Summary
在这里,我们提出了膜结合焦磷酶(来自热托加水红素)抑制剂的筛选方法,其依据是96孔板格式的二恶极蓝色反应。
Abstract
膜结合的焦道面酶 (mPPases) 是存在于细菌、古体、植物和原生寄生虫中的二恶酶。这些蛋白质将焦磷酸盐切成两个正磷酸盐分子,与质子和/或钠在膜上泵送结合。由于动物和人类中不存在同源性蛋白,因此,在设计潜在的药物靶点时,mPPass 是很好的候选者。在这里,我们提出了一个详细的协议,以筛选mPPase抑制剂利用在96井板系统中的三联体蓝色反应。我们使用来自热亲菌的mPPase作为模型酶。该协议简单且成本低廉,产生一致且可靠的结果。从测定开始到吸光度测量,只需大约一个小时完成活动测定协议。由于此测定中产生的蓝色长期稳定,因此后续测定可在上一批之后立即进行,并且以后可以同时测量所有批次的吸光度。该协议的缺点是,它是手动完成的,因此可能会耗尽,以及需要良好的移液和时间保持技能。此外,本测定中使用的阿森特-柠酸酯溶液含有醋酸钠,该钠有毒,应采取必要的预防措施处理。
Introduction
细胞蛋白总量的约25%是膜蛋白,其中约60%为药物靶点1、2。潜在的药物目标之一,膜结合的焦磷酸酶(mPPases),是二氧化硅酶,通过水解焦磷酸化将质子和/或钠子泵入膜,并注入两个正磷酸盐4。mPPases可以在各种生物中发现,如细菌、古生物、植物和原生寄生虫,但人类和动物4除外。在原生寄生虫中,例如恶性疟原虫、弓形虫和锥虫病,pPPases对寄生虫毒性6至关重要,在寄生虫中敲除这种表达会导致在接触外部基本pH7时无法维持细胞内pH。由于其重要性和缺乏同源蛋白存在于脊椎动物中,mPPases可被视为潜在的药物靶点,用于原原病3。
这项工作中mPPase抑制剂的体外筛选基于TmPPase模型系统。TmPPase是一种钠电泵和钾依赖mPPase从T.马里蒂马,其最佳活性在71°C8。例如,这种酶的益处是易于生产和纯化,热稳定性好,活性高。TmPPase除了完全保持位置外,还表现出高度相似性,并且所有催化残留物与前子mPPases3、9和Vigna radiata10 mPPase的求解结构具有特征。不同符合的TmPPase的可用结构也可用于基于结构的药物设计实验(如虚拟筛选和de novo设计)。
在这里,我们报告一个详细的协议,以96孔板格式筛选TmPPase抑制剂(图1)。该协议基于由菲斯克和Subbarow11首先开发的蓝色反应的色度测定方法。该方法涉及在酸性条件下从正磷酸盐和磷酸中形成12磷酸,然后减少,使具有特征的蓝绿色磷脂物质物种12。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 蛋白质制备
注:TmPPase的表达和纯化已在其他地方13所述。
- 制备含有20 mM2-(N-变形)乙酸(MES) pH 6.5、3.5%(v/v)甘油、2 mM二硫二硫醇(DTT)和0.05%二硫酰硫莉醇(DTT)的再活化缓冲液溶液10mL。
- 制备含有 200 mM Tris-Cl pH 8.0、8.0 mM MgCl2、333 mM KCl 和 67 mM NaCl 的反应混合物 10 mL。
注:Mg2+需要将焦磷酸盐作为mPPase的基质,需要K+来增加酶活性,因为TmPPase是钾依赖性mPPase,而在TmPPase钠释放期间,需要Na+用于酶活性。 - 准备30mg/mL脂体,用于酶的重新激活。
- 将 10 mL 的 20 mM Tris-HCl pH 8.0 与 1 mM DTT 添加到 0.3 g 的 L-α-磷脂酰胆碱从大豆到 10 mL 的 20 mM Tris-HCl pH 8.0 与 1 mM DTT。
- 将脂质体放在冰上,用1秒脉冲间隔声波1分钟,暂停1分钟,然后重复,直到溶液变为透明黄色。
- 将脂液体与液氮相融合,冷冻在-80°C,直到使用。
- 重新激活酶。
- 将40μL的脂体溶液与22.5μL的20%DDM混合。
- 将混合物在55°C加热15分钟,使其冷却至室温。
- 加入36.5μL的复活缓冲液,混合并加入1μL的浓缩蛋白(13mg/mL),使总浓度为0.13毫克/mL。
注:蛋白质通常在纯化后冷冻在10μL等分物中,并在使用前在冰上解冻。
- 取20μL的重新激活的酶,加入1,480μL的反应混合物,然后轻轻混合。
注:在使用反应混合物之前应先将重新激活的酶添加到混合物中。
2. 化合物制备
- 溶解二甲基硫酸盐(DMSO)中的化合物,根据化合物的可用性,在50~200μL中制造25~100 mM的库存溶液。
注:此处使用的所有化合物(图2A)已发表于9。如果化合物的溶解度低,可以相应地调整库存浓度。 - 在水中制备三种不同浓度的化合物。
注:反应混合物中的最终浓度分别为1、5和50微摩尔或1、5和20微摩尔,用于可溶性和少溶性化合物。- 在微管中用水稀释库存溶液至1 mL,为可溶性化合物提供2μM、10μM和100μM,或者为可溶性化合物提供2μM、10μM和40μM。
- 稀释库存溶液后立即涡旋复合溶液,以便进行适当的混合。
- 使用肾上咽机检查化合物聚合。
注:此研究分为三浓度(1 μM、5 μM 和 20 μM)的三分法,并归化为 96 孔板中的空白。- 使用多通道移液器将75 μL的反应混合物分配到每个井中。
- 加入每种化合物的75μL(对于空白,改用75μL的水),然后通过上下移液5°混合。
- 使用微孔计在 300 V 下测量每个孔。
3. 用于测定制备的试剂
- 准备阿森特-酸盐溶液。
- 称量5克醋酸钠和5克柠酸二酯三钠。
注意:醋酸钠有毒,因此使用适当的防护设备和处理特别小心。作为预防措施,在阅读和理解所有必要的安全预防措施之前,不要处理。仅在烟气罩中处理,以免吸入化合物或其溶液的灰尘/蒸汽。如果吸入,移动到新鲜空气,并获得医疗照顾。佩戴适当的化学安全护目镜、防护手套和衣物,避免摄入和眼睛/皮肤接触。如果吞咽,立即致电中毒中心或医生/医生。如果它进入皮肤或眼睛,用大量的水洗涤,并获得医疗照顾。 - 溶解成100 mL的水。
- 加入5 mL的冰川醋酸,混合,并加入水到250 mL。
- 在室温下存放,防止光线照射。
注:该解决方案稳定了一年多。
- 称量5克醋酸钠和5克柠酸二酯三钠。
- 准备解决方案 A 和解决方案 B。
- 对于溶液A,将10 mL的冰冷0.5 M HCl加入0.3克抗坏血酸。通过涡旋溶解抗坏血酸。
- 对于溶液B,将1mL的冰冷水加入70毫克七聚氨酯四水合物和涡流溶解。
注:将两种溶液都存放在冰上,直到使用。为了检测结果的一致性,两种溶液都可以在冰上储存最多一周。
- 制备浓度为0μM、62.5μM、250μM和500μM的磷酸盐(Pi)标准进行校准。
- 将0μL、25μL、50μL和100 μL的5 mM Na2HPO4二水合物添加到四个含有370μL反应混合物的微管中。
- 用水充值至1 mL。
4. 一个 96 孔板的活动测定
注:有关测定原理图工作流,参见图 1。
- 将1 mL溶液B添加到10 mL溶液A中,通过涡旋混合,并将溶液储存在冰上。
注:此解决方案应透明且黄色。使用前,将溶液A+ B放在冰上至少30分钟。但是,在 3 小时内使用该解决方案,因为长期存储后会变坏。 - 使用多通道移液器将 40 μL 的 0 μM、62.5 μM、250 μM 和 500 μM Pi标准添加到三联管条中。
注:未添加Pi的反应混合物将用作空白。 - 使用多通道移液器向管条添加 25 μL 的复合溶液。
注:每种化合物在三联体中具有三种不同的浓度,足以初步估计半最大抑制浓度(IC50)。为了更精确的IC50测定,可以使用8种不同的化合物浓度。对于未抑制的酶,复合溶液被等量的水所取代。作为正对照2.5μM,25μM和250μM的imidodi磷酸(IDP)钠盐被使用。 - 使用多通道移液器将 15 μL 的 mPPase 溶液混合物添加到管条中(含有 Pi标准的管除外)。
- 用粘合密封板密封管条。切割密封板以分离每个管条。
- 在71°C下预孵育样品5分钟。将样品放在加热块上,每个条带间隔为 20 秒,以便在接下来的步骤中最大程度地消耗时间。
- 对于每个条,打开胶粘剂密封。使用多通道移液器添加 10 μL 的 2 mM 焦磷酸钠二基基,并通过上下移液混合 5°。使用相同的密封再次密封管条。
注意:此步骤最初可能很难在 20 s 内完成;然而,经过一些检测后,它会变得更容易。 - 在71°C孵育5分钟。
- 将样品放在冷却装置上,每个条带之间间隔为 20 秒。让他们冷却10分钟,但离心机每条后5分钟的冷却,将滴水滴在密封片下,然后放回冷却装置并去除密封。
注:冷却装置只需在聚苯乙烯培养皿(尺寸为 150 mm × 15 mm)上放置一个 96 孔 PCR 板即可制成,该盘装满了水和冷冻至少 1 小时。在开始测定前约 5 分钟,应从冰箱中取出该装置。在样品冷却前不要拿出冷却装置,因为冷却装置会冻结反应混合物并阻碍颜色的发育。 - 冷却 10 分钟后,加入 60 μL 溶液 A + B,上下移液 5°,并将管条放在冷却装置上 10 分钟。
- 加入90 μL的青基铝溶液,在室温下保持至少30分钟,以产生稳定的蓝色。
注意:由于其毒性,所有含有醋酸钠的溶液应始终格外小心处理。因此,在烟气罩中应添加紫锥酸盐溶液。 - 将每种反应混合物的180 μL放入透明96孔聚苯乙烯微孔板中。
- 使用微板分光光度计测量每口井在 860 nm 处的吸光度。
5. 结果分析
- 平均每个样本的三次和 Pi标准。然后用空格减去以消除背景信号。
- 通过根据 Pi标准 (nmol) 的量绘制吸收率 (A860)值来绘制校准曲线,并使用以下公式执行线性回归以获取趋势线函数:
- 根据上述线性回归公式计算酶反应释放的磷酸盐量(nmol)。
- 使用以下公式计算特定活动:
其中nPi是从反应 (nmol) 释放的磷酸盐的量,t 是反应时间(分钟),m TmPPase是测定中使用的纯 TmPPase 的量(mg)。 - 使用以下公式计算每种抑制剂浓度的活性百分比:
其中SAi是具有抑制剂的样品的特定活性,SAun是未抑制样品的特定活性。 - 使用以下公式使用四参数剂量-响应曲线的非线性回归拟合计算 logIC50(估计)和 IC50(估计):
其中 X 是浓度的日志 (μM),Y 是活动 (%),顶部和底部是与 Y(分别为 100% 和 0%)相同的单位中的高原,对数 IC50具有与 X 相同的日志单位,而希尔斜率 = 坡度因子或坡度,无单位。
注: 软件 (材料表) 用于配件.在没有抑制剂的样品使用0.01 μM(而不是0.00μM)的浓度,因为未定义零对数。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
在本协议中,八种化合物(图2A)与IDP(热磷酶的常见抑制剂)一起作为阳性对照物进行了测试(图2A)。每种化合物在三次试用中测试三种不同的浓度(1 μM、5 μM和20 μM)。筛选的工作流程如图1所示,从样品和试剂制备开始,直到860nm的吸光度测量。
在该协议结束时,在添加溶液A+B和阿森酸盐-酸盐后,由于磷酸离子的形成具有可观察到的磷酸离子的复杂形成,并且显示了酶反应的发生,因此溶液形成稳定的蓝色,最大吸收在709nm和860 nm14。对于这个实验,我们使用860nm的吸收率来测量释放的Pi量,因为它具有更好的检测极限和灵敏度,而709nm15的吸收率。蓝色在室温下30分钟的孵育中完全发育,稳定至少5小时14小时。测定的灵敏度下降到Pi浓度为10μM,吸光度在10~800μM14的浓度范围内是线性的。在此具有代表性的结果中,井E1_E3(图2C)含有无抑制剂的反应混合物,在测定结束时可以观察到蓝色溶液。在未达到完全抑制的低化合物浓度下也可以观察到这一点,如IDP的F1+F3井和化合物1的A4+A6井(ATC,最近已知的TmPPase9的无竞争力抑制剂),浓度分别为2.5μM和1μM。IDP和化合物1的浓度越高,可以观察到的蓝色越少(G1+G3和H1+H3代表IDP,B4+B6和C4+C6表示抑制酶活性)。 所有三种浓度的非抑制化合物(2、3和8)都表现出相同的蓝色强度,E1+E3没有任何抑制剂(图2C)。
在 860 nm 处测量吸光度后,可以处理和分析数据(参见协议第 5 节)。图 2D显示了 Pi标准的校准图及其线性拟合(y = 0.0576x = 0.0019;r2 = 0.999)。图 3显示了酶活性图 (%)针对每个测试化合物的浓度。对于具有抑制活性的化合物,还显示非线性曲线拟合。用作正对照的国内流离失所者清楚地表明,在浓度较高时活动减少。基于三种不同浓度计算的IC50(估计值)为88.2 μM(表1),这与先前的测量值(80.0 μM)相似,有8个浓度点14。化合物1、4、5、6和7显示出与IDP相似的趋势,因为浓度随着IC50(估计值)分别增加约1.3μM、7.4μM、19.0μM、37.4μM和156.1 μM(表1)。 对于化合物2、3和8,在测定浓度下不能观察到活性或抑制的减少。 附加的测定有8个浓度点,可以产生精确的IC50。图4显示了化合物1、5、6、7和8的抑制曲线,其IC50分别为1.7μM、21.4μM、58.8μM、239.0μM和>500μM,分别为9。
图1:TmPPase抑制测定的原理图工作流程,采用96孔板格式。红色编号显示根据协议进行检测的步骤,蓝色箭头显示间隔顺序。请点击此处查看此图的较大版本。
图2:样品,其排列和颜色发展在96孔板。(A) 用于测定的化合物1+8的结构.这些化合物的抑制活性已在维迪拉泽里斯等人9报告。(B) 样品排列。(C) 颜色开发,30分钟后加入阿森特-酸盐溶液。控制抑制剂(IDP)和样品的浓度分别为2.5μM、25μM和250μM浓度和1μM、5μM和20μM浓度。蓝色的强度对应于由于酶反应而释放的Pi的量,而缺乏颜色对应于无酶反应。(D) Pi标准 (nmol) 的校准曲线与带线性拟合的 A860(y = 0.0576x = 0.0019;r2 = 0.999)。请点击此处查看此图的较大版本。
图3:三种不同抑制剂浓度的TmPPase活性曲线。计算IC50(估计值)的非线性回归曲线为IDP以及化合物1、4、5、6和7显示,但化合物2、3和8则不显示,因为它们在测定浓度下没有抑制TmPPase活性。每个化合物的对数50和IC50(估计值)如表1所示。所有数据均值 = SD,有三个复制。请点击此处查看此图的较大版本。
图4:化合物1、5、6、7和8的8个浓度点的抑制曲线。这个数字取自维迪拉泽里斯等人9号,稍作修改。所有数据均值 = SD,有三个复制。请点击此处查看此图的较大版本。
样品 | 日志50 | IC50 (估计) (μM) |
国内流离失所者 | 1.95 × 0.0142 | 87.9 × 2.46 |
1 | 0.112 × 0.0274 | 1.29 ± 0.0816 |
2 | · | 无抑制 |
3 | · | 无抑制 |
4 | 0.870 × 0.0447 | 7.39 ± 0.760 |
5 | 1.28 ± 0.0296 | 19.0 ± 1.29 |
6 | 1.57 × 0.0846 | 37.4 × 7.29 |
7 | 2.19 ± 0.366 | 156 × 131 |
8 | · | 无抑制 |
表1:基于图3的数据,IDP和化合物1+8的LogIC50和IC50(估计值)。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
在这里,我们报告一个详细的协议,用于简单筛选从T.Maritima膜结合热磷酶的抑制剂在96井板格式基于Vidilaseris等人14。该协议是廉价的,基于12磷酸,这是由正磷酸盐和乙基在酸性条件下形成的,并减少到具有明显蓝色12的磷脂树种。此方法比其他协议更可取,如更敏感的马拉奇特绿色测定16,因为这种方法不显示干扰存在高磷脂浓度,这是TMPPase重新激活14所必需的。
筛选协议的工作流程如图1所示,此过程可在 1 h 内完全完成。该协议针对TmPPase进行了优化,最佳工作温度为71°C,反应时间为5分钟。由于水会从这个温度下从反应混合物中蒸发,因此应用粘合密封片(切片以适合和覆盖条体)以防止蒸发14,并且蒸发的水只需通过离心回收即可。选择5分钟的孵育时间,因为它仍然在酶释放磷酸盐的线性范围内,足以进行可靠的筛选14。在此协议中,定时和移液技术是获得良好、可靠的结果的重要因素。在检测过程中添加试剂,在条带之间间隔为 20 秒,是一种优化的定时选项,便于执行后续步骤。
对于不同的mPPas,在抑制测定中使用之前,应分别确定最佳温度和孵育时间。上述酶重新激活协议针对 TmPPase 进行了优化,其他 mPPas 可能需要不同的重新激活协议。例如,不应添加DDM以重新激活来自Pyrobaculum的嗜热杆菌的mPPase,因为它将减少其酶活性17。由于如果事先做好充分准备,酶的活性会降低,因此在开始测定前不久,应在反应混合物中加入再活性酶。加入阿森酸盐-酸盐溶液后,反应产物稳定至少5 h14。因此,可以立即执行下一批的测定,并且稍后可以一次对所有批次进行吸光度测量。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了简和Aatos Erkko基金会和BBSRC(BB/M021610)对阿德里安·戈德曼的资助, 芬兰学院(第308105号)给基尼·维迪拉利斯,(第310297号)到亨利·夏德,(第265481号)到贾里·伊利-考哈卢马,赫尔辛基大学研究基金给古斯塔夫·博伊耶·阿夫·根纳斯。作者感谢伯纳黛特·盖尔在项目期间提供的技术帮助。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Adhesive sealing sheet | Thermo Scientific | AB0558 | |
Ammonium heptamolybdate tetrahydrate | Merck | F1412481 636 | |
Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | 95212-250G | |
BioLite 96Well Multidish | Thermo Scientific | 130188 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Merck | 1167431000 | |
8-well PCR Tube Strips 0.2 ml without caps (120) | Nippon genetics | FG-028 | |
Dodecyl maltoside (DDM) | Melford | B2010-100G | |
Ethanol | Merck | 1009901001 | |
Glacial acetic acid | Merck | 1000631011 | |
Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148-500ML | |
Imidodiphosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | I0631-1G | |
L-α-Phosphatidyl choline from soybean lecithin | Sigma | 429415-100GM | |
Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 8147330500 | |
Multiplate 96-Well PCR Plates | Bio-Rad | MLL9651 | |
MultiSkan Go | Thermo Scientific | 10680879 | |
Nepheloskan Ascent (Type 750) | Labsystems | ||
Polystyrene Petri dish (size 150 mm x 15 mm) | Sigma-Aldrich | P5981-100EA | |
Potassium chloride | Merck | 104936 | |
Prism 6 software | GraphPad | ||
QBT2 Heating block | Grant Instruments | ||
Sodium meta-arsenite | Fisher Chemical | 12897692 | |
Sodium phosphate dibasic (Pi) | Sigma | S0876-1KG | |
Sodium pyrophosphate dibasic | Fluka | 71501-100G | |
Trisodium citrate dihydrate | Fluka | 71404-1KG |
References
- Terstappen, G. C., Reggiani, A. In silico research in drug discovery. Trends in Pharmacological Sciences. 22 (1), 23-26 (2001).
- Rask-Andersen, M., Almen, M. S., Schioth, H. B. Trends in the exploitation of novel drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (8), 579-590 (2011).
- Shah, N. R., Vidilaseris, K., Xhaard, H., Goldman, A. Integral membrane pyrophosphatases: a novel drug target for human pathogens. AIMS Biophysics. 3 (1), 171-194 (2016).
- Baykov, A. A., Malinen, A. M., Luoto, H. H., Lahti, R. Pyrophosphate-Fueled Na+ and H+ Transport in Prokaryotes. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 77 (2), 267-276 (2013).
- Serrano, A., Perez-Castineira, J. R., Baltscheffsky, M., Baltscheffsky, H. H+-PPases: yesterday, today and tomorrow. IUBMB Life. 59 (2), 76-83 (2007).
- Liu, J., et al. A vacuolar-H+-pyrophosphatase (TgVP1) is required for microneme secretion, host cell invasion, and extracellular survival of Toxoplasma gondii. Molecular Microbiology. 93 (4), 698-712 (2014).
- Lemercier, G., et al. A pyrophosphatase regulating polyphosphate metabolism in acidocalcisomes is essential for Trypanosoma brucei virulence in mice. Journal of Biological Chemistry. 279 (5), 3420-3425 (2004).
- Belogurov, G. A., et al. Membrane-bound pyrophosphatase of Thermotoga maritima requires sodium for activity. Biochemistry. 44 (6), 2088-2096 (2005).
- Vidilaseris, K., et al. Asymmetry in catalysis by Thermotoga maritima membrane-bound pyrophosphatase demonstrated by a nonphosphorus allosteric inhibitor. Science Advances. 5 (5), (2019).
- Lin, S. M., et al. Crystal structure of a membrane-embedded H+-translocating pyrophosphatase. Nature. 484 (7394), 399-403 (2012).
- Fiske, C. H., Subbarow, Y. The colorimetric determination of phosphorus. Journal of Biological Chemistry. 66 (2), 375-400 (1925).
- Nagul, E. A., McKelvie, I. D., Worsfold, P., Kolev, S. D. The molybdenum blue reaction for the determination of orthophosphate revisited: Opening the black box. Analytica Chimica Acta. 890, 60-82 (2015).
- Kellosalo, J., Kajander, T., Palmgren, M. G., Lopez-Marques, R. L., Goldman, A. Heterologous expression and purification of membrane-bound pyrophosphatases. Protein Expression and Purification. 79 (1), 25-34 (2011).
- Vidilaseris, K., Kellosalo, J., Goldman, A. A high-throughput method for orthophosphate determination of thermostable membrane-bound pyrophosphatase activity. Analytical Methods. 10 (6), 646-651 (2018).
- He, Z. Q., Honeycutt, C. W. A modified molybdenum blue method for orthophosphate determination suitable for investigating enzymatic hydrolysis of organic phosphates. Communications in Soil Science and Plant Analysis. 36 (9-10), 1373-1383 (2005).
- Martin, B., Pallen, C. J., Wang, J. H., Graves, D. J. Use of fluorinated tyrosine phosphates to probe the substrate specificity of the low molecular weight phosphatase activity of calcineurin. Journal of Biological Chemistry. 260 (28), 14932-14937 (1985).
- Strauss, J., Wilkinson, C., Vidilaseris, K., Harborne, S. P. D., Goldman, A. A simple strategy to determine the dependence of membrane-bound pyrophosphatases on K+ as a cofactor. Methods in Enzymology. 607, 131-156 (2018).