Summary
ここでは、96ウェルプレート形式のモリブデンブルー反応に基づく膜結合ピロホスファターゼ(サーモトガマリティマ由来)阻害剤のスクリーニング方法を提示する。
Abstract
膜結合性ピロホスファターゼ(mPPPasaas)は、細菌、古細菌、植物、およびプロティスト寄生虫に生じる二量体酵素です。これらのタンパク質は、ピロリン酸を2つのオルトリン酸分子に切断し、これはプロトンおよび/または膜全体をポンプで送り出すナトリウムイオンと結合される。動物やヒトには相同タンパク質が生じないため、mPPPAxは潜在的な薬物標的の設計において良好な候補となる。ここでは、96ウェルプレート系におけるモリブデンブルー反応を利用したmPPPase阻害剤をスクリーニングするための詳細なプロトコルを提示する。熱性細菌サーモトガマリティマ(TmPPPase)のmPPaseをモデル酵素として使用しています。このプロトコルはシンプルで安価で、一貫性のある堅牢な結果を生み出します。アッセイの開始から吸光度測定まで約1時間しかかからない。このアッセイで生成される青色は長期間安定しているため、前のバッチの直後に後続のアッセイを行うことができ、吸光度は後ですべてのバッチに対して一度に測定することができます。このプロトコルの欠点は、手動で行われるため、疲れ果て、ピペットと時間保持の優れたスキルを必要とする可能性が高いことです。さらに、このアッセイで使用されるアルセイン酸クエン酸溶液には、有毒であり、必要な予防措置で取り扱うべきであるアルセイン酸ナトリウムが含まれています。
Introduction
全細胞タンパク質の約25%が膜タンパク質であり、その約60%が薬物標的1、2である。潜在的な薬物標的の1つは、膜結合ピロホスファターゼ(mPPPases)であり、ピロリン酸の加水分解によって膜全体にプロトンおよび/またはナトリウムイオンをポンプする二量体酵素である。mPPPPアーゼは、細菌、古細菌、植物、およびプロティスト寄生虫などの様々な生物5で見つけることができ、ヒトおよび動物4を除く。プロトイスト寄生虫では、例えば熱帯熱マラリア原虫、トキソプラズマゴンディおよびトリパノソーマ・ブルシは、寄生虫におけるこの発現のノックアウトに必須であり、外部塩基性pH7への曝露時に細胞内pHを維持する失敗につながる。脊椎動物に存在する相同タンパク質の重要性と欠如のために、mPPPPアーゼは、前駆疾患の潜在的な薬物標的として考えることができる3.
本研究におけるmPPPase阻害剤のインビトロスクリーニングは、TmPPPeモデルシステムに基づいている。TmPPPaseは、T.マリティマ由来のナトリウムイオンポンピングおよびカリウムイオン依存性mPPPaseであり、71°C8で最適な活性を有する。この酵素の利点は、例えば、生産および精製の容易さ、良好な熱安定性および高い特異的活性である。TmPPPeは、位置の完全な保存に加えて、プロティストmPPPass3、9およびヴィニャラジエタ10mPPPPPの解決構造に対する全ての触媒残基の同一性に加えて、高い類似性を示す。異なる立体構造のTmPPeの利用可能な構造は、構造ベースの薬物設計実験(仮想スクリーニングおよびde novo設計として)にも有用である。
ここでは、96ウェルプレート形式でTmPPPe阻害剤をスクリーニングするための詳細なプロトコルを報告する(図1)。このプロトコルは、フィスケとSubbarow11によって最初に開発されたモリブデンブルー反応の比色法に基づいている。この方法は、酸性条件下でオルトリン酸およびモリブデン酸から12-ホスホモリブデン酸の形成を伴い、その後、特徴的な青色のホスホモリブデン種種12を与えるために減少する。
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Protocol
1. タンパク質調製
注:TmPPeの発現および精製は、他の場所で13について説明されている。
- 20 mM2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸(MES)pH 6.5、3.5%(v/v)グリセロール、2mMジチオスレイトール(DTT)、および0.05%ドデシルマルトシド(DDM)を含む再活性化緩衝液の10mLを調製する。
- 200 mM Tris-Cl pH 8.0、8.0 mM MgCl 2、333 mM KCl、および 67 mM NaCl を含む反応混合物の 10 mL を調製します。
注:Mg2+は、mPPPeの基質としてピロリン酸をキレートするために必要であり、K+は、TmPPPeeがカリウム依存性mPPPAeであるとして酵素活性を増加させるために必要であり、TmPPPesによるナトリウムイオン転座中の酵素活性にはNa+が必要である。 - 酵素再活性化のために30 mg/mLリポソームを調製する。
- 大豆から20 mMトリスHCl pH 8.0の10 mLに1mMのトリス-HCl pH 8.0を1mM DTTで10mM TTで0.3gのL-α-ホスファチジルコリンに加えます。
- リポソームを氷の上に置き、1秒間のパルス間隔で1分間超音波処理し、1分間一時停止し、溶液が透明な黄色になるまで繰り返します。
- リポソームをアリコートし、液体窒素中で凍結し、使用するまで-80°Cで保存する。
- 酵素を再活性化します。
- 20%DDMの22.5 μLでリポソーム溶液の40°Lを混合します。
- 混合物を55°Cで15分間加熱し、室温まで冷却します。
- 再活性化緩衝液の36.5μLを加え、濃縮タンパク質(13mg/mL)を1μL加え、合計濃度0.13mg/mLを作ります。
注:タンパク質は、通常、精製後に10μLのアリコートで凍結し、使用前に氷上で解凍します。
- 再活性化酵素の20μLを取り、反応混合物の1,480°Lに加え、穏やかに混合します。
注:再活性化された酵素を反応混合物に添加することは、使用する直前に行う必要があります。
2. 化合物調製
- ジメチルスルホキシド(DMSO)に化合物を溶解し、化合物の入手可能性に基づいて、25-100 mMのストック溶液を50−200 μLにします。
注 : ここで使用されるすべての化合物 (図 2A) は、以前に9を公開されています。化合物溶解度が低い場合は、それに応じてストック濃度を調整することができる。 - 水中の各化合物の3つの異なる濃度を準備します。
注:反応混合物中の最終濃度は、それぞれ可溶性および難溶性化合物の1、5、5、または1、5、および20マイクロモルになります。- ストック液をマイクロチューブで1mLに水で希釈し、可溶性化合物の場合は2μM、10μM、100μM、または難溶性化合物の場合は2μM、10μM、40μMを与えます。
- 適切な混合のための原液の希釈後即座に化合物溶液をボルテックスする。
- ネフェロメータを使用して複合凝集を確認します。
注:これは3つの濃度(1μM、5μMおよび20μM)の三重として研究され、96ウェルプレート内のブランクに正規化された。- マルチチャンネルピペットを使用して、反応混合物の75°Lを各ウェルに分配する。
- 各化合物の75 μLを加え(ブランクの場合は、代わりに75°Lの水を使用)、5×を上下にピペットで混ぜます。
- マイクロプレートネフェロメータを使用して、300Vで各ウェルを測定します。
3. アッセイ製剤用試薬
- アルセネクレート溶液を準備します。
- アルセナイトナトリウム5gとクエン酸三ナトリウムの20gを重量を量る。
注意:アルセマイトナトリウムは有毒であるため、適切な保護具とハンドルを特別な注意で使用してください。予防措置として、必要なすべての安全上の注意が読まれ、理解される前に取り扱わないでください。化合物またはその溶液のほこり/蒸気を吸入しないように、ヒュームフードでのみ取り扱ってください。吸入した場合は、新鮮な空気に移動し、医師の診察を受けます。摂取や目と肌の接触を避けるために、適切な化学物質安全ゴーグル、保護手袋、衣類を着用してください。飲み込んだ場合は、直ちに毒物センターまたは医師/医師に電話してください。皮膚や目に入った場合は、水をたっぷり洗い、医師の診察を受けてください。 - 100 mLの水に溶かします。
- 5mLの氷酢酸を加え、混ぜ、250mLに水を加えます。
- 光から保護された室温で保管してください。
注:ソリューションは1年以上安定しています。
- アルセナイトナトリウム5gとクエン酸三ナトリウムの20gを重量を量る。
- ソリューション A とソリューション B を準備します。
- 溶液Aの場合、アスコルビン酸の0.3gに氷冷0.5 M HClの10 mLを加えます。ボルテックスによりアスコルビン酸を溶解する。
- 溶液Bの場合、70mgのヘプタモリブデン酸アンモニウムに1mLの氷冷水を加え、四水和物と渦を溶解させる。
メモ:使用するまで、両方のソリューションを氷の上に保管してください。アッセイ結果の一貫性のために、両方の溶液を最大1週間氷上に保存することができます。
- キャリブレーション用に、濃度0μM、62.5μM、250μM、500μMのリン酸塩(Pi)規格を準備します。
- 反応混合物の370°Lを含む4つのマイクロチューブに、0 μL、25 μL、50 μL、および100 μLの5 mM Na2HPO4二水和物を加えます。
- 水で1 mLまで上に。
4. 1つの96ウェルプレートの活性アッセイ
注: アッセイのスケマティック ワークフローについては、図 1を参照してください。
- 溶液Aの10 mLに溶液Bの1 mLを加え、渦で混合し、溶液を氷上に保存します。
注: このソリューションは透明で黄色である必要があります。溶液A +Bを使用前に少なくとも30分間氷の上に保管してください。ただし、長期保存後に不良になるため、3 時間以内にソリューションを使用してください。 - マルチチャンネルピペットを使用して、40 μLの0μM、62.5μM、250 μM、500 μM Pi標準をトリプリケートのチューブストリップに追加します。
注:Piを添加していない反応混合物はブランクとして使用されます。 - マルチチャンネルピペットを使用して、25°Lの複合溶液をチューブストリップに追加します。
注:各化合物は、半分最大阻害濃度(IC50)の初期推定に十分である三重に3つの異なる濃度を有する。より正確なIC50測定のために、8つの異なる化合物濃度を使用することができる。無阻害酵素の場合、化合物溶液は等量の水に置換される。陽性対照として2.5μM、25μM、250μMのイミド二酸化リン酸塩(IDP)ナトリウム塩が使用された。 - マルチチャンネルピペットを使用して、15μLのmPPase溶液混合物をチューブストリップ(Pi規格を含むチューブを除く)に追加します。
- 粘着シールシートでチューブストリップを密封します。シールシートをカットして各チューブストリップを分離します。
- 71°Cで5分間サンプルを事前にインキュベートします。後続のステップ中の時間消費を最小限に抑えるために、各ストリップ間の間隔を 20 s の加熱ブロックにサンプルを配置します。
- 各ストリップについて、接着剤のシールを開きます。マルチチャンネルピペットを使用して2mMピロリン酸ナトリウム二塩基ナトリウムの10 μLを追加し、5×のために上下にピペットで混合します。同じシールを使用してチューブストリップをもう一度密封します。
注: この手順は、最初は 20 s では実行するのが難しい場合があります。しかし、いくつかのアッセイの後に簡単になります。 - 71°Cで5分間インキュベートします。
- 各ストリップ間の間隔を20sで冷却装置にサンプルを置きます。10分間冷却しますが、冷却の5分後に各ストリップを短時間遠心分離し、シールシートの下に水滴をデカントし、冷却装置に戻してシールを取り外します。
注:冷却装置は、単に水で満たされたポリスチレンペトリ皿(サイズ150ミリメートル×15ミリメートル)に96ウェルPCRプレートを置き、少なくとも1時間凍結することによって作ることができる。装置は、アッセイの開始の約5分前に冷凍庫から取り出されるべきである。反応混合物を凍結し、発色を妨げるので、サンプル冷却の直前に冷却装置を取り出しないでください。 - 10分間の冷却後、溶液A+Bを60μL加え、5×で上下にピペットで混ぜ、チューブストリップを冷却装置に10分間保持します。
- アルセナトクエン酸溶液の90°Lを加え、室温で少なくとも30分間保ち、安定した青色を生成します。
注意:その毒性のために、ナトリウムアルセネトを含むすべての溶液は、常に余分な注意を払って処理する必要があります。したがって、アルセネトクエン酸溶液の添加は、ヒュームフードで行われるべきである。 - 各反応混合物の180μLを透明な96ウェルポリスチレンマイクロプレートに分配する。
- マイクロプレート分光度計を用いて860nmで各ウェルの吸光度を測定する。
5. 結果分析
- 各サンプルとPi規格の三重を平均します。次に、空白で減算してバックグラウンド信号を除去します。
- Pi標準 (nmol) の量に対して吸光度 (A860)値をプロットしてキャリブレーション曲線を作成し、線形回帰を実行して、次の式を使用して近似曲線関数を取得します。
- 上記の線形回帰式に基づいて酵素反応から放出されるリン酸量(nmol)を算出する。
- 次の式を使用して、特定の活動を計算します。
ここで、nPiは反応から放出されるリン酸塩の量(nmol)、tは反応時間(分)、m TmPPPeはアッセイ(mg)で使用される純粋なTmPPPeの量である。 - 次の式を使用して、各阻害剤濃度のパーセント活性を計算します。
ここで、SAiは阻害剤およびSAunを有する試料の特異的活性が阻害されていない試料の特異的活性である。 - 次の式を使用して、4 パラメータの線量応答曲線から非線形回帰フィットを使用して logIC50 (推定値) と IC50 (推定値) を計算します。
ここで、X は濃度の対数 (>M)、Y はアクティビティ (%)、上と下は Y (それぞれ 100% と 0%) と同じ単位で高原、logIC50は X と同じログ単位を持ち、HillSlope = 傾斜角または丘の勾配は単位なしです。
メモ:ソフトウェア(材料表)は継手に使用されます。ゼロの対数が定義されていないため、阻害剤を使用しないサンプルには 0.01 μM (0.00 μM の代わりに) の濃度を使用します。
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Representative Results
このプロトコルでは、8つの化合物(1−8)を、パイロホスファターゼの一般的な阻害剤であるIDPとともに陽性対照として試験した(図2A)。各化合物は、三重で3つの異なる濃度(1μM、5μMおよび20μM)で試験した。スクリーニングのワークフローを図1に示し、サンプルおよび試薬の調製から860nmでの吸光度測定までである。
このプロトコルの終わりに、溶液A+Bおよびアルセニトクエン酸塩を添加した後、溶液は、観察することができるモリブデン酸を有するリン酸イオンの複雑な形成に起因する709 nmおよび860nm14で最大吸収を有する安定な青色を開発し、酵素反応の発生を示す。この実験では、709nm15での吸光度に比べて検出限界や感度が高く、放出されるPi量の測定に860nmでの吸光度を用いた。青色は室温で30分のインキュベーションで完全に発達し、少なくとも5時間14で安定している。アッセイは、10μMのPi濃度までの感度を有し、吸光度は10−800μM14の濃度範囲にわたって線形である。ここでの代表的な結果では、ウェルE1−E3(図2C)は、阻害剤を含まない反応混合物を含有し、青色溶液はアッセイの終わりに観察することができる。これは、完全な阻害に達していない低い化合物濃度でも観察することができ、IDPのウェルF1-F3と化合物1のウェルA4-A6(ATC、TmPPe9の最近知られている非競合阻害剤)は、それぞれ2.5μMおよび1μMの濃度で観察できます。IDPおよび化合物1の濃度が高いほど、青色の色が少ないほど観察できる(IDPの場合はG1−G3およびH1−H3、化合物1の場合はB4−B6およびC4−C6)は酵素活性の阻害を示す。非阻害化合物の3つの濃度(2、3、および8)はすべて、阻害剤なしで同じ青色の強度を示したE1−E3を有する(図2C)。
860 nmでの吸光度測定の後、データを処理および分析することができます(プロトコルセクション5を参照)。図2Dは、線形フィッティングを備えたPi規格の較正プロットを示しています(y = 0.0576x + 0.0019;r2 = 0.999)。図3は酵素活性のプロットを示す(%)各試験化合物の濃度に対して。阻害活性を有する化合物の場合、非線形曲線フィッティングも示される。IDPは、陽性対照として使用され、より高い濃度での活性の低下を明確に示す。3つの異なる濃度に基づいて算出されたIC50(推定値)は88.2μM(表1)であり、これは8つの濃度点14を有する前の測定値(80.0μM)と同様である。化合物1、4、5、6、および7は、IC50(推定値)が約1.3μM、7.4μM、19.0μM、37.4μM、および156.1μMでそれぞれ増加したため、IDPと同様の傾向を示した(表1)。 化合物2、3、および8の場合、アッセイ濃度では活性または阻害の低下は観察できない。 8つの濃度点を有する追加のアッセイは精密なIC50を発生させることができる。図4は、IC50が1.7μM、21.4μM、58.8μM、239.0 μMおよび>500 μMの化合物1、5、6、7および8の阻害曲線をそれぞれ9を示す。
図1:96ウェルプレート形式におけるTmPPase阻害アッセイの概略ワークフロー赤い番号はプロトコルに従ってアッセイのステップを示し、青い矢印は間隔の順序を示します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:サンプル、96ウェルプレートにおけるその配置および発色。(A)アッセイに用いられる化合物1−8の構造。これらの化合物の阻害活性は、Vidilaseris et al.9で報告されている。(B) サンプル配置。(C)発色、アルセナ酸クエン酸溶液の添加後30分。制御阻害剤(IDP)および使用するサンプルの濃度は、上から下に配置され、それぞれ2.5μM、25μM、250μM濃度、1μM、5μM、および20μM濃度です。青色の強度は、酵素反応による放出Piの量に相当し、色の欠如は酵素反応に対応しない。(D) 線形フィッティング付きの A860に対する Pi標準 (nmol) のキャリブレーション曲線 (y = 0.0576x + 0.0019;r2 = 0.999)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:3つの異なる阻害剤濃度に対するTmPPeeパーセント活性の曲線。IC50(推定値)を計算する非線形回帰曲線は、IDPと化合物1、4、5、6、7に対して示されていますが、アッセイ濃度でTmPPe活性を阻害していなかったため、化合物2、3、および8については示されていません。 各化合物のlogIC50およびIC50(推定値)を表1に示す。すべてのデータは、3つの反復を持つ平均±SDとして表示されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:化合物1、5、6、7および8の8つの濃度点からの阻害曲線。この図は、わずかの改変を伴うVidilaserisら9から採取される。すべてのデータは、3つの反復を持つ平均±SDとして表示されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| サンプル | LogIC50 | IC50 (推定値) (μM) |
| Idp | 1.95 ± 0.0142 | 87.9 ± 2.46 |
| 1 | 0.112 ± 0.0274 | 1.29 ± 0.0816 |
| 2 | − | 阻害なし |
| 3 | − | 阻害なし |
| 4 | 0.870 ± 0.0447 | 7.39 ± 0.760 |
| 5 | 1.28 ± 0.0296 | 19.0 ± 1.29 |
| 6 | 1.57 ± 0.0846 | 37.4 ± 7.29 |
| 7 | 2.19 ± 0.366 | 156 ± 131 |
| 8 | − | 阻害なし |
表 1: 図 3 のデータに基づく IDP および化合物 1-8 の LogIC50および IC50 (推定値)
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Discussion
ここでは、Vidilaserisら14に基づく96ウェルプレート形式のT.マリティマからの膜結合ピロホスファターゼの阻害剤の簡易スクリーニングに関する詳細なプロトコルを報告する。このプロトコルは安価であり、酸性条件下でオルトリン酸およびモリブデン酸から形成され、明確な青色12を有するホスホモリスブデン種に還元される12-ホスホモリブデン酸に基づいている。この方法は、より感受性の高いマラカイトグリーンアッセイ16のような他のプロトコルよりも好ましいが、この方法は、TmPPase再活性化14に必要とされる高リン脂質濃度の存在下での干渉を示さないからである。
スクリーニングプロトコルのワークフローを図1に示し、このプロセスを1時間で完全に達成することができます。このプロトコルは71 °Cおよび5分の反応時間の最適の働く温度のTmPPeのために最大限に活用される。反応混合物からこの温度で水が蒸発するので、蒸発を防ぐために接着シールシート(ストリップに合わせてスライス)が適用され、蒸発した水は単に遠心分離で回収されます。5分間のインキュベーション時間は、酵素的に放出されたリン酸塩の線形範囲のままであり、信頼性の高いスクリーニング14に十分であるように選択される。このプロトコルでは、タイミングとピペットのスキルは、良好で信頼性の高い結果を得るための重要な要因です。ストリップ間の20s間隔のアッセイ中の試薬の添加は、後続のステップを実行しやすいように最適化されたタイミングオプションです。
異なるmPPPアーゼの場合、最適な温度およびインキュベーション時間は、阻害アッセイで使用する前に別々に決定されるべきである。上記の酵素再活性化プロトコルは、TmPPEおよび他のmPPPe用に最適化されており、異なる再活性化プロトコルが必要な場合がある。例えば、DDMは、その酵素活性17を減少させるので、ピロバキュラム好気球からのmPPPaeの再活性化のために添加すべきではない。酵素は、事前に十分に調製すれば活性が低下するので、再活性化酵素の添加は、アッセイが開始される直前に反応混合物に添加されるべきである。アルセイン酸クエン酸溶液を添加した後、反応生成物は少なくとも5時間14のために安定である。したがって、アッセイの次のバッチはすぐに実行することができ、吸光度測定は、一度にすべてのバッチに後で行うことができます。
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Disclosures
著者たちは何も開示する必要はない。
Acknowledgments
この作品は、ジェーンとアートス・エルッコ財団とBBSRC(BB/M021610)からエイドリアン・ゴールドマンへの助成金によって支えられ、 フィンランドアカデミー(No. 308105)からケニ・ヴィディレーザーイス、(No. 310297)からアンリ・シャアール、(No. 265481)からヤリ・イリ・カハルオマ、ヘルシンキ大学からグスタフ・ボイエ・アフ・ジェンナスへの研究基金。著者たちは、プロジェクト中の彼女の技術的な助けのためにベルナデット・ゲールに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesive sealing sheet | Thermo Scientific | AB0558 | |
| Ammonium heptamolybdate tetrahydrate | Merck | F1412481 636 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | 95212-250G | |
| BioLite 96Well Multidish | Thermo Scientific | 130188 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Merck | 1167431000 | |
| 8-well PCR Tube Strips 0.2 ml without caps (120) | Nippon genetics | FG-028 | |
| Dodecyl maltoside (DDM) | Melford | B2010-100G | |
| Ethanol | Merck | 1009901001 | |
| Glacial acetic acid | Merck | 1000631011 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148-500ML | |
| Imidodiphosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | I0631-1G | |
| L-α-Phosphatidyl choline from soybean lecithin | Sigma | 429415-100GM | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 8147330500 | |
| Multiplate 96-Well PCR Plates | Bio-Rad | MLL9651 | |
| MultiSkan Go | Thermo Scientific | 10680879 | |
| Nepheloskan Ascent (Type 750) | Labsystems | ||
| Polystyrene Petri dish (size 150 mm x 15 mm) | Sigma-Aldrich | P5981-100EA | |
| Potassium chloride | Merck | 104936 | |
| Prism 6 software | GraphPad | ||
| QBT2 Heating block | Grant Instruments | ||
| Sodium meta-arsenite | Fisher Chemical | 12897692 | |
| Sodium phosphate dibasic (Pi) | Sigma | S0876-1KG | |
| Sodium pyrophosphate dibasic | Fluka | 71501-100G | |
| Trisodium citrate dihydrate | Fluka | 71404-1KG |
References
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