Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

In Vivo Infeksjon med Leishmania amazonensis å evaluere parasitt virulens hos mus

Published: February 20, 2020 doi: 10.3791/60617
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Physiology, Institute of Bioscience, University of Sao Paulo

Summary

Her presenterer vi en kompilert protokoll for å evaluere kutan infeksjon av mus med Leishmania amazonensis. Dette er en pålitelig metode for å studere parasittvirulens, noe som gir et systemisk syn på virveldyrvertens respons på infeksjonen.

Abstract

Leishmania spp. er protozoiske parasitter som forårsaker leishmaniases, sykdommer som presenterer et bredt spekter av kliniske manifestasjoner fra kutane til viscerale lesjoner. For tiden er 12 millioner mennesker anslått å være smittet med Leishmania over hele verden og over 1 milliard mennesker lever i fare for infeksjon. Leishmania amazonensis er endemisk i Sentral- og Sør-Amerika og fører vanligvis til den kutane formen av sykdommen, som kan visualiseres direkte i en dyremodell. Derfor er L. amazonensis stammer gode modeller for kutan leishmaniasis studier fordi de er også lett dyrket in vitro. C57BL/6 mus etterligner L. amazonensis-drevetsykdomsprogresjon observert hos mennesker og regnes som en av de beste musstammermodellen for kutan leishmaniasis. I virveldyrverten bor disse parasittene makrofager til tross for forsvarsmekanismene til disse cellene. Flere studier bruker in vitro makrofag infeksjon analyser for å evaluere parasitten infectivity under ulike forhold. In vitro-tilnærmingen er imidlertid begrenset til et isolert cellesystem som ser bort fra organismens respons. Her utarbeider vi en in vivo murine infeksjonsmetode som gir en systemisk fysiologisk oversikt over vertsparasittinteraksjonen. Den detaljerte protokollen for in vivo-infeksjonen av C57BL/6 mus med L. amazonensis består av parasittdifferensiering i infeksiøse amastigoter, mus fotpute kutan inokulasjon, lesjonsutvikling og parasittbelastningsbestemmelse. Vi foreslår denne veletablerte metoden som den mest tilstrekkelige metoden for fysiologiske studier av vertens immun- og metabolske respons er på kutan leishmaniasis.

Introduction

Leishmaniases er verdensomspennende utbredtparasittiske smittsomme sykdommer som representerer viktige utfordringer i utviklingsland og er anerkjent som en av de viktigste forsømte tropiske sykdommene av Verdens helseorganisasjon1,2. Leishmaniases er preget av kutan, slimhinne, og / eller visceral manifestasjoner. Kutan leishmaniasis er vanligvis forårsaket av L. amazonensis, L. mexicana, L. braziliensis, L. guyanensis, L. major, L. tropica og L. aethiopica3. Denne sykdomsformen er ofte selvhelbredende hos mennesker på grunn av induksjon av beskyttende cellulær immunrespons. Imidlertid kan den cellulære immunresponsen mislykkes, og sykdommen kan utvikle seg til spredt kutan leishmaniasis4,5. Det er ingen tilgjengelig vaksine på grunn av mangfoldet blant Leishmania arter og vert genetisk bakgrunn6,7. Behandlingstilbud er også begrenset som de fleste av de tilgjengelige stoffene er enten dyre, giftige, og / eller kan kreve langsiktig behandling8,9. Dessuten har det vært rapporter om resistens mot tilgjengelige behandlinger10,11.

Den forårsakende agenten til leishmaniases er den protozoiske parasitten Leishmania. Parasitten presenterer to distinkte morfologiske former i livssyklusen: promastigotes, den flagellated form funnet i sandfluer; og amastigotes, den intracellulære formen som finnes i parasitophorous vacuoles av pattedyr vert makrofager12,13. Amastigotes evne til å invadere, overleve og replikere til tross for forsvarsmekanismene til virveldyrvertens makrofager er underlagt mange studier14,15,16,17. Derfor har flere forskningsgrupper beskrevet in vitro makrofag infeksjon analyser for å evaluere virkningen av spesifikke miljøfaktorer, samt parasitt og vert gener på parasitt ensmittivitet. Denne analysen presenterer flere fordeler, for eksempel evnen til å tilpasse studier til et høyt gjennomstrømningsformat, relativt kortere tidsperiode for å oppnå resultater, og redusert antall laboratoriedyr ofret18. Men funnene av in vitro analyser er begrenset fordi de ikke alltid replikere in vivo studier14,19,20,21. In vivo assays gir en systemisk fysiologisk oversikt over host-parasittinteraksjonen, som ikke kan etterlignes fullt ut av in vitro-analyser. For eksempel kan immunologiske studier utføres gjennom immunohistokjemiske analyser fra innsamlede fotputevevseksjoner eller til og med fra popliteale lymfeknuter for analyse av de gjenopprettede immuncellene22.

Dyr brukes ofte som modell for menneskelige sykdommer i biologisk og biomedisinsk forskning for å bedre forstå de underliggende fysiologiske mekanismene til sykdommene23. I tilfelle av leishmaniasis, påvirker ruten, stedet eller dosen av inokulasjon sykdomsutfallet24,25,26,27. Videre er mottakelighet og motstand mot infeksjonen hos mennesker og mus sterkt regulert av den genetiske bakgrunnen til verten og parasitten4,5,22,28,29,30,31. BALB/c-mus er svært utsatt for L. amazonensis kutan infeksjon, som viser en rask sykdomsprogresjon med parasittenes spredning til lymfeknuter, milt og lever32. Ettersom sykdommen kan utvikle seg til kutane metastaser, kan infeksjonen være dødelig. I motsetning utvikler C57BL/6 mus ofte kroniske lesjoner med vedvarende parasittbelastning i L. amazonensisinfeksjonsanalyser 33. Dermed har L. amazonensisinfeksjon med denne spesielle musearten blitt ansett som en utmerket modell for å studere kroniske former for kutan leishmaniasis hos mennesker, fordi den etterligner sykdomsprogresjonen bedre enn BALB / c mus infeksjonmodell5,34.

Derfor foreslår vi at murine in vivo infeksjon er en nyttig metode for Leishmania virulence fysiologiske studier som gjelder for menneskelig sykdom, slik at et systemisk syn på vertsparasittinteraksjonen. Revisiting veletablerte analyser22, presenterer vi her en kompilert trinnvis protokoll av in vivo infeksjon av C57BL/6 mus med L. amazonensis som består parasittdifferensiering i axenic amastigotes, mus fotpute kutan inokulasjon, lesjon utvikling, og parasitt last bestemmelse. Denne protokollen kan tilpasses andre mus stammer og Leishmania arter som forårsaker kutane leishmaniases. Til slutt er metoden som presenteres her avgjørende for å identifisere nyeanti-Leishmania narkotikamål og vaksiner, samt i fysiologiske studier av vertens immun- og metabolske respons på Leishmania-infeksjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle eksperimentelle prosedyrer ble godkjent av Animal Care and Use Committee ved Institute of Bioscience ved Universitetet i São Paulo (CEUA 342/2019), og ble gjennomført i samsvar med anbefalingene og retningslinjene for omsorg og bruk av laboratoriedyr i São Paulo State (Lei Estadual 11.977, de 25/08/2005) og den brasilianske regjeringen (Lei Federal 11.794, de 08/10/2008). Alle trinn som er beskrevet i avsnitt 1-5 bør utføres aseptisk inne i lamimerstrømningsskap. Personlig verneutstyr bør benyttes mens du håndterer levende Leishmania parasitter.

1. In Vitro Differensiering av L. amazonensis Promastigotes i Axenic Amastigotes15,20,35,36,37,38

MERK: L. amazonensis (MHOM/BR/1973/M2269) (La) parasitt ble brukt i denne analysen. Avhengig av studieformålet kan den infeksive parasittformen oppnås enten ved rensing av metasykliske form ved hjelp av en tetthetgradient, som tidligere beskrevet14,eller ved differensiering av promastigotes til aksenisk amastigotes, i henhold til følgende protokoll.

  1. Vokse La promastigotes i en 25 cm2 celle kultur kolbe som inneholder 10 ml medium for promastigotes (pro-medium) (pH = 7,0).
  2. Inkuber ved 25 °C i 3 dager.
    MERK: Bruk promastigote kulturer som ble passaged in vitro mindre enn 10x for å unngå tap av virulence og aneuploidy endringer av parasitter39,40,41,42,43,44.
  3. Pipette 5 ml logaritmisk vekstfase promastigote kultur i en ny 25 cm2 kolbe.
  4. Tilsett 5 ml medium for aksenisk amastigotes (ama-medium) (pH = 5.2).
  5. Inkuber ved 34 °C i 3-4 dager.
  6. Del kulturen ved å fortynne med ama-medium i forholdet 1:3 i en ny 25 cm2 kolbe.
  7. Inkuber ved 34 °C i 3-5 dager.
    MERK: Inkuber aksesyreamastigotene i opptil 5 dager, da det representerer slutten avmodningen 37.

2. C57BL/6 Fotpute infeksjon med L. amazonensis

MERK: Kvinnelige C57BL/6 mus (6-8 uker gammel) ble innhentet og vedlikeholdt ved Animal Center of the Biomedical Sciences Institute ved Universitetet i São Paulo. Dyr fikk mat og vann annonse libitum.

  1. Telle kulturen av axenic amastigotes ved å overføre en aliquot av parasittsuspensjonen fortynnet i PBS til et Neubauer-kammer (dvs. hemocytometer). Tell de ikke-flagellated parasittene, som representerer amastigotes former.
    MERK: Alternativt kan Trypan blå (1:1) brukes til å telle antall levedyktige amastigotes (dvs. de som ikke er farget med Trypan blå).
  2. Fortynn aksonamastigotene i PBS i henhold til ønsket inoculumdose og antall inonoumer beregnet (1 x 106 aksoniske amastigoter i 50 μL PBS anbefales).
  3. Legg en tuberculinsprøyte med en 27 G nål med suspensjon av preparerte parasitter.
  4. Bedøve en C57BL/6 mus ved hjelp av 3-5% isoflurane, som anbefalt av Johns Hopkins University Animal Care and Use Committee45. Vurder bedøvelsesdybden ved å teste musens respons på en tåklype.
  5. Inokuler5 μL av den homogeniserte parasittsuspensjonen (1 x 106 aksoniske amastigoter eller ønsket inoculumdose) i subplantarvevet på venstre bakfotpute, ved hjelp av den tidligere lastede tuberkulinsprøyten (trinn 2,3).

3. Mus Fotpad Lesjon Utvikling

  1. Mål utviklingen av lesjonen en gang i uken ved å måle tykkelsen på venstre (infisert) og høyre (ikke-infiserte) fotbeskyttere ved hjelp av en kaliper.
  2. Beregn forskjellen på tykkelsen mellom venstre og høyre bakfotputer ukentlig for å evaluere lesjonsprogresjon.
  3. Tegn de beregnede forskjellene på Y-aksen og infeksjonstiden på X-aksen og beregn den statistiske betydningen.
    MERK: I samsvar med dyreverns- og brukskomiteens anbefalinger må dyr ofres før den infiserte lesjonen blir sår, fordi hudsår kan føre til sekundær infeksjon. Som vist i Tilleggstall figur 1,tar det ca. 10 uker før lesjonene presenterer tegn på sårdannelse med parasittdosen (106 aksoniske amastigoter) og vertsstamme (C57BL/6) som brukes i denne protokollen. Musene skal ofres for lesjonsekstraksjon før tegn på sårdannelse observeres.

4. Mus Fotpute Lesjon Ekstraksjon og parasitt begrense fortynning

  1. Forbered en 96 brønnplate (flat bunn) for den begrensende fortynningsanalysen46,47 ved å legge til 180 μL pro-medium til alle brønner.
    MERK: Bruk fire platebaner (halvparten av platen) for hvert dyr, som representerer quadruplicate-analyser (dvs. dyr 1 = baner A-D; dyr 2 = baner E-H).
  2. Tilsett 1 ml pro-medium i et glassvevsliperrør per lesjon og vei røret.
    MERK: Røret må holdes sterilt, så bruk et sterilt lokk og vei røret med lukket lokk, hvis du veier utenfor laminarstrømningsskapet.
  3. Ofr dyret i et CO 2-kammer, etter dyreverns- og brukskomiteens anbefalinger. Desinfiser dyret ved å sprøyte med 70% etanol.
  4. Avgiftsrommet dyrets fot på det hæler for å trekke ut den infiserte fotputen og spray 70% etanol på fotputen for desinfeksjon. Sørg for sterilisering av saks og tang ved å holde dem gjennomvåt i 70% etanol.
  5. Plasser den infiserte fotputen i en steril Petri-tallerken og disseker ved hjelp av sterile tang og en skalpell for å samle alle myke vev. Kast beinene.
    MERK: Ensartethet i disseksjonstrinnet anbefales for å unngå partisk vevsgjenoppretting.
  6. Overfør det innsamlede vevet til glassvevsliperrøret med pro-medium, og vei deretter røret igjen for å bestemme lesjonsvekten.
    MERK: Unngå å plassere tang og skalpell direkte inn i mediet, da små volumer kan fjernes, noe som resulterer i en undervurdert vevsvekt. Vekten av lesjonen beregnes ved å trekke fra vekten av røret som inneholder pro-medium med det innsamlede vevet fra vekten av røret som bare inneholder pro-medium.
  7. Homogeniser vevet 10x ved hjelp av kvernen for fullstendig vevsforstyrrelse.
  8. La blandingen sediment i 10 min, og samle deretter 20 μL av supernatanten.
  9. Legg 20 μL av supernatanten i 1m kolonne i 1st kjørefelt på 96 brønnplate utarbeidet i trinn 4.1. Gjenta dette for de neste tre banene for å ha quadruplicates for hvert dyr (dvs. for dyr 1 tilsett 20 μL til hver brønn og etikett A1, B1, C1 og D1).
  10. Homogeniser hver brønn i 1m kolonne 10x ved hjelp av en flerkanals pipette. Deretter overfører du 20 μL av de fortynnede prøvene fra 1m kolonne til2.
    MERK: Det er viktig å homogenisere hver brønn 10x fra en kolonne til den neste.
  11. Gjenta trinn 4,10 til alle gjenværende kolonner til den siste kolonnen (12th)og kast den endelige 20 μL fortynnet prøve.
    MERK: Endre spissene etter hver fortynning for å unngå krysskontaminering.
  12. Forsegle platene med en film og inkubator ved 25 °C i 7 dager i et fuktig kammer.

5. Bestemmelse av lesjonsparasittlast

  1. Analyser platene etter 7 dager med inkubasjon ved hjelp av et invertert mikroskop for å bestemme den siste parasittholdige brønnen for hvert kjørefelt.
    MERK: Det er også mulig å ha en indikasjon på veksten av parasittene, eller celletettheten, ved visuell analyse av fargeendringene og turbiditeten til mediet.
  2. Beregn parasittvevsbelastningen for hvert kjørefelt ved å dele fortynningsfaktoren per lesjonsvekt.
    MERK: I et bestemt kjørefelt, hvis parasitter bare finnes i kolonne 1-5 (dvs. brønner A1-A5 er positive for parasittvekst), betyr dette at kolonne 5 inneholdt bare 1 parasitt, kolonne 4 inneholdt 10 parasitter, og så videre, i multipler på ti. Kolonne 1 ville inneholde 104 parasitter, som representerer antall parasitter i den første 20 μL supernatant (den ikke-fortynnede prøven i trinn 4.7). Fordi denne 20 μL ble fortynnet med 180 μL pro-medium, inneholdt det første røret 5 x 105 parasitter: (1 x 104) / (0,02 ml) = 5 x 105 parasitter/1 ml. Deretter kan parasittbelastningen i denne lesjonen beregnes ved å dele den første konsentrasjonen av parasitten ved lesjonsvekten: (5 x 105) / lesjonvekt (se trinn 4.6).
  3. Plott gjennomsnittet av quadruplicated resultatet for hvert dyr med en logg Y-skala.

6. Statistisk analyse

  1. Representerer dataene som gjennomsnittlig ± standardavvik ved hjelp av minst fem dyr per eksperimentell gruppe som replikerer.
  2. Utfør statistisk analyse ved hjelp av ikke-parkoblet to-tailed test, med tanke på en p-verdi < 0,05 som signifikant.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Leishmania protozoan parasitter finnes i to utviklingsformer i løpet av livssyklusen i virvelløse og virvelløse verter: promastigotes, de proliferative formene som finnes i lumen av den kvinnelige sandfluen; og amastigotes, de proliferative former som finnes i parasitophorous vacuoles av pattedyr vertsceller. Promastigotes har en langstrakt kropp på ca. 1,5 μm bred og 20 μm lang, med et flagellum som vanligvis kommer fra fremre ekstremitet. Amastigotes har en avrundet eller oval kropp som varierer i størrelse fra 2-6 μm i lengde og 1,5-3 μm i bredde, og har en inapparent flagellum12,13 (Figur 1A). Under blodmåltidet får virvelløse vert, et hematophagous insekt av familien Psychodidae makrofager smittet med Leishmania-amastigoter. Når disse cellene når sandfly fordøyelsesrøret, amastigotes frigjøres og differensiere til prosykliske promastigotes (Figur 1A). Disse formene er ikke-infeksive og multipliserer intensivt ved binær deling og koloniserer fordøyelsesrøret til insektvektoren. De prosykiske formene skiller deretter til metasykliske former, en infeksiøs og rask bevegelseform, som presenterer en tynnere kropp og langstrakt flagellum (Figur 1A). De metasykiske formene invaderer de de nye delene av spiserøret og proventriculus av sandflyet, slik at under sitt neste blodmåltid sikrer oppblåsthet inokulasjonen av disse infiserende former til en ny virveldyrvert. I virveldyrvertens tegument blir parasittene hyllet av makrofagene og differensierer seg til amastigoter inne i parasitophorous vacuoles, hvor amastigotene multipliserer med binær divisjon og fullfører livssyklusen til Leishmania12,13.

Aksoniske forhold kan simulere ulike vertsmiljøer in vitro, opprettholde parasittmorfologi og levedyktighet. Aksoniske forhold for amastigotes ble tidligere beskrevet simulere en makrofag parasitophorous vacuole miljø og utløser promastigote in vitro differensiering i amastigote form37. Disse forholdene etterligner det sure miljøet (pH = 5,5) og den økte temperaturen på virveldyrvertene (34 °C). Figur 1B illustrerer promastigotes differensiert til amastigotes ved å endre disse forholdene i kulturen. Levedyktigheten til disse axenic amastigotes kan analyseres av Trypan blå farging, en metode basert på prinsippet om at levende celler har intakte membraner som utelukker visse fargestoffer, mens døde celler ikke48. Alternativt analyserte vi levedyktigheten til axenic amastigotes som bekrefter deres evne til å forvandle seg tilbake til promastigotes når de overføres til nøytral pH og inkubert ved 25 °C (Figur 1B).

Her foreslår vi en in vivo infeksjonmetode for å evaluere virulence av forskjellige Leishmania stammer. Figur 2A representerer en in vivo infeksjonanalyse som viser kutan lesjonutvikling av C57BL/6 mus fotputer som var smittet med vill type (La-WT) og Leishmania Iron Regulator 1 knockout (La-LIR1-/-) L. amazonensis renset metasykliske. LIR1 regulerer intracellulære jernnivåer i Leishmania som medierer jerneksport og forhindrer intracellulær akkumulering til giftige nivåer14. Observere utviklingen av tykkelsesforskjellene til de infiserte vs. ikke-infiserte fotputer, var vi i stand til å demonstrere at La-LIR1-/- infiserte mus presenterte mindre lesjoner enn La-WT infiserte mus (Figur 2A). Disse funnene viste at LIR1 er avgjørende for L. amazonensis in vivo virulence. Dette viser viktigheten og effekten av denne metoden for å vurdere forskjellene i Leishmania-drevnekutane sykdommer. Figur 2B illustrerer de ikke-infiserte (høyre) og infiserte (venstre) fotputer og lesjonsutvikling 73 dager etter infeksjon, som viser forskjellene i hevelse og lesjonprogresjon av La-WT og La-LIR1-/- infiserte mus.

Utviklingen av Leishmania-infeksjonen består ikke bare av lesjonsutviklingen, som representerer den inflammatoriske responsen, men også parasittens intracellulære replikasjon. For å evaluere parasittreplikasjon ble parasittbelastningen av lesjonene bestemt ved å trekke ut den infiserte lesjonen, etterfulgt av en begrensende fortynningsanalyse i en 96 brønnplate (figur 3A). Figur 3B viser parasittbelastningsanalysen av fotputelesjonene fra La-WT og La-LIR1-/- infiserte mus etter 73 dagers infeksjon. Fra den begrensende fortynningsanalysen oppdaget vi 106 -foldfærre parasitter i lesjonen av La-LIR1-/- infiserte mus i forhold til La-WT, og avslører at fravær av LIR1 forhindrer intracellulær replikering av amastigotene14.

En av fordelene med å evaluere både lesjonsutvikling og parasittbelastning er å oppdage mulige forskjeller i parasitt intracellulær replikasjon og vertens inflammatoriske respons. Vi observerte forskjeller mellom disse to fenotypene ved hjelp av add-back LIR1 (La-LIR1AB), som er La-LIR1-/- med LIR1 ORF integrert tilbake i ribosomal locus14. Da La-LIR1AB ble injisert i en musfotblokk, observerte vi mellomstore lesjoner sammenlignet med La-LIR1-/- og La-WT-infeksjoner, men en bemerkelsesverdig full parasittlastredning av La-WT-fenotypen(Tilleggsnummer 2). Disse resultatene indikerer at La-LIR1AB parasitter var i stand til å replikere som La-WT parasitter i en langsiktig in vivo infeksjon. Musen inflammatorisk respons ble imidlertid ikke så forverret som La-WT infeksjoner fordi lesjonene var betydelig mindre.

Dermed ble metoden beskrevet her vist seg å være avgjørende for identifisering og karakterisering av en L. amazonensis virulence faktor som kreves for vellykket amastigote intracellulær replikering og kutan lesjon utvikling i pattedyr vertene.

Figure 1
Figur 1: Morfologi av L. amazonensis promastigotes og amastigotes. (A) Illustrasjoner av de forskjellige morfologiske former for Leishmania: prosyklisk promastigote, metasyklisk promastigote og amastigote. Skala bar = 2 μm. (B) Bilder av in vitro L. amazonensis kulturer. In vitro differensiering av promastigotes i aksenisk amastigotes, og av axenic amastigotes tilbake til promastigotes ved å endre pH og temperaturforhold, som beskrevet i trinnvis protokoll. Bildene ble tatt ved hjelp av et omvendt mikroskop. Skala bar = 50 μm. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: LIR1 knockout reduserer l. amazonensis in vivo lesjonsutvikling. C57BL/6 mus ble vaksinert i venstre bakfotpute med 106 rensede metasykliske l. amazonensis villtype (La-WT) og L. amazonensis LIR1 knockout (La-LIR1-/-). (A) Fotpute kutan lesjon progresjon av La-WT og La-LIR1-/- infiserte mus analysert ukentlig. Dataene representerer gjennomsnittet ± SEM av den infiserte fotblokken trukket av ikke-infisert fotputetykkelse fra fem forskjellige mus i hver gruppe (tilpasset fra Laranjeira-Silva et al.14). (B) Bilder av de ikke-infiserte og infiserte fotputene til La-WT og La-LIR1-/- infiserte mus som viser forskjellene i hevelse 73 dager etterinfeksjon (tilpasset fra Laranjeira-Silva et al.14). Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: LIR1 knockout reduserer l. amazonensis in vivo intracellulær replikering. (A) En illustrasjon av en 96 brønnplate som representerer 10x seriefortynninger av gjenvunnet fotputevev infisert med L. amazonensis vill type (La-WT) og LIR1 knockout (La-LIR1-/-). Rader A-D representerer quadruplicate av seriefortynninger av La-WT-footpad lesjon prøve. Rader E-H representerer quadruplicat av seriefortynningene til La-LIR1-/--fotputelesjonsprøven. De forskjellige nyanser av grått representerer den observerte celletettheten per brønn (dvs. lysere farge betyr færre parasitter). Brønnene som er merket i rødt representerer de siste brønnene som inneholdt parasitter per replikat. (B) Parasittbelastning i gjenvunnet fotputevev av C57BL/6 mus infisert med 106 rensede metasykliske l. amazonensis villtype (La-WT) og L. amazonensis LIR1 knockout (La-LIR1-/-) bestemt 73 dager etterinfeksjon. Dataene representerer gjennomsnittet av parasittbelastningen per mg vev fra fem forskjellige mus i hver gruppe (tilpasset fra Laranjeira-Silva et al.14). Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Supplementary Figure 1
Tilleggstall Figur 1: Hudsår som et tegn på en sekundær infeksjon. Representative bilder av C57BL/6 mus fotputer infisert med L. amazonensis vill type (La-WT) tatt 80 dager etterinfeksjon. Røde piler peker på tegn på sårdannelse, noe som indikerer at eksperimentet skal avsluttes. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Supplementary Figure 2
Supplerende figur 2: Rollen til LIR1 på in vivo lesjonsutvikling og intracellulær parasittreplikasjon. C57BL/6 mus ble vaksinert i venstre bakfotpute med 106 rensede metasykliske l. amazonensis villtype (La-WT), L. amazonensis LIR1 knockout (La-LIR1-/-), og L. amazonensis LIR1 add-back (La-LIR1AB). (A) Fotpute kutan lesjon progresjon av La-WT, La-LIR1-/-, og La-LIR1AB infiserte mus analysert ukentlig. Dataene representerer gjennomsnittet ± SEM av den infiserte fotblokken trukket av ikke-infisert fotputetykkelse fra fem forskjellige mus i hver gruppe (tilpasset fra Laranjeira-Silva et al.14). (B) Parasittbelastning i gjenvunnet fotputevev fra La-WT, La-LIR1-/-eller La-LIR1AB infiserte mus bestemt 73 dager etterinfeksjon. Dataene representerer gjennomsnittet av parasittbelastningen per mg vev fra fem forskjellige mus i hver gruppe (tilpasset fra Laranjeira-Silva et al.14). Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In vivo infeksjon analyse beskrevet i denne protokollen tillater enhver forsker å evaluere in vivo kutan leishmaniasis vurderer verten-parasitt interaksjon i et systemisk scenario. Disse analysene har blitt brukt av mange grupper22,24,27,29,31,32,34,49 og her vi samlet en trinnvis protokoll for å standardisere denne metoden mens vurderer infrastrukturbegrensninger som noen grupper kan ha. Denne protokollen kan også brukes til å evaluere virulence av transgene Leishmania parasitter ved in vivo bioimaging50,51,52. Som enhver annen eksperimentell prosedyre har denne analysen begrensninger og kritiske skritt for å utføre, for eksempel å kreve opplært personell som er komfortable med å jobbe med mus og har erfaring med å utføre subplantarinjeksjoner for å unngå utilsiktede infeksjoner. Standardisering av protokoller er ekstremt viktig for å unngå partiske resultater og å gi sammenlignbare resultater mellom ulike forskningsgrupper.

Den største fordelen med å bruke L. amazonensis som modell for kutan leishmaniases er fordi fotputelesjonen forårsaket av denne arten lett kan vurderes hos mus. Hevelsen i fotputen bestemmes av metoden som er beskrevet her, representerer summen av to infeksjonfenotyper: vert inflammatorisk respons og parasittreplikasjon. Begge fenotyper kan evalueres separat ved å knytte parasittvevsbelastningsmetoden som gjenspeiler parasittintracellulær replikasjon med bestemmelse av lesjonstykkelsesprogresjonen. En annen fordel er at L. amazonensis' promastigotes er lett dyrket in vitro. Tatt i betraktning disse, kan enhver forskningsgruppe manipulere denne Leishmania-arten i henhold til deres behov. Funnene fra L. amazonensis' studier kan deretter sammenlignes med andre Leishmania arter for å avgjøre om en bestemt vei er evolusjonært bevart eller divergerende21,53,54.

I den naturlige syklusen oppstår Leishmania-overføring til virveldyrverten ved bitt av en infisert sandflue under blodmåltidet. Sandfluen inokulerer vanligvis noen hundre Leishmania metacykliske promastigote former i insektets spytt. I eksperimentelle in vivo infeksjoner, er det hyppigste stedet for inokulasjon dyrets fotpute22. Intradermal injeksjon i øret eller intraperitoneal injeksjon er alternative steder av inokulasjon avhengig av studieformålet fordi hvert nettsted presenterer forskjellige fagocytiske celletyper24,56. Derfor bruker noen forskningsgrupper laboratorieinfiserte sandfluer for å infisere dyrets øredermis for å etterligne den naturlige overføringen56,57,58,59. Denne protokollen presenterer imidlertid noen restriksjoner, for eksempel vedlikehold av sandfluekolonier, som krever fasiliteter som ikke er tilgjengelige for de fleste forskningsgrupper.

Det opprinnelige arbeidet som beskriver in vivo C57BL/6 infeksjon med La-LIR1-/- har brukt renset metasykliske promastigotes former14. Leishmania genetisk manipulasjon kan imidlertid svekke enten promastigotes differensiering i akseamastigotes14 eller i metasykliske infeksiøs former20. Derfor, avhengig av Leishmania-stammen, bør forskeren bestemme den mest tilstrekkelige metoden for å oppnå levedyktige infeksiøs parasittformer for studien. Protokollen av axenic amastigotes differensiert fra promastigote kulturer beskrevet her kan være et enklere alternativ, produsere sammenlignbare resultater i mange tilfeller19,20,35,37,38,64. Denne tilnærmingen unngår bruk av andre metoder som vanligvis resulterer i lavere utbytter av infeksive parasitter, for eksempel inkubering av promastigotes med spesifikke, men ikke allment tilgjengelige antistoffer65 for metasyklisk promastigoter rensing, eller ved tetthet gradient avhengig av metasykliske LPG uttrykk18,66. Effektiviteten av differensieringsprotokollen kan evalueres ved å bestemme uttrykksnivåene til amastin-familiegener64,67. Amastins er medlemmer av en bevart genfamilie som er differensialmodulert under Leishmania livssyklus68 og er forbundet med parasitt virulence og patogenese67,69,70. Andre markører kan også brukes til å skille amastigote fra promastigote former. For eksempel er gp63 nedregulert i amastigotes, fordi dens rolle er å beskytte promastigotes fra insektets fordøyelsesenzymer71.

Valget av musen belastning er et annet kritisk skritt som skal vurderes når du utvikler en standardisert in vivo infeksjon protokoll. Mottakelighet og resistens mot Leishmania infeksjon hos mus er hovedsakelig regulert av genetisk bakgrunn29,30,55. I denne protokollen ble C57BL/6-stammen valgt fordi immunresponsen mot L. amazonensis er nært knyttet til blandet Th1-Th2-respons hos mennesker72,73. Eksperimentelle murine infeksjoner med L. amazonensis har blitt beskrevet for å forårsake moderate lesjoner i C57BL/6 mus i forhold til andre mus stammer28,34,74. Men avhengig av parasittstammen, er forskjeller i lesjonsstørrelsen bare påviselige i følsomme musstammer, som BALB / c36. Tidsforløpet må også vurderes og korrelerer med de valgte musenestamme 29,26,60,61,62,63,75. Ulcerated fotputer bør alltid unngås da det kan representere sekundære infeksjoner og observeres ofte i lange perioder med infeksjon, spesielt i eksperimenter med mottakelige musstammer. Å utpeke tiden på dagen for å starte infeksjonen er et annet skritt å bli vurdert. Som vist i tidligere studier med L. amazonensis,påvirker tidspunktet for parasittens inoculum lesjonsutvikling fordi vertsparasittinteraksjonen påvirkes på en circadian måte av pineal-utgitt melatonin i den mørke tiden på dagen75.

Den store ulempen med in vivo infeksjonmetoden er at eksperimentet krever bruk av et betydelig antall laboratoriedyr og tar lengre tid å oppnå endelige resultater sammenlignet med in vitro infeksjon metode18. Dette sistnevnte aspektet kan imidlertid også betraktes som en fordel siden in vivo-resultatene gjenspeiler det naturlige tidsforløpet av sykdomsprogresjon mer nøyaktig enn resultatene som er oppnådd fra in vitro-infeksjon. Enda viktigere, funnene fra L. amazonensis in vivo infeksjon kan ikke bare reflektere forbigående endringer i parasitt virulence, men anerkjenner også systemisk status for verten og alle dens spillere. Derfor, med tanke på de flere faktorene nevnt ovenfor, kan metoden beskrevet i denne protokollen tilpasses for å møte spesifikke eksperimentelle behov for karakterisering av andre mål og behandlinger knyttet til virulence slik at ny innsikt for kutan leishmaniasis kontroll.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Vi vil gjerne takke prof. Dr. Niels Olsen Saraiva Câmara fra Animal Center of the Biomedical Sciences Institute ved Universitetet i São Paulo for støtte og prof. Dr. Silvia Reni Uliana for å gi glassvevsliperen. Dette arbeidet ble støttet av Sao Paulo Research Foundation (FAPESP - MFLS' stipend 2017/23933-3).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well plate Greiner bio-ne 655180 A flat-bottom plate for limiting dilution assay
adenine Sigma A8626 Supplement added to M199 cell culture media
caliper Mitutoyo 700-118-20 A caliper to measure the thickness of footpad
cell culture flask Corning 353014 A 25 cm2 volume cell culture flask to cultivate Leishmania parasite
centrifuge Eppendorf 5804R An equipament used for separating samples based on its density
CO2 incubator 34 °C Thermo Scientific 3110 An incubator for amastigotes differentiation
ethanol Merck K50237083820 A disinfectant for general items
fetal bovine serum Gibco 12657-029 Supplement added to M199 cell culture media
glass tissue grinder tube Thomas Scientific 3431 E04 A tube to collect and disrupt infected footpad tissue
glucose Synth G1008.01.AH Supplement added to M199 cell culture media
GraphPad Prism Software GraphPad A software used to plot the data and calculate statistical significance
hemin Sigma H-2250 Supplement added to M199 cell culture media
HEPES Promega H5303 Supplement added to M199 cell culture media
incubator 25 °C Fanem 347CD An incubator for promastigotes cultivation
inverted microscope Nikon TMS An equipament used to visual analyze the promastigote and amastigote cultures
isoflurane An inhalant anesthetics for mice (3-5%)
laminar flow cabinet Veco VLFS-09 A biosafety cabinet used for aseptical work area
M199 cell culture media Gibco 31100-035 A cell culture media for Leishmania cultivation
microcentrifuge tube Axygen MCT150C A microtube used for sample collection, processing and storage
multichanel pipette Labsystems F61978 A multichannel pipette used for limiting dilution assay
NaHCO3 Merck 6329 Supplement added to M199 cell culture media
NaOH Sigma S8045 Supplement added to M199 cell culture media
Neubauer chamber HBG 2266 A hemocytometer to count the parasite suspension
optical microscope Nikon E200 An optical equipament used to count parasite
parafilm Bemis 349 A flexible and resistant plastic to seal the plate
penicillin/streptomycin Gibco 15140122 Supplement added to M199 cell culture media
Petri dishes TPP 93100 A sterile dish to dissect the footpad tissue
pipetman kit Gilson F167360 A micropipette kit containing four pipettors (P2 P20 P200 P1000)
scale Quimis BG2000 An equipament used to weigh collected footpad lesions
scalpel Solidor 10237580026 A scalpel to cut and collect footpad tissue
serological pipette 10 mL Nest 327001 A sterile pipette used for transfering mililiter volumes
tips Axygen A pipette tip used for transfering microliter volumes
Trypan blue Gibco 15250-061 A dye used to count viable parasites
trypticase peptone Merck Supplement added to M199 cell culture media
tuberculin syringe BD 305945 A syringe with 27G needle to inoculate the parasite suspension

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alvar, J., et al. Leishmaniasis worldwide and global estimates of its incidence. PloS One. 7 (5), e35671 (2012).
  2. Ashford, R. W. The leishmaniases as emerging and reemerging zoonoses. International Journal for Parasitololy. 30 (12-13), 1269-1281 (2000).
  3. Burza, S., Croft, S. L., Boelaert, M. Leishmaniasis. Lancet. 392 (10151), 951-970 (2018).
  4. Scorza, B. M., Carvalho, E. M., Wilson, M. E. Cutaneous Manifestations of Human and Murine Leishmaniasis. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), e1296 (2017).
  5. Afonso, L. C., Scott, P. Immune responses associated with susceptibility of C57BL/10 mice to Leishmania amazonensis. Infection and Immunity. 61 (7), 2952-2959 (1993).
  6. Khamesipour, A., Rafati, S., Davoudi, N., Maboudi, F., Modabber, F. Leishmaniasis vaccine candidates for development: a global overview. Indian Journal of Medical Research. 123 (3), 423-438 (2006).
  7. Kumar, R., Engwerda, C. Vaccines to prevent leishmaniasis. Clinical & Translational Immunology. 3 (3), e13 (2014).
  8. Murray, H. W., Berman, J. D., Davies, C. R., Saravia, N. G. Advances in leishmaniasis. Lancet. 366 (9496), 1561-1577 (2005).
  9. Hotez, P. J., Bottazzi, M. E., Franco-Paredes, C., Ault, S. K., Periago, M. R. The neglected tropical diseases of Latin America and the Caribbean: a review of disease burden and distribution and a roadmap for control and elimination. PLoS Neglected Tropical Diseases. 2 (9), e300 (2008).
  10. Croft, S. L., Sundar, S., Fairlamb, A. H. Drug resistance in leishmaniasis. Clinical Microbiology Reviews. 19 (1), 111-126 (2006).
  11. Ponte-Sucre, A., et al. Drug resistance and treatment failure in leishmaniasis: A 21st century challenge. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (12), e0006052 (2017).
  12. Teixeira, D. E., et al. The cell biology of Leishmania: how to teach using animations. PLoS Pathogens. 9 (10), e1003594 (2013).
  13. Sunter, J., Gull, K. Shape, form, function and Leishmania pathogenicity: from textbook descriptions to biological understanding. Open Biology Journal. 7 (9), 170165 (2017).
  14. Laranjeira-Silva, M. F., et al. A MFS-like plasma membrane transporter required for Leishmania virulence protects the parasites from iron toxicity. PLoS Pathogens. 14 (6), e1007140 (2018).
  15. Aoki, J. I., et al. L-arginine availability and arginase activity: Characterization of amino acid permease 3 in Leishmania amazonensis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (10), e0006025 (2017).
  16. Probst, C. M., et al. A comparison of two distinct murine macrophage gene expression profiles in response to Leishmania amazonensis infection. BMC Microbiology. 12, 22 (2012).
  17. Dillon, L. A., et al. Simultaneous transcriptional profiling of Leishmania major and its murine macrophage host cell reveals insights into host-pathogen interactions. BMC Genomics. 16, 1108 (2015).
  18. Sarkar, A., Khan, Y. A., Laranjeira-Silva, M. F., Andrews, N. W., Mittra, B. Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites. Journal of Visualized Experiments. (133), e57486 (2018).
  19. Mittra, B., Laranjeira-Silva, M. F., Miguel, D. C., Perrone Bezerra de Menezes, J., Andrews, N. W. The iron-dependent mitochondrial superoxide dismutase SODA promotes. The Journal of Biological Chemistry. 292 (29), 12324-12338 (2017).
  20. Flannery, A. R., Huynh, C., Mittra, B., Mortara, R. A., Andrews, N. W. LFR1 ferric iron reductase of Leishmania amazonensis is essential for the generation of infective parasite forms. The Journal of Biological Chemistry. 286 (26), 23266-23279 (2011).
  21. Laranjeira-Silva, M. F., Zampieri, R. A., Muxel, S. M., Beverley, S. M., Floeter-Winter, L. M. Leishmania amazonensis arginase compartmentalization in the glycosome is important for parasite infectivity. PloS One. 7 (3), e34022 (2012).
  22. Sacks, D. L., Melby, P. C. Animal models for the analysis of immune responses to leishmaniasis. Current Protocols in Immunology. , (1998).
  23. Andersen, M. L., Winter, L. M. F. Animal models in biological and biomedical research - experimental and ethical concerns. Anais da Academia Brasileira de Ciências. 91, e20170238 (2019).
  24. Ribeiro-Gomes, F. L., et al. Site-dependent recruitment of inflammatory cells determines the effective dose of Leishmania major. Infection and Immunity. 82 (7), 2713-2727 (2014).
  25. Mahmoudzadeh-Niknam, H., Khalili, G., Abrishami, F., Najafy, A., Khaze, V. The route of Leishmania tropica infection determines disease outcome and protection against Leishmania major in BALB/c mice. The Korean Journal of Parasitology. 51 (1), 69-74 (2013).
  26. Oliveira, D. M., et al. Evaluation of parasitological and immunological parameters of Leishmania chagasi infection in BALB/c mice using different doses and routes of inoculation of parasites. Parasitology Research. 110 (3), 1277-1285 (2012).
  27. Côrtes, D. F., et al. Low and high-dose intradermal infection with Leishmania major and Leishmania amazonensis in C57BL/6 mice. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 105 (6), 736-745 (2010).
  28. Blackwell, J. M., et al. Genetics and visceral leishmaniasis: of mice and man. Parasite Immunology. 31 (5), 254-266 (2009).
  29. Loeuillet, C., Bañuls, A. L., Hide, M. Study of Leishmania pathogenesis in mice: experimental considerations. Parasites & Vectors. 9, 144 (2016).
  30. Alexander, J., Brombacher, F. T Helper1/T Helper2 Cells and Resistance/Susceptibility to Leishmania Infection: Is This Paradigm Still Relevant? Frontiers in Immunology. 3, 80 (2012).
  31. Sacks, D., Noben-Trauth, N. The immunology of susceptibility and resistance to Leishmania major in mice. Nature Reviews Immunology. 2 (11), 845-858 (2002).
  32. Bogdan, C., et al. Experimental Cutaneous Leishmaniasis: Mouse Models for Resolution of Inflammation Versus Chronicity of Disease. Methods in Molecular Biology. 1971, 315-349 (2019).
  33. Jones, D. E., Ackermann, M. R., Wille, U., Hunter, C. A., Scott, P. Early enhanced Th1 response after Leishmania amazonensis infection of C57BL/6 interleukin-10-deficient mice does not lead to resolution of infection. Infection and Immunity. 70 (4), 2151-2158 (2002).
  34. Velasquez, L. G., et al. Distinct courses of infection with Leishmania (L.) amazonensis are observed in BALB/c, BALB/c nude and C57BL/6 mice. Parasitology. 143 (6), 692-703 (2016).
  35. de Menezes, J. P., et al. Leishmania infection inhibits macrophage motility by altering F-actin dynamics and the expression of adhesion complex proteins. Cellular Microbiology. 19 (3), 1266 (2017).
  36. Mittra, B., et al. A Trypanosomatid Iron Transporter that Regulates Mitochondrial Function Is Required for Leishmania amazonensis Virulence. PLoS Pathogens. 12 (1), e1005340 (2016).
  37. Zilberstein, D., Nitzan Koren, R. Host-Free Systems for Differentiation of Axenic Leishmania. Methods in Molecular Biology. 1971, 1-8 (2019).
  38. Zilberstein, D., Shapira, M. The role of pH and temperature in the development of Leishmania parasites. Annual Review of Microbiology. 48, 449-470 (1994).
  39. Dumetz, F., et al. Modulation of Aneuploidy in Leishmania donovani during adaptation to different in vitro and in vivo environments and its impact on gene expression. MBio. 8 (3), e00599-e00517 (2017).
  40. Sinha, R., et al. Genome Plasticity in Cultured Leishmania donovani: Comparison of Early and Late Passages. Frontiers in Microbiology. 9, 1279 (2018).
  41. Magalhães, R. D., et al. Identification of differentially expressed proteins from Leishmania amazonensis associated with the loss of virulence of the parasites. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (4), e2764 (2014).
  42. Lei, S. M., Romine, N. M., Beetham, J. K. Population changes in Leishmania chagasi promastigote developmental stages due to serial passage. Journal of Parasitology. 96 (6), 1134-1138 (2010).
  43. Ali, K. S., Rees, R. C., Terrell-Nield, C., Ali, S. A. Virulence loss and amastigote transformation failure determine host cell responses to Leishmania mexicana. Parasite Immunology. 35 (12), 441-456 (2013).
  44. Rebello, K. M., et al. Leishmania (Viannia) braziliensis: influence of successive in vitro cultivation on the expression of promastigote proteinases. Experimental Parasitology. 126 (4), 570-576 (2010).
  45. Johns Hopkins Animal Care and Use Program. , The Johns Hopkins University Animal Care and Use Committee. http://web.jhu.edu/animalcare/index.html (2019).
  46. Titus, R. G., Marchand, M., Boon, T., Louis, J. A. A limiting dilution assay for quantifying Leishmania major in tissues of infected mice. Parasite Immunology. 7 (5), 545-555 (1985).
  47. Lima, H. C., Bleyenberg, J. A., Titus, R. G. A simple method for quantifying Leishmania in tissues of infected animals. Parasitology Today. 13 (2), 80-82 (1997).
  48. Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. , (1997).
  49. Sacks, D., Kamhawi, S. Molecular aspects of parasite-vector and vector-host interactions in leishmaniasis. Annual Review of Microbiology. 55, 453-483 (2001).
  50. Reimão, J. Q., et al. Parasite burden in Leishmania (Leishmania) amazonensis-infected mice: validation of luciferase as a quantitative tool. Journal of Microbiological Methods. 93 (2), 95-101 (2013).
  51. Buckley, S. M., et al. In vivo bioimaging with tissue-specific transcription factor activated luciferase reporters. Scientific Reports. 5, 11842 (2015).
  52. Thalhofer, C. J., et al. In vivo imaging of transgenic Leishmania parasites in a live host. Journal of Visualized Experiments. (41), e1980 (2010).
  53. Roberts, S. C., et al. Arginase plays a pivotal role in polyamine precursor metabolism in Leishmania. Characterization of gene deletion mutants. The Journal of Biological Chemistry. 279 (22), 23668-23678 (2004).
  54. Boitz, J. M., et al. Arginase Is Essential for Survival of Leishmania donovani Promastigotes but Not Intracellular Amastigotes. Infection and Immunity. 85 (1), e00554 (2017).
  55. Rosas, L. E., et al. Genetic background influences immune responses and disease outcome of cutaneous L. mexicana infection in mice. International Immunology. 17 (10), 1347-1357 (2005).
  56. Belkaid, Y., et al. Development of a natural model of cutaneous leishmaniasis: powerful effects of vector saliva and saliva preexposure on the long-term outcome of Leishmania major infection in the mouse ear dermis. Journal of Experimental Medicine. 188 (10), 1941-1953 (1998).
  57. Titus, R. G., Ribeiro, J. M. Salivary gland lysates from the sand fly Lutzomyia longipalpis enhance Leishmania infectivity. Science. 239 (4845), 1306-1308 (1988).
  58. Lima, H. C., Titus, R. G. Effects of sand fly vector saliva on development of cutaneous lesions and the immune response to Leishmania braziliensis in BALB/c mice. Infection and Immunity. 64 (12), 5442-5445 (1996).
  59. Theodos, C. M., Ribeiro, J. M., Titus, R. G. Analysis of enhancing effect of sand fly saliva on Leishmania infection in mice. Infection and Immunity. 59 (5), 1592-1598 (1991).
  60. Kaur, S., et al. Effect of dose and route of inoculation on the generation of CD4+ Th1/Th2 type of immune response in murine visceral leishmaniasis. Parasitology Research. 103 (6), 1413-1419 (2008).
  61. Rolão, N., Melo, C., Campino, L. Influence of the inoculation route in BALB/c mice infected by Leishmania infantum. Acta Tropica. 90 (1), 123-126 (2004).
  62. Kébaïer, C., Louzir, H., Chenik, M., Ben Salah, A., Dellagi, K. Heterogeneity of wild Leishmania major isolates in experimental murine pathogenicity and specific immune response. Infection and Immunity. 69 (8), 4906-4915 (2001).
  63. Baldwin, T. M., Elso, C., Curtis, J., Buckingham, L., Handman, E. The site of Leishmania major infection determines disease severity and immune responses. Infection and Immunity. 71 (12), 6830-6834 (2003).
  64. Aoki, J. I., et al. RNA-seq transcriptional profiling of Leishmania amazonensis reveals an arginase-dependent gene expression regulation. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (10), e0006026 (2017).
  65. Pinto-da-Silva, L. H., et al. The 3A1-La monoclonal antibody reveals key features of Leishmania (L) amazonensis metacyclic promastigotes and inhibits procyclics attachment to the sand fly midgut. International Journal for Parasitology. 35 (7), 757-764 (2005).
  66. Spath, G. F., Beverley, S. M. A lipophosphoglycan-independent method for isolation of infective Leishmania metacyclic promastigotes by density gradient centrifugation. Experimental Parasitology. 99 (2), 97-103 (2001).
  67. Aoki, J. I., Laranjeira-Silva, M. F., Muxel, S. M., Floeter-Winter, L. M. The impact of arginase activity on virulence factors of Leishmania amazonensis. Current Opinion in Microbiology. 52, 110-115 (2019).
  68. Jackson, A. P. The evolution of amastin surface glycoproteins in trypanosomatid parasites. Molecular Biology and Evolution. 27 (1), 33-45 (2010).
  69. Rochette, A., et al. Characterization and developmental gene regulation of a large gene family encoding amastin surface proteins in Leishmania spp. Molecular and Biochemical Parasitology. 140 (2), 205-220 (2005).
  70. Rochette, A., Raymond, F., Corbeil, J., Ouellette, M., Papadopoulou, B. Whole-genome comparative RNA expression profiling of axenic and intracellular amastigote forms of Leishmania infantum. Molecular and Biochemical Parasitology. 165 (1), 32-47 (2009).
  71. Schneider, P., Rosat, J. P., Bouvier, J., Louis, J., Bordier, C. Leishmania major: differential regulation of the surface metalloprotease in amastigote and promastigote stages. Experimental Parasitology. 75 (2), 196-206 (1992).
  72. Ji, J., Sun, J., Qi, H., Soong, L. Analysis of T helper cell responses during infection with Leishmania amazonensis. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 66 (4), 338-345 (2002).
  73. Ji, J., Sun, J., Soong, L. Impaired expression of inflammatory cytokines and chemokines at early stages of infection with Leishmania amazonensis. Infection and Immunity. 71 (8), 4278-4288 (2003).
  74. Felizardo, T. C., Toma, L. S., Borges, N. B., Lima, G. M., Abrahamsohn, I. A. Leishmania (Leishmania) amazonensis infection and dissemination in mice inoculated with stationary-phase or with purified metacyclic promastigotes. Parasitology. 134 (12), 1699-1707 (2007).
  75. Laranjeira-Silva, M. F., Zampieri, R. A., Muxel, S. M., Floeter-Winter, L. M., Markus, R. P. Melatonin attenuates Leishmania (L.) amazonensis infection by modulating arginine metabolism. Journal of Pineal Research. 59 (4), 478-487 (2015).

Tags

Immunologi og infeksjon Utgave 156 C57BL/6 mus betennelsesrespons parasittbelastning lesjonsutvikling kutan infeksjon aksenisk amastigoter
In Vivo Infeksjon med <em>Leishmania amazonensis</em> å evaluere parasitt virulens hos mus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Aoki, J. I., Hong, A., Zampieri, R.… More

Aoki, J. I., Hong, A., Zampieri, R. A., Floeter-Winter, L. M., Laranjeira-Silva, M. F. In Vivo Infection with Leishmania amazonensis to Evaluate Parasite Virulence in Mice. J. Vis. Exp. (156), e60617, doi:10.3791/60617 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter