Summary
여기에서, 우리는 Leishmania amazonensis를가진 마우스의 절단 감염을 평가하기 위하여 컴파일된 프로토콜을 제출합니다. 이것은 기생충 바이러스를 공부하기 위한 믿을 수 있는 방법, 감염에 척추동물 호스트 반응의 체계적인 보기를 허용하.
Abstract
Leishmania 종은 leishmaniases, 내장 병변에 절단에서 임상 표현의 넓은 스펙트럼을 제시하는 질병을 일으키는 원인이 되는 원생 동물 기생충입니다. 현재, 1,200만 명의 사람들이 전 세계적으로 Leishmania에 감염되고 10억 명 이상이 감염의 위험에 살고 있는 것으로 추정됩니다. 리슈마니아 아마존은 중남미에서 발병하며 일반적으로 동물 모델에서 직접 시각화 할 수있는 질병의 절단 형태로 이어집니다. 따라서, L. amazonensis 균주는 또한 쉽게 시험관내에서 재배되기 때문에 종족 리슈만편모충증 연구를 위한 좋은 모델이다. C57BL/6 마우스는 인간에서 관찰된 L. amazonensis-구동질병 진행을 모방하고 절단 성 리슈만편모충증을 위한 제일 마우스 긴장 모형의 한개로 여겨집니다. 척추 동물 숙주에서, 이 기생충은 이 세포의 방어 기계장치에도 불구하고 대식세포에 서식합니다. 몇몇 연구 결과는 다른 조건의 기생충 감염을 평가하기 위하여 시험관 내 대식세포 감염 반응을 이용합니다. 그러나, 시험관내 접근법은 유기체의 반응을 무시하는 단리된 세포 시스템으로 제한된다. 여기서, 우리는 숙주-기생충 상호작용의 전신 생리학적 개요를 제공하는 생체 내 뮤린 감염 방법을 컴파일한다. L. amazonensis를 가진 C57BL/6 마우스의 생체 내 감염을 위한 상세한 프로토콜은 감염성 amastigotes, 마우스 발판 절단 접종, 병변 발달 및 기생충 부하 결정으로 기생충 분화를 포함합니다. 우리는 이 잘 확립된 방법을 종피 리슈만편모충증에 대한 숙주 면역 및 대사 반응의 생리학적 연구를 위한 가장 적절한 방법으로 제안합니다.
Introduction
리슈마니아제는 개발도상국에서 중요한 과제를 나타내는 세계적으로 널리 퍼진 기생 전염병이며세계보건기구(WHO)에 의해 가장 중요한 소홀히 한 열대성 질병 중 하나로 인정받고있다. 리슈만편모충증은 상처, 점막 및/또는 내장 증상이 특징입니다. 절단 성 리슈만편모충증은 일반적으로 L. amazonensis, L. 멕시코, L. 브라질리아엔시스, L. guyanensis, L. major, L. 트로피카 및 L. aethiopica3에기인합니다. 이 형태의 질병은 종종 보호 세포 면역 반응의 유도로 인해 인간에서 자가 치유됩니다. 그러나, 세포 면역 반응이 실패할 수 있고, 질병은 종족 리슈만편모충증4,5를전파하기 위하여 진행될 수 있다. 리슈마니아 종과 호스트 유전적 배경 중 다양성으로 인해 사용 가능한 백신이 없습니다6,7. 치료 옵션은 또한 현재 사용 가능한 약물의 대부분이 비싸고 독성이 있거나 장기 치료가 필요할 수 있기 때문에 제한됩니다8,9. 게다가, 사용 가능한 치료에 대한 약물 내성의 보고가 있었다10,11.
리슈만편모충증의 원인인 것은 원생동물 기생충 리슈마니아이다. 기생충은 그것의 생활 주기에 있는 2개의 명백한 형태학적인 양식을 제출합니다: promastigotes, 모래파리에서 찾아낸 깃발 모양; 및 아마티고테스, 포유류 숙주 대식세포12,13의기생충 성 액수올에서 발견되는 세포내 형태. 척추동물 숙주들의 대식세포의 방어 기전에도 불구하고 침략, 생존 및 복제하는 Amastigotes의 능력은 많은 연구의 대상이 된다14,15,16,17. 따라서, 몇몇 연구 단은 기생충 감염에 특정 환경 요인의 충격을 평가하기 위하여 시험관 내 대식세포 감염 분석, 뿐만 아니라 기생충 및 호스트 유전자를 기술하고 있습니다. 이 분석은 연구를 높은 처리량 형식으로 적응하는 능력, 결과를 얻기 위해 비교적 짧은 기간, 및 희생된 실험실 동물의 감소수(18)와같은 몇 가지 장점을 제시한다. 그러나, 시험관내 시험관내 비고법의 발견은 항상 생체내 연구에서 복제되지 않기 때문에 제한적이다14,19,20,21. 생체 외 에서 시험관 내 애시스에 의해 완전히 모방 될 수 없는 호스트 기생충 상호 작용의 조직 생리적 개요를 제공 합니다. 예를 들어, 면역학적 연구는 수집된 풋패드 조직 섹션으로부터의 면역조직화학 분석또는 회복된 면역세포의 분석을 위한 포물성 림프절로부터의 면역조직화학분석(22)을 통해 수행될 수 있다.
동물은 종종 질병의 근본적인 생리적 기전을 더 잘 이해하기 위해 생물학적 및 생물의학 연구에서 인간 질병에 대한 모델로사용된다(23). 리슈만편모충증의 경우, 접종의 경로, 부위 또는 투여량이 질병 결과24,25,26,27에영향을 미친다. 더욱이, 인간과 마우스의 감염에 대한 감수성과 저항성은 숙주 및 기생충4,5,22,28,29,30,31의유전적 배경에 의해 매우 조절된다. BALB/c 마우스는 L. amazonensis 절단 감염에 매우 민감하며, 림프절, 비장 및 간32에기생충의 보급과 함께 급속한 질병 진행을 나타낸다. 질병이 절단 전이에 점진할 수 있기 때문에, 감염은 치명적일 수 있습니다. 대조적으로, C57BL/6 마우스는 L. amazonensis 감염 asays33에있는 지속적인 기생충 부전을 가진 만성 병변을 수시로 개발합니다. 이에 따라, L. amazonensis 감염은 BALB/c 마우스 감염 모델5,34보다질병 진행을 더 잘 모방하기 때문에 인간에서 만성 형태의 종족 리슈만편모충증을 연구하는 훌륭한 모델로 간주되고 있다.
따라서, 우리는 생체 내 뮤린 감염이 인간 질병에 적용 가능한 리슈마니아 바이러스 성 생리학적 연구에 유용한 방법이며, 숙주 기생충 상호 작용의 전신 보기를 허용하는 것을 제안한다. 잘 확립된분석22를다시 방문하면, 우리는 여기에 암기생충 분화를 포함하는 L. amazonensis를 가진 C57BL/6 마우스의 생체 내 감염의 컴파일된 단계별 프로토콜을 제시하고, 마우스 발판 절단 접종, 병변 발달 및 기생충 부하 측정. 이 프로토콜은 다른 마우스 균주 및 리슈마니아 종에 적응될 수 있으며 이는 종족의 리슈만편모충증을 유발한다. 결론적으로, 여기에 제시된 방법은 새로운 항리슈마니아 약물 표적 및 백신을 식별하는 데 중요하며, 리슈마니아 감염에 대한 숙주 면역 및 대사 반응의 생리학적 연구에서도 중요하다.
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Protocol
모든 실험 절차는 상파울루 대학 생명 과학 연구소의 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았으며(CEUA 342/2019), 상파울루 주의 실험실 동물 관리 및 사용에 대한 권장 사항 및 정책에 따라 수행되었습니다(Lei Estadual 11.977, de 25/08/2005) 및 브라질 정부 (레이 연방 11.794, 드 08/10/2008). 섹션 1-5에 설명된 모든 단계는 층류 캐비닛 내부에 무균 적으로 수행되어야한다. 살아있는 리슈마니아 기생충을 처리하는 동안 개인 보호 장비를 활용해야합니다.
1. A. 아마조넨시스 프롬스티고테스를 악센 아마스티고테스15,20,35,36,37,38로 분화
참고: L. 아마조넨시스(MHOM/BR/1973/M2269)(La)기생충이 이 분석에 사용되었다. 연구 목적에 따라, 감염성 기생충 형태는 앞서 설명한바와같이 밀도 구배를 사용하여 전이형 형태의 정제에 의해 또는 다음 프로토콜에 따라 무도회가 축아제내로 분화함으로써 얻어질 수 있다.
- 25 cm2 세포 배양 플라스크에서 10 mL의 무도회(pro-medium)(pH=7.0)를 함유하는 라 프로마스티고테스를 성장시다.
- 3일 동안 25°C에서 배양합니다.
참고 : 기생충39,40,41,42,43,44의독성 및 이수성 변화의 손실을 피하기 위해 시험관 내에서 10 배 미만으로 통과 된 promastigote 배양을 사용하십시오. - 피펫 5 mL의 로그 성장 단계 promastigote 배양 새로운 25 cm2 플라스크.
- 축산 아마스티고트(아마-미디엄)에 대해 5 mL의 배지를 추가합니다(pH = 5.2).
- 34°C에서 3-4일 동안 배양합니다.
- 1:3의 비율로 아마 배지로 희석하여 새로운 25 cm2 플라스크로 배양을 분할합니다.
- 34°C에서 3-5일 동안 배양합니다.
참고 : 그것은 성숙의 끝을 나타내는 대로 최대 5 일 동안 축 산 아마스티고를 인큐베이션37.
2. L. 아마존시스와 C57BL / 6 풋 패드 감염
참고: 여성 C57BL/6 마우스 (6-8 주 오래 된) 입수 하 고 상파울루 대학의 생물 의학 연구소의 동물 센터에서 유지. 동물은 음식과 물 광고 리비툼을 받았다.
- PBS에서 희석된 기생충 현탁액의 알리쿼트(즉, 혈세포계)로 옮겨 악센 아마티고트의 배양을 계산한다. amastigotes 양식을 나타내는 비 깃발 기생충을 계산합니다.
참고: 또는, 트라이판 블루 (1:1) 실행 가능한 amastigotes의 수를 계산 하는 데 사용할 수 있습니다 (즉, 그 Trypan 블루로 염색 하지). - 원하는 접종 용량 및 의도 된 접종수의 수에 따라 PBS에서 축 아마스티고를 희석하십시오 (PBS의 50 μL에서 1 x 106 축 아마스티고트 권장).
- 준비된 기생충 현탁액으로 27 G 바늘로 결핵 주사기를 적재하십시오.
- 존스 홉킨스 대학 동물 관리 및 사용 위원회45에의해 권장대로 3-5 % 이소플루란을 사용하여 C57BL / 6 마우스를 마취 . 발가락 핀치에 대한 마우스의 반응을 테스트하여 마취 깊이를 평가합니다.
- 왼쪽 뒷발패드의 아차플란타르 조직에서 균질화된 기생충 현탁액(1 x 106 액센시닉 아마스티고트 또는 원하는 접종 용량)의 50 μL을 접종하고, 이전에 로드된 결핵 주사기를 사용하였다(단계 2.3).
3. 마우스 풋 패드 병변 개발
- 캘리퍼스를 사용하여 왼쪽(감염) 및 오른쪽(감염되지 않은) 풋패드의 두께를 측정하여 일주일에 한 번 병변의 진행을 측정합니다.
- 병변 진행을 평가하기 위해 매주 왼쪽과 오른쪽 뒷발 사이의 두께 차이를 계산합니다.
- X축에 Y축과 감염 시간에 계산된 차이를 플롯하고 통계적 유의를 계산합니다.
참고: 동물 관리 및 사용 위원회의 권고에 따라, 동물은 피부 궤양이 이차 감염으로 이끌어 낼 수 있기 때문에 감염된 병변이 궤양이 되기 전에 희생되어야 합니다. 보충 그림 1에도시된 바와 같이, 병변이 이 프로토콜에 사용된 기생충 용량(106 axenic amastigotes) 및 숙주 균주(C57BL/6)와 함께 궤양의 징후를 제시하는 데 약 10주가 걸린다. 마우스는 궤양의 표시가 관찰되기 전에 병변 추출을 위해 희생되어야 합니다.
4. 마우스 풋 패드 병변 추출 및 희석을 제한 하는 기생충
- 모든 웰에 180 μL의 프로 배지를 첨가하여 제한적인 희석분석(46,47)을 위한 96웰 플레이트(flat bottom)를 준비한다.
참고: 각 동물에 대해 4개의 플레이트 레인(플레이트의 절반)을 사용하여 4중계 검정 검정 검정(즉, 동물 1 = 레인 A-D, 동물 2 = 레인 E-H)을 나타냅니다. - 병변 당 유리 조직 분쇄기 튜브에 프로 매체 1 mL을 추가하고 튜브를 무게.
참고 : 튜브는 멸균 상태로 유지되어야하므로 멸균 뚜껑을 사용하고 라미나 흐름 캐비닛 외부의 무게를 측정할 경우 닫힌 뚜껑으로 튜브를 계량하십시오. - 동물 관리 및 사용 위원회의 권고에 따라 CO2 챔버에서 동물을 희생하십시오. 70% 에탄올로 동물을 소독합니다.
- 감염된 풋패드를 추출하고 소독을 위해 풋패드에 70% 에탄올을 분무하기 위해 동물의 발을 발뒤꿈치에 절제하십시오. 가위와 집게의 멸균을 70% 에탄올에 담가 두십시오.
- 감염된 풋패드를 멸균 페트리 접시에 놓고 멸균 집게와 메스를 사용하여 해부하여 모든 연조직을 수집합니다. 뼈를 버리십시오.
참고 : 해부 단계의 균일성은 편향 된 조직 회복을 피하는 것이 좋습니다. - 수집된 조직을 유리 조직 분쇄기 튜브에 프로 배지로 옮은 다음 튜브를 다시 무게를 재하여 병변 무게를 결정합니다.
참고: 작은 부피가 제거되어 조직 무게가 과소 평가될 수 있으므로 집게와 메스를 매체에 직접 배치하지 마십시오. 병변의 무게는 프로 매체만을 포함하는 관의 무게에서 수집된 조직과 프로 매체를 포함하는 관의 무게를 빼서 계산됩니다. - 완전한 조직 파괴를 위해 분쇄기를 사용하여 조직을 10x 균질화하십시오.
- 혼합물을 10 분 동안 침전물을 허용한 다음 상수의 20 μL을 수집합니다.
- 4.1단계에서 제조된 96웰 플레이트의1st 레인의 1st컬럼에 상층부체의 20 μL을 적재한다. 다음 세 차선에 대해 각 동물에 대해 4배의 네 배가 되는 경우(즉, 동물 1의 경우 각 웰에 20 μL을 추가하고 A1, B1, C1 및 D1레이블을 지정합니다).
- 다중 채널 파이펫을 사용하여 1st 컬럼 10x에서 각각의 웰을 균질화합니다. 이어서, 희석된 시료의 20 μL을1st 컬럼으로부터2nd 컬럼으로 이송한다.
참고: 각 웰을 한 열에서 다음 열로 10배 균질화하는 것이 중요합니다. - 4.10단계를 마지막 컬럼(12일)까지 나머지모든 컬럼에 반복하고 희석된 시료의 최종 20 μL을 폐기한다.
참고: 교차 오염을 방지하기 위해 각 희석 후 팁을 변경합니다. - 필름으로 플레이트를 밀봉하고 습한 챔버에서 7 일 동안 25 °C에서 배양하십시오.
5. 병변 기생충 부하 결정
- 반전된 현미경을 사용하여 7일간의 배양 후 플레이트를 분석하여 각 차선에 대해 잘 함유된 마지막 기생충을 결정합니다.
참고: 배지의 색 변화 및 탁도를 시각적으로 분석하여 기생충 또는 세포 밀도의 성장을 나타낼 수도 있다. - 병변 중량당 희석 계수를 나누어 각 레인에 대한 기생충 조직 하중을 계산합니다.
참고 : 특정 차선에서 기생충이 열 1-5 (즉, 우물 A1-A5는 기생충 성장에 긍정적임)에만 존재하는 경우, 이것은 열 5가 1 개의 기생충만 포함하고, 열 4에는 10 개의 기생충이 포함되어 있음을 의미합니다. 열 1은 상급체의 초기 20 μL에서 기생충의 수를 나타내는 104 개의 기생충을 포함 할 것이다 (단계 4.7에서 비 희석 샘플). 이 20 μL은 프로 배지의 180 μL로 희석되었기 때문에, 초기 튜브에는 5 x 105 기생충이 함유되어 있습니다: (1 x 104)/ (0.02 mL) = 5 x 105 기생충/1 mL. 이어서, 그 병변에서의 기생충 하중은 병변 중량으로 기생충의 초기 농도를 나누어 계산할 수 있다: (5 x 105)/ 병변 중량(단계 4.6 참조). - 로그 Y-스케일을 가진 각 동물에 대한 네 배 의 결과의 평균을 플로팅합니다.
6. 통계분석
- 실험군당 적어도 5마리의 동물을 복제하여 평균 ± 표준 편차로 데이터를 나타낸다.
- p 값 < 0.05를 유의한 것으로 고려하여 페어링되지 않은 두 꼬리 테스트를 사용하여 통계 분석을 수행합니다.
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Representative Results
Leishmania 원생 동물 기생충은 무척추 동물과 척추 동물 숙주에서 수명 주기 동안 두 가지 발달 형태로 존재합니다 : 무도회, 여성 모래의 내원에서 발견되는 증식 형태; 및 암스티고테스, 포유류 숙주 세포의 기생충 기피액에서 발견되는 증식형태. Promastigotes는 대략 1.5 μm 넓이 및 20 μm 길이의 길쭉한 바디가 있고, 전형적으로 전방 사지에서 나오는 편모와. 아마스티고테스는 길이 2-6 μm, 폭 1.5-3 μm의 크기에 이르는 둥근 또는 난형 체를 가지며, 명백한기모12,13(도 1A)을갖는다. 혈액 식사 도중 무척추 동물 호스트, 가족 Psychodidae의 조혈 곤충은, 리슈마니아 amastigotes에 감염된 대식세포를 취득합니다. 이 세포가 모래파리 소화관에 도달하면, 아마스티고테가 방출되고 procyclic promastigotes로 분화됩니다(그림 1A). 이러한 형태는 비감염성이며 이진 분열에 의해 집중적으로 증식하고 곤충 벡터의 소화관을 식민지화한다. 원시 형태는 다음 메타 사이클 형태, 감염 및 빠르게 움직이는 형태로 분화, 얇은 몸과 길쭉한 기모를 제시(그림 1A). 메타 시크 린 형태는 모래파리의 식도와 입증된 부분의 앞쪽 부분을 침범하여 다음 혈액 식사 중에 역류가 이러한 감염 형태의 접종을 새로운 척추 동물 숙주로 접종하도록합니다. 척추 동물 숙주의 테그먼트에서, 기생충은 대식세포에 의해 식세포에 의해 식세포화되고 기생충 이진 분열에 의해 곱하고 리슈마니아12,13의수명 주기를 완료하는 기생충 백액골 내부의 아마스티고테로 분화된다.
Axenic 조건은 기생충 형태및 생존가능성을 유지하면서 체외에서 다른 호스트 환경을 시뮬레이션할 수 있습니다. amastigotes에 대한 축세포 조건은 이전에 대식세포의 파라시토포인성 액포올 환경을 시뮬레이션하고 시험관 내 에서 무도회 분화를 트리거링하는 것을 아마티고트 형태37로기술되었다. 이러한 조건은 산성 환경(pH=5.5)과 척추동물 숙주(34°C)의 증가된 온도를 모방한다. 그림 1B는 문화에서 이러한 조건을 변경하여 아마스티고트에 차별화된 무도회를 나타낸 것을 보여 준다. 이러한 악센 아마스티고테의 생존가능성은 살아있는 세포가 특정 염료를 배제하는 손상막을 가지고 있다는 원칙에 기초한 방법인 Trypan blue 염색에 의해 분석될 수 있지만, 죽은 세포는48이아니다. 대안적으로, 우리는 중성 pH로 옮겨지고 25°C에서 배양할 때 무도환으로 다시 변형하는 능력을 검증하는 축산 아마스티고테의 생존 가능성을 분석하였다(그림1B).
여기서 우리는 상이한 리슈마니아 균주의 독성을 평가하기 위한 생체 내 감염 방법을 제안한다. 도 2A는 야생형(La-WT) 및 리슈마니아 철 조절기 1 녹아웃(La-LIR1-/-) L. 아마존시스 정제 형에감염된 C57BL/6 마우스 풋패드의 종족 병변 발달을 나타내는 생체내 감염 분석서를 나타낸다. LIR1은 리슈마니아에서 철분 내 철 분수 조절및 세포내 축적을 독성 수준14로예방합니다. 감염된 풋패드와 비감염풋패드의 두께 차이의 진행을 관찰하여, 우리는 라-LIR1-/-감염된 마우스가 라-WT감염 마우스보다 더 작은 병변을 제시한다는 것을 입증할 수 있었다(도2 A). 그 사실 인정은 LIR1가 생체 내 독성에 있는 L. amazonensis를 위해 필수적이다는 것을 밝혔습니다. 이것은 Leishmania-driven절단 성 질병의 다름을 평가하는 이 방법의 중요성 그리고 효험을 보여줍니다. 도 2B는 감염되지 않은(오른쪽) 및 감염(왼쪽) 풋패드 및 병변 개발 73일 후, 라-WT 및 라-LIR1-감염마우스의부종 및 병변 진행의 차이를 나타낸다.
Leishmania 감염의 진행은 염증 반응을 나타내는 병변 발달뿐만 아니라 기생충의 세포 내 복제로 구성됩니다. 기생충 복제를 평가하기 위해, 병변의 기생충 하중은 감염된 병변을 추출하여 결정하였고, 이어서 96 웰 플레이트에서 희석 분석법을 제한하였다(도3A). 도 3B는 감염 73일 후 라-WT및 La-LIR1-/-감염된 마우스로부터의 풋패드 병변의 기생충 부하 분석을 나타낸다. 제한적인 희석 분석에서, 우리는 라-WT에 비해 라-LIR1-/-감염된 마우스의 병변에서 106-배적은 기생충을 검출하소, LIR1의 부재가 아마스티고테스14의세포내 복제를 방지한다는 것을 밝혔다.
병변 발달 및 기생충 부하 둘 다 평가의 이점 의 한개는 기생충 세포내 복제 및 호스트 선동적인 반응의 가능한 다름을 검출하기 위한 것입니다. 우리는 리보좀궤적(14)에다시 통합된 LIR1ORF와 함께 라-LIR1-/--인 추가 백 LIR1(La-LIR1AB)을사용하여 이들 두 표현형 사이의 차이를 관찰했다. La-LIR1AB가 마우스의 풋패드에 주입되었을 때, 우리는 라-LIR1-/-및 라-WT감염에 비해 중간 크기의 병변을 관찰했지만, 라-WT표현형의 현저한 완전한 기생충 부하 구조(보충도2). 이러한 결과는 La-LIR1AB 기생충이 장기적으로 생체 감염에서 라-WT기생충처럼 복제할 수 있었다는 것을 나타낸다. 그러나, 마우스 염증 반응은 병변이 유의히 작기 때문에 La-WT 감염만큼 악화되지 않았다.
따라서, 여기에 기술된 방법은 포유류 숙주에서 성공적인 아마스티고테 세포내 복제 및 종피 병변 발달에 필요한 L. amazonensis 독성 인자의 식별 및 특성화에 필수적인 것으로 나타났다.
그림 1: L. 아마조안시스 의 형태와 아마스티고테스. (A) 리슈마니아의다양한 형태학적 형태의 일러스트레이션 : 프로사이클 프로마스티고트, 메타시클리크 무도회, 및 아마스티고테. 배율 막대 = 2 μm. (B)체외 L. 아마조네시스 문화의 사진. 단계별 프로토콜에 기재된 바와 같이, 시험관내 분화는 액스닉 아마티고트, 및 액스닉 아마스티고테의 pH 및 온도 조건을 변경하여 다시 프로마스티고트에 있다. 사진은 거꾸로 된 현미경을 사용하여 촬영되었습니다. 배율 막대 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: LIR1 녹아웃은 생체 병변 발달에서 L. 아마조넨시스를 현저하게 감소시킨다. C57BL/6 마우스를 L. 아마조넨시스 야생형(La-WT)과 L. 아마조넨시스 LIR1녹아웃(La-LIR1-/-)의정제된 메타사이클106마리로 왼쪽 뒷발패드에 접종하였다. (a) 풋패드의 종족 병변 진행은 라-WT 및 라-LIR1-/- 감염된 마우스의 매주 분석된다. 데이터는 각 군에서 5개의 상이한 마우스로부터 비감염풋패드 두께에 의해 감산된 감염된 풋패드의 평균 ±SEM을 나타낸다(Laranjeira-Silva등에서 적응된 14). (B) 라-WT및 La-LIR1------ 감염마우스의 비감염 및 감염된 풋패드의 사진은 감염 후 73일의 부종의 차이를 나타낸다(라란제이이라-실바 등에서적응). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: LIR1 녹아웃은 생체 내 세포 내 복제에서 L. 아마조넨시스를 현저하게 감소시킨다. (A) L. 아마조엔시스 와일드 타입(La-WT) 및 LIR1 녹아웃(La-LIR1-/-)에감염된 회수된 풋패드조직의 10x 직렬 희석을 나타내는 96웰 플레이트의 예. 행 A-D는 La-WT-풋패드 병변 샘플의 직렬 희석의 4중을 나타낸다. 행 E-H는 La-LIR1-/- 풋패드 병변 샘플의직렬 희석의 4중을 나타낸다. 회색의 다른 음영은 잘 당 관찰 된 세포 밀도를 나타냅니다 (즉, 밝은 색상은 적은 기생충을 의미합니다). 빨간색으로 표시된 우물은 복제당 기생충이 포함된 마지막 우물을 나타냅니다. (B)C57BL/6 마우스의 회수된 풋패드 조직에서 기생충 부하를 106°C로 감염된 L. 아마조넨시스 야생형(La-WT) 및 L. 아마조넨시스 LIR1 녹아웃(La-LIR1-/-)73일 후 감염 을 결정했다. 데이터는 각 그룹에서 5개의 상이한 마우스로부터의 조직의 mg당 기생충 부하의 평균을 나타낸다(Laranjeira-Silva등에서 적응된 14). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보조 그림 1: 이차 감염을 나타내는 피부 궤 양. L. 아마조엔시스 야생형(La-WT)에 감염된 C57BL/6 마우스 풋패드의 대표적인 사진은 80일 후 감염후 촬영하였다. 빨간색 화살표는 궤양의 징후를 가리키며 실험을 종료해야 한다는 것을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 2: 생체 내 병변 개발 및 세포 내 기생충 복제에 LIR1의 역할. C57BL/6 마우스를 왼쪽 뒷발패드에106개의 정제된 메타사이클로 접종하였다(La-WT), L. 아마조넨시스 LIR1 녹아웃(La-LIR1-/-), 및 L. 아마조니시스 LIR1 추가백(La-LIR1AB). (a)풋패드 의 종족 병변 진행은 라-WT, 라-LIR1-/- 및 라-LIR1AB 감염 마우스의 매주 분석된다. 데이터는 각 군에서 5개의 상이한 마우스로부터 비감염풋패드 두께에 의해 감산된 감염된 풋패드의 평균 ±SEM을 나타낸다(Laranjeira-Silva등에서 적응된 14). (B)라-WT, La-LIR1-/- 또는La-LIR1AB 감염 마우스로부터 회수된 풋패드 조직에서 기생충 하중은 73일 후 감염을 결정하였다. 데이터는 각 그룹에서 5개의 상이한 마우스로부터의 조직의 mg당 기생충 부하의 평균을 나타낸다(Laranjeira-Silva등에서 적응된 14). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜에 기재된 생체 내 감염 분석법은 모든 연구원이 전신 시나리오에서 숙주 기생충 상호작용을 고려하여 생체 내 종족 근동성 편동증을 평가할 수 있게 한다. 이러한 분석법은 많은 그룹22,24,29,31,32,34,49에 의해 사용되었으며, 여기서 우리는 일부 그룹이 가질 수 있는 인프라 한계를 고려하면서 이 방법을 표준화하기 위한 단계별 프로토콜을 컴파일하였다. 이 프로토콜은 또한 생체 내 생체 이미징50,51,52에의해 형질전환 리슈마니아 기생충의 독성을 평가하는데 사용될 수 있다. 다른 실험 절차와 마찬가지로, 이 분석실험은 마우스로 작업할 수 있고 우발적인 감염을 피하기 위해 서브플란타르 주사를 수행한 경험이 있는 숙련된 직원을 요구하는 것과 같이 실행해야 할 한계와 중요한 단계가 있습니다. 프로토콜을 표준화하는 것은 편향된 결과를 피하고 다른 연구 그룹 간에 비교 가능한 결과를 생성하는 데 매우 중요합니다.
L. amazonensis를 절단 성 리슈만편모충증의 모델로 사용하는 주요 장점은 이 종에 의한 풋패드 병변이 마우스에서 쉽게 평가될 수 있기 때문입니다. 여기에 설명된 방법에 의해 결정된 풋패드의 부종은 두 가지 감염 표현형의 합계를 나타낸다: 호스트 염증 반응 및 기생충 복제. 두 표현형 모두 병변 두께 진행의 결정과 기생충 세포 내 복제를 반영하는 기생충 조직 부하 방법을 연관시킴으로써 별도로 평가될 수 있다. 또 다른 장점은 L. amazonensis' promastigotes 는 체외에서 쉽게 재배됩니다. 이러한 고려, 어떤 연구 그룹 그들의 필요에 따라이 리슈마니아 종을 조작할 수 있습니다. L. amazonensis' 연구 결과에서 결과 다음 특정 경로 진화적으로 보존 또는 발산 여부를 결정 하기 위해 다른 리슈마니아 종과 비교 될 수 있습니다21,53,54.
자연 주기에서, 척추 동물 숙주에 리슈마니아 전송 혈액 식사 동안 감염된 모래 파리의 물린에 의해 발생. 모래 파리는 일반적으로 곤충의 타액에 있는 수백 개의 리슈마니아 메타시크릭 promastigote 양식을 접종합니다. 실험적인 생체 내 감염에서, 접종의 가장 빈번한 부위는 동물의발판(22)이다. 귀 내 또는 복강 내 주사는 각 부위가 상이한 식세포 유형24,56을제시하기 때문에 연구 목적에 따라 접종의 대체 부위이다. 따라서 일부 연구 그룹은 실험실에 감염된 모래 파리를 사용하여 동물의 귀 진피를 감염시켜 자연전염56,57,58,59를모방한다. 그러나 이 프로토콜은 대부분의 연구 그룹에서 사용할 수 없는 시설을 필요로 하는 모래 비행 식민지의 유지 보수와 같은 몇 가지 제한 사항을 제시합니다.
라-LIR1-/-와 생체 내 C57BL/6 감염을 설명하는 원래 의작품은 정제된 메타사이클 무도회 형태14를사용했다. 그러나, Leishmania 유전 조작은 무도회' 분화를 축세포 아마스티고트14또는 전이성 감염성 양식20으로손상시킬 수 있습니다. 따라서, Leishmania 긴장에 따라, 연구원은 그들의 연구를 위한 실행 가능한 감염 기생충 양식을 얻기 위하여 가장 적당한 방법을 결정해야 합니다. 여기에 설명된 무도회 배양물과 구별되는 악센 아마스티고테의 프로토콜은19,20,35,37,38,64의많은 경우에 유사한 결과를 생성하는 더 쉬운 대안이 될 수 있다. 이러한 접근법은 전형적으로 전형적으로 전형적으로 전형적으로 전형적으로 전이성 무도회 정제를 위한 특이적이지만 널리 이용되지 않는 항체65를 가진 무도회 배양과 같은 감염성 기생충의 낮은 수율을 초래하는 다른 방법의 사용을 피하거나, 또는 전이세포의 LPG 발현에 의존하는 밀도 구배에의해,66. 분화 프로토콜의 효율은 아마스테인 패밀리유전자(64,67)의발현 수준을 결정함으로써 평가될 수 있다. 아마스테인은 리슈마니아 생애주기68 동안 분화되고 기생충 독성 및 병인과 연관되는 보존된 유전자 패밀리의 구성원이며67,69,70. 다른 마커는 또한 promastigote 양식에서 아마스티고테를 구별하기 위하여 이용될 수 있습니다. 예를 들어, gp63은 곤충의 소화효소(71)로부터무도회를 보호하는 것이기 때문에 아마스티고테에서 하향 조절된다.
마우스 균주의 선택은 생체 내 감염 프로토콜을 표준화개발할 때 고려해야 할 또 다른 중요한 단계이다. 쥐에서 리슈마니아 감염에 대한 감수성과 저항성은 주로 유전적 배경29,30,55에의해 조절된다. 이 프로토콜에서, C57BL/6 균주는 L. amazonensis에 대한 면역 반응이 인간72,73에서혼합 된 Th1-Th2 반응과 밀접하게 관련되어 있기 때문에 선택되었다. L. amazonensis를 가진 실험적인 뮤린 감염은 그밖 마우스 긴장28,34,74에비교된 C57BL/6 마우스에 있는 온건한 병변을 일으키는 원인이 되기 위하여 기술되었습니다. 그러나, 기생충 긴장에 따라서, 병변 크기에 있는 다름은 BALB/c36같이 영향을 받기 쉬운 마우스 긴장에서만 검출가능합니다. 감염의 시간 과정은 또한 고려되어야하고 선택된 마우스 균주29,26,60,61,62,63,75와상관 관계가 있습니다. 울진 된 풋 패드는 이차 감염을 나타낼 수 있으며 감염의 긴 기간, 특히 영향을 받기 쉬운 마우스 균주를 가진 실험에서 종종 관찰되기 때문에 항상 피해야 합니다. 감염을 시작하는 하루의 시간을 지정하는 것은 고려되어야 할 또 다른 단계입니다. L. amazonensis를가진 이전 연구 결과에서 설명한 바와 같이, 기생충 접종의 시간의 시간은 호스트 기생충 상호 작용이 일의 어두운 시간 동안 송과소 방출 된 멜라토닌에 의해 circadian 방식으로 영향을 미치기 때문에 병변 발달에 영향을 미칩니다75.
생체내 감염 방법의 주요 단점은 실험이 상당수의 실험실 동물을 사용해야 하고 시험관내 감염방법(18)에비해 최종 결과를 얻기 위해 더 오랜 시간이 걸린다는 것입니다. 그러나, 이러한 후자의 양상은 생체외 감염으로부터 얻은 결과보다 질병 진행의 자연적인 시간 과정을 보다 정확하게 반영하기 때문에 또한 장점으로 간주될 수 있다. 더 중요 한 것은, 생체 내 L. amazonensis에서 발견 뿐만 아니라 기생충 독성에 일시적인 변화를 반영 할 수 없습니다 뿐만 아니라 호스트와 모든 선수의 전신 상태를 인정. 따라서, 위에서 언급한 몇몇 요인을 고려하여, 이 프로토콜에 기술된 방법은 다른 표적의 특성화에 대한 특정 실험적 요구를 충족하도록 적응될 수 있고, 독성과 관련된 치료법은 절단리슈만편모충증 조절에 대한 새로운 통찰력을 허용한다.
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Disclosures
저자는 그들이 경쟁 적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
상파울루 대학교 생물의학 연구소의 동물 센터의 닐스 올슨 사라이바 카마라 교수님의 지원과 실비아 레니 울리아나 교수님에게 유리 조직 분쇄기를 제공한 것에 대해 감사드립니다. 이 작품은 상파울루 연구 재단에 의해 지원되었다 (FAPESP - MFLS의 보조금 2017/23933-3).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well plate | Greiner bio-ne | 655180 | A flat-bottom plate for limiting dilution assay |
| adenine | Sigma | A8626 | Supplement added to M199 cell culture media |
| caliper | Mitutoyo | 700-118-20 | A caliper to measure the thickness of footpad |
| cell culture flask | Corning | 353014 | A 25 cm2 volume cell culture flask to cultivate Leishmania parasite |
| centrifuge | Eppendorf | 5804R | An equipament used for separating samples based on its density |
| CO2 incubator 34 °C | Thermo Scientific | 3110 | An incubator for amastigotes differentiation |
| ethanol | Merck | K50237083820 | A disinfectant for general items |
| fetal bovine serum | Gibco | 12657-029 | Supplement added to M199 cell culture media |
| glass tissue grinder tube | Thomas Scientific | 3431 E04 | A tube to collect and disrupt infected footpad tissue |
| glucose | Synth | G1008.01.AH | Supplement added to M199 cell culture media |
| GraphPad Prism Software | GraphPad | A software used to plot the data and calculate statistical significance | |
| hemin | Sigma | H-2250 | Supplement added to M199 cell culture media |
| HEPES | Promega | H5303 | Supplement added to M199 cell culture media |
| incubator 25 °C | Fanem | 347CD | An incubator for promastigotes cultivation |
| inverted microscope | Nikon | TMS | An equipament used to visual analyze the promastigote and amastigote cultures |
| isoflurane | An inhalant anesthetics for mice (3-5%) | ||
| laminar flow cabinet | Veco | VLFS-09 | A biosafety cabinet used for aseptical work area |
| M199 cell culture media | Gibco | 31100-035 | A cell culture media for Leishmania cultivation |
| microcentrifuge tube | Axygen | MCT150C | A microtube used for sample collection, processing and storage |
| multichanel pipette | Labsystems | F61978 | A multichannel pipette used for limiting dilution assay |
| NaHCO3 | Merck | 6329 | Supplement added to M199 cell culture media |
| NaOH | Sigma | S8045 | Supplement added to M199 cell culture media |
| Neubauer chamber | HBG | 2266 | A hemocytometer to count the parasite suspension |
| optical microscope | Nikon | E200 | An optical equipament used to count parasite |
| parafilm | Bemis | 349 | A flexible and resistant plastic to seal the plate |
| penicillin/streptomycin | Gibco | 15140122 | Supplement added to M199 cell culture media |
| Petri dishes | TPP | 93100 | A sterile dish to dissect the footpad tissue |
| pipetman kit | Gilson | F167360 | A micropipette kit containing four pipettors (P2 P20 P200 P1000) |
| scale | Quimis | BG2000 | An equipament used to weigh collected footpad lesions |
| scalpel | Solidor | 10237580026 | A scalpel to cut and collect footpad tissue |
| serological pipette 10 mL | Nest | 327001 | A sterile pipette used for transfering mililiter volumes |
| tips | Axygen | A pipette tip used for transfering microliter volumes | |
| Trypan blue | Gibco | 15250-061 | A dye used to count viable parasites |
| trypticase peptone | Merck | Supplement added to M199 cell culture media | |
| tuberculin syringe | BD | 305945 | A syringe with 27G needle to inoculate the parasite suspension |
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