 A disinfectant for general items
fetal bovine serum Gibco 12657-029 Supplement added to M199 cell culture media
glass tissue grinder tube Thomas Scientific 3431 E04 A tube to collect and disrupt infected footpad tissue
glucose Synth G1008.01.AH Supplement added to M199 cell culture media
GraphPad Prism Software GraphPad A software used to plot the data and calculate statistical significance
hemin Sigma H-2250 Supplement added to M199 cell culture media
HEPES Promega H5303 Supplement added to M199 cell culture media
incubator 25 °C Fanem 347CD An incubator for promastigotes cultivation
inverted microscope Nikon TMS An equipament used to visual analyze the promastigote and amastigote cultures
isoflurane An inhalant anesthetics for mice (3-5%)
laminar flow cabinet Veco VLFS-09 A biosafety cabinet used for aseptical work area
M199 cell culture media Gibco 31100-035 A cell culture media for Leishmania cultivation
microcentrifuge tube Axygen MCT150C A microtube used for sample collection, processing and storage
multichanel pipette Labsystems F61978 A multichannel pipette used for limiting dilution assay
NaHCO3 Merck 6329 Supplement added to M199 cell culture media
NaOH Sigma S8045 Supplement added to M199 cell culture media
Neubauer chamber HBG 2266 A hemocytometer to count the parasite suspension
optical microscope Nikon E200 An optical equipament used to count parasite
parafilm Bemis 349 A flexible and resistant plastic to seal the plate
penicillin/streptomycin Gibco 15140122 Supplement added to M199 cell culture media
Petri dishes TPP 93100 A sterile dish to dissect the footpad tissue
pipetman kit Gilson F167360 A micropipette kit containing four pipettors (P2 P20 P200 P1000)
scale Quimis BG2000 An equipament used to weigh collected footpad lesions
scalpel Solidor 10237580026 A scalpel to cut and collect footpad tissue
serological pipette 10 mL Nest 327001 A sterile pipette used for transfering mililiter volumes
tips Axygen A pipette tip used for transfering microliter volumes
Trypan blue Gibco 15250-061 A dye used to count viable parasites
trypticase peptone Merck Supplement added to M199 cell culture media
tuberculin syringe BD 305945 A syringe with 27G needle to inoculate the parasite suspension

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Infezione in vivo con <em>Leishmania amazonensis</em> per valutare la virulenza dei parassiti nei topi
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