Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

In Vivo Infektion med Leishmania amazonensis att utvärdera parasit virulens i möss

Published: February 20, 2020 doi: 10.3791/60617
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Physiology, Institute of Bioscience, University of Sao Paulo

Summary

Här presenterar vi ett sammanställt protokoll för att utvärdera den testninginfektion av möss med Leishmania amazonensis. Detta är en tillförlitlig metod för att studera parasitvirulens, vilket möjliggör en systemisk bild av ryggradsdjur värd svar på infektionen.

Abstract

Leishmania spp. är protozoiska parasiter som orsakar leishmaniases, sjukdomar som presenterar ett brett spektrum av kliniska manifestationer från testning till viscerala skador. För närvarande beräknas 12 miljoner människor vara smittade med Leishmania över hela världen och över 1 miljard människor lever med risk för infektion. Leishmania amazonensis är endemisk i Central-och Sydamerika och leder vanligtvis till den testningform av sjukdomen, som direkt kan visualiseras i en djurmodell. Därför är L. amazonensis stammar bra modeller för testning leishmaniasis studier eftersom de också lätt odlas in vitro. C57BL/6 möss härmar L. amazonensis-drivensjukdomprogression observerats hos människor och anses vara en av de bästa mössstammar na modell för testning leishmaniasis. I ryggradsdjur värd, dessa parasiter bebor makrofager trots försvarsmekanismer av dessa celler. Flera studier använder in vitro makrofaginfektion analyser för att utvärdera parasiten smittsamhet under olika förhållanden. In vitro-metoden är dock begränsad till ett isolerat cellsystem som bortser från organismens svar. Här sammanställer vi en in vivo-infektionsmetod som ger en systemisk fysiologisk översikt över host-parasitinteraktionen. Det detaljerade protokollet för in vivo-infektion en C57BL/6 möss med L. amazonensis består av parasitdifferentiering till infekterande amastigotes, möss fotpad testning inokulering, lesion utveckling och parasit belastning bestämning. Vi föreslår denna väletablerade metod som den mest adekvata metoden för fysiologiska studier av värden immun och metaboliska svar på testning leishmaniasis.

Introduction

Leishmaniases är världsomfattande parasitiska infektionssjukdomar som representerar viktiga utmaningar i utvecklingsländerna och erkänns som en av de viktigaste försummade tropiska sjukdomar av Världshälsoorganisationen1,2. Leishmaniases kännetecknas av testning, slemhinnor och / eller visceral manifestationer. Testning leishmaniasis orsakas vanligtvis av L. amazonensis, L. mexicana, L. braziliensis, L. guyanensis, L. major, L. tropica och L. aethiopica3. Denna form av sjukdomen är ofta självläkande hos människor på grund av induktion av skyddande cellulära immunsvar. Men den cellulära immunsvaret kan misslyckas, och sjukdomen kan utvecklas till spridas testning leishmaniasis4,5. Det finns inget tillgängligt vaccin på grund av mångfalden bland Leishmania arter och värd genetiska bakgrunder6,7. Behandlingsalternativen är också begränsade eftersom de flesta av de läkemedel som för närvarande finns är dyra, giftiga och/eller kan kräva långtidsbehandling8,9. Dessutom har det förekommit rapporter om läkemedelsresistens mot tillgängliga behandlingar10,11.

Den orsakande agenten för leishmaniases är den protozoiska parasiten Leishmania. Parasiten presenterar två distinkta morfologiska former i sin livscykel: promastigotes, den flagelerade formen som finns i sandflugor; och amastigotes, den intracellulära formen finns i parasitofforösa vacuoles av däggdjur värd makrofager12,13. Amastigotes förmåga att invadera, överleva och replikera trots försvarsmekanismerna i ryggradsdjur värdens makrofager är föremål för många studier14,15,16,17. Följaktligen har flera forskargrupper beskrivit in vitro makrofaginfektion analyser för att utvärdera effekterna av specifika miljöfaktorer, liksom parasit och värd gener på parasit smittsamhet. Denna analys presenterar flera fördelar, såsom förmågan att anpassa studier till ett högt genomströmningsformat, relativt kortare tidsperiod för att få resultat, och minskat antal försöksdjur offras18. Resultaten av in vitro-analyser är dock begränsade eftersom de inte alltid replikerar in vivo-studier14,19,20,21. In vivo-analyser ger en systemisk fysiologisk översikt över host-parasitinteraktionen, som inte helt kan härmas av in vitro-analyser. Till exempel, immunologiska studier kan utföras genom immunohistochemical analyser från insamlade fotdyna vävnad sektioner eller ens från popliteal lymfkörtlar för analys av återvunna immunceller22.

Djur används ofta som en modell för mänskliga sjukdomar i biologisk och biomedicinsk forskning för att bättre förstå de underliggande fysiologiska mekanismerna för sjukdomarna23. När det gäller leishmaniasis, rutten, platsen eller dosen av inokulering påverkar sjukdomsutfallet24,25,26,27. Dessutom regleras känslighet och resistens mot infektionen hos människor och möss starkt av värdens och parasitens genetiska bakgrund4,5,22,28,29,30,31. BALB/c möss är mycket mottagliga för L. amazonensis testning infektion, visar en snabb sjukdom progression med parasiternaspridning till lymfkörtlarna, mjälte och lever32. Eftersom sjukdomen kan utvecklas till testning metastaser, infektionen kan vara dödlig. Däremot utvecklar C57BL/6 möss ofta kroniska lesioner med ihållande parasitbelastningar i L. amazonensinfektion sa33. Därmed l. amazonensis infektion med just denna mus arter har ansetts vara en utmärkt modell för att studera kroniska former av testning leishmaniasis hos människor, eftersom det härmar sjukdomen progression bättre än BALB / c möss infektion modell5,34.

Därför föreslår vi att musinin vivo infektion är en användbar metod för Leishmania virulens fysiologiska studier som gäller för människors sjukdom, vilket möjliggör en systemisk bild av värd-parasit interaktion. Återbesök väletablerade analyser22, presenterar vi här en sammanställs steg-för-steg-protokoll av in vivo infektion av C57BL/6 möss med L. amazonensis som består av parasitdifferentiering i axenic amastigotes, möss footpad testning inokulering, lesion utveckling, och parasit belastning bestämning. Detta protokoll kan anpassas till andra möss stammar och Leishmania arter som orsakar testning leishmaniases. Sammanfattningsvis är den metod som presenteras här avgörande för att identifiera nyaanti-Leishmania läkemedelsmål och vacciner, liksom i fysiologiska studier av värdimmun och metaboliska svar på Leishmania infektion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla experimentella förfaranden godkändes av kommittén för djurvård och användning vid Institutet för biovetenskap vid universitetet i São Paulo (CEUA 342/2019), och genomfördes i enlighet med rekommendationerna och policyerna för vård och användning av laboratoriedjur i staten São Paulo (Lei Estadual 11.977, de 25/08/2005) och den brasilianska regeringen (Lei Federal 11.794, de 08/10/2008). Alla steg som beskrivs i avsnitten 1-5 bör utföras aseptiskt inuti laminarflödesskåp. Personlig skyddsutrustning bör användas vid hantering av levande Leishmania parasiter.

1. I Vitro Differentiering av L. amazonensis Promastigotes i Axenic Amastigotes15,20,35,36,37,38

OBS: L. amazonensis (MHOM/BR/1973/M2269) (La) parasit användes i denna analys. Beroende på studiesyftet kan den infekterande parasitformen erhållas antingen genom rening av den metacykliska formen med hjälp av en densitetsgradient, som tidigare beskrivits14, eller genom differentiering av promastigotes till yxniska amastigotes, enligt följande protokoll.

  1. Odla La promastigotes i en 25 cm2 cell odlingkolv som innehåller 10 ml medium för promastigotes (pro-medium) (pH = 7,0).
  2. Inkubera vid 25 °C i 3 dagar.
    OBS: Använd promastigote kulturer som var passager in vitro mindre än 10x för att undvika förlust av virulens och aneuploidy förändringar av parasiter39,40,41,42,43,44.
  3. Pipette 5 ml logaritmisk tillväxtfas promastigote kultur i en ny 25 cm2 kolv.
  4. Tillsätt 5 ml medium för axenic amastigotes (ama-medium) (pH = 5,2).
  5. Inkubera vid 34 °C i 3-4 dagar.
  6. Dela upp kulturen genom att späda med ama-medium med ett förhållande av 1:3 i en ny 25 cm2 kolv.
  7. Inkubera vid 34 °C i 3-5 dagar.
    OBS: Inkubera de axenic amastigotes i upp till 5 dagar, eftersom det representerar slutet av mognad37.

2. C57BL/6 Fotramp infektion med L. amazonensis

NOTERA: Kvinnliga C57BL/6 möss (6-8 veckor) erhölls och underhålls vid Animal Center vid Biomedical Sciences Institute vid University of São Paulo. Djur fick mat och vatten ad libitum.

  1. Räkna kulturen av axenic amastigotes genom att överföra en alikvot av parasiten suspension utspädd i PBS till en Neubauer kammare (dvs. hemocytometer). Räkna de icke-flagerade parasiterna, som representerar amastigotes former.
    OBS: Alternativt kan Trypan blå (1:1) användas för att räkna antalet livskraftiga amastigotes (dvs. de som inte färgas med Trypan blå).
  2. Späd yxanska amastigotes i PBS enligt önskad inokulärdos och antalet inokulat avsedda (1 x 106 axenic amastigotes i 50 μL PBS rekommenderas).
  3. Fyll en tuberkulinspruta med en 27 G nål med den förberedda parasitsuspensionen.
  4. Anesthetize en C57BL/6 mus med 3-5% isofluran, som rekommenderas av Johns Hopkins University Animal Care and Use Committee45. Utvärdera bedövningsdjupet genom att testa musens svar på en tå nypa.
  5. Inokulera 50 μl av den homogeniserade parasitsuspensionen (1 x 106 yxanigoter eller önskad inokulärdos) i den vänstra bakfotplattans subplantarvävnad med hjälp av den tidigare laddade tuberkulinsprutan (steg 2.3).

3. Mus fotramp lesion utveckling

  1. Mät lesionens progression en gång i veckan genom att mäta tjockleken på de vänstra (infekterade) och de högra (icke-infekterade) fotplattorna med hjälp av ett bromsok.
  2. Beräkna skillnaden mellan tjockleken mellan vänster och höger bakfotblock varje vecka för att utvärdera lesion progression.
  3. Rita de beräknade skillnaderna på Y-axeln och infektionstiden på X-axeln och beräkna den statistiska betydelsen.
    OBS: I enlighet med djurvårds- och användningskommittéernas rekommendationer måste djuren offras innan den infekterade lesionen blir ulcererad, eftersom hudsår kan leda till sekundär infektion. Som visas i Kompletterande figur 1,det tar cirka 10 veckor för skador att presentera tecken på ulceration med parasitdosen (106 yxanska amastigotes) och värdstam (C57BL/6) som används i detta protokoll. Mössen ska offras för lesionextraktion innan tecken på sår observeras.

4. Möss Footpad Lesion Extraktion och parasitbegränsa utspädning

  1. Förbered en 96 brunnsplatta (platt botten) för den begränsande utspädningsanalysen46,47 genom att lägga till 180 μl pro-medium till alla brunnar.
    OBS: Använd fyra skyltbanor (halva plattan) för varje djur, som representerar fyrdubbla analyser (dvs. djur 1 = körfält A-D; djur 2 = körfält E-H).
  2. Tillsätt 1 ml pro-medium i ett glasvävnadkvarnrör per lesion och väg röret.
    OBS: Röret måste hållas sterilt, så använd ett sterilt lock och väg röret med det stängda locket, om det väger utanför laminarflödesskåpet.
  3. Offra djuret i en CO2 kammare, enligt Animal Care and Use committees rekommendationer. Desinficera djuret genom att spruta med 70 % etanol.
  4. Punktskatt djurets fot på det klackar för att extrahera den infekterade fotplattan och spraya 70% etanol på fotplattan för desinfektion. Se till att sterilisering en sax och pincett ska vara blöt genom att hålla dem indränkta i 70% etanol.
  5. Placera den infekterade fotplattan i en steril Petri skålen och dissekera med sterila pincett och en skalpell för att samla alla mjuka vävnader. Kasta benen.
    OBS: Enhetlighet i dissekeringssteget rekommenderas för att undvika partisk vävnadsåterhämtning.
  6. Överför de insamlade vävnaderna till glasvävnadskårröret med pro-medium, väg sedan röret igen för att bestämma lesionvikten.
    OBS: Undvik att placera pincett och skalpell direkt i mediet, eftersom små volymer kan tas bort, vilket resulterar i en underskattad vävnadsvikt. Lesionens vikt beräknas genom att rörets vikt subtraheras med promediet med den insamlade vävnaden från rörets vikt som endast innehåller pro-medium.
  7. Homogenisera vävnaden 10x med hjälp av kvarnen för fullständig vävnadsstörningar.
  8. Låt blandningen sedimenti 10 min, samla sedan 20 μL av supernatant.
  9. Last 20 μL av supernatanten i den1:a kolumnen i den1:a körfält på 96 brunnsplattan som är förberedd i steg 4.1. Upprepa detta för de kommande tre körfält en fyrdubbeltid för varje djur (dvs. för djur 1 tillsätt 20 μL till varje brunn och etikett A1, B1, C1 och D1).
  10. Homogenisera varje brunn i 1st kolumn 10x med hjälp av en flerkanalig pipett. Överför sedan 20 μL av de utspädda proverna från den1:a kolumnen till den2:a kolumnen.
    OBS: Det är viktigt att homogenisera varje brunn 10x från en kolumn till nästa.
  11. Upprepa steg 4.10 till alla återstående kolumner fram till den sista kolumnen (12th)och kassera det slutliga 20 μl utspädda provet.
    OBS: Byt tips efter varje utspädning för att undvika korskontaminering.
  12. Försegla plattorna med en film och inkubera vid 25 °C i 7 dagar i en fuktig kammare.

5. Lesion Parasit belastning bestämning

  1. Analysera plattorna efter 7 dagars inkubation med hjälp av ett inverterat mikroskop för att bestämma den sista parasiten som innehåller brunn för varje körfält.
    OBS: Det är också möjligt att ha en indikation på tillväxten av parasiterna, eller celldensitet, genom visuell analys av färgförändringar och grumlighet av mediet.
  2. Beräkna parasitvävnadsbelastningen för varje körfält genom att dividera utspädningsfaktorn per lesionvikt.
    OBS: I ett specifikt körfält, om parasiter endast finns i kolumnerna 1-5 (dvs. brunnar A1-A5 är positiva för parasittillväxt), innebär detta att kolumn 5 innehöll endast 1 parasit, kolumn 4 innehöll 10 parasiter, och så vidare, i multiplar av tio. Kolumn 1 skulle innehålla 104 parasiter, som representerar antalet parasiter i de ursprungliga 20 μl supernatant (det icke-utspädda provet i steg 4.7). Eftersom detta 20 μL späddes med 180 μl pro-medium innehöll det ursprungliga röret 5 x 105 parasiter: (1 x 104) / (0,02 ml) = 5 x 105 parasiter/1 ml. Därefter kan parasitbelastningen i lesionen beräknas genom att dividera parasitens initiala koncentration med lesionvikten: (5 x 105) / lesionvikt (se steg 4.6).
  3. Rita genomsnittet av det fyrdubblade resultatet för varje djur med en stock Y-skala.

6. Statistisk analys

  1. Representera uppgifterna som genomsnittlig ± standardavvikelse med minst fem djur per försöksgrupp som replikat.
  2. Utför statistisk analys med oparade tvåsidiga test, med tanke på ett p-värde < 0,05 som signifikant.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Leishmania protozoan parasiter finns i två utvecklingsformer under sin livscykel i ryggradslösa och ryggradslösa värdar: promastigotes, de proliferativa former som finns i lumen av den kvinnliga sandflugen; och amastigotes, de proliferativa former som finns i parasitofforösa vacuoles av däggdjurvärdceller. Promastigotes har en långsträckt kropp på ca 1,5 μm bred och 20 μm lång, med en flagellum som vanligtvis kommer från den främre änden. Amastigotes har en rundad eller ägglös kropp som varierar i storlek från 2-6 μm i längd och 1,5-3 μm i bredd, och har en ouppenbar flagellum12,13 (figur 1A). Under blodmåltiden förvärvar den ryggradslösa värden, en hematophagous insekt i familjen Psychodidae, makrofager infekterade med Leishmania amastigotes. När dessa celler når sandfluga matsmältningsröret frigörs amastigotes och skiljer åt procykliska promastigotes(figur 1A). Dessa former är noninfective och multiplicera intensivt med binära division och kolonisera matsmältningsröret av insektsvektorn. De procykliska formerna skiljer sedan till metacykliska former, en smittsam och snabbrörlig form, som presenterar en tunnare kropp och långsträckt flagellum(figur 1A). Metacykliska former invaderar de främre delarna av matstrupen och proventriculus av sandflugan, så att under nästa blodmåltid, regurgitation säkerställer inokulering av dessa infekteraformer till en ny ryggradsdjur värd. I tegumenten av ryggradsdjur värd, parasiterna är fagocytosed av makrofager och differentiera till amastigotes inuti parasitofforösa vacuoles, där amastigotes multiplicera med binära division och slutföra livscykeln för Leishmania12,13.

Axenic villkor kan simulera olika värdmiljöer in vitro, upprätthålla parasiten morfologi och livskraft. Axenic villkor för amastigotes beskrevs tidigare simulera en makrofag parasitophorous vacuole miljö och utlöser promastigote in vitro differentiering i amastigote form37. Dessa förhållanden efterliknar den sura miljön (pH = 5,5) och den ökade temperaturen på ryggradsdjur värdar (34 °C). Figur 1B illustrerar promastigotes differentierade till amastigotes genom att ändra dessa förhållanden i kultur. Livskraften hos dessa yxniska amastigotes kan analyseras genom Trypan blå färgning, en metod baserad på principen att levande celler har intakta membran som utesluter vissa färgämnen, medan döda celler inte48. Alternativt analyserade vi lönsamheten hos yxanska amastigotes som verifierade deras förmåga att omvandla tillbaka till promastigotes när de överförs till neutralt pH och ruvade vid 25 °C (figur 1B).

Här föreslår vi en in vivo infektion metod för att utvärdera virulens av olika Leishmania stammar. Figur 2A representerar en in vivo infektion analys som visar testning lesion utveckling av C57BL/6 möss fotplattor som var infekterade med vild typ(La-WT) och Leishmania Iron Regulator 1 knockout(La-LIR1-/-) L. amazonensis renade metacykliska. LIR1 reglerar intracellulära järnnivåer i Leishmania medla järn export och förhindra dess intracellulära ackumulering till giftiga nivåer14. Observera utvecklingen av tjockleksskillnaderna hos de infekterade kontra noninfected footpads, kunde vi visa att La-LIR1-/- infekterade möss presenterade mindre skador än La-WT infekterade möss(figur 2A). Dessa resultat visade att LIR1 är avgörande för L. amazonensis in vivo virulence. Detta visar vikten och effekten av denna metod vid bedömningen av skillnaderna i Leishmania-driventestning sjukdomar. Figur 2B illustrerar de ickeinfekterade (höger) och infekterade (vänster) fotplattor na och lesionutveckling 73 dagar efter infektion, som visar skillnaderna i svullnad och lesionprogression av La-WT och La-LIR1-/- infekterade möss.

Utvecklingen av Leishmania-infektionen består inte bara av lesionutvecklingen, som representerar det inflammatoriska svaret, utan även parasitens intracellulära replikation. För att utvärdera parasitreplikationen bestämdes parasitbelastningen av lesionerna genom att extrahera den infekterade lesionen, följt av en begränsande utspädningsanalys i en 96 brunnsplatta (figur 3A). Figur 3B visar parasitbelastningsanalysen av fotplattans lesioner från La-WT och La-LIR1-/- infekterade möss efter 73 dagars infektion. Från den begränsande utspädningsanalysen upptäckte vi 106-faldiga färre parasiter i lesionen av La-LIR1-/- infekterade möss i jämförelse med La-WT, vilket avslöjar att frånvaron av LIR1 förhindrar intracellulär replikering av amastigotes14.

En av fördelarna med att utvärdera både lesionutveckling och parasitbelastning är att upptäcka möjliga skillnader i parasitintracellulär replikation och värdinflammatorisk reaktion. Vi observerade skillnader mellan dessa två fenotyper med hjälp av add-back LIR1(La-LIR1AB),som är La-LIR1-/- med LIR1 ORF integreras tillbaka i ribosomal locus14. När La-LIR1AB injicerades i en mus fotramp, observerade vi mellanliggande storlek skador jämfört med La-LIR1-/- och La-WT infektioner men en anmärkningsvärd full parasit belastning räddning av La-WT fenotyp(Kompletterande Figur 2). Dessa resultat tyder på att La-LIR1AB parasiter kunde replikera som La-WT parasiter i en långsiktig in vivo infektion. Musinflammatoriska svar förvärrades dock inte lika mycket som La-WT-infektioner eftersom lesionerna var betydligt mindre.

Därmed visade sig den metod som beskrivs här vara avgörande för identifiering och karakterisering av en L. amazonensis virulens faktor som krävs för framgångsrik amastigote intracellulär replikering och testning lesion utveckling i däggdjur värdar.

Figure 1
Figur 1: Morfologi av L. amazonensis promastigotes och amastigotes. (A) Illustrationer av de olika morfologiska formerna av Leishmania: procyklisk promastigote, metacyklisk promastigote och amastigote. Skalstång = 2 μm. (B) Bilder av in vitro L. amazonensis kulturer. In vitro differentiation av promastigotes i axenic amastigotes, och av axenic amastigotes tillbaka till promastigotes genom att ändra pH och temperaturförhållanden, som beskrivs i steg-för-steg-protokollet. Bilderna togs med hjälp av ett inverterat mikroskop. Skalstång = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: LIR1 knockout minskar markant L. amazonensis in vivo lesion utveckling. C57BL/6 möss inokulerades i vänster bakfotblock med 106 renade metacykliska l. amazonensis wild type (La-WT) och L. amazonensis LIR1 knockout(La-LIR1-/-). (A)Footpad testning lesion progression av La-WT och La-LIR1-/- infekterade möss analyseras varje vecka. Uppgifterna representerar den genomsnittliga ± SEM för den infekterade fotplattan subtraheras av noninfected footpad tjocklek från fem olika möss i varje grupp (anpassad från Laranjeira-Silva et al.14). (B)Bilder av de ickeinfekterade och infekterade fotplattorna i La-WT och La-LIR1-/- infekterade möss som visar skillnaderna i svullnad 73 dagar efterinfektion (anpassad från Laranjeira-Silva et al.14). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Bild 3: LIR1 knockout minskar markant L. amazonensis in vivo intracellulär replikering. (A)En illustration av en 96 brunnsplatta som representerar 10x serieutspädningar av de återvunna fotdynornavävnader infekterade med L. amazonensis wild type(La-WT) och LIR1 knockout(La-LIR1-/-). Rad A-D representerar fyrdubblandet av de seriella utspädningarna av la-WT-fotplattans lesionprov. Rader E-H representerar fyrdubblandet av de seriella utspädningarna av La-LIR1-/--fotplattanlesionprov. De olika grånyanserna representerar de observerade celltätheterna per brunn (dvs. ljusare färg innebär färre parasiter). Brunnarna markerade i rött representerar de sista brunnarna som innehöll parasiter per replikat. (B)Parasitbelastning i återvunna fotdynevävnader av C57BL/6 möss infekterade med 106 renade metacykliska l. amazonensis wild type(La-WT) och L. amazonensis LIR1 knockout(La-LIR1-/-) bestäms 73 dagar efterinfektion. Data representerar genomsnittet av parasitbelastningen per mg vävnad från fem olika möss i varje grupp (anpassad från Laranjeira-Silva et al.14). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Supplementary Figure 1
Kompletterande figur 1: Hudsår som ett tecken på en sekundär infektion. Representativa bilder på C57BL/6 möss fotplattor infekterade med L. amazonensis vild typ(La-WT) tagit 80 dagar efterinfektion. Röda pilar pekar på tecken på ulceration, vilket indikerar att experimentet bör avslutas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Supplementary Figure 2
Kompletterande figur 2: LIR1:s roll på in vivo-lesionutveckling och intracellulär parasitreplikation. C57BL/6 möss inokulerades i vänster bakfotblock med 106 renade metacyclics av L. amazonensis vild typ (La-WT), L. amazonensis LIR1 knockout(La-LIR1-/-), och L. amazonensis LIR1 add-back(La-LIR1AB). (A)Footpad testning lesion progression av La-WT, La-LIR1-/-, och La-LIR1AB infekterade möss analyseras varje vecka. Uppgifterna representerar den genomsnittliga ± SEM för den infekterade fotplattan subtraheras av noninfected footpad tjocklek från fem olika möss i varje grupp (anpassad från Laranjeira-Silva et al.14). (B)Parasitbelastning i återvunna fotdynevävnader från La-WT, La-LIR1-/-eller La-LIR1AB infekterade möss bestäms 73 dagar efter infektion. Data representerar genomsnittet av parasitbelastningen per mg vävnad från fem olika möss i varje grupp (anpassad från Laranjeira-Silva et al.14). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In vivo infektion analys som beskrivs i detta protokoll tillåter alla forskare att utvärdera in vivo testning leishmaniasis med tanke på värd-parasit interaktion i ett systemiskt scenario. Dessa analyser har använts av många grupper22,24,27,29,31,32,34,49 och här sammanställde vi ett steg-för-steg-protokoll för att standardisera denna metod samtidigt som man överväger de infrastrukturbegränsningar som vissa grupper kan ha. Detta protokoll kan också användas för att utvärdera virulens av transgena Leishmania parasiter genom in vivo bioimaging50,51,52. Som alla andra experimentella förfarande, denna analys har begränsningar och kritiska åtgärder för att utföra, såsom att kräva utbildad personal som är bekväm att arbeta med möss och har erfarenhet av att utföra subplantar injektioner för att undvika oavsiktliga infektioner. Standardisera protokoll är oerhört viktigt att undvika partiska resultat och att producera jämförbara resultat mellan olika forskargrupper.

Den största fördelen med att använda L. amazonensis som en modell för testning leishmaniases är att fotplattan lesion orsakas av denna art kan lätt bedömas på möss. Svullnaden av fotplattan bestäms av den metod som beskrivs här representerar summan av två infektion fenotyper: värd inflammatorisk reaktion och parasit replikation. Båda fenotyperna kan utvärderas separat genom att associera parasitvävnadsbelastningsmetoden som återspeglar parasitintracellulär replikation med bestämningen av lesiontjockleksprogressionen. En annan fördel är att L. amazonensispromastigotes lätt odlas in vitro. Med tanke på dessa, kan någon forskargrupp manipulera denna Leishmania arter enligt deras behov. Resultaten från L. amazonensisstudier kan sedan jämföras med andra Leishmania arter för att avgöra om en viss väg är evolutionärt bevaras eller divergerande21,53,54.

I den naturliga cykeln, Leishmania överföring till ryggradsdjur värd sker genom bett av en infekterad sand flyga under blodmåltiden. Sandflugan brukar vaccinera några hundra Leishmania metacykliska promastigote former i insektens saliv. Vid experimentella in vivo infektioner, den vanligaste platsen för inokulering är djurets fotramp22. Intradermala injektion i örat eller intraperitoneal injektion är alternativa platser för inokulering beroende på studiesyfte eftersom varje plats presenterar olika fagocytiska celltyper24,56. Därför använder vissa forskargrupper laboratorieinfekterade sandflugor för att infektera djurets örondermis för att efterlikna den naturliga transmissionen56,57,58,59. Detta protokoll innehåller dock vissa begränsningar, såsom underhåll av sandflugkolonier, vilket kräver anläggningar som inte är tillgängliga för de flesta forskargrupper.

Det ursprungliga arbetet som beskriver in vivo C57BL/6 infektion med La-LIR1-/- har använt renade metacykliska promastigotes former14. Emellertid, Leishmania genetisk manipulation kan försämra antingen promastigotes differentiering i axenic amastigotes14 eller i metacykliska infektionsformer20. Därför, beroende på Leishmania stam, bör forskaren bestämma den mest adekvata metoden för att få livskraftiga infektionsparasit former för sin studie. Protokollet av axenic amastigotes differentierade från promastigote kulturer som beskrivs här kan vara ett enklare alternativ, producerar jämförbara resultat i många fall19,20,35,37,38,64. Detta tillvägagångssätt undviker användning av andra metoder som vanligtvis resulterar i lägre avkastning av infektionsparasiter, såsom inkubering promastigotes med specifika men inte allmänt tillgängliga antikroppar65 för metacykliska promastigotes rening, eller genom densitet lutning beroende av metacyclics LPG uttryck18,66. Effektiviteten i differentieringsprotokollet kan utvärderas genom att bestämma uttrycksnivåerna för amastin-familjegener64,67. Amastiner är medlemmar i en bevarad genfamilj som är differentially moduleras under Leishmania livscykel68 och är associerade med parasit virulens och patogenes67,69,70. Andra markörer kan också användas för att skilja amastigot från promastigote former. Till exempel är gp63 downregulated i amastigotes, eftersom dess roll är att skydda promastigotes från insektens matsmältningsenzymer71.

Valet av musstam är ett annat kritiskt steg att överväga när man utvecklar ett standardiserat in vivo-infektionsprotokoll. Känslighet och resistens mot Leishmania infektion hos möss regleras främst av genetisk bakgrund29,30,55. I detta protokoll valdes C57BL/6 stammen eftersom dess immunsvar till L. amazonensis är nära besläktad med den blandade Th1-Th2 svar hos människor72,73. Experimentella murine infektioner med L. amazonensis har beskrivits för att orsaka måttliga skador i C57BL/6 möss i jämförelse med andra möss stammar28,34,74. Beroende på parasitstammen kan dock skillnader i lesionstorlek endast upptäckas hos mottagliga mössstammar, som BALB/c36. Tidsförloppet måste också beaktas och korrelerar med de valda mössstam29,26,60,61,62,63,75. Ulcererade fotplattor bör alltid undvikas eftersom det kan representera sekundära infektioner och observeras ofta under långa perioder av infektion, särskilt i experiment med mottagliga möss stammar. Att utse tiden på dagen för att starta infektionen är ytterligare ett steg att överväga. Som visats i tidigare studier med L. amazonensis,tiden för dagen för parasitinokulan påverkar lesion utveckling eftersom värd-parasit interaktion påverkas på ett dygnsrytm sätt av tallkottkörteln frigörs melatonin under den mörka tiden på dagen75.

Den största nackdelen med in vivo infektionmetoden är att experimentet kräver användning av ett stort antal försöksdjur och tar längre tid att få slutresultat jämfört med in vitro infektionmetod18. Emellertid, denna senare aspekt kan också betraktas som en fördel eftersom in vivo resultaten återspeglar den naturliga tidsförloppet av sjukdomsprogression mer exakt än de resultat som erhållits från in vitro infektion. Ännu viktigare är att resultaten från L. amazonensis in vivo infektion kan inte bara återspegla de övergående förändringarna i parasitvirulens utan erkänner också den systemiska statusen för värden och alla dess spelare. Med tanke på de flera faktorer som nämns ovan kan därför den metod som beskrivs i detta protokoll anpassas för att möta specifika experimentella behov av karakterisering av andra mål och behandlingar relaterade till virulens som möjliggör nya insikter för testning leishmaniasis kontroll.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Vi vill tacka professor Dr Niels Olsen Saraiva Câmara från Animal Center of the Biomedical Sciences Institute vid Universitetet i São Paulo för stöd och prof. Dr Silvia Reni Uliana för att tillhandahålla glasvävnad kvarn. Detta arbete stöddes av Sao Paulo Research Foundation (FAPESP - MFLS bidrag 2017/23933-3).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well plate Greiner bio-ne 655180 A flat-bottom plate for limiting dilution assay
adenine Sigma A8626 Supplement added to M199 cell culture media
caliper Mitutoyo 700-118-20 A caliper to measure the thickness of footpad
cell culture flask Corning 353014 A 25 cm2 volume cell culture flask to cultivate Leishmania parasite
centrifuge Eppendorf 5804R An equipament used for separating samples based on its density
CO2 incubator 34 °C Thermo Scientific 3110 An incubator for amastigotes differentiation
ethanol Merck K50237083820 A disinfectant for general items
fetal bovine serum Gibco 12657-029 Supplement added to M199 cell culture media
glass tissue grinder tube Thomas Scientific 3431 E04 A tube to collect and disrupt infected footpad tissue
glucose Synth G1008.01.AH Supplement added to M199 cell culture media
GraphPad Prism Software GraphPad A software used to plot the data and calculate statistical significance
hemin Sigma H-2250 Supplement added to M199 cell culture media
HEPES Promega H5303 Supplement added to M199 cell culture media
incubator 25 °C Fanem 347CD An incubator for promastigotes cultivation
inverted microscope Nikon TMS An equipament used to visual analyze the promastigote and amastigote cultures
isoflurane An inhalant anesthetics for mice (3-5%)
laminar flow cabinet Veco VLFS-09 A biosafety cabinet used for aseptical work area
M199 cell culture media Gibco 31100-035 A cell culture media for Leishmania cultivation
microcentrifuge tube Axygen MCT150C A microtube used for sample collection, processing and storage
multichanel pipette Labsystems F61978 A multichannel pipette used for limiting dilution assay
NaHCO3 Merck 6329 Supplement added to M199 cell culture media
NaOH Sigma S8045 Supplement added to M199 cell culture media
Neubauer chamber HBG 2266 A hemocytometer to count the parasite suspension
optical microscope Nikon E200 An optical equipament used to count parasite
parafilm Bemis 349 A flexible and resistant plastic to seal the plate
penicillin/streptomycin Gibco 15140122 Supplement added to M199 cell culture media
Petri dishes TPP 93100 A sterile dish to dissect the footpad tissue
pipetman kit Gilson F167360 A micropipette kit containing four pipettors (P2 P20 P200 P1000)
scale Quimis BG2000 An equipament used to weigh collected footpad lesions
scalpel Solidor 10237580026 A scalpel to cut and collect footpad tissue
serological pipette 10 mL Nest 327001 A sterile pipette used for transfering mililiter volumes
tips Axygen A pipette tip used for transfering microliter volumes
Trypan blue Gibco 15250-061 A dye used to count viable parasites
trypticase peptone Merck Supplement added to M199 cell culture media
tuberculin syringe BD 305945 A syringe with 27G needle to inoculate the parasite suspension

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alvar, J., et al. Leishmaniasis worldwide and global estimates of its incidence. PloS One. 7 (5), e35671 (2012).
  2. Ashford, R. W. The leishmaniases as emerging and reemerging zoonoses. International Journal for Parasitololy. 30 (12-13), 1269-1281 (2000).
  3. Burza, S., Croft, S. L., Boelaert, M. Leishmaniasis. Lancet. 392 (10151), 951-970 (2018).
  4. Scorza, B. M., Carvalho, E. M., Wilson, M. E. Cutaneous Manifestations of Human and Murine Leishmaniasis. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), e1296 (2017).
  5. Afonso, L. C., Scott, P. Immune responses associated with susceptibility of C57BL/10 mice to Leishmania amazonensis. Infection and Immunity. 61 (7), 2952-2959 (1993).
  6. Khamesipour, A., Rafati, S., Davoudi, N., Maboudi, F., Modabber, F. Leishmaniasis vaccine candidates for development: a global overview. Indian Journal of Medical Research. 123 (3), 423-438 (2006).
  7. Kumar, R., Engwerda, C. Vaccines to prevent leishmaniasis. Clinical & Translational Immunology. 3 (3), e13 (2014).
  8. Murray, H. W., Berman, J. D., Davies, C. R., Saravia, N. G. Advances in leishmaniasis. Lancet. 366 (9496), 1561-1577 (2005).
  9. Hotez, P. J., Bottazzi, M. E., Franco-Paredes, C., Ault, S. K., Periago, M. R. The neglected tropical diseases of Latin America and the Caribbean: a review of disease burden and distribution and a roadmap for control and elimination. PLoS Neglected Tropical Diseases. 2 (9), e300 (2008).
  10. Croft, S. L., Sundar, S., Fairlamb, A. H. Drug resistance in leishmaniasis. Clinical Microbiology Reviews. 19 (1), 111-126 (2006).
  11. Ponte-Sucre, A., et al. Drug resistance and treatment failure in leishmaniasis: A 21st century challenge. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (12), e0006052 (2017).
  12. Teixeira, D. E., et al. The cell biology of Leishmania: how to teach using animations. PLoS Pathogens. 9 (10), e1003594 (2013).
  13. Sunter, J., Gull, K. Shape, form, function and Leishmania pathogenicity: from textbook descriptions to biological understanding. Open Biology Journal. 7 (9), 170165 (2017).
  14. Laranjeira-Silva, M. F., et al. A MFS-like plasma membrane transporter required for Leishmania virulence protects the parasites from iron toxicity. PLoS Pathogens. 14 (6), e1007140 (2018).
  15. Aoki, J. I., et al. L-arginine availability and arginase activity: Characterization of amino acid permease 3 in Leishmania amazonensis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (10), e0006025 (2017).
  16. Probst, C. M., et al. A comparison of two distinct murine macrophage gene expression profiles in response to Leishmania amazonensis infection. BMC Microbiology. 12, 22 (2012).
  17. Dillon, L. A., et al. Simultaneous transcriptional profiling of Leishmania major and its murine macrophage host cell reveals insights into host-pathogen interactions. BMC Genomics. 16, 1108 (2015).
  18. Sarkar, A., Khan, Y. A., Laranjeira-Silva, M. F., Andrews, N. W., Mittra, B. Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites. Journal of Visualized Experiments. (133), e57486 (2018).
  19. Mittra, B., Laranjeira-Silva, M. F., Miguel, D. C., Perrone Bezerra de Menezes, J., Andrews, N. W. The iron-dependent mitochondrial superoxide dismutase SODA promotes. The Journal of Biological Chemistry. 292 (29), 12324-12338 (2017).
  20. Flannery, A. R., Huynh, C., Mittra, B., Mortara, R. A., Andrews, N. W. LFR1 ferric iron reductase of Leishmania amazonensis is essential for the generation of infective parasite forms. The Journal of Biological Chemistry. 286 (26), 23266-23279 (2011).
  21. Laranjeira-Silva, M. F., Zampieri, R. A., Muxel, S. M., Beverley, S. M., Floeter-Winter, L. M. Leishmania amazonensis arginase compartmentalization in the glycosome is important for parasite infectivity. PloS One. 7 (3), e34022 (2012).
  22. Sacks, D. L., Melby, P. C. Animal models for the analysis of immune responses to leishmaniasis. Current Protocols in Immunology. , (1998).
  23. Andersen, M. L., Winter, L. M. F. Animal models in biological and biomedical research - experimental and ethical concerns. Anais da Academia Brasileira de Ciências. 91, e20170238 (2019).
  24. Ribeiro-Gomes, F. L., et al. Site-dependent recruitment of inflammatory cells determines the effective dose of Leishmania major. Infection and Immunity. 82 (7), 2713-2727 (2014).
  25. Mahmoudzadeh-Niknam, H., Khalili, G., Abrishami, F., Najafy, A., Khaze, V. The route of Leishmania tropica infection determines disease outcome and protection against Leishmania major in BALB/c mice. The Korean Journal of Parasitology. 51 (1), 69-74 (2013).
  26. Oliveira, D. M., et al. Evaluation of parasitological and immunological parameters of Leishmania chagasi infection in BALB/c mice using different doses and routes of inoculation of parasites. Parasitology Research. 110 (3), 1277-1285 (2012).
  27. Côrtes, D. F., et al. Low and high-dose intradermal infection with Leishmania major and Leishmania amazonensis in C57BL/6 mice. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 105 (6), 736-745 (2010).
  28. Blackwell, J. M., et al. Genetics and visceral leishmaniasis: of mice and man. Parasite Immunology. 31 (5), 254-266 (2009).
  29. Loeuillet, C., Bañuls, A. L., Hide, M. Study of Leishmania pathogenesis in mice: experimental considerations. Parasites & Vectors. 9, 144 (2016).
  30. Alexander, J., Brombacher, F. T Helper1/T Helper2 Cells and Resistance/Susceptibility to Leishmania Infection: Is This Paradigm Still Relevant? Frontiers in Immunology. 3, 80 (2012).
  31. Sacks, D., Noben-Trauth, N. The immunology of susceptibility and resistance to Leishmania major in mice. Nature Reviews Immunology. 2 (11), 845-858 (2002).
  32. Bogdan, C., et al. Experimental Cutaneous Leishmaniasis: Mouse Models for Resolution of Inflammation Versus Chronicity of Disease. Methods in Molecular Biology. 1971, 315-349 (2019).
  33. Jones, D. E., Ackermann, M. R., Wille, U., Hunter, C. A., Scott, P. Early enhanced Th1 response after Leishmania amazonensis infection of C57BL/6 interleukin-10-deficient mice does not lead to resolution of infection. Infection and Immunity. 70 (4), 2151-2158 (2002).
  34. Velasquez, L. G., et al. Distinct courses of infection with Leishmania (L.) amazonensis are observed in BALB/c, BALB/c nude and C57BL/6 mice. Parasitology. 143 (6), 692-703 (2016).
  35. de Menezes, J. P., et al. Leishmania infection inhibits macrophage motility by altering F-actin dynamics and the expression of adhesion complex proteins. Cellular Microbiology. 19 (3), 1266 (2017).
  36. Mittra, B., et al. A Trypanosomatid Iron Transporter that Regulates Mitochondrial Function Is Required for Leishmania amazonensis Virulence. PLoS Pathogens. 12 (1), e1005340 (2016).
  37. Zilberstein, D., Nitzan Koren, R. Host-Free Systems for Differentiation of Axenic Leishmania. Methods in Molecular Biology. 1971, 1-8 (2019).
  38. Zilberstein, D., Shapira, M. The role of pH and temperature in the development of Leishmania parasites. Annual Review of Microbiology. 48, 449-470 (1994).
  39. Dumetz, F., et al. Modulation of Aneuploidy in Leishmania donovani during adaptation to different in vitro and in vivo environments and its impact on gene expression. MBio. 8 (3), e00599-e00517 (2017).
  40. Sinha, R., et al. Genome Plasticity in Cultured Leishmania donovani: Comparison of Early and Late Passages. Frontiers in Microbiology. 9, 1279 (2018).
  41. Magalhães, R. D., et al. Identification of differentially expressed proteins from Leishmania amazonensis associated with the loss of virulence of the parasites. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (4), e2764 (2014).
  42. Lei, S. M., Romine, N. M., Beetham, J. K. Population changes in Leishmania chagasi promastigote developmental stages due to serial passage. Journal of Parasitology. 96 (6), 1134-1138 (2010).
  43. Ali, K. S., Rees, R. C., Terrell-Nield, C., Ali, S. A. Virulence loss and amastigote transformation failure determine host cell responses to Leishmania mexicana. Parasite Immunology. 35 (12), 441-456 (2013).
  44. Rebello, K. M., et al. Leishmania (Viannia) braziliensis: influence of successive in vitro cultivation on the expression of promastigote proteinases. Experimental Parasitology. 126 (4), 570-576 (2010).
  45. Johns Hopkins Animal Care and Use Program. , The Johns Hopkins University Animal Care and Use Committee. http://web.jhu.edu/animalcare/index.html (2019).
  46. Titus, R. G., Marchand, M., Boon, T., Louis, J. A. A limiting dilution assay for quantifying Leishmania major in tissues of infected mice. Parasite Immunology. 7 (5), 545-555 (1985).
  47. Lima, H. C., Bleyenberg, J. A., Titus, R. G. A simple method for quantifying Leishmania in tissues of infected animals. Parasitology Today. 13 (2), 80-82 (1997).
  48. Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. , (1997).
  49. Sacks, D., Kamhawi, S. Molecular aspects of parasite-vector and vector-host interactions in leishmaniasis. Annual Review of Microbiology. 55, 453-483 (2001).
  50. Reimão, J. Q., et al. Parasite burden in Leishmania (Leishmania) amazonensis-infected mice: validation of luciferase as a quantitative tool. Journal of Microbiological Methods. 93 (2), 95-101 (2013).
  51. Buckley, S. M., et al. In vivo bioimaging with tissue-specific transcription factor activated luciferase reporters. Scientific Reports. 5, 11842 (2015).
  52. Thalhofer, C. J., et al. In vivo imaging of transgenic Leishmania parasites in a live host. Journal of Visualized Experiments. (41), e1980 (2010).
  53. Roberts, S. C., et al. Arginase plays a pivotal role in polyamine precursor metabolism in Leishmania. Characterization of gene deletion mutants. The Journal of Biological Chemistry. 279 (22), 23668-23678 (2004).
  54. Boitz, J. M., et al. Arginase Is Essential for Survival of Leishmania donovani Promastigotes but Not Intracellular Amastigotes. Infection and Immunity. 85 (1), e00554 (2017).
  55. Rosas, L. E., et al. Genetic background influences immune responses and disease outcome of cutaneous L. mexicana infection in mice. International Immunology. 17 (10), 1347-1357 (2005).
  56. Belkaid, Y., et al. Development of a natural model of cutaneous leishmaniasis: powerful effects of vector saliva and saliva preexposure on the long-term outcome of Leishmania major infection in the mouse ear dermis. Journal of Experimental Medicine. 188 (10), 1941-1953 (1998).
  57. Titus, R. G., Ribeiro, J. M. Salivary gland lysates from the sand fly Lutzomyia longipalpis enhance Leishmania infectivity. Science. 239 (4845), 1306-1308 (1988).
  58. Lima, H. C., Titus, R. G. Effects of sand fly vector saliva on development of cutaneous lesions and the immune response to Leishmania braziliensis in BALB/c mice. Infection and Immunity. 64 (12), 5442-5445 (1996).
  59. Theodos, C. M., Ribeiro, J. M., Titus, R. G. Analysis of enhancing effect of sand fly saliva on Leishmania infection in mice. Infection and Immunity. 59 (5), 1592-1598 (1991).
  60. Kaur, S., et al. Effect of dose and route of inoculation on the generation of CD4+ Th1/Th2 type of immune response in murine visceral leishmaniasis. Parasitology Research. 103 (6), 1413-1419 (2008).
  61. Rolão, N., Melo, C., Campino, L. Influence of the inoculation route in BALB/c mice infected by Leishmania infantum. Acta Tropica. 90 (1), 123-126 (2004).
  62. Kébaïer, C., Louzir, H., Chenik, M., Ben Salah, A., Dellagi, K. Heterogeneity of wild Leishmania major isolates in experimental murine pathogenicity and specific immune response. Infection and Immunity. 69 (8), 4906-4915 (2001).
  63. Baldwin, T. M., Elso, C., Curtis, J., Buckingham, L., Handman, E. The site of Leishmania major infection determines disease severity and immune responses. Infection and Immunity. 71 (12), 6830-6834 (2003).
  64. Aoki, J. I., et al. RNA-seq transcriptional profiling of Leishmania amazonensis reveals an arginase-dependent gene expression regulation. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (10), e0006026 (2017).
  65. Pinto-da-Silva, L. H., et al. The 3A1-La monoclonal antibody reveals key features of Leishmania (L) amazonensis metacyclic promastigotes and inhibits procyclics attachment to the sand fly midgut. International Journal for Parasitology. 35 (7), 757-764 (2005).
  66. Spath, G. F., Beverley, S. M. A lipophosphoglycan-independent method for isolation of infective Leishmania metacyclic promastigotes by density gradient centrifugation. Experimental Parasitology. 99 (2), 97-103 (2001).
  67. Aoki, J. I., Laranjeira-Silva, M. F., Muxel, S. M., Floeter-Winter, L. M. The impact of arginase activity on virulence factors of Leishmania amazonensis. Current Opinion in Microbiology. 52, 110-115 (2019).
  68. Jackson, A. P. The evolution of amastin surface glycoproteins in trypanosomatid parasites. Molecular Biology and Evolution. 27 (1), 33-45 (2010).
  69. Rochette, A., et al. Characterization and developmental gene regulation of a large gene family encoding amastin surface proteins in Leishmania spp. Molecular and Biochemical Parasitology. 140 (2), 205-220 (2005).
  70. Rochette, A., Raymond, F., Corbeil, J., Ouellette, M., Papadopoulou, B. Whole-genome comparative RNA expression profiling of axenic and intracellular amastigote forms of Leishmania infantum. Molecular and Biochemical Parasitology. 165 (1), 32-47 (2009).
  71. Schneider, P., Rosat, J. P., Bouvier, J., Louis, J., Bordier, C. Leishmania major: differential regulation of the surface metalloprotease in amastigote and promastigote stages. Experimental Parasitology. 75 (2), 196-206 (1992).
  72. Ji, J., Sun, J., Qi, H., Soong, L. Analysis of T helper cell responses during infection with Leishmania amazonensis. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 66 (4), 338-345 (2002).
  73. Ji, J., Sun, J., Soong, L. Impaired expression of inflammatory cytokines and chemokines at early stages of infection with Leishmania amazonensis. Infection and Immunity. 71 (8), 4278-4288 (2003).
  74. Felizardo, T. C., Toma, L. S., Borges, N. B., Lima, G. M., Abrahamsohn, I. A. Leishmania (Leishmania) amazonensis infection and dissemination in mice inoculated with stationary-phase or with purified metacyclic promastigotes. Parasitology. 134 (12), 1699-1707 (2007).
  75. Laranjeira-Silva, M. F., Zampieri, R. A., Muxel, S. M., Floeter-Winter, L. M., Markus, R. P. Melatonin attenuates Leishmania (L.) amazonensis infection by modulating arginine metabolism. Journal of Pineal Research. 59 (4), 478-487 (2015).

Tags

Immunologi och infektion Utgåva 156 C57BL/6 möss inflammation svar parasit belastning lesion utveckling testning infektion yxanska amastigotes
In Vivo Infektion med <em>Leishmania amazonensis</em> att utvärdera parasit virulens i möss
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Aoki, J. I., Hong, A., Zampieri, R.… More

Aoki, J. I., Hong, A., Zampieri, R. A., Floeter-Winter, L. M., Laranjeira-Silva, M. F. In Vivo Infection with Leishmania amazonensis to Evaluate Parasite Virulence in Mice. J. Vis. Exp. (156), e60617, doi:10.3791/60617 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter