Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

В Vivo инфекции с Лейшмания amazonensis для оценки паразитов virulence у мышей

Published: February 20, 2020 doi: 10.3791/60617

Summary

Здесь мы представляем составленный протокол для оценки кожной инфекции мышей с Leishmania amazonensis. Это надежный метод изучения паразитной вирулентности, позволяющий системно смотреть на реакцию позвоночных хозяев на инфекцию.

Abstract

Лейшмания spp. являются простейшие паразиты, которые вызывают лейшманиозы, заболевания, которые представляют широкий спектр клинических проявлений от кожных до висцеральных поражений. В настоящее время 12 миллионов человек, по оценкам, инфицированы лейшманией во всем мире и более 1 миллиарда человек живут в опасности заражения. Leishmania amazonensis является эндемическим заболеванием в Центральной и южной Америке и обычно приводит к кожной форме заболевания, которая может быть непосредственно визуализирована в животной модели. Таким образом, штаммы L. amazonensis являются хорошими моделями для кожных исследований лейшманиоза, потому что они также легко культивируются в пробирке. C57BL/6 мышей имитировать L. amazonensis-управляемыйпрогрессирования болезни наблюдается у людей и считаются одним из лучших мышей штаммов модель кожного лейшманиоза. В позвоночных хозяина, эти паразиты населяют макрофаги, несмотря на защитные механизмы этих клеток. Несколько исследований используют in vitro макрофаговые анализы инфекции для оценки инфекционной паразита в различных условиях. Однако подход in vitro ограничивается изолированной клеточной системой, которая игнорирует реакцию организма. Здесь мы компилировать in vivo murine инфекции метод, который обеспечивает системный физиологический обзор взаимодействия хозяина-паразита. Подробный протокол для инфекции in vivo мышей C57BL/6 с L. amazonensis включает дифференциацию паразитов в инфекционные амастиготы, мышей подножки кожной прививки, развитие поражения, и определение нагрузки паразита. Мы предлагаем этот устоявшийся метод как наиболее адекватный метод физиологических исследований иммунной и метаболической реакции хозяина на кожный лейшманиоз.

Introduction

Лейшманиозы являются во всем мире распространенными паразитарными инфекционными заболеваниями, представляющими важные проблемы в развивающихся странах и признаны одним из наиболее важных забытых тропических заболеваний Всемирной организацией здравоохранения1,2. Лейшманиазы характеризуются кожными, слизистыми и/или висцеральными проявлениями. Кожный лейшманиоз, как правило, вызвано L. amazonensis, L. mexicana, L. braziliensis, L. guyanensis, L. major, L. tropica и L. aethiopica3. Эта форма заболевания часто самовосстановления у людей из-за индукции защитного клеточного иммунного ответа. Тем не менее, клеточный иммунный ответ может потерпеть неудачу, и болезнь может прогрессировать до распространения кожного лейшманиоза4,5. Существует нет доступной вакцины из-за разнообразия среди видов Лейшмании и принимающей генетического происхождения6,7. Варианты лечения также ограничены, поскольку большинство имеющихся в настоящее время лекарств являются либо дорогими, токсичными, и / или может потребовать длительного лечения8,9. Кроме того, были сообщения о лекарственной устойчивости против доступных методов лечения10,11.

Возбудитель лейшманиозов является простейший паразит Лейшмания. Паразит представляет две различные морфологические формы в своем жизненном цикле: промастиготы, флагеллированная форма, встречающаяся в мухах; и amastigotes, внутриклеточная форма, найденная в паразитофорных вакуолах млекопитающих хозяина макрофагов12,13. Способность Amastigotes вторгаться, выживать и размножаться, несмотря на защитные механизмы макрофагов позвоночных хозяина подлежат многим исследованиям14,15,16,17. Следовательно, несколько исследовательских групп были описания в пробирке макрофагов инфекции анализы для оценки воздействия конкретных факторов окружающей среды, а также паразитов и генов-хозяев на инфекционность паразитов. Этот ассс и сойд представляет собой ряд преимуществ, таких как способность адаптировать исследования к формату высокой пропускной способности, относительно более короткий период времени для получения результатов, и сокращение числа лабораторных животных, принесено в жертву18. Тем не менее, результаты in vitro анализы ограничены, потому что они не всегда реплицируются в vivo исследования14,19,20,21. In vivo анализы обеспечивают системный физиологический обзор взаимодействия хозяина-паразита, который не может быть полностью имитирован in vitro анализы. Например, иммунологические исследования могут быть выполнены с помощью иммуногистохимических анализов из собранных участков ткани разделов или даже из popliteal лимфатических узлов для анализа восстановленных иммунных клеток22.

Звери часто используются в качестве модели для заболеваний человека в биологических и биомедицинских исследований, чтобы лучше понять основные физиологические механизмы заболеваний23. В случае лейшманиоза, маршрут, участок, или доза прививки влияют на исход заболевания24,25,26,27. Кроме того, восприимчивость и устойчивость к инфекции у людей и мышей строго регулируются генетическим фоном хозяина и паразита4,5,22,28,29,30,31. BALB/c мышей очень восприимчивы к L. amazonensis кожной инфекции, показывая быстрое прогрессирование заболевания с распространением паразитов в лимфатических узлов, селезенки и печени32. Как болезнь может прогрессировать до кожных метастазов, инфекция может быть фатальным. В отличие от этого, C57BL/6 мышей часто развиваются хронические поражения с стойкими паразитами нагрузки в L. amazonensis инфекциианализы 33. Таким образом, L. amazonensis инфекции с этой конкретной мыши видов считается отличной моделью для изучения хронических форм кожного лейшманиоза у людей, потому что он имитирует прогрессирование болезни лучше, чем BALB / c мышей модель5,34.

Таким образом, мы предлагаем, что мурин in vivo инфекции является полезным методом для Лейшмании вирулентности физиологических исследований, применимых к болезни человека, что позволяет системное представление о принимающей паразит взаимодействия. Пересмотр устоявшихся анализов22, мы представляем здесь составленный пошагонный протокол in vivo инфекции C57BL/6 мышей с L. amazonensis, которая включает в себя дифференциацию паразитов в топорные amastigotes, мышей подножки кожной прививки, развитие поражения, и определение нагрузки паразитов. Этот протокол может быть адаптирован к другим штаммам мышей и видам лейшмании, которые вызывают кожные лейшманиазы. В заключение, метод, представленный здесь имеет решающее значение в выявлении новых целей противлейшмании наркотиков и вакцин, а также в физиологических исследованиях принимающей иммунной и метаболических реакций на инфекции Лейшмании.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все экспериментальные процедуры были одобрены Комитетом по уходу за животными и использованию в Институте бионауки Университета Сан-Паулу (CEUA 342/2019), и были проведены в соответствии с рекомендациями и политикой по уходу и использованию лабораторных животных штата Сан-Паулу (Lei Estadual 11.977, de 25/08/2005) и бразильское правительство (Lei Federal 11.794, de 08/10/2008). Все шаги, описанные в разделах 1-5, должны выполняться асептически внутри ламинарных шкафов. Личные защитные средства должны быть использованы при обработке живых паразитов Лейшмания.

1. В пробирке Дифференциация L. amazonensis Promastigotes в Axenic Amastigotes15,20,35,36,37,38

ПРИМЕЧАНИЕ: L. amazonensis (MHOM/BR/1973/M2269) (La) паразит был использован в этом рассее. В зависимости от цели исследования, форма инфекционного паразита может быть получена либо путем очищения метациклической формы с использованием градиента плотности, как ранее описано14, или путем дифференциации промастиготов в амастиготы, в соответствии со следующим протоколом.

  1. Выращивайте La promastigotes в 25 см2-клеточной культуры колбу, содержащей 10 мл среднего для промастиготей (про-средний) (рН 7,0).
  2. Инкубировать при 25 градусах По Цельсию в течение 3 дней.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте promastigote культур, которые были проложены в пробирке менее 10x, чтобы избежать потери вирулентности и анеуплоидных изменений паразитов39,40,41,42,43,44.
  3. Пипетка 5 мл логарифмической фазы роста promastigote культуры в новый 25 см2 колбы.
  4. Добавьте 5 мл среднего для аксенанских амастигов (ама-средний) (рН 5,2).
  5. Инкубировать при 34 градусах по Цельсию в течение 3-4 дней.
  6. Разделите культуру, разбавляя ама-медиум в соотношении 1:3 в новую2-сантиметровую колбу.
  7. Инкубировать при 34 градусах по Цельсию в течение 3-5 дней.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубировать амастиготы axenic на срок до 5 дней, так как он представляет собой конец созревания37.

2. C57BL/6 Footpad Инфекция с L. amazonensis

ПРИМЕЧАНИЕ: Самки C57BL/6 мышей (6-8 недель) были получены и поддерживается в Центре животных Института биомедицинских наук Университета Сан-Паулу. Звери получали пищу и воду ad libitum.

  1. Подсчитайте культуру акетических амастиготов, переведя аликот суспензии паразита, разбавленного в PBS, в камеру Нойбауэра (т.е. гемоцитометр). Подсчитайте не-flagellated паразитов, которые представляют формы amastigotes.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, Трипан синий (1:1) может быть использован для подсчета числа жизнеспособных amastigotes (т.е., те, которые не окрашены Трипан синий).
  2. Разбавить апорические амастиготы в PBS в соответствии с желаемой дозой инокулума и количество инокулумов, предназначенных (1 х 106 апорных амастигот в 50 ЗЛ PBS рекомендуется).
  3. Загрузите туберкулин шприц с 27 G иглы с подготовленным паразитподвески.
  4. Анестезия C57BL/6 мыши с помощью 3-5% изолюран, как рекомендовано Университетом Джонса Хопкинса по уходу за животными и использования комитета45. Оцените глубину анестезии, испытав реакцию мыши на щепотку ног.
  5. Прививка 50 зл гомогенизированной подвески паразита (1 х 106 апорных амазиготов или желаемой дозы инокулума) в подплантарной ткани левой задней подножия, используя ранее загруженный шприц туберкулина (шаг 2.3).

3. Мышь Footpad развитие поражения

  1. Измерьте прогрессирование поражения один раз в неделю, измеряя толщину левой (инфицированных) и правых (неинфицированных) подножок с помощью калипера.
  2. Рассчитайте разницу толщины между левой и правой задними подножками еженедельно, чтобы оценить прогрессирование поражения.
  3. Участоте рассчитанные различия на оси Y и времени заражения на X-оси и вычислите статистическую значимость.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В соответствии с рекомендациями Комитетов по уходу за животными и использованию животные должны быть принесены в жертву до того, как инфицированное отделение становится язвено, поскольку язвы кожи могут привести к вторичной инфекции. Как показано на дополнительной рисунке 1, это занимает около 10 недель для поражений представить признаки язвы с дозой паразита (106 аксиготы) и принимающей штамм (C57BL/6), используемых в этом протоколе. Мышей следует принести в жертву для извлечения поражения до признаки язвы наблюдаются.

4. Мыши Footpad Извлечения и паразитов Ограничение разбавления

  1. Подготовьте 96 хорошо пластины (плоское дно) для ограничения разбавления асссе46,47, добавив 180 л про-средних для всех скважин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте четыре полосы пластины (половина пластины) для каждого животного, представляющих четырехсторонние анализы (т.е., животных 1 и полосы A-D; животных 2 и полосы E-H).
  2. Добавьте 1 мл про-медиума в трубку измельчителя стеклянной ткани на поражения и взвесьте трубку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Трубка должна быть стерильной, поэтому используйте стерильную крышку и взвесьте трубку с закрытой крышкой, если они взвешивают за пределами ламинарного шкафа.
  3. Пожертвуйте животным в камере CO2, следуя рекомендациям Комитетов по уходу за животными и использованию. Дезинфекция животных путем распыления с 70% этанола.
  4. Акциз ноги животного на пятки, чтобы извлечь инфицированных подножки и спрей 70% этанола на подножку для дезинфекции. Убедитесь в стерилизации ножниц и щипцы, сохраняя их пропитанной в 70% этанола.
  5. Поместите зараженную подножку в стерильную чашку Петри и расчлените с помощью стерильных щипц и скальпеля, чтобы собрать все мягкие ткани. Отбросьте кости.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Единообразие в рассечении шаг рекомендуется, чтобы избежать предвзятого восстановления тканей.
  6. Перенесите собранные ткани в трубку измельчителя стеклянной ткани с про-средой, затем взвесьте трубку еще раз, чтобы определить вес поражения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте размещения щипцы и скальпеля непосредственно в среду, так как небольшие объемы могут быть удалены, в результате чего недооцененный вес ткани. Вес поражения рассчитывается путем вычитания веса трубки, содержащей про-средний с собранной тканью из веса трубки, содержащей только про-средний.
  7. Гомогенизировать ткань 10x с помощью мясорубки для полного нарушения тканей.
  8. Разрешить смесь в отложения в течение 10 минут, а затем собрать 20 зл супернатанта.
  9. Нагрузка 20 зл и супернатант в1-й колонне1-й полосы 96 хорошо плиты подготовлены в шаге 4.1. Повторите это для следующих трех полос, чтобы иметь четыре раза для каждого животного (т.е. для животных 1 добавить 20 зл к каждой скважине и этикетки A1, B1, C1, и D1).
  10. Гомогенизировать каждую скважину в1-й колонке 10x с помощью многоканального пипетки. Затем перенесите 20 л разбавленных образцов из1-й колонки в2-ю колонку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно гомогензировать каждый колодец 10x от одного столбца к другому.
  11. Повторите шаг 4.10 для всех оставшихся столбцов до последней колонки (12тыс.)и отбросьте окончательные 20 л разбавленного образца.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Изменение советы после каждого разбавления, чтобы избежать перекрестного загрязнения.
  12. Печать пластин с пленкой и инкубировать при 25 градусов по Цельсию в течение 7 дней во влажной камере.

5. Определение нагрузки на паразитов

  1. Проанализируйте пластины после 7 дней инкубации с помощью перевернутого микроскопа, чтобы определить последний паразит-содержащих хорошо для каждой полосы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это также возможно иметь представление о росте паразитов, или плотность клеток, путем визуального анализа изменения цвета и мутности среды.
  2. Рассчитайте нагрузку ткани паразита для каждой полосы, разделив коэффициент разбавления на вес поражения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В определенной полосе, если паразиты присутствуют только в столбцах 1-5 (т.е. скважины А1-А5 являются положительными для роста паразитов), это означает, что столбец 5 содержал только 1 паразита, столбец 4 содержал 10 паразитов и так далее, в кратных десяти. Колонка 1 будет содержать 104 паразитов, что представляет собой количество паразитов в первоначальном 20 Зл супернатанта (неразбавленный образец в шаге 4.7). Поскольку этот 20 л был разбавлен 180 л про-средних, начальная трубка содержала 5 х 105 паразитов: (1 х 104) / (0,02 мл) 5 х 105 паразитов /1 мл. Затем, паразит нагрузки в том, что поражения могут быть рассчитаны путем деления первоначальной концентрации паразита на вес поражения: (5 х 105) / вес поражения (см. шаг 4.6).
  3. Участок средний четырехкратный результат для каждого животного с журналом Y-масштаб.

6. Статистический анализ

  1. Представляем данные в качестве среднего стандартного отклонения, используя по крайней мере пять животных на экспериментальную группу в качестве репликаций.
  2. Выполняйте статистический анализ с помощью неспаренного двуххвостого теста, учитывая значение p slt; 0,05 как значительное.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Лейшмания простейшие паразиты существуют в двух формах развития во время их жизненного цикла в беспозвоночных и позвоночных хостов: promastigotes, размножающихся форм, найденных в прозме женского sandfly; и amastigotes, пролиферативные формы, найденные в паразитофорных вакуол из клеток-хозяев млекопитающих. Promastigotes имеют удлиненный корпус примерно 1,5 мкм в ширину и 20 мкм в длину, с flagellum обычно выходит из передней конечности. Amastigotes имеют округлые или яйцевидное тело в диапазоне размеров от 2-6 мкм в длину и 1,5-3 мкм в ширину, и обладают неочевидным flagellum12,13 (Рисунок 1А). Во время трапезы крови беспозвоночный хозяин, гематофаговское насекомое семейства Психодида, приобретает макрофаги, инфицированные лейшманией амастиготы. Как только эти клетки достигают sandfly пищеварительной трубки, amastigotes выпускаются и дифференцируются к проциклическим проматиготам(Рисунок 1A). Эти формы являются неинфекционными и размножаются интенсивно двоичным делением и колонизируют пищеварительную трубку переносчика насекомых. Проциклические формы затем дифференцируются к метациклическим формам, инфекционной и быстро движущейся форме, представляя более тонкое тело и удлиненный флагеллум(рисунок 1А). Метациклические формы вторгаются в передние части пищевода и proventriculus sandfly, так что во время своей следующей пищи крови, регургитация обеспечивает прививку этих инфекционных форм в новый хозяин позвоночных. В тегумент позвоночных хозяина, паразиты фагоцитозируются макрофагов и дифференцировать в amastigotes внутри паразитофорных ваквоол, где amastigotes размножаться бинарным делением и завершить жизненный цикл Лейшмании12,13.

Аксеновские условия могут имитировать различные среды пребывания в пробирке, поддерживая морфологию паразитов и жизнеспособность. Аксеновские условия для amastigotes были ранее описаны имитации паразитофорной среды макрофага вакуола и запуска promastigote in vitro дифференциации в форме amastigote37. Эти условия имитируют кислую среду (рН 5,5) и повышенную температуру позвоночных хостов (34 градусов по Цельсию). Рисунок 1B иллюстрирует промастиготы, отличаемые к амастиготам, изменяя эти условия в культуре. Жизнеспособность этих асамынских амастигов может быть проанализирована Трипан синий окрашивание, метод, основанный на принципе, что живые клетки обладают нетронутыми мембранами, которые исключают определенные красители, в то время как мертвые клетки не48. Кроме того, мы проанализировали жизнеспособность агенных амастиготов, проверяющих их способность трансформироваться обратно в промастиготы при переводе на нейтральный рН и инкубации при 25 кВ(рисунок 1B).

Здесь мы предлагаем метод инфекции in vivo для оценки вирулентности различных штаммов лейшмании. Рисунок 2представляет собой in vivo инфекции ассеев, показывающие кожное развитие поражения C57BL/6 мышей footpads, которые были инфицированы диким типом ( La-WT) и Лейшмания железный регулятор 1 нокаут(La-LIR1-/-) L. amazonensis очищенных метациклики. LIR1 регулирует внутриклеточный уровень железа в Лейшмании посредничество экспорта железа и предотвращения его внутриклеточного накопления до токсичныхуровней 14. Наблюдая прогрессирование разницы толщины инфицированных против неинфицированных подножия, мы смогли продемонстрировать, что La-LIR1-/- инфицированные мыши представили меньшие поражения, чем La-WT инфицированных мышей (Рисунок 2A). Эти выводы показали, что LIR1 имеет важное значение для L. amazonensis in vivo virulence. Это свидетельствует о важности и эффективности этого метода в оценке различий Лейшманииуправляемых кожных заболеваний. Рисунок 2B иллюстрирует неинфицированные (справа) и инфицированные (левые) подножки и развитие поражения 73 дней послеинфицирования, показывая различия в отеках и поражении прогрессирования La-WT и La-LIR1-/- инфицированных мышей.

Прогрессирование инфекции Лейшмании состоит не только из развития поражения, которое представляет собой воспалительный ответ, но и внутриклеточной репликации паразита. Для оценки репликации паразитов, паразит нагрузки поражений было определено путем извлечения инфицированных поражения, а затем ограничение разбавления контроль в 96 хорошо пластины (Рисунок 3A). На рисунке 3B показан анализ нагрузки паразитов на поражения подножки от La-WT и La-LIR1-/- инфицированных мышей после 73 дней инфицирования. Из ограничивающего разбавления, мы обнаружили 106-разменьше паразитов в поражении La-LIR1-/- инфицированных мышей по сравнению с La-WT, показывая, что отсутствие LIR1 предотвращает внутриклеточной репликации амастиготов14.

Одним из преимуществ оценки как развития поражения, так и паразитной нагрузки является выявление возможных различий внутриклеточной репликации паразитов и воспалительной реакции хозяина. Мы наблюдали различия между этими двумя фенотипами с использованием надстройки LIR1 (La-LIR1AB), который является La-LIR1-/- с LIR1 ORF интегрированы обратно в рибосомный локус14. Когда La-LIR1AB был введен в подножку мыши, мы наблюдали промежуточных поражений по сравнению с La-LIR1-/- и La-WTинфекций, но замечательный полный паразит нагрузки спасения La-WTфенотипа (Дополнительный Рисунок 2). Эти результаты показывают, что паразитыLa-LIR1AB смогли воспроизвести, как паразитыLa-WT в долгосрочной инфекции in vivo. Тем не менее, мышь воспалительные реакции не так усугубляется,как La-WT инфекций, потому что поражения были значительно меньше.

Таким образом, метод, описанный здесь, оказался необходимым для идентификации и характеристики фактора вирулентности L. amazonensis, необходимого для успешного внутриклеточного репликации аматигота и развития кожного поражения у млекопитающих хозяев.

Figure 1
Рисунок 1: Морфология L. amazonensis promastigotes и amastigotes. ()Иллюстрации различных морфологических форм лейшмании: проциклический промастигот, метациклический промастигот и аматигот. Шкала бар 2 мкм. (B) Фотографии in vitro L. amazonensis культур. В пробирке дифференциации promastigotes в апорических амастигот, и апорических amastigotes обратно в promastigotes путем изменения рН и температурных условий, как описано в шагзации протокола. Снимки были сделаны с помощью перевернутого микроскопа. Шкала бар 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: LIR1 нокаут заметно снижает L. amazonensis in vivo развития поражения. C57BL/6 мышей были привиты в левой задней подножке с 106 очищенных метациклики L. amazonensis дикого типа(La-WT) и L. amazonensis LIR1 нокаутом(La-LIR1-/-). (A) Footpad кожное поражения прогрессии La-WTи La-LIR1-/- инфицированных мышей проанализированы еженедельно. Данные представляют собой средний SEM инфицированных подножки вычитается неинфицированных footpad толщиной из пяти различных мышей в каждой группе (адаптированы из Laranjeira-Silva и др.14). (B) Фотографии неинфицированных и инфицированных подножок La-WTи La-LIR1-/- инфицированных мышей, показывающих различия в отеках 73 дней послеинфекции (адаптировано из Laranjeira-Silva и др.14). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: LIR1 нокаут заметно уменьшает L. amazonensis in vivo внутриклеточной репликации. ()Иллюстрация 96 хорошо пластины, представляющие 10x серийных разбавления восстановленных подножки тканей инфицированных L. amazonensis дикого типа (La-WT) и LIR1 нокаутом (La-LIR1-/-). Строки A-D представляют собой четырехсторонний разбавления образца пораженияLa-WT-footpad. Строки E-H представляют собой четырехсторонний разбавления La-LIR1-/--footpadпоражений образца. Различные оттенки серого цвета представляют наблюдаемую плотность клеток на скважину (т.е. более светлый цвет означает меньше паразитов). Скважины, отмеченные красным цветом, представляют собой последние скважины, содержащие паразитов на репликацию. (B) Паразитная нагрузка в восстановленных подножьках тканей C57BL/6 мышей, инфицированных 106 очищенных метациклики L. amazonensis дикого типа (La-WT) и L. amazonensis LIR1 knockout(La-LIR1-/-) определено 73 дней послезаражения. Данные представляют собой среднее количество паразитов нагрузки на мг ткани из пяти различных мышей в каждой группе (адаптированы из Laranjeira-Silva и др.14). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Supplementary Figure 1
Дополнительная рисунок 1: Язва кожи как показатель вторичной инфекции. Представитель фотографии C57BL/6 мышей footpads инфицированных L. amazonensis дикого типа ( La-WT) приняты 80 дней после инфекции. Красные стрелки указывают на признаки язвы, указывая на то, что эксперимент должен быть прекращен. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Supplementary Figure 2
Дополнительная диаграмма 2: Роль LIR1 на развитии поражения in vivo и репликации внутриклеточного паразита. C57BL/6 мышей были привиты в левой задней подножке с 106 очищенных метациклики L. amazonensis дикого типа(La-WT), L. amazonensis LIR1 нокаут(La-LIR1-/-), и L. amazonensis LIR1 надстежка(La-LIR1AB). (A) Footpad кожное поражения прогрессии La-WT, La -LIR1-/-, и La-LIR1AB инфицированных мышей проанализированы еженедельно. Данные представляют собой средний SEM инфицированных подножки вычитается неинфицированных footpad толщиной из пяти различных мышей в каждой группе (адаптированы из Laranjeira-Silva и др.14). (B) Паразитная нагрузка в восстановленных тканей подножки из La-WT, La -LIR1-/-, или La-LIR1AB инфицированных мышей определяется 73 дней послеинфекции. Данные представляют собой среднее количество паразитов нагрузки на мг ткани из пяти различных мышей в каждой группе (адаптированы из Laranjeira-Silva и др.14). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Анализ инфекции in vivo, описанный в этом протоколе, позволяет любому исследователю оценить in vivo кожный лейшманиоз, рассматривая взаимодействие хозяина-паразита в системном сценарии. Эти анализы были использованы многими группами22,24,27,29,31,32,34,49 и здесь мы составили пошаговой протокол для стандартизации этого метода при рассмотрении ограничений инфраструктуры, которые могут иметь некоторые группы. Этот протокол также может быть использован для оценки вирулентности трансгенных паразитов Лейшмании по in vivo биоизображение50,51,52. Как и любая другая экспериментальная процедура, этот процесс имеет ограничения и критические шаги для выполнения, такие как требование квалифицированного персонала, который комфортно работает с мышами и имеют опыт в выполнении субплантарных инъекций, чтобы избежать случайных инфекций. Стандартизация протоколов чрезвычайно важна для того, чтобы избежать предвзятых результатов и добиться сопоставимых результатов между различными исследовательскими группами.

Основным преимуществом использования L. amazonensis в качестве модели для кожных лейшманиаз является то, что поражения подножия, вызванного этим видом, можно легко оценить у мышей. Отек подножия, определяемый описанным здесь методом, представляет собой сумму двух фенотипов инфекции: воспалительный ответ хозяина и репликацию паразитов. Оба фенотипа могут быть оценены отдельно, связывая метод нагрузки ткани паразита, который отражает внутриклеточную репликацию паразитов с определением прогрессии толщины поражения. Еще одним преимуществом является то, что промастиготы L. amazonensisлегко культивируются в пробирке. Учитывая это, любая исследовательская группа может манипулировать этим видом Лейшмания в соответствии с их потребностями. Выводы из исследований L. amazonensis'может быть затем по сравнению с другими видами Лейшмании, чтобы определить, является ли конкретный путь эволюционно сохранены или расходятся21,53,54.

В естественном цикле передача Лейшмании позвоночному хозяину происходит при укусе инфицированной песчаной мухи во время трапезы крови. Песчаная муха обычно прививают несколько сотен метациклических промастигот форм Лейшмании в слюне насекомого. В экспериментальных in vivo инфекций, наиболее частым местом прививки является подножия животного22. Интрейдермальная инъекция в ухо или интраперитонеальная инъекция являются альтернативными местами прививки в зависимости от цели исследования, потому что каждый сайт представляет различные типы фагоцитических клеток24,56. Таким образом, некоторые исследовательские группы используют лабораторны инфицированных песчаных мух, чтобы заразить ушную дерму животного, чтобы имитировать естественную передачу56,57,58,59. Однако этот протокол представляет некоторые ограничения, такие как содержание колоний песчаных мух, что требует недоступных для большинства исследовательских групп помещений.

Оригинальная работа, описывающая in vivo C57BL/6 инфекции с La-LIR1-/- использовал очищенные метациклические промастиготы формы14. Тем не менее, Лейшмания генетические манипуляции могут нарушить либо дифференциации promastigotes в апоры amastigotes14 или в метациклических инфекционных форм20. Таким образом, в зависимости от штамма лейшмании, исследователь должен определить наиболее адекватный метод для получения жизнеспособных форм инфекционных паразитов для их изучения. Протокол аксинициготов, отличаемых от описанных здесь культур промастигот, может быть более простой альтернативой, производя сопоставимые результаты во многих случаях19,20,35,37,38,64. Этот подход позволяет избежать использования других методов, которые обычно приводят к снижению урожайности инфекционных паразитов, таких как инкубация promastigotes с конкретными, но не широко доступны антитела65 для метациклической очистки промастиготы, или плотность градиента зависит от экспрессии СУГ метациклов18,66. Эффективность протокола дифференциации можно оценить, определив уровни экспрессии амастин-семейных генов64,67. Амастины являются членами семейства консервированныхгенов,которые дифферепрециально модулируются во время жизненного цикла Лейшмании 68 и связаны с паразитом вирулентности и патогенеза67,69,70. Другие маркеры также могут быть использованы для различения amastigote от промастигот формы. Например, gp63 является downregulated в amastigotes, потому что его роль заключается в защите promastigotes от пищеварительных ферментов насекомых71.

Выбор штамма мыши является еще одним важным шагом, который следует учитывать при разработке стандартизированного протокола инфекции in vivo. Чувствительность и устойчивость к инфекции лейшмании у мышей в основном регулируются генетическим фоном29,30,55. В этом протоколе, штамм C57BL/6 был выбран потому, что его иммунный ответ на L. amazonensis тесно связан ас-энсом со смешанным ответом Th1-Th2 у людей72,73. Экспериментальные инфекции мурина с L. amazonensis были описаны, чтобы вызвать умеренные поражения у мышей C57BL/6 по сравнению с другими штаммами мышей28,34,74. Однако, в зависимости от штамма паразита, различия в размере поражения обнаруживаются только в восприимчивых штаммов мышей, как BALB/c36. Время, течение инфекции также необходимо учитывать и коррелирует с выбранным штаммом мышей29,26,60,61,62,63,75. Ulcerated footpads следует всегда избегать, поскольку это может представлять вторичные инфекции и часто наблюдаются в длительные периоды инфекции, особенно в экспериментах с восприимчивыми штаммами мышей. Назначение времени суток, чтобы начать инфекцию является еще одним шагом, который следует рассмотреть. Как показали в предыдущих исследованиях с L. amazonensis, время суток паразита инокулум влияет на развитие поражения, потому что хозяин-паразит взаимодействия влияет в циркадной образом шишковидной высвобожденный мелатонин в темное время суток75.

Основным недостатком метода инфекции in vivo является то, что эксперимент требует использования значительного числа лабораторных животных и занимает больше времени, чтобы получить окончательные результаты по сравнению с методом инфекции in vitro18. Тем не менее, этот последний аспект можно также рассматривать в качестве преимущества, поскольку результаты in vivo отражают естественный временной ход прогрессирования заболевания более точно, чем результаты, полученные от инфекции in vitro. Что еще более важно, выводы l. amazonensis in vivo инфекции не могут только отражать преходящее изменения в паразитной вирулентности, но и признает системный статус хозяина и всех его игроков. Поэтому, учитывая несколько факторов, упомянутых выше, метод, описанный в этом протоколе, может быть адаптирован для удовлетворения конкретных экспериментальных потребностей в характеристиках других целей и методов лечения, связанных с вирулентностью, позволяющей получить новые идеи для борьбы с кожным лейшманиозами.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Мы хотели бы поблагодарить профессора д-ра Нильса Олсена Сарайву Камара из Центра животных Института биомедицинских наук Университета Сан-Паулу за поддержку и профессора д-ра Сильвию Рени Ульяну за предоставление мясорубки из стеклянной ткани. Эта работа была поддержана Сан-Паулу научно-исследовательский фонд (FAPESP - MFLS ' грант 2017/23933-3).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well plate Greiner bio-ne 655180 A flat-bottom plate for limiting dilution assay
adenine Sigma A8626 Supplement added to M199 cell culture media
caliper Mitutoyo 700-118-20 A caliper to measure the thickness of footpad
cell culture flask Corning 353014 A 25 cm2 volume cell culture flask to cultivate Leishmania parasite
centrifuge Eppendorf 5804R An equipament used for separating samples based on its density
CO2 incubator 34 °C Thermo Scientific 3110 An incubator for amastigotes differentiation
ethanol Merck K50237083820 A disinfectant for general items
fetal bovine serum Gibco 12657-029 Supplement added to M199 cell culture media
glass tissue grinder tube Thomas Scientific 3431 E04 A tube to collect and disrupt infected footpad tissue
glucose Synth G1008.01.AH Supplement added to M199 cell culture media
GraphPad Prism Software GraphPad A software used to plot the data and calculate statistical significance
hemin Sigma H-2250 Supplement added to M199 cell culture media
HEPES Promega H5303 Supplement added to M199 cell culture media
incubator 25 °C Fanem 347CD An incubator for promastigotes cultivation
inverted microscope Nikon TMS An equipament used to visual analyze the promastigote and amastigote cultures
isoflurane An inhalant anesthetics for mice (3-5%)
laminar flow cabinet Veco VLFS-09 A biosafety cabinet used for aseptical work area
M199 cell culture media Gibco 31100-035 A cell culture media for Leishmania cultivation
microcentrifuge tube Axygen MCT150C A microtube used for sample collection, processing and storage
multichanel pipette Labsystems F61978 A multichannel pipette used for limiting dilution assay
NaHCO3 Merck 6329 Supplement added to M199 cell culture media
NaOH Sigma S8045 Supplement added to M199 cell culture media
Neubauer chamber HBG 2266 A hemocytometer to count the parasite suspension
optical microscope Nikon E200 An optical equipament used to count parasite
parafilm Bemis 349 A flexible and resistant plastic to seal the plate
penicillin/streptomycin Gibco 15140122 Supplement added to M199 cell culture media
Petri dishes TPP 93100 A sterile dish to dissect the footpad tissue
pipetman kit Gilson F167360 A micropipette kit containing four pipettors (P2 P20 P200 P1000)
scale Quimis BG2000 An equipament used to weigh collected footpad lesions
scalpel Solidor 10237580026 A scalpel to cut and collect footpad tissue
serological pipette 10 mL Nest 327001 A sterile pipette used for transfering mililiter volumes
tips Axygen A pipette tip used for transfering microliter volumes
Trypan blue Gibco 15250-061 A dye used to count viable parasites
trypticase peptone Merck Supplement added to M199 cell culture media
tuberculin syringe BD 305945 A syringe with 27G needle to inoculate the parasite suspension

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alvar, J., et al. Leishmaniasis worldwide and global estimates of its incidence. PloS One. 7 (5), e35671 (2012).
  2. Ashford, R. W. The leishmaniases as emerging and reemerging zoonoses. International Journal for Parasitololy. 30 (12-13), 1269-1281 (2000).
  3. Burza, S., Croft, S. L., Boelaert, M. Leishmaniasis. Lancet. 392 (10151), 951-970 (2018).
  4. Scorza, B. M., Carvalho, E. M., Wilson, M. E. Cutaneous Manifestations of Human and Murine Leishmaniasis. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), e1296 (2017).
  5. Afonso, L. C., Scott, P. Immune responses associated with susceptibility of C57BL/10 mice to Leishmania amazonensis. Infection and Immunity. 61 (7), 2952-2959 (1993).
  6. Khamesipour, A., Rafati, S., Davoudi, N., Maboudi, F., Modabber, F. Leishmaniasis vaccine candidates for development: a global overview. Indian Journal of Medical Research. 123 (3), 423-438 (2006).
  7. Kumar, R., Engwerda, C. Vaccines to prevent leishmaniasis. Clinical & Translational Immunology. 3 (3), e13 (2014).
  8. Murray, H. W., Berman, J. D., Davies, C. R., Saravia, N. G. Advances in leishmaniasis. Lancet. 366 (9496), 1561-1577 (2005).
  9. Hotez, P. J., Bottazzi, M. E., Franco-Paredes, C., Ault, S. K., Periago, M. R. The neglected tropical diseases of Latin America and the Caribbean: a review of disease burden and distribution and a roadmap for control and elimination. PLoS Neglected Tropical Diseases. 2 (9), e300 (2008).
  10. Croft, S. L., Sundar, S., Fairlamb, A. H. Drug resistance in leishmaniasis. Clinical Microbiology Reviews. 19 (1), 111-126 (2006).
  11. Ponte-Sucre, A., et al. Drug resistance and treatment failure in leishmaniasis: A 21st century challenge. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (12), e0006052 (2017).
  12. Teixeira, D. E., et al. The cell biology of Leishmania: how to teach using animations. PLoS Pathogens. 9 (10), e1003594 (2013).
  13. Sunter, J., Gull, K. Shape, form, function and Leishmania pathogenicity: from textbook descriptions to biological understanding. Open Biology Journal. 7 (9), 170165 (2017).
  14. Laranjeira-Silva, M. F., et al. A MFS-like plasma membrane transporter required for Leishmania virulence protects the parasites from iron toxicity. PLoS Pathogens. 14 (6), e1007140 (2018).
  15. Aoki, J. I., et al. L-arginine availability and arginase activity: Characterization of amino acid permease 3 in Leishmania amazonensis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (10), e0006025 (2017).
  16. Probst, C. M., et al. A comparison of two distinct murine macrophage gene expression profiles in response to Leishmania amazonensis infection. BMC Microbiology. 12, 22 (2012).
  17. Dillon, L. A., et al. Simultaneous transcriptional profiling of Leishmania major and its murine macrophage host cell reveals insights into host-pathogen interactions. BMC Genomics. 16, 1108 (2015).
  18. Sarkar, A., Khan, Y. A., Laranjeira-Silva, M. F., Andrews, N. W., Mittra, B. Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites. Journal of Visualized Experiments. (133), e57486 (2018).
  19. Mittra, B., Laranjeira-Silva, M. F., Miguel, D. C., Perrone Bezerra de Menezes, J., Andrews, N. W. The iron-dependent mitochondrial superoxide dismutase SODA promotes. The Journal of Biological Chemistry. 292 (29), 12324-12338 (2017).
  20. Flannery, A. R., Huynh, C., Mittra, B., Mortara, R. A., Andrews, N. W. LFR1 ferric iron reductase of Leishmania amazonensis is essential for the generation of infective parasite forms. The Journal of Biological Chemistry. 286 (26), 23266-23279 (2011).
  21. Laranjeira-Silva, M. F., Zampieri, R. A., Muxel, S. M., Beverley, S. M., Floeter-Winter, L. M. Leishmania amazonensis arginase compartmentalization in the glycosome is important for parasite infectivity. PloS One. 7 (3), e34022 (2012).
  22. Sacks, D. L., Melby, P. C. Animal models for the analysis of immune responses to leishmaniasis. Current Protocols in Immunology. , (1998).
  23. Andersen, M. L., Winter, L. M. F. Animal models in biological and biomedical research - experimental and ethical concerns. Anais da Academia Brasileira de Ciências. 91, e20170238 (2019).
  24. Ribeiro-Gomes, F. L., et al. Site-dependent recruitment of inflammatory cells determines the effective dose of Leishmania major. Infection and Immunity. 82 (7), 2713-2727 (2014).
  25. Mahmoudzadeh-Niknam, H., Khalili, G., Abrishami, F., Najafy, A., Khaze, V. The route of Leishmania tropica infection determines disease outcome and protection against Leishmania major in BALB/c mice. The Korean Journal of Parasitology. 51 (1), 69-74 (2013).
  26. Oliveira, D. M., et al. Evaluation of parasitological and immunological parameters of Leishmania chagasi infection in BALB/c mice using different doses and routes of inoculation of parasites. Parasitology Research. 110 (3), 1277-1285 (2012).
  27. Côrtes, D. F., et al. Low and high-dose intradermal infection with Leishmania major and Leishmania amazonensis in C57BL/6 mice. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 105 (6), 736-745 (2010).
  28. Blackwell, J. M., et al. Genetics and visceral leishmaniasis: of mice and man. Parasite Immunology. 31 (5), 254-266 (2009).
  29. Loeuillet, C., Bañuls, A. L., Hide, M. Study of Leishmania pathogenesis in mice: experimental considerations. Parasites & Vectors. 9, 144 (2016).
  30. Alexander, J., Brombacher, F. T Helper1/T Helper2 Cells and Resistance/Susceptibility to Leishmania Infection: Is This Paradigm Still Relevant? Frontiers in Immunology. 3, 80 (2012).
  31. Sacks, D., Noben-Trauth, N. The immunology of susceptibility and resistance to Leishmania major in mice. Nature Reviews Immunology. 2 (11), 845-858 (2002).
  32. Bogdan, C., et al. Experimental Cutaneous Leishmaniasis: Mouse Models for Resolution of Inflammation Versus Chronicity of Disease. Methods in Molecular Biology. 1971, 315-349 (2019).
  33. Jones, D. E., Ackermann, M. R., Wille, U., Hunter, C. A., Scott, P. Early enhanced Th1 response after Leishmania amazonensis infection of C57BL/6 interleukin-10-deficient mice does not lead to resolution of infection. Infection and Immunity. 70 (4), 2151-2158 (2002).
  34. Velasquez, L. G., et al. Distinct courses of infection with Leishmania (L.) amazonensis are observed in BALB/c, BALB/c nude and C57BL/6 mice. Parasitology. 143 (6), 692-703 (2016).
  35. de Menezes, J. P., et al. Leishmania infection inhibits macrophage motility by altering F-actin dynamics and the expression of adhesion complex proteins. Cellular Microbiology. 19 (3), 1266 (2017).
  36. Mittra, B., et al. A Trypanosomatid Iron Transporter that Regulates Mitochondrial Function Is Required for Leishmania amazonensis Virulence. PLoS Pathogens. 12 (1), e1005340 (2016).
  37. Zilberstein, D., Nitzan Koren, R. Host-Free Systems for Differentiation of Axenic Leishmania. Methods in Molecular Biology. 1971, 1-8 (2019).
  38. Zilberstein, D., Shapira, M. The role of pH and temperature in the development of Leishmania parasites. Annual Review of Microbiology. 48, 449-470 (1994).
  39. Dumetz, F., et al. Modulation of Aneuploidy in Leishmania donovani during adaptation to different in vitro and in vivo environments and its impact on gene expression. MBio. 8 (3), e00599-e00517 (2017).
  40. Sinha, R., et al. Genome Plasticity in Cultured Leishmania donovani: Comparison of Early and Late Passages. Frontiers in Microbiology. 9, 1279 (2018).
  41. Magalhães, R. D., et al. Identification of differentially expressed proteins from Leishmania amazonensis associated with the loss of virulence of the parasites. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (4), e2764 (2014).
  42. Lei, S. M., Romine, N. M., Beetham, J. K. Population changes in Leishmania chagasi promastigote developmental stages due to serial passage. Journal of Parasitology. 96 (6), 1134-1138 (2010).
  43. Ali, K. S., Rees, R. C., Terrell-Nield, C., Ali, S. A. Virulence loss and amastigote transformation failure determine host cell responses to Leishmania mexicana. Parasite Immunology. 35 (12), 441-456 (2013).
  44. Rebello, K. M., et al. Leishmania (Viannia) braziliensis: influence of successive in vitro cultivation on the expression of promastigote proteinases. Experimental Parasitology. 126 (4), 570-576 (2010).
  45. Johns Hopkins Animal Care and Use Program. , The Johns Hopkins University Animal Care and Use Committee. http://web.jhu.edu/animalcare/index.html (2019).
  46. Titus, R. G., Marchand, M., Boon, T., Louis, J. A. A limiting dilution assay for quantifying Leishmania major in tissues of infected mice. Parasite Immunology. 7 (5), 545-555 (1985).
  47. Lima, H. C., Bleyenberg, J. A., Titus, R. G. A simple method for quantifying Leishmania in tissues of infected animals. Parasitology Today. 13 (2), 80-82 (1997).
  48. Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. , (1997).
  49. Sacks, D., Kamhawi, S. Molecular aspects of parasite-vector and vector-host interactions in leishmaniasis. Annual Review of Microbiology. 55, 453-483 (2001).
  50. Reimão, J. Q., et al. Parasite burden in Leishmania (Leishmania) amazonensis-infected mice: validation of luciferase as a quantitative tool. Journal of Microbiological Methods. 93 (2), 95-101 (2013).
  51. Buckley, S. M., et al. In vivo bioimaging with tissue-specific transcription factor activated luciferase reporters. Scientific Reports. 5, 11842 (2015).
  52. Thalhofer, C. J., et al. In vivo imaging of transgenic Leishmania parasites in a live host. Journal of Visualized Experiments. (41), e1980 (2010).
  53. Roberts, S. C., et al. Arginase plays a pivotal role in polyamine precursor metabolism in Leishmania. Characterization of gene deletion mutants. The Journal of Biological Chemistry. 279 (22), 23668-23678 (2004).
  54. Boitz, J. M., et al. Arginase Is Essential for Survival of Leishmania donovani Promastigotes but Not Intracellular Amastigotes. Infection and Immunity. 85 (1), e00554 (2017).
  55. Rosas, L. E., et al. Genetic background influences immune responses and disease outcome of cutaneous L. mexicana infection in mice. International Immunology. 17 (10), 1347-1357 (2005).
  56. Belkaid, Y., et al. Development of a natural model of cutaneous leishmaniasis: powerful effects of vector saliva and saliva preexposure on the long-term outcome of Leishmania major infection in the mouse ear dermis. Journal of Experimental Medicine. 188 (10), 1941-1953 (1998).
  57. Titus, R. G., Ribeiro, J. M. Salivary gland lysates from the sand fly Lutzomyia longipalpis enhance Leishmania infectivity. Science. 239 (4845), 1306-1308 (1988).
  58. Lima, H. C., Titus, R. G. Effects of sand fly vector saliva on development of cutaneous lesions and the immune response to Leishmania braziliensis in BALB/c mice. Infection and Immunity. 64 (12), 5442-5445 (1996).
  59. Theodos, C. M., Ribeiro, J. M., Titus, R. G. Analysis of enhancing effect of sand fly saliva on Leishmania infection in mice. Infection and Immunity. 59 (5), 1592-1598 (1991).
  60. Kaur, S., et al. Effect of dose and route of inoculation on the generation of CD4+ Th1/Th2 type of immune response in murine visceral leishmaniasis. Parasitology Research. 103 (6), 1413-1419 (2008).
  61. Rolão, N., Melo, C., Campino, L. Influence of the inoculation route in BALB/c mice infected by Leishmania infantum. Acta Tropica. 90 (1), 123-126 (2004).
  62. Kébaïer, C., Louzir, H., Chenik, M., Ben Salah, A., Dellagi, K. Heterogeneity of wild Leishmania major isolates in experimental murine pathogenicity and specific immune response. Infection and Immunity. 69 (8), 4906-4915 (2001).
  63. Baldwin, T. M., Elso, C., Curtis, J., Buckingham, L., Handman, E. The site of Leishmania major infection determines disease severity and immune responses. Infection and Immunity. 71 (12), 6830-6834 (2003).
  64. Aoki, J. I., et al. RNA-seq transcriptional profiling of Leishmania amazonensis reveals an arginase-dependent gene expression regulation. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (10), e0006026 (2017).
  65. Pinto-da-Silva, L. H., et al. The 3A1-La monoclonal antibody reveals key features of Leishmania (L) amazonensis metacyclic promastigotes and inhibits procyclics attachment to the sand fly midgut. International Journal for Parasitology. 35 (7), 757-764 (2005).
  66. Spath, G. F., Beverley, S. M. A lipophosphoglycan-independent method for isolation of infective Leishmania metacyclic promastigotes by density gradient centrifugation. Experimental Parasitology. 99 (2), 97-103 (2001).
  67. Aoki, J. I., Laranjeira-Silva, M. F., Muxel, S. M., Floeter-Winter, L. M. The impact of arginase activity on virulence factors of Leishmania amazonensis. Current Opinion in Microbiology. 52, 110-115 (2019).
  68. Jackson, A. P. The evolution of amastin surface glycoproteins in trypanosomatid parasites. Molecular Biology and Evolution. 27 (1), 33-45 (2010).
  69. Rochette, A., et al. Characterization and developmental gene regulation of a large gene family encoding amastin surface proteins in Leishmania spp. Molecular and Biochemical Parasitology. 140 (2), 205-220 (2005).
  70. Rochette, A., Raymond, F., Corbeil, J., Ouellette, M., Papadopoulou, B. Whole-genome comparative RNA expression profiling of axenic and intracellular amastigote forms of Leishmania infantum. Molecular and Biochemical Parasitology. 165 (1), 32-47 (2009).
  71. Schneider, P., Rosat, J. P., Bouvier, J., Louis, J., Bordier, C. Leishmania major: differential regulation of the surface metalloprotease in amastigote and promastigote stages. Experimental Parasitology. 75 (2), 196-206 (1992).
  72. Ji, J., Sun, J., Qi, H., Soong, L. Analysis of T helper cell responses during infection with Leishmania amazonensis. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 66 (4), 338-345 (2002).
  73. Ji, J., Sun, J., Soong, L. Impaired expression of inflammatory cytokines and chemokines at early stages of infection with Leishmania amazonensis. Infection and Immunity. 71 (8), 4278-4288 (2003).
  74. Felizardo, T. C., Toma, L. S., Borges, N. B., Lima, G. M., Abrahamsohn, I. A. Leishmania (Leishmania) amazonensis infection and dissemination in mice inoculated with stationary-phase or with purified metacyclic promastigotes. Parasitology. 134 (12), 1699-1707 (2007).
  75. Laranjeira-Silva, M. F., Zampieri, R. A., Muxel, S. M., Floeter-Winter, L. M., Markus, R. P. Melatonin attenuates Leishmania (L.) amazonensis infection by modulating arginine metabolism. Journal of Pineal Research. 59 (4), 478-487 (2015).

Tags

Иммунология и инфекция Выпуск 156 C57BL/6 мышей воспаление ответ паразит нагрузки развитие поражения кожной инфекции топорные amastigotes
В Vivo инфекции с <em>Лейшмания amazonensis</em> для оценки паразитов virulence у мышей
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Aoki, J. I., Hong, A., Zampieri, R.More

Aoki, J. I., Hong, A., Zampieri, R. A., Floeter-Winter, L. M., Laranjeira-Silva, M. F. In Vivo Infection with Leishmania amazonensis to Evaluate Parasite Virulence in Mice. J. Vis. Exp. (156), e60617, doi:10.3791/60617 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter