Summary
ここでは、レーシュマニア・アマゾネンシスを用いたマウスの皮状感染を評価するためのコンパイル済みプロトコルを提示する。これは、寄生虫の病原性を研究するための信頼性の高い方法であり、感染に対する脊椎動物宿主応答の全身的な見解を可能にする。
Abstract
リーシュマニア属は、リーシュマニアーゼを引き起こす原虫の寄生虫であり、皮疹から内臓病変まで幅広い臨床症状を示す疾患である。現在、世界中で1,200万人がリーシュマニアに感染していると推定されており、10億人以上が感染の危険にさらされています。リーシュマニアアマゾネンシスは中南米で流行しており、通常は動物モデルで直接視覚化できる病気の皮形成につながる。したがって、L.アマゾネンシス株は、インビトロでも容易に栽培されるため、皮状リーシュマニア症研究に適したモデルです。C57BL/6マウスは、ヒトで観察されるL.アマゾネンシス主導の疾患進行を模倣し、皮状リーシュマニア症のモデルに最適なマウス株の1つと考えられている。脊椎動物宿では、これらの寄生虫は、これらの細胞の防御機構にもかかわらずマクロファージに生息する。いくつかの研究は、異なる条件下で寄生虫の感染性を評価するために、インビトロマクロファージ感染アッセイを使用しています。しかし、インビトロアプローチは、生物の応答を無視する単離された細胞系に限定される。ここでは、宿主寄生虫相互作用の全身生理学的概要を提供するインビボマウス感染法をまとめます。L.アマゾネンシスを有するC57BL/6マウスのインビボ感染に関する詳細なプロトコルは、感染性アマスティゴテ、マウスフットパッドの皮状接種、病変発生、および寄生虫負荷測定への寄生虫分化を含む。この確立された方法は、皮状リーシュマニア症に対する宿主免疫および代謝反応の生理学的研究のための最も適切な方法として提案する。
Introduction
リーシュマニア症は、発展途上国で重要な課題を表す世界的に流行している寄生虫感染症であり、世界保健機関1、2によって最も重要な放置熱帯病の一つとして認識されています。リーシュマニア症は、皮、粘膜、および/または内臓症状によって特徴付けられる。通常、L. アマゾネンシスによって引き起こされます, L. メキシカーナ, L. ブラジル人, L. ガイアナシス, L. メジャー, L. 熱帯と L. aethiopica3.この疾患の形態は、保護細胞性免疫応答の誘導によるヒトにおける自己治癒性が高い。しかし、細胞性免疫応答が失敗する可能性があり、病気は広がった皮状リーシュマニア症4、5に進行する可能性がある。リーシュマニア種とホスト遺伝的背景の間の多様性に利用可能なワクチンはありません6,7.現在入手可能な薬物のほとんどが高価で有毒であり、および/または長期治療8、9を必要とすることができるので、治療の選択肢も制限されている。その上、利用可能な治療10、11に対する薬剤耐性の報告があった。
リーシュマニア症の原因物質は原虫寄生虫リーシュマニアである。寄生虫は、そのライフサイクルに2つの異なる形態を提示する:プロマスティゴテ、サンドフライに見られる旗揚げ形態;そして、アマスティゴテは、哺乳動物宿主マクロファージ12、13の寄生性空胞に見られる細胞内形態である。脊椎動物宿主のマクロファージの防御機構にもかかわらず、アマスティゴテスの侵略、生存、複製する能力は、多くの研究の対象となる14、15、16、17。その結果、いくつかの研究グループが、特定の環境要因の影響を評価するためにインビトロマクロファージ感染アッセイを記述し、寄生虫および宿主遺伝子が寄生虫感染性に及ぼす影響を評価している。このアッセイは、高スループット形式に研究を適応させる能力、結果を得るための比較的短い期間、および犠牲にした実験動物の数を減少させる18のようないくつかの利点を提示する。しかし、インビトロアッセイの所見は、インビボ研究14、19、20、21を常に複製するとは限らない。インビボアッセイは、宿主寄生虫相互作用の全身的な生理学的概要を提供し、インビトロアッセイでは完全に模倣することができない。例えば、免疫学的研究は、回収されたフットパッド組織切片から、あるいは回収された免疫細胞22の分析のために球輝リンパ節からも免疫組織化学的アッセイを通して行うことができる。
動物は、多くの場合、疾患23の基礎的な生理学的メカニズムをよりよく理解するために、生物学的および生物医学的研究におけるヒト疾患のモデルとして使用される。リーシュマニア症の場合、接種の経路、部位、または用量が疾患の結果24、25、26、27に影響を与える。さらに、ヒトおよびマウスにおける感染に対する感受性および耐性は、宿主および寄生虫4の遺伝的背景によって高度に調節される4、5、22、28、29、30、31である。BALB/cマウスは、L.アマゾニスの皮感染に対して非常に感受性であり、寄生虫がリンパ節、脾臓、および肝臓32に広がることを伴う急速な疾患進行を示す。病気が皮の転移に進行する可能性があるため、感染は致命的になる可能性があります。対照的に、C57BL/6マウスは、L.アマゾネンシス感染アッセイ33において持続的な寄生虫負荷を有する慢性病変をしばしば発症する。それにより、この特定のマウス種に対するL.アマゾネンシス感染は、ヒトにおける慢性形態の皮状リーシュマニア症を研究する優れたモデルと考えられているが、それはBALB/cマウス感染モデル5、34よりも疾患進行を模倣するからである。
したがって、マウスインビボ感染は、ヒト疾患に適用可能なリーシュマニア病原性生理学的研究に有用な方法であり、宿主と寄生虫の相互作用の全身的な見解を可能にすることを提案する。確立されたアッセイ22を再検討し、我々はここに、亜感染性アマスタチゴテへの寄生虫分化、マウスフットパッドの細部発微、病変の発達、および寄生虫負荷測定を含むL.アマゾネンシスを有するC57BL/6マウスのインビボ感染のコンパイルされたステップバイステッププロトコルを提示する。このプロトコルは、他のマウス株および皮状リーシュマニアーゼを引き起こすリーシュマニア種に適応させることができる。結論として、ここで提示された方法は、新しい抗リーシュマニア薬物標的およびワクチンを同定する上で重要であり、また、リーシュマニア感染に対する宿主の免疫および代謝応答の生理学的研究において重要である。
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Protocol
すべての実験手順は、サンパウロ大学生物科学研究所の動物ケアと使用委員会によって承認され(CEUA 342/2019)、サンパウロ州の実験動物のケアと使用に関する勧告と方針に従って実施されました(Lei Estadual 11.977、 de 25/08/2005)とブラジル政府(レイ連邦11.794、de 08/10/2008)。セクション1-5に記載されているすべてのステップは、層流キャビネット内で無菌的に行われるべきである。リーシュマニアの生きた寄生虫を取り扱う際には、個人用保護具を利用する必要があります。
1. In Vitro Differentiation of L. amazonensis Promastigotes into Axenic Amastigotes15,20,35,36,37,38
注: L. アマゾネンシス(MHOM/BR/1973/M2269) (La) 寄生虫は、このアッセイで使用されました.研究目的に応じて、感染性寄生虫形態は、先に述べたように、密度勾配を用いてメタサイクリック形態の精製によって、または以下のプロトコルに従って、プロマチゴテスをアキセンチックなアマスティゴテに分化することによって得ることができる。
- ラ・プロマスチゴは、プロマスティゴテ(プロ培地)用培地10mL(pH=7.0)を含む25cm2細胞培養フラスコで増殖する。
- 25°Cで3日間インキュベートする。
注:寄生虫39、40、41、42、43、44の病原性および異常変化の損失を避けるために、10倍未満のvitroで通過したプロマスティゴテ培養物を使用してください。 - ピペット5mLの対数成長相の前駆植物培養を新しい25cm2フラスコに入れた。
- アキセンチックなアマスティゴテス(アマ培地)用の培地5mL(pH=5.2)を加える。
- 34°Cで3~4日間インキュベートします。
- 1:3の割合でアマ培地で希釈して新しい25cm2フラスコに分けます。
- 34°Cで3~5日間インキュベートします。
注:それは成熟の終わりを表すとして、最大5日間、アキセンチックなアマスティゴテをインキュベート37.
2. C57BL/6 L.アマゾネンシスによるフットパッド感染
注:サンパウロ大学生物医学研究所動物センターで、雌のC57BL/6マウス(生後6~8週)を入手し、維持した。動物は食べ物と水アドリビタムを受け取りました。
- PBSで希釈した寄生虫懸濁液のアリコートをノイバウアーチャンバー(すなわち、ヘモサイトメーター)に移すことによって、アキセキニック系アマスティゴテの培養を数える。アマスティゴテスの形態を表す非フラグラ状寄生虫を数える。
注:または、トリパンブルー(1:1)は、実行可能なアマスティゴテ(すなわち、トリパンブルーで染色されていないもの)の数をカウントするために使用することができます。 - 望ましい接種量および意図した接種数に応じてPBS中のアキセキセン系アマスチゴテスを希釈する(PBSの50μLで1 x106アキセン系アマスティゴトが推奨される)。
- 調製した寄生虫懸濁液で27G針で結核注射器をロードします。
- ジョンズ・ホプキンス大学アニマルケアと使用委員会45が推奨する3-5%イソファフルランを使用してC57BL/6マウスを麻酔する。つま先のピンチに対するマウスの反応をテストして、麻酔の深さを評価します。
- 左後足パッドの下足板組織に均質化された寄生虫懸濁液(1 x106アキセンチックなアマスティゴテまたは所望の接種量)の50μLを接種し、予め装填されたツベルクリンシリンジ(ステップ2.3)を用いた。
3. マウスフットパッドの病変開発
- キャリパーを使用して左(感染)および右(非感染)フットパッドの厚さを測定することによって、週に1回の病変の進行を測定します。
- 病変の進行を評価するために、左と右の後ろ足パッドの厚さの差を毎週計算します。
- X軸上のY軸と感染時間に計算された差をプロットし、統計的有意性を計算します。
注:動物のケアと使用委員会の勧告に従って、皮膚潰瘍は二次感染につながる可能性があるため、感染病変が潰瘍になる前に動物を犠牲にする必要があります。補助図1に示すように、このプロトコルで使用される寄生虫用量(106アキセンチック・アマスティゴテ)および宿主株(C57BL/6)で潰瘍化の徴候が示されるまでに約10週間かかる。マウスは、潰瘍の徴候が観察される前に病変抽出のために屠殺されるべきである。
4. マウスフットパッド病変抽出と寄生虫制限希釈
- すべての井戸に180 μLのプロミディアムを加えて、制限希釈アッセイ46、47用の96ウェルプレート(平底)を準備します。
注:四重アッセイ(すなわち、動物1 = レーンA-D;動物2 = レーンE-H)を表す、各動物に対して4つのプレートレーン(プレートの半分)を使用します。 - 病変あたりガラス組織グラインダーチューブに1mLのプロミディアムを加え、チューブの重量を量る。
注:チューブは無菌状態に保たれる必要がありますので、薄層流キャビネットの外側で重量を量る場合は、滅菌蓋を使用し、閉じた蓋でチューブを計量してください。 - 動物のケアと使用委員会の勧告に従って、CO2室で動物を犠牲にします。70%エタノールを噴霧して動物を消毒する。
- 感染したフットパッドを抽出し、消毒のためにフットパッドに70%のエタノールをスプレーするために、それかかとで動物の足を切除します。70%エタノールに浸し続けることで、はさみや鉗子の滅菌を確保します。
- 感染したフットパッドを無菌のペトリ皿に入れ、無菌鉗子とメスを使ってすべての軟部組織を採取します。骨を捨てる。
注:偏った組織回復を避けるために、解剖ステップの均一性が推奨されます。 - 収集した組織をプロ培地でガラス組織グラインダーチューブに移し、その後、チューブを再度計量して病変重量を決定する。
注:小さな体積が取り除かれ、組織重量が過小評価されるため、鉗子とメスを直接媒体に入れないようにしてください。病変の重量は、プロ培地のみを含むチューブの重量から、収集された組織を有するプロ培地を含むチューブの重量を差し引くことによって計算される。 - 完全な組織破壊のために粉砕機を使用して組織10xを均質化する。
- 混合物を10分間沈降させ、上清の20μLを集めます。
- ステップ4.1で調製した96ウェルプレートの1番目のレーンの1番目の列に上清の20μLをロードする。次の 3 つのレーンについて、動物ごとに 4 つ四つんたつものを持つ場合は、この手順を繰り返します (動物 1 の場合は、各ウェルに 20 μL を追加し、ラベル A1、B1、C1、および D1 を表します)。
- マルチチャンネルピペットを使用して、1番目の列10xの各ウェルを均質化します。次いで、希釈したサンプルを1番目のカラムから2番目のカラムに20μL転写する。
注: 各ウェルを 10 倍ずつ列ごとに均質化することが重要です。 - 最後の列(12番目)まで残りのすべてのカラムに対してステップ4.10を繰り返し、希釈されたサンプルの最後の20 μLを廃棄します。
注: クロスコンタミネーションを避けるために、各希釈後にチップを変更します。 - フィルムでプレートを密封し、湿気の多いチャンバーで7日間25°Cでインキュベートします。
5. 病変寄生虫負荷測定
- 反転顕微鏡を使用して7日間のインキュベーション後にプレートを分析し、各レーンの最後の寄生虫含有ウェルを決定します。
注:また、媒質の色変化や濁度の視覚的分析によって、寄生虫、または細胞密度の成長の指標を有することも可能である。 - 病変重量当たりの希釈係数を割ることにより、各レーンの寄生虫組織負荷を計算する。
注: 特定のレーンでは、1 ~ 5 桁目にのみ寄生虫が存在する場合 (つまり、ウェル A1-A5 は寄生虫の成長に対してプラス)、列 5 には 1 つの寄生虫のみが含まれ、列 4 には 10 個の寄生虫が含まれ、その後は 10 の倍数になります。列1には10個の4個の寄生虫が含まれ、これは最初の20 μLの上清(ステップ4.7の非希釈サンプル)の寄生虫の数を表す。この20μLを180μLのプロ培地で希釈したため、初期管には5 x 105寄生虫((1 x 104)/(0.02mL)=5 x 105寄生虫/1mLが含まれていました。そして、その病変における寄生虫負荷は、寄生虫の初期濃度を病変重量で割ることによって算出することができる:(5 x105)/病変重量(ステップ4.6参照)。 - ログ Y スケールを持つ各動物の四重化結果の平均をプロットします。
6. 統計分析
- 反復として実験群ごとに少なくとも5匹の動物を用いて平均±標準偏差としてデータを表す。
- p値 < 0.05 を有意と見なして、対になっていない両側検定を使用して統計分析を実行します。
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Representative Results
リーシュマニア原虫寄生虫は、無脊椎動物および脊椎動物の宿主におけるライフサイクルの間に2つの発達形態に存在する:プロマチゴテ、雌のサンドフライの内腔に見られる増殖形態;そして、哺乳動物宿主細胞の寄生性空胞に見られる増殖性形態を有する。プロマスチゴは幅約1.5μm、長さ20μmの細長い体を有し、典型的には前肢から出てくるフラグエルムを有する。アマスティゴは、長さが2~6μm、幅が1.5~3μmの範囲の丸みまたは欠型体を有し、見かけにくいフラグラム12、13(図1A)を有する。血液中に無脊椎動物の宿主、家族サイコジダエの血液型昆虫は、リーシュマニアのアマスティゴテスに感染したマクロファージを獲得する。これらの細胞がサンドフライ消化管に到達すると、アマスティゴテが放出され、プロサイクリックプロマスチゴテに分化されます(図1A)。これらの形態は非感染性であり、二項分裂によって集中的に増殖し、昆虫ベクターの消化管を植民地化する。その後、プロサイクリック形態は、感染型および動きの速い形態であるメタサイクリック形態に分化し、より薄い体と細長いフラグラムを提示する(図1A)。メタサイクリック形態は、食道および砂飛の証明された部分に侵入するので、その次の血液中に逆流は、新しい脊椎動物の宿主にこれらの感染形態の接種を確実にする。脊椎動物宿主の骨突起では、寄生虫はマクロファージによって貪食され、アマスティゴテが二項分裂で増殖し、リーシュマニア12、13のライフサイクルを完了する寄生虫が寄生虫の中の肥満者に分化される。
Axenic条件は、寄生虫の形態と生存率を維持し、インビトロで異なる宿主環境をシミュレートすることができます。アマスティゴテに対するアキセニック条件は、前に、マクロファージの寄生性空胞環境をシミュレートし、アマスティゴテ形態37へのインビトロ分化におけるプロマスチゴテを引き起こすことについて説明した。これらの条件は酸性環境(pH = 5.5)および脊椎動物の宿主の上昇温度(34 °C)を模倣する。図1Bは、培養中のこれらの条件を変化させることによりアマスティゴテスに分化されたプロマスチゴテスを示す。これらのアキセンチックなアマスティゴの生存率は、生細胞が特定の染料を排除する無傷の膜を有するという原理に基づく方法であるTrypan blue染色法によって分析することができるが、死細胞は48ではない。あるいは、25°Cで中性pHに移し、インキュベートした時にプロマスティゴテに戻って変換する能力を検証するアキセンチックなアマスティゴテの生存率を分析した(図1B)。
ここでは、異なるリーシュマニア株の病原性を評価する生体内感染法を提案する。図2Aは、野生型(La-WT)およびリーシュマニア鉄レギュレータ1ノックアウト(La-LIR1----)L.アマゾネンシス精製されたメタサイクリックに感染したC57BL/6マウスフットパッドの皮状病変発生を示すインビボ感染アッセイを表す。LIR1は、リーシュマニアにおける細胞内鉄レベルを調節し、鉄の輸出を媒介し、その細胞内蓄積を有毒レベル14に阻止する。感染したフットパッドと非感染型フットパッドの厚さの違いの進行を観察して、La-LIR1----感染マウスがLa-WT感染マウスよりも小さい病変を呈していることを実証することができた(図2A)。これらの知見は、LIR1がインビボ病原性におけるL.アマゾネンシスに不可欠であることを明らかにした。これは、リーシュマニア駆動型の皮疾患の違いを評価する際のこの方法の重要性と有効性を示す。図2Bは、感染していない(右)及び感染した(左)フットパッドおよび病変発生73日後の感染後の発症を示し、感染したマウスのLa−WTおよびLa-LIR1−−−−−の腫脹および病変進行の違いを示す。
リーシュマニア感染の進行は、炎症反応を表す病変発生だけでなく、寄生虫の細胞内複製も含む。寄生虫の複製を評価するために、病変の寄生虫負荷は感染病変を抽出することによって決定し、続いて96ウェルプレート中の限定希釈アッセイを行った(図3A)。図3Bは、感染73日後のLa−WTおよびLa−LIR1--感染マウスからのフットパッド病変の寄生虫負荷分析を示す。 限定希釈アッセイから、La-LIR1-/-感染マウスの病変における106倍の寄生虫をLa-WTと比較して検出し、LIR1の不在がアマスティゴト14の細胞内複製を防ぐことを明らかにした。
病変発生と寄生虫負荷の両方を評価する利点の1つは、寄生虫の細胞内複製と宿主炎症反応の可能性のある違いを検出することです。我々は、リボソーム遺伝子14にLIR1 ORFが統合されたLiR1 ORFと共に、A-BACK LIR1(La-LIR1AB)である、この2つの表皮型の違いを観測した。La-LIR1ABをマウスのフットパッドに注入したところ、La-LIR1----およびLa-WT感染と比較して中間サイズの病変を観察したが、La-WT表現型の顕著な完全な寄生虫負荷救助(補足図2)。 これらの結果は、La-LIR1AB寄生虫が長期の生体内感染においてLa-WT寄生虫のように複製できたことを示している。しかし、マウスの炎症反応は、病変が有意に小さかったため、La-WT感染ほど悪化しなかった。
それにより、ここで説明する方法は、哺乳類宿主における細胞内複製および皮状病変発生の成功に必要なL.アマゾネンシス病原性因子の同定および特徴付けに不可欠であることが示された。
図1:L.アマゾネンシスの原形質およびアマスチゴテスの形態論。(A)リーシュマニアの形態学的形態の異なる図示: プロサイクリックのプロマスティゴテ、メタサイクリックプロマスチックゴテ、およびアマスティゴテ。スケールバー = 2 μm(B) インビトロL. アマゾネンシス文化の写真。アキセンチックなアマスティゴテへのプロマスチゴテスのインビトロ分化、およびアキセンチックなアマスティゴテスのpHおよび温度条件を変化させることによって、継数ごとのプロスチゴテに戻る。写真は逆顕微鏡を使って撮影した。スケールバー = 50 μmこの図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:LIR1ノックアウトは、生体内病変におけるL.アマゾネンシスを著しく減少させる。C57BL/6マウスを左後ろ足パッドにL.アマゾネンシス野生型の106精製metacyclics(La-WT)およびL.アマゾネンシスLIR1ノックアウト(La-LIR1 -/-)で接種した。(A) フットパッド La-WTおよびLa-LIR1の皮状病変進行-/-感染マウスを毎週分析した。 データは、各群の5種類のマウスから非感染フットパッド厚さによって差し引かれた感染フットパッドの平均±SEMを表す(Laranjeira-Silvaらより適合される)。(B) 感染していないラ-WTおよびLa-LIR1のフットパッドの写真--感染したマウスは、感染後73日間腫脹の違いを示す(Laranjeira-Silvaらから適応される)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3: LIR1ノックアウトは、細胞内のL.アマゾネンシスを著しく減少させる。(A) L. アマゾネンシス野生型(La-WT)および LIR1 ノックアウト (La-LIR1--) に感染した回収されたフットパッド組織の 10 倍の連続希釈を表す 96 ウェルプレートの図。行A-Dは、La-WT-フットパッド病変サンプルの連続希釈の四重化を表す。行 E-H は、La-LIR1-/-フットパッド病変サンプルの連続希釈の四重化を表す。灰色の異なる色合いは、ウェル当たりの観察された細胞密度を表します(すなわち、明るい色は寄生虫が少なくなる)。赤でマークされた井戸は、レプリケートごとに寄生虫を含む最後の井戸を表します。(B) L.アマゾネンシス野生型の106精製メタサイクチング(La-WT)およびL.アマゾネンシスLIR1ノックアウト(La-LIR1----)に感染したC57BL/6マウスの回収フットパッド組織における寄生虫負荷は、73日後に決定された。データは、各群の5つの異なるマウスからの組織のmg当たりの寄生虫負荷の平均を表す(Laranjeira-Silvaらから適応14)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足図1:二次感染を示す皮膚潰瘍。L.アマゾネンシス野生型(La-WT)に感染したC57BL/6マウスフットパッドの代表的な写真は、感染後80日撮影した。赤い矢印は潰瘍の兆候を指し、実験を終了する必要があることを示しています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足図2:生体内病変発生と細胞内寄生虫複製に対するLIR1の役割C57BL/6マウスを左後ろ足パッドに106種の精製されたL.アマゾネンシス野生型(La-WT)、L.アマゾネンシスLIR1ノックアウト(La-LIR1-/-)、およびL.アマゾネンシスLIR1アドインバック(La-LIR1AB)を接種した。(A) フットパッドの皮状病変進行の La-WT, La-LIR1---, およびLa-LIR1AB感染マウスは毎週分析した。 データは、各群の5種類のマウスから非感染フットパッド厚さによって差し引かれた感染フットパッドの平均±SEMを表す(Laranjeira-Silvaらより適合される)。(B) 感染後73日間に決定されたマウスに感染したマウスに感染したマウスは、La-WT、La-LIR1-----またはLa-LIR1AB感染マウスから回収されたフットパッド組織における寄生虫負荷。 データは、各群の5つの異なるマウスからの組織のmg当たりの寄生虫負荷の平均を表す(Laranjeira-Silvaらから適応14)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルで説明されているin vivo感染アッセイは、全身的なシナリオにおける宿主寄生虫相互作用を考慮して、すべての研究者が生体内での皮状リーシュマニア症を評価することを可能にする。これらのアッセイは、多くのグループ22、24、27、29、31、32、34、49で使用されており、ここではいくつかのグループが持つかもしれないインフラストラクチャの制限を考慮しながら、この方法を標準化するためのステップバイステップのプロトコルをまとめました。このプロトコルはまた、生体内バイオイメージング50、51、52によるトランスジェニックリーシュマニア寄生虫の病原性を評価するためにも使用することができる。他の実験手順と同様に、このアッセイには、マウスでの作業に慣れ、偶発的な感染を避けるために足下注射を行った経験のある訓練を受けた人員を必要とするなど、実行する制限と重要なステップがあります。プロトコルの標準化は、偏った結果を避け、異なる研究グループ間で同等の結果を生み出すために非常に重要です。
L. アマゾネンシスを皮状リーシュマニア症のモデルとして使用する主な利点は、この種によって引き起こされるフットパッド病変がマウスで容易に評価できることである。ここで説明する方法によって決定されるフットパッドの腫脹は、宿主炎症反応および寄生虫複製の2つの感染表現型の合計を表す。両方の表現型は、寄生虫を反映する寄生虫組織負荷法を病変の厚み進行の判定と関連付けることによって別々に評価することができる。もう一つの利点は、L. アマゾネンシス' プロマスティゴテが簡単にインビトロで栽培していることです。.これらを考えると、どの研究グループも、このリーシュマニア種をニーズに応じて操作することができます。L. アマゾネンシスの研究結果は、他のリーシュマニア種と比較して、特定の経路が進化的に保存されているか、発散性の21、53、54であるかを判断することができる。
自然の周期では、脊椎動物宿主へのリーシュマニア感染は、血液中に感染した砂の飛びの咬傷によって起こる。砂の飛びは通常、昆虫の唾液中に数百リーシュマニアのメタサイクリックのプロマスチゴテ形態を接種する。実験的な生体内感染において、接種の最も頻繁な部位は動物のフットパッド22である。耳への皮内注射または腹腔内注射は、各部位が異なる貪食細胞タイプ24、56を提示するので、研究目的に応じて接種の代替部位である。したがって、一部の研究グループは、自然感染56、57、58、59を模倣するために動物の耳真皮に感染するために実験室感染した砂のハエを使用する。しかし、このプロトコルは、ほとんどの研究グループでは利用できない施設を必要とする砂のフライコロニーの維持など、いくつかの制限を提示します。
La-LIR1-/-による生体内C57BL/6感染を記述する元の研究では、精製されたメタサイクリック基体形成体14を使用している。 しかしながら、リーシュマニア遺伝子操作は、その原形基体の分化をアキセンチックなアマスティゴテ14に、またはメタサイクリック感染形態20に損なう可能性がある。したがって、リーシュマニア株に応じて、研究者は、彼らの研究のために実行可能な感染寄生虫の形態を得るための最も適切な方法を決定する必要があります。ここで説明するプロマスティゴテ培養と区別されたアキセンチック系アマスチゴテのプロトコルは、より簡単な代替であり、多くの場合、19、20、35、37、38、64の場合に比較可能な結果を生み出す。このアプローチは、メタサイクリックプロマスチゴテス精製のための特異的だが広く利用されていない抗体65を有するプロマスチゴテのインキュベート、またはメタサイクリックのLPG発現18、66の密度勾配依存によるなど、典型的には感染性寄生虫の収量を低下させる他の方法の使用を避ける。分化プロトコルの効率は、アマスチンファミリー遺伝子64、67の発現レベルを決定することによって評価することができる。Amastinsは、リーシュマニアのライフサイクル68の間に異変調され、寄生虫の病原性および病因に関連する保存された遺伝子ファミリーのメンバーである67、69、70である。他のマーカーは、アマスティゴテとプロマスティゴテの形態を区別するためにも使用することができる。例えば、gp63は、アマスティゴテにおいてダウンレギュレートされ、その役割は昆虫の消化酵素71から原発を保護することにあるからである。
マウス株の選択は、標準化された生体内感染プロトコルを開発する際に考慮されるべきもう一つの重要なステップである。マウスにおけるリーシュマニア感染に対する感受性および耐性は、主に遺伝的背景29、30、55によって調節される。このプロトコルでは、L.アマゾネンシスに対する免疫応答がヒト72、73の混合Th1-Th2応答と密接に関連しているため、C57BL/6株が選択された。L.アマゾネンシスによる実験的なマウス感染は、他のマウス株28、34、74と比較してC57BL/6マウスにおいて中等度の病変を引き起こすことが記載されている。しかしながら、寄生虫株に依存して、病変サイズの違いは、BALB/c36のような感受性マウス株でのみ検出可能である。感染の時間経過も考慮する必要があり、選択したマウス株29、26、60、61、62、63、75と相関する。潰瘍化されたフットパッドは、二次感染を表す可能性があり、特に感受性マウス株の実験において、長期間の感染で観察されることが多いため、常に避けるべきである。感染を開始する時刻を指定することは、考慮されるべきもう一つのステップである。L. アマゾネンシスとの以前の研究で示したように, 寄生接種の日の時間は、宿主と寄生虫の相互作用は、日の暗い時間の間に松葉からメラトニンによって概日的な方法で影響を受けるので病変の開発に影響を与える75.
in vivo感染方法の主な欠点は、実験がかなりの数の実験動物の使用を必要とし、in vitro感染方法18と比較して最終結果を得るのに時間がかかることである。しかし、この後者の側面は、in vivoの結果がin vitro感染から得られた結果よりも正確に疾患進行の自然な時間経過を反映するので、利点と考えることができる。さらに重要なことに、L.アマゾネンシスin vivo感染からの知見は、寄生虫の病原性の一過性の変化を反映するだけでなく、ホストとそのすべてのプレーヤーの全身的な状態を認める。したがって、上記のいくつかの要因を考慮すると、このプロトコルに記載されている方法は、他の標的の特徴付けおよび病原性に関連する治療のための特定の実験的ニーズを満たすために適合させることができ、皮状リーシュマニア症制御のための新たな洞察を可能にする。
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Disclosures
著者らは、彼らが競合する財政的利益を持っていないと宣言します。
Acknowledgments
サンパウロ大学生物医学研究所動物センターのニールセン・サライヴァ・カマラ教授の皆様の支援、ガラス組織グラインダーの提供に対するシルビア・レニ・ウリアナ教授に感謝申し上げます。この研究はサンパウロ研究財団(FAPESP - MFLSの助成金2017/23933-3)によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well plate | Greiner bio-ne | 655180 | A flat-bottom plate for limiting dilution assay |
| adenine | Sigma | A8626 | Supplement added to M199 cell culture media |
| caliper | Mitutoyo | 700-118-20 | A caliper to measure the thickness of footpad |
| cell culture flask | Corning | 353014 | A 25 cm2 volume cell culture flask to cultivate Leishmania parasite |
| centrifuge | Eppendorf | 5804R | An equipament used for separating samples based on its density |
| CO2 incubator 34 °C | Thermo Scientific | 3110 | An incubator for amastigotes differentiation |
| ethanol | Merck | K50237083820 | A disinfectant for general items |
| fetal bovine serum | Gibco | 12657-029 | Supplement added to M199 cell culture media |
| glass tissue grinder tube | Thomas Scientific | 3431 E04 | A tube to collect and disrupt infected footpad tissue |
| glucose | Synth | G1008.01.AH | Supplement added to M199 cell culture media |
| GraphPad Prism Software | GraphPad | A software used to plot the data and calculate statistical significance | |
| hemin | Sigma | H-2250 | Supplement added to M199 cell culture media |
| HEPES | Promega | H5303 | Supplement added to M199 cell culture media |
| incubator 25 °C | Fanem | 347CD | An incubator for promastigotes cultivation |
| inverted microscope | Nikon | TMS | An equipament used to visual analyze the promastigote and amastigote cultures |
| isoflurane | An inhalant anesthetics for mice (3-5%) | ||
| laminar flow cabinet | Veco | VLFS-09 | A biosafety cabinet used for aseptical work area |
| M199 cell culture media | Gibco | 31100-035 | A cell culture media for Leishmania cultivation |
| microcentrifuge tube | Axygen | MCT150C | A microtube used for sample collection, processing and storage |
| multichanel pipette | Labsystems | F61978 | A multichannel pipette used for limiting dilution assay |
| NaHCO3 | Merck | 6329 | Supplement added to M199 cell culture media |
| NaOH | Sigma | S8045 | Supplement added to M199 cell culture media |
| Neubauer chamber | HBG | 2266 | A hemocytometer to count the parasite suspension |
| optical microscope | Nikon | E200 | An optical equipament used to count parasite |
| parafilm | Bemis | 349 | A flexible and resistant plastic to seal the plate |
| penicillin/streptomycin | Gibco | 15140122 | Supplement added to M199 cell culture media |
| Petri dishes | TPP | 93100 | A sterile dish to dissect the footpad tissue |
| pipetman kit | Gilson | F167360 | A micropipette kit containing four pipettors (P2 P20 P200 P1000) |
| scale | Quimis | BG2000 | An equipament used to weigh collected footpad lesions |
| scalpel | Solidor | 10237580026 | A scalpel to cut and collect footpad tissue |
| serological pipette 10 mL | Nest | 327001 | A sterile pipette used for transfering mililiter volumes |
| tips | Axygen | A pipette tip used for transfering microliter volumes | |
| Trypan blue | Gibco | 15250-061 | A dye used to count viable parasites |
| trypticase peptone | Merck | Supplement added to M199 cell culture media | |
| tuberculin syringe | BD | 305945 | A syringe with 27G needle to inoculate the parasite suspension |
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