Summary
Aqui, apresentamos um protocolo compilado para avaliar a infecção cutânea de camundongos com Leishmania amazonensis. Este é um método confiável para estudar a virulência parasite, permitindo uma visão sistêmica da resposta do hospedeiro vertebrado à infecção.
Abstract
Leishmania spp. são parasitas protozoários que causam leishmanioses, doenças que apresentam um amplo espectro de manifestações clínicas, desde lesões cutâneas até viscerais. Atualmente, estima-se que 12 milhões de pessoas estejam infectadas pela Leishmania em todo o mundo e mais de 1 bilhão de pessoas vivem em risco de infecção. A leishmania amazonensis é endêmica na América Central e do Sul e geralmente leva à forma cutânea da doença, que pode ser diretamente visualizada em um modelo animal. Portanto, as cepas de L. amazonensis são bons modelos para estudos de leishmaniose cutânea, pois também são facilmente cultivados in vitro. Camundongos C57BL/6 imitam a progressão da doença orientada por L. amazonensisobservada em humanos e são consideradas um dos melhores modelode cepas de camundongos para leishmaniose cutânea. No hospedeiro vertebrado, esses parasitas habitam macrófagos apesar dos mecanismos de defesa dessas células. Diversos estudos utilizam ensaios de infecção por macrófagos in vitro para avaliar a infectividade do parasita em diferentes condições. No entanto, a abordagem in vitro limita-se a um sistema celular isolado que desconsidera a resposta do organismo. Aqui, compilamos um método de infecção por murina in vivo que fornece uma visão geral fisiológica sistêmica da interação hospedeiro-parasita. O protocolo detalhado para a infecção in vivo de camundongos C57BL/6 com L. amazonensis compreende diferenciação parasite em amastigotes infecciosos, inoculação cutânea do pé de camundongos, desenvolvimento de lesões e determinação de carga parasite. Propomos esse método bem estabelecido como o método mais adequado para estudos fisiológicos das respostas imunes e metabólicas do hospedeiro à leishmaniose cutânea.
Introduction
Os leishmanioses são doenças infecciosas parasitárias predominantes mundialmente representando desafios importantes nos países em desenvolvimento e são reconhecidas como uma das doenças tropicais negligenciadas mais importantes pela Organização Mundial da Saúde1,2. Os leishmanioses são caracterizados por manifestações cutâneas, mucosas e/ou viscerais. Leishmaniose cutânea geralmente é causada por L. amazonensis, L. mexicana, L. braziliensis, L. guyanensis, L. major, L. tropica e L. aethiopica3. Esta forma da doença é muitas vezes auto-curativa em humanos devido à indução da resposta imune celular protetora. No entanto, a resposta imune celular pode falhar, e a doença pode progredir para a leishmaniose cutânea disseminada4,5. Não há vacina disponível devido à diversidade entre espécies de Leishmania e hospedam origens genéticas6,7. As opções de tratamento também são limitadas, pois a maioria dos medicamentos disponíveis atualmente são caros, tóxicos e/ou podem exigir tratamento de longo prazo8,9. Além disso, houve relatos de resistência medicamentosa contra os tratamentos disponíveis10,11.
O agente causal da leishmaniose é o parasita protozoário Leishmania. O parasita apresenta duas formas morfológicas distintas em seu ciclo de vida: promastigotes, a forma flagelada encontrada em moscas de areia; e amastigotes, a forma intracelular encontrada nos vacuoles parasitophorosos dos macrófagos hospedeiros de mamíferos12,13. A capacidade dos amastigotes de invadir, sobreviver e replicar apesar dos mecanismos de defesa dos macrófagos do hospedeiro vertebrado estão sujeitas a muitos estudos14,15,16,17. Consequentemente, vários grupos de pesquisa têm descrito ensaios de infecção por macrófagos in vitro para avaliar o impacto de fatores ambientais específicos, bem como genes parasitas e hospedeiros na infectividade do parasita. Este ensaio apresenta várias vantagens, como a capacidade de adaptar estudos a um formato de alto desempenho, período de tempo relativamente menor para obter resultados, e número reduzido de animais de laboratório sacrificados18. No entanto, os achados dos ensaios in vitro são limitados porque nem sempre se replicam nos estudos vivo14,19,20,21. Em ensaios vivos fornecem uma visão geral fisiológica sistêmica da interação host-parasita, que não pode ser totalmente imitada por ensaios in vitro. Por exemplo, estudos imunológicos podem ser realizados através de ensaios imunohistoquímicos de seções de tecido de pisque coletados ou até mesmo de linfonodos popliteis para análise das células imunes recuperadas22.
Os animais são frequentemente usados como modelo para doenças humanas em pesquisas biológicas e biomédicas para entender melhor os mecanismos fisiológicos subjacentes das doenças23. No caso da leishmaniose, a rota, local ou dose de inoculação influenciam o desfecho da doença24,25,26,27. Além disso, a suscetibilidade e a resistência à infecção em humanos e camundongos são altamente reguladas pelos antecedentes genéticos do hospedeiro e parasita4,5,22,28,29,30,31. Os camundongos BALB/c são altamente suscetíveis à infecção cutânea de L. amazonensis, mostrando uma rápida progressão da doença com a disseminação dos parasitas para os linfonodos, baço e fígado32. Como a doença pode progredir para metástases cutâneas, a infecção pode ser fatal. Em contraste, os camundongos C57BL/6 geralmente desenvolvem lesões crônicas com cargas de parasitas persistentes em ensaios de infecção por L. amazonensis 33. Assim, a infecção por L. amazonensis com essa espécie de camundongos em particular tem sido considerada um excelente modelo para estudar formas crônicas de leishmaniose cutânea em humanos, pois imita melhor a progressão da doença do que o modelo de infecção por camundongos BALB/C5,34.
Por isso, propomos que a murina na infecção vivo seja um método útil para estudos fisiológicos de virilidade leishmania aplicáveis à doença humana, permitindo uma visão sistêmica da interação hospedeiro-parasita. Revisitando ensaios bem estabelecidos22,apresentamos aqui um protocolo compilado passo a passo da infecção in vivo de camundongos C57BL/6 com L. amazonensis que compreende a diferenciação parasita em amastigotes axenic, ambulatora cutânea cutânea cutânea, desenvolvimento de lesões e determinação de carga parasite. Este protocolo pode ser adaptado a outras cepas de camundongos e espécies de Leishmania que causam leishmanioses cutâneas. Em conclusão, o método aqui apresentado é crucial para identificar novas metas e vacinasanti-Leishmania, bem como em estudos fisiológicos das respostas imunes e metabólicas do hospedeiro à infecção por Leishmania.
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Protocol
Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Instituto de Biociência da Universidade de São Paulo (CEUA 342/2019), e foram conduzidos de acordo com as recomendações e as políticas de Cuidado e Uso de Animais Laboratoriais do Estado de São Paulo (Lei Estadual 11.977, lei Estadual 11.977, de 25/08/2005) e do governo brasileiro (Lei Federal 11.794, de 08/10/2008). Todas as etapas descritas nas seções 1-5 devem ser realizadas de forma asséptica dentro de armários de fluxo laminar. Os equipamentos de proteção individual devem ser utilizados durante o manuseio de parasitas leishmania vivos.
1. Diferenciação In Vitro de L. amazonensis Promastigotes em Amastigotes Axenic15,20,35,36,37,38
NOTA: L. amazonensis (MHOM/BR/1973/M2269) (La) parasita foi usado neste ensaio. Dependendo do propósito do estudo, a forma de parasita infecciosa pode ser obtida seja pela purificação da forma metacíclica utilizando um gradiente de densidade, como descrito anteriormente14, ou por diferenciação de promastigotes em amastigotes axenic, de acordo com o seguinte protocolo.
- Grow La promastigotes em um frasco de cultura celular de 25 cm2 contendo 10 mL de médio para promastigotes (pro-médio) (pH = 7,0).
- Incubar a 25 °C por 3 dias.
NOTA: Use culturas promastigotas que foram periciadas in vitro menos de 10x para evitar a perda de virulência e alterações aneuploidy de parasitas39,40,41,42,43,44. - Pipette 5 mL de cultura promastigote fase de crescimento logarítmico em um novo frasco de 25 cm2.
- Adicione 5 mL de média para amastigotes axenic (ama-médio) (pH = 5,2).
- Incubar a 34 °C por 3-4 dias.
- Divida a cultura diluindo com ama-médio a uma proporção de 1:3 em um novo frasco de 25 cm2.
- Incubar a 34 °C por 3-5 dias.
NOTA: Incubar os amastigotes axenic por até 5 dias, pois representa o fim do amadurecimento37.
2. Infecção por Pé c57BL/6 com L. amazonensis
NOTA: Camundongos C57BL/6 femininos (6 a 8 semanas) foram obtidos e mantidos no Centro Animal do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo. Os animais receberam comida e água ad libitum.
- Conte a cultura dos amastigotes axenic transferindo uma alíquota da suspensão do parasita diluída na PBS para uma câmara de Neubauer (ou seja, hemocímetro). Conte os parasitas não flagrados, que representam formas de amastigotes.
NOTA: Alternativamente, o Trypan azul (1:1) pode ser usado para contar o número de amastigotes viáveis (ou seja, aqueles que não estão manchados com azul Trypan). - Diluir os amastigotes axenic em PBS de acordo com a dose inólquia desejada e o número de inóculos pretendidos (1 x 106 amastigotes axenic em 50 μL de PBS é recomendado).
- Carregue uma seringa de tubécula com uma agulha de 27 G com a suspensão preparada do parasita.
- Anestesiar um mouse C57BL/6 usando 3-5% isoflurane, conforme recomendado pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Johns Hopkins45. Avalie a profundidade anestéstica testando a resposta do mouse a uma pitada de dedo do dedo do dodo do dedo do dodo do dedo do dodo do dedo.
- Inocular 50 μL da suspensão de parasitas homogeneizada (1 x 106 amastigotes axenic ou a dose inólmétrica desejada) no tecido subplantar do footpad traseiro esquerdo, utilizando a seringa de tubéculina previamente carregada (passo 2.3).
3. Desenvolvimento de Lesões de Pé de Rato
- Meça a progressão da lesão uma vez por semana medindo a espessura das pastilhas esquerda (infectada) e direita (não infectada) usando uma pinça.
- Calcule a diferença da espessura entre os peões traseiros esquerdo e direito semanalmente para avaliar a progressão da lesão.
- Traçar as diferenças calculadas sobre o eixo Y e o tempo de infecção no eixo X e calcular o significado estatístico.
NOTA: De acordo com as recomendações dos Comitês de Cuidados e Uso de Animais, os animais devem ser sacrificados antes que a lesão infectada se torne ulcerada, pois úlceras cutâneas podem levar à infecção secundária. Como mostrado na Figura Complementar 1,leva aproximadamente 10 semanas para as lesões apresentarem sinais de ulceração com a dose de parasita (106 amastigotes axenic) e cepa hospedeira (C57BL/6) utilizadaneste protocolo. Os camundongos devem ser sacrificados para extração de lesões antes que os sinais de ulceração sejam observados.
4. Extração de Lesão de Pé de Camundongos e Diluição limitante do parasita
- Prepare uma placa de 96 poços (fundo plano) para o ensaio de diluição limitante46,47 adicionando 180 μL de pró-médio a todos os poços.
NOTA: Use quatro faixas de placa (metade da placa) para cada animal, representando ensaios quadruplicates (ou seja, animal 1 = faixas A-D; animal 2 = faixas E-H). - Adicione 1 mL de pró-médio em um tubo moedor de tecido de vidro por lesão e pesar o tubo.
NOTA: O tubo deve ser mantido estéril, por isso use uma tampa estéril e pese o tubo com a tampa fechada, se pesar fora do armário de fluxo laminar. - Sacrifique o animal em uma câmara de CO2, seguindo as recomendações dos Comitês de Cuidados e Uso de Animais. Desinfete o animal pulverizando com 70% de etanol.
- Excir o pé do animal para extrair o footpad infectado e pulverizar 70% de etanol no footpad para desinfecção. Certifique-se de esterilização de tesouras e fórceps mantendo-as encharcadas em 70% de etanol.
- Coloque o footpad infectado em uma placa de Petri estéril e disseque usando fórceps estéreis e um bisturi para coletar todos os tecidos moles. Descarte os ossos.
NOTA: Recomenda-se uniformidade na etapa de dissecção para evitar a recuperação do tecido tendencioso. - Transfira os tecidos coletados para o tubo moedor de tecido de vidro com pró-médio e, em seguida, pese o tubo novamente para determinar o peso da lesão.
NOTA: Evite colocar os fórceps e bisturi diretamente no meio, pois pequenos volumes podem ser removidos, resultando em um peso tecido subestimado. O peso da lesão é calculado subtraindo o peso do tubo contendo pró-médio com o tecido coletado do peso do tubo contendo apenas pró-médio. - Homogeneize o tecido de 10x usando o moedor para interrupção completa do tecido.
- Deixe a mistura sedimentar por 10 min, depois cole 20 μL do supernatante.
- Carregue 20 μL do supernatant na1ª coluna da1ª pista da placa de poço 96 preparada na etapa 4.1. Repita isso para as próximas três pistas para ter quadruplicatos para cada animal (ou seja, para animal 1 adicionar 20 μL a cada poço e rotular A1, B1, C1 e D1).
- Homogeneize cada poço na1ª coluna 10x usando uma pipeta multicanal. Em seguida, transfira 20 μL das amostras diluídas da1ª coluna para acoluna 2.
NOTA: É importante homogeneizar cada poço de 10x de uma coluna para outra. - Repita a etapa 4.10 para todas as colunas restantes até a última coluna(12)e descarte os 20 μL finais de amostra diluída.
NOTA: Altere as dicas após cada diluição para evitar contaminação cruzada. - Selar as placas com um filme e incubar a 25 °C por 7 dias em uma câmara úmida.
5. Determinação de carga de parasitas de lesão
- Analise as placas após 7 dias de incubação usando um microscópio invertido para determinar o último poço contendo parasitas para cada pista.
NOTA: Também é possível ter uma indicação do crescimento dos parasitas, ou densidade celular, por análise visual das mudanças de cor e turbidez do meio. - Calcule a carga de tecido parasita para cada pista dividindo o fator de diluição por peso de lesão.
NOTA: Em uma pista específica, se os parasitas estiverem presentes apenas nas colunas 1-5 (ou seja, os poços A1-A5 são positivos para o crescimento do parasita), isso significa que a coluna 5 continha apenas 1 parasita, a coluna 4 continha 10 parasitas, e assim por diante, em múltiplos de dez. A coluna 1 conteria 104 parasitas, o que representa o número de parasitas nos 20 μL iniciais de supernatant (a amostra não diluída na etapa 4.7). Como este 20 μL foi diluído com 180 μL de pró-médio, o tubo inicial continha 5 x 105 parasitas: (1 x 104) / (0,02 mL) = 5 x 105 parasitas/1 mL. Em seguida, a carga de parasitas nessa lesão pode ser calculada dividindo a concentração inicial do parasita pelo peso da lesão: (5 x 105) / peso da lesão (ver passo 4.6). - Traçar a média do resultado quadruplicado para cada animal com uma escala Y log.
6. Análise Estatística
- Represente os dados como um desvio padrão ± médio usando pelo menos cinco animais por grupo experimental como replica.
- Realizar análiseestatística utilizando teste de duas caudas não emparelhado, considerando um valor p < 0,05 como significativo.
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Representative Results
Parasitas protozoários de leishmania existem em duas formas de desenvolvimento durante seu ciclo de vida em hospedeiros invertebrados e vertebrados: promastigotes, as formas proliferativas encontradas no lúmen da sandfly fêmea; e amastigotes, as formas proliferativas encontradas nos vacúrios parasitophorosos das células hospedeiras dos mamíferos. Os promastigotes têm um corpo alongado de aproximadamente 1,5 μm de largura e 20 μm de comprimento, com um flagellum tipicamente emergindo da extremidade anterior. Os amastigotes possuem um corpo arredondado ou ovoid variando de 2 a 6 μm de comprimento e 1,5-3 μm de largura, e possuem um flagellum aparente12,13 (Figura 1A). Durante a refeição sanguínea, o hospedeiro invertebrado, um inseto hematófago da família Psicodidae, adquire macrófagos infectados com amastigotes leishmania. Uma vez que essas células atingem o tubo digestivo de sandfly, os amastigotes são liberados e diferenciam-se para promastigotes procíclicos (Figura 1A). Essas formas não são infecciosas e se multiplicam intensamente pela divisão binária e colonizam o tubo digestivo do vetor de insetos. As formas procíclicas então se diferenciam para formas metacíclicas, uma forma infecciosa e rápida, apresentando um corpo mais fino e flagellum alongado(Figura 1A). As formas metacíclicas invadem as porções anteriores do esôfago e proventéculo da sandfly, de modo que durante sua próxima refeição de sangue, a regurgitação garante a inoculação dessas formas infectantes em um novo hospedeiro vertebrado. No tegument do hospedeiro vertebrado, os parasitas são fagocytosed pelos macrófagos e diferenciam-se em amastigotes dentro dos vacuoles parasitophorosos, onde os amastigotes se multiplicam por divisão binária e completam o ciclo de vida da Leishmania12,13.
Condições axenicas podem simular diferentes ambientes host in vitro, mantendo a morfologia do parasita e viabilidade. As condições axenic para amastigotes foram previamente descritas simulando o ambiente vacuole parasitophorous de um macrófago e desencadeando diferenciação in vitro de promastigote na forma amastigote37. Essas condições imitam o ambiente ácido (pH = 5,5) e o aumento da temperatura dos hospedeiros vertebrados (34 °C). A Figura 1B ilustra promastigotes diferenciados aos amastigotes mudando essas condições na cultura. A viabilidade desses amastigotes axenic pode ser analisada pela coloração azul Trypan, um método baseado no princípio de que as células vivas possuem membranas intactas que excluem certos corantes, enquanto as células mortas não fazem48. Alternativamente, analisamos a viabilidade dos amastigotes axenic verificando sua capacidade de se transformar em promastigotes quando transferidos para pH neutro e incubados a 25 °C (Figura 1B).
Aqui propomos um método de infecção in vivo para avaliar a virulência de diferentes cepas de Leishmania. A Figura 2A representa um ensaio de infecção in vivo mostrando o desenvolvimento de lesões cutâneas de pegadas c57BL/6 camundongos que foram infectadas com tipo selvagem (La-WT) e Leishmania Iron Regulator 1 knockout(La-LIR1-/-) L. amazonensis purified metacíclics. O LIR1 regula os níveis intracelulares de ferro na Leishmania mediando a exportação de ferro e impedindo seu acúmulo intracelular para níveistóxicos 14. Observando a progressão das diferenças de espessura dos peões infectados versus não infectados, pudemos demonstrar que oscamundongos infectados la -LIR1apresentaram lesões menores do que os camundongos infectados por La-WT(Figura 2A). Esses achados revelaram que o LIR1 é essencial para l. amazonensis em viulência vivo. Isso demonstra a importância e a eficácia desse método na avaliação das diferenças das doenças cutâneas orientadas pela Leishmania. A Figura 2B ilustra os pés não infectados (à direita) e infectados (esquerda) e o desenvolvimento de lesões 73 dias após a infecção, mostrando as diferenças no inchaço e na progressão da lesão de camundongos infectados por La-WTe La-LIR1./- infecciosos infectados.
A progressão da infecção pela Leishmania consiste não apenas no desenvolvimento da lesão, o que representa a resposta inflamatória, mas também a replicação intracelular do parasita. Para avaliar a replicação do parasita, a carga de parasitas das lesões foi determinada pela extração da lesão infectada, seguida por um ensaio de diluição limitante em uma placa de 96 poços (Figura 3A). A Figura 3B mostra a análise da carga do parasita das lesões do példeiro de La-WTe La-LIR1-/- camundongos infectados após 73 dias de infecção. A partir do ensaio de diluição limitante, detectamos 106-vezes menos parasitas na lesão dos camundongos infectados La-LIR1-/- infectados em comparação com la-WT, revelando que a ausência de LIR1 previne a replicação intracelular dos amastigotes14.
Uma das vantagens de avaliar tanto o desenvolvimento da lesão quanto a carga parasite é detectar possíveis diferenças de replicação intracelular parasita e a resposta inflamatória do hospedeiro. Observamos diferenças entre esses dois fenótipos usando o lIR1 adicionado (La-LIR1AB), que é o La-LIR1-/- com o LIR1 ORF integrado de volta ao lócus ribossômico14. Quando la-LIR1AB foi injetado no pé de um rato, observamos lesões de tamanho intermediário em comparação com asinfecções la -LIR1-/- e La-WT, mas um notável resgate completo de carga de parasitas do fenótipo La-WT(Figura Suplementar 2). Esses resultados indicam que parasitas La-LIR1AB foram capazes de se replicar como parasitas La-WT em um longo período de infecção ao vivo. No entanto, a resposta inflamatória do camundongo não foi tão exacerbada quanto as infecções por La-WT porque as lesões eram significativamente menores.
Assim, o método aqui descrito mostrou-se essencial para a identificação e caracterização de um fator de virulência L. amazonensis necessário para a replicação intracelular de amastigote bem sucedida e desenvolvimento de lesões cutâneas nos hospedeiros mamíferos.
Figura 1: Morfologia de L. amazonensis promastigotes e amastigotes. (A) Ilustrações das diferentes formas morfológicas da Leishmania: promastigote procíclico, promastigote metacíclico e amastigote. Barra de escala = 2 μm. (B)Imagens de culturas in vitro L. amazonensis. Diferenciação in vitro de promastigotes em amastigotes axenic, e de amastigotes axenic de volta aos promastigotes mudando o pH e as condições de temperatura, como descrito no protocolo passo-a-passo. As fotos foram tiradas usando um microscópio invertido. Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 2: Nocaute lIR1 reduz significativamente L. amazonensis no desenvolvimento de lesões ao vivo. Os ratos C57BL/6 foram inoculados no pé traseiro esquerdo com 106 metacíclicos purificados de L. amazonensis tipo selvagem(La-WT) e L. amazonensis LIR1 knockout (La-LIR1-/-). (A)Progressão cutânea de lesãode La -WT e La-LIR1-/- camundongos infectados analisados semanalmente. Os dados representam a média ± SEM do footpad infectado subtraído pela espessura do footpad não infectado de cinco camundongos diferentes em cada grupo (adaptado de Laranjeira-Silva et al.14). (B) Imagens dos pés não infectados e infectados de La-WT e La-LIR1-/- camundongos infectados mostrando as diferenças no inchaço 73 dias após a infecção (adaptado sem Laranjeira-Silva et al.14). Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 3: Nocaute lIR1 reduz significativamente L. amazonensis em replicação intracelular vivo. (A) Uma ilustração de uma placa de poço de 96 representando as diluições em série de 10x dos tecidos de pés recuperados infectados com l. amazonensis tipo selvagem(La-WT) e nocaute LIR1 (La-LIR1-/-). As linhas A-D representam o quadruplica das diluições em série daamostra de lesão la-WT-footpad. As linhas E-H representam o quadruplica das diluições em série da amostra de lesão de la-LIR1-/--footpad. Os diferentes tons de cinza representam as densidades celulares observadas por poço (ou seja, cor mais clara significa menos parasitas). Os poços marcados em vermelho representam os últimos poços que continham parasitas por replicação. (B) Carga parasita em tecidos de footpad recuperados de camundongos C57BL/6 infectados com 106 metacíclicos purificados de L. amazonensis tipo selvagem(La-WT) e L. amazonensis LIR1 knockout(La-LIR1-/-) determinados 73 dias após a infecção. Os dados representam a média da carga de parasitapor mg de tecido de cinco camundongos diferentes em cada grupo (adaptados de Laranjeira-Silva et al.14). Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura Suplementar 1: Úlcera da pele como indicativo de uma infecção secundária. Fotos representativas de pegadas c57BL/6 camundongos infectados com L. amazonensis tipo selvagem(La-WT) tiradas 80 dias após a infecção. As setas vermelhas apontam sinais de ulceração, indicando que o experimento deve ser encerrado. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura Suplementar 2: O papel do LIR1 no desenvolvimento de lesões in vivo e replicação de parasitas intracelulares. Os ratos C57BL/6 foram inoculados no footpad traseiro esquerdo com 106 metacíclicos purificados de L. amazonensis tipo selvagem(La-WT), L. amazonensis LIR1 knockout (La-LIR1-/-), e L. amazonensis LIR1 add-back(La-LIR1AB). (A)Footpad redução de lesão cutânea de La-WT, La-LIR1-/-, e la-LIR1AB infectou camundongos infectados analisados semanalmente. Os dados representam a média ± SEM do footpad infectado subtraído pela espessura do footpad não infectado de cinco camundongos diferentes em cada grupo (adaptado de Laranjeira-Silva et al.14). (B) Carga parasita em tecidos de pés recuperados de La-WT, La-LIR1-/-ou La-LIR1AB infectou camundongos infectados determinaram 73 dias após a infecção. Os dados representam a média da carga de parasitapor mg de tecido de cinco camundongos diferentes em cada grupo (adaptados de Laranjeira-Silva et al.14). Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
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Discussion
O ensaio de infecção in vivo descrito neste protocolo permite que qualquer pesquisador avalie na leishmaniose cutânea vivo considerando a interação hospedeiro-parasita em um cenário sistêmico. Esses ensaios têm sido utilizados por muitos grupos22,24,27,29,31,32,34,49 e aqui compilamos um protocolo passo a passo para padronizar esse método, considerando as limitações de infraestrutura que alguns grupos podem ter. Este protocolo também pode ser usado para avaliar a virulência dos parasitas transgênicos da Leishmania por meio da bioimagem in vivo50,51,52. Como qualquer outro procedimento experimental, este ensaio tem limitações e medidas críticas para serem executadas, como exigir pessoal treinado que se sinta confortável trabalhando com camundongos e ter experiência na realização de injeções subplantarpara evitar infecções acidentais. Padronizar protocolos é extremamente importante para evitar resultados tendenciosos e produzir resultados comparáveis entre diferentes grupos de pesquisa.
A principal vantagem de usar L. amazonensis como modelo para leishmanioses cutâneas é porque a lesão do pé causada por esta espécie pode ser facilmente avaliada em camundongos. O inchaço do footpad determinado pelo método descrito aqui representa a soma de dois fenótipos infectórios: resposta inflamatória hospedeiro e replicação de parasitas. Ambos os fenótipos podem ser avaliados separadamente associando o método de carga de tecido parasita que reflete a replicação intracelular parasita com a determinação da progressão de espessura da lesão. Outra vantagem é que os promastigotes da L. amazonensissão facilmente cultivados in vitro. Considerando isso, qualquer grupo de pesquisa pode manipular essa espécie leishmania de acordo com suas necessidades. Os achados dos estudos de L. amazonensispodem ser então comparados com outras espécies de Leishmania para determinar se um caminho específico é evolutivamente conservado ou divergente21,53,54.
No ciclo natural, a transmissão de Leishmania para o hospedeiro vertebrado ocorre pela mordida de uma mosca de areia infectada durante a refeição sanguínea. A mosca de areia geralmente inocula algumas centenas de formas promastigotas leishmania na saliva do inseto. Em infecções experimentais in vivo, o local mais frequente de inoculação é o footpad22do animal . A injeção intradermal no ouvido ou injeção intraperitoneal são locais alternativos de inoculação dependendo do propósito do estudo, pois cada local apresenta diferentes tipos de células fagócticas24,56. Portanto, alguns grupos de pesquisa usam moscas de areia infectadas em laboratório para infectar a derme do ouvido do animal para imitar a transmissão natural56,57,58,59. No entanto, esse protocolo apresenta algumas restrições, como a manutenção de colônias de moscas de areia, o que exige instalações não disponíveis para a maioria dos grupos de pesquisa.
O trabalho original descrevendo na infecção vivo C57BL/6 com La-LIR1-/- usou promastigotes metacíclicos purificadosformas 14. No entanto, a manipulação genética leishmania pode prejudicar a diferenciação dos promastigotes em amastigotes axenic14 ou em formas infecciosas metacíclicas20. Assim, dependendo da cepa leishmania, o pesquisador deve determinar o método mais adequado para obter formas de parasitas infecciosos viáveis para seu estudo. O protocolo de amastigotes axenic diferenciados das culturas promastigotas descritas aqui pode ser uma alternativa mais fácil, produzindo resultados comparáveis em muitos casos19,20,35,37,38,64. Essa abordagem evita o uso de outros métodos que normalmente resultam em menor rendimento de parasitas infecciosos, como a incubação de promastigotes com anticorpos específicos, mas não amplamentedisponíveis, 65 para purificação de promastigotes metacíclicos, ou por gradiente de densidade dependente da expressão GLP18,66. A eficiência do protocolo de diferenciação pode ser avaliada determinando os níveis de expressão dos genes da família amastina64,67. As amastinas são membros de uma família genética conservada que são diferencialmente moduladas durante o ciclo de vida leishmania 68 e estão associadas à virulência parasita e patógense67,69,70. Outros marcadores também podem ser usados para distinguir amastigote de formas promastigotas. Por exemplo, o GP63 é regulado em amastigotes, porque seu papel é proteger os promastigotes das enzimas digestivas do inseto71.
A escolha da cepa do camundongo é mais um passo crítico a ser considerado ao desenvolver um protocolo padronizado de infecção vivo. A suscetibilidade e a resistência à infecção por Leishmania em camundongos são reguladas principalmente pelo fundo genético29,30,55. Neste protocolo, a cepa C57BL/6 foi escolhida porque sua resposta imune a L. amazonensis está intimamente relacionada com a resposta mista th1-Th2 em humanos72,73. Infecções experimentais de murina com L. amazonensis foram descritas para causar lesões moderadas em camundongos C57BL/6 em comparação com outras cepas de camundongos28,34,74. No entanto, dependendo da cepa do parasita, as diferenças no tamanho da lesão só são detectáveis em cepas de camundongos suscetíveis, como BALB/c36. O curso de tempo da infecção também precisa ser considerado e correlaciona-se com a cepa de camundongos escolhidos29,26,60,61,62,63,75. Os pés ulcerados devem ser sempre evitados, pois podem representar infecções secundárias e são frequentemente observados em longos períodos de infecção, especialmente em experimentos com cepas de camundongos suscetíveis. Designar a hora do dia para iniciar a infecção é mais um passo a ser considerado. Como demonstrado em estudos anteriores com L. amazonensis, a época do dia do inóculo parasita afeta o desenvolvimento de lesões porque a interação hospedeiro-parasita é afetada de forma circadiana pela melatonina liberada em pineal durante a hora escura do dia75.
A maior desvantagem do método de infecção in vivo é que o experimento requer o uso de um número substancial de animais de laboratório e leva mais tempo para obter resultados finais em comparação com o método de infecção in vitro18. No entanto, este último aspecto também pode ser considerado como uma vantagem, uma vez que os resultados in vivo refletem o curso de tempo natural da progressão da doença com mais precisão do que os resultados obtidos a partir de infecção in vitro. Mais importante, os achados de L. amazonensis na infecção vivo não podem apenas refletir as mudanças transitórias na virulência parasite, mas também reconhece o status sistêmico do hospedeiro e de todos os seus jogadores. Portanto, considerando os diversos fatores mencionados acima, o método descrito neste protocolo pode ser adaptado para atender às necessidades experimentais específicas para caracterização de outras metas e tratamentos relacionados à virulência permitindo novos insights para o controle da leishmaniose cutânea.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Agradecemos ao Prof. Dr. Niels Olsen Saraiva Câmara, do Centro Animal do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, pelo apoio e pela Profª Dra. Este trabalho contou com o apoio da Fundação de Amparo à Pesquisa de São Paulo (FAPESP - Bolsa 2017/23933-3).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well plate | Greiner bio-ne | 655180 | A flat-bottom plate for limiting dilution assay |
| adenine | Sigma | A8626 | Supplement added to M199 cell culture media |
| caliper | Mitutoyo | 700-118-20 | A caliper to measure the thickness of footpad |
| cell culture flask | Corning | 353014 | A 25 cm2 volume cell culture flask to cultivate Leishmania parasite |
| centrifuge | Eppendorf | 5804R | An equipament used for separating samples based on its density |
| CO2 incubator 34 °C | Thermo Scientific | 3110 | An incubator for amastigotes differentiation |
| ethanol | Merck | K50237083820 | A disinfectant for general items |
| fetal bovine serum | Gibco | 12657-029 | Supplement added to M199 cell culture media |
| glass tissue grinder tube | Thomas Scientific | 3431 E04 | A tube to collect and disrupt infected footpad tissue |
| glucose | Synth | G1008.01.AH | Supplement added to M199 cell culture media |
| GraphPad Prism Software | GraphPad | A software used to plot the data and calculate statistical significance | |
| hemin | Sigma | H-2250 | Supplement added to M199 cell culture media |
| HEPES | Promega | H5303 | Supplement added to M199 cell culture media |
| incubator 25 °C | Fanem | 347CD | An incubator for promastigotes cultivation |
| inverted microscope | Nikon | TMS | An equipament used to visual analyze the promastigote and amastigote cultures |
| isoflurane | An inhalant anesthetics for mice (3-5%) | ||
| laminar flow cabinet | Veco | VLFS-09 | A biosafety cabinet used for aseptical work area |
| M199 cell culture media | Gibco | 31100-035 | A cell culture media for Leishmania cultivation |
| microcentrifuge tube | Axygen | MCT150C | A microtube used for sample collection, processing and storage |
| multichanel pipette | Labsystems | F61978 | A multichannel pipette used for limiting dilution assay |
| NaHCO3 | Merck | 6329 | Supplement added to M199 cell culture media |
| NaOH | Sigma | S8045 | Supplement added to M199 cell culture media |
| Neubauer chamber | HBG | 2266 | A hemocytometer to count the parasite suspension |
| optical microscope | Nikon | E200 | An optical equipament used to count parasite |
| parafilm | Bemis | 349 | A flexible and resistant plastic to seal the plate |
| penicillin/streptomycin | Gibco | 15140122 | Supplement added to M199 cell culture media |
| Petri dishes | TPP | 93100 | A sterile dish to dissect the footpad tissue |
| pipetman kit | Gilson | F167360 | A micropipette kit containing four pipettors (P2 P20 P200 P1000) |
| scale | Quimis | BG2000 | An equipament used to weigh collected footpad lesions |
| scalpel | Solidor | 10237580026 | A scalpel to cut and collect footpad tissue |
| serological pipette 10 mL | Nest | 327001 | A sterile pipette used for transfering mililiter volumes |
| tips | Axygen | A pipette tip used for transfering microliter volumes | |
| Trypan blue | Gibco | 15250-061 | A dye used to count viable parasites |
| trypticase peptone | Merck | Supplement added to M199 cell culture media | |
| tuberculin syringe | BD | 305945 | A syringe with 27G needle to inoculate the parasite suspension |
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