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Biochemistry

热通菌膜-双磷酶抑制剂的筛选

doi: 10.3791/60619 Published: November 23, 2019
* These authors contributed equally

Summary

在这里,我们提出了膜结合焦磷酶(来自热托加水红素)抑制剂的筛选方法,其依据是96孔板格式的二恶极蓝色反应。

Abstract

膜结合的焦道面酶 (mPPases) 是存在于细菌、古体、植物和原生寄生虫中的二恶酶。这些蛋白质将焦磷酸盐切成两个正磷酸盐分子,与质子和/或钠在膜上泵送结合。由于动物和人类中不存在同源性蛋白,因此,在设计潜在的药物靶点时,mPPass 是很好的候选者。在这里,我们提出了一个详细的协议,以筛选mPPase抑制剂利用在96井板系统中的三联体蓝色反应。我们使用来自热亲菌的mPPase作为模型酶。该协议简单且成本低廉,产生一致且可靠的结果。从测定开始到吸光度测量,只需大约一个小时完成活动测定协议。由于此测定中产生的蓝色长期稳定,因此后续测定可在上一批之后立即进行,并且以后可以同时测量所有批次的吸光度。该协议的缺点是,它是手动完成的,因此可能会耗尽,以及需要良好的移液和时间保持技能。此外,本测定中使用的阿森特-柠酸酯溶液含有醋酸钠,该钠有毒,应采取必要的预防措施处理。

Introduction

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细胞蛋白总量的约25%是膜蛋白,其中约60%为药物靶点1、2。潜在的药物目标之一,膜结合的焦磷酸酶(mPPases),是二氧化硅酶,通过水解焦磷酸化将质子和/或钠子泵入膜,并注入两个正磷酸盐4。mPPases可以在各种生物中发现,如细菌、古生物、植物和原生寄生虫,但人类和动物4除外。在原生寄生虫中,例如恶性疟原虫、弓形虫和锥虫病,pPPases对寄生虫毒性6至关重要,在寄生虫中敲除这种表达会导致在接触外部基本pH7时无法维持细胞内pH。由于其重要性和缺乏同源蛋白存在于脊椎动物中,mPPases可被视为潜在的药物靶点,用于原原病3。

这项工作中mPPase抑制剂的体外筛选基于TmPPase模型系统。TmPPase是一种钠电泵和钾依赖mPPase从T.马里蒂马,其最佳活性在71°C8。例如,这种酶的益处是易于生产和纯化,热稳定性好,活性高。TmPPase除了完全保持位置外,还表现出高度相似性,并且所有催化残留物与前子mPPases3、9和Vigna radiata10 mPPase的求解结构具有特征。不同符合的TmPPase的可用结构也可用于基于结构的药物设计实验(如虚拟筛选和de novo设计)。

在这里,我们报告一个详细的协议,以96孔板格式筛选TmPPase抑制剂(图1)。该协议基于由菲斯克和Subbarow11首先开发的蓝色反应的色度测定方法。该方法涉及在酸性条件下从正磷酸盐和磷酸中形成12磷酸,然后减少,使具有特征的蓝绿色磷脂物质物种12。

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Protocol

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1. 蛋白质制备

注:TmPPase的表达和纯化已在其他地方13所述。

  1. 制备含有20 mM2-(N-变形)乙酸(MES) pH 6.5、3.5%(v/v)甘油、2 mM二硫二硫醇(DTT)和0.05%二硫酰硫莉醇(DTT)的再活化缓冲液溶液10mL。
  2. 制备含有 200 mM Tris-Cl pH 8.0、8.0 mM MgCl2、333 mM KCl 和 67 mM NaCl 的反应混合物 10 mL。
    注:Mg2+需要将焦磷酸盐作为mPPase的基质,需要K+来增加酶活性,因为TmPPase是钾依赖性mPPase,而在TmPPase钠释放期间,需要Na+用于酶活性。
  3. 准备30mg/mL脂体,用于酶的重新激活。
    1. 将 10 mL 的 20 mM Tris-HCl pH 8.0 与 1 mM DTT 添加到 0.3 g 的 L-α-磷脂酰胆碱从大豆到 10 mL 的 20 mM Tris-HCl pH 8.0 与 1 mM DTT。
    2. 将脂质体放在冰上,用1秒脉冲间隔声波1分钟,暂停1分钟,然后重复,直到溶液变为透明黄色。
    3. 将脂液体与液氮相融合,冷冻在-80°C,直到使用。
  4. 重新激活酶。
    1. 将40μL的脂体溶液与22.5μL的20%DDM混合。
    2. 将混合物在55°C加热15分钟,使其冷却至室温。
    3. 加入36.5μL的复活缓冲液,混合并加入1μL的浓缩蛋白(13mg/mL),使总浓度为0.13毫克/mL。
      注:蛋白质通常在纯化后冷冻在10μL等分物中,并在使用前在冰上解冻。
  5. 取20μL的重新激活的酶,加入1,480μL的反应混合物,然后轻轻混合。
    注:在使用反应混合物之前应先将重新激活的酶添加到混合物中。

2. 化合物制备

  1. 溶解二甲基硫酸盐(DMSO)中的化合物,根据化合物的可用性,在50~200μL中制造25~100 mM的库存溶液。
    注:此处使用的所有化合物(图2A)已发表于9。如果化合物的溶解度低,可以相应地调整库存浓度。
  2. 在水中制备三种不同浓度的化合物。
    注:反应混合物中的最终浓度分别为1、5和50微摩尔或1、5和20微摩尔,用于可溶性和少溶性化合物。
    1. 在微管中用水稀释库存溶液至1 mL,为可溶性化合物提供2μM、10μM和100μM,或者为可溶性化合物提供2μM、10μM和40μM。
    2. 稀释库存溶液后立即涡旋复合溶液,以便进行适当的混合。
  3. 使用肾上咽机检查化合物聚合。
    注:此研究分为三浓度(1 μM、5 μM 和 20 μM)的三分法,并归化为 96 孔板中的空白。
    1. 使用多通道移液器将75 μL的反应混合物分配到每个井中。
    2. 加入每种化合物的75μL(对于空白,改用75μL的水),然后通过上下移液5°混合。
    3. 使用微孔计在 300 V 下测量每个孔。

3. 用于测定制备的试剂

  1. 准备阿森特-酸盐溶液。
    1. 称量5克醋酸钠和5克柠酸二酯三钠。
      注意:醋酸钠有毒,因此使用适当的防护设备和处理特别小心。作为预防措施,在阅读和理解所有必要的安全预防措施之前,不要处理。仅在烟气罩中处理,以免吸入化合物或其溶液的灰尘/蒸汽。如果吸入,移动到新鲜空气,并获得医疗照顾。佩戴适当的化学安全护目镜、防护手套和衣物,避免摄入和眼睛/皮肤接触。如果吞咽,立即致电中毒中心或医生/医生。如果它进入皮肤或眼睛,用大量的水洗涤,并获得医疗照顾。
    2. 溶解成100 mL的水。
    3. 加入5 mL的冰川醋酸,混合,并加入水到250 mL。
    4. 在室温下存放,防止光线照射。
      注:该解决方案稳定了一年多。
  2. 准备解决方案 A 和解决方案 B。
    1. 对于溶液A,将10 mL的冰冷0.5 M HCl加入0.3克抗坏血酸。通过涡旋溶解抗坏血酸。
    2. 对于溶液B,将1mL的冰冷水加入70毫克七聚氨酯四水合物和涡流溶解。
      注:将两种溶液都存放在冰上,直到使用。为了检测结果的一致性,两种溶液都可以在冰上储存最多一周。
  3. 制备浓度为0μM、62.5μM、250μM和500μM的磷酸盐(Pi)标准进行校准。
    1. 将0μL、25μL、50μL和100 μL的5 mM Na2HPO4二水合物添加到四个含有370μL反应混合物的微管中。
    2. 用水充值至1 mL。

4. 一个 96 孔板的活动测定

注:有关测定原理图工作流,参见图 1。

  1. 将1 mL溶液B添加到10 mL溶液A中,通过涡旋混合,并将溶液储存在冰上。
    注:此解决方案应透明且黄色。使用前,将溶液A+ B放在冰上至少30分钟。但是,在 3 小时内使用该解决方案,因为长期存储后会变坏。
  2. 使用多通道移液器将 40 μL 的 0 μM、62.5 μM、250 μM 和 500 μM Pi标准添加到三联管条中。
    注:未添加Pi的反应混合物将用作空白。
  3. 使用多通道移液器向管条添加 25 μL 的复合溶液。
    注:每种化合物在三联体中具有三种不同的浓度,足以初步估计半最大抑制浓度(IC50)。为了更精确的IC50测定,可以使用8种不同的化合物浓度。对于未抑制的酶,复合溶液被等量的水所取代。作为正对照2.5μM,25μM和250μM的imidodi磷酸(IDP)钠盐被使用。
  4. 使用多通道移液器将 15 μL 的 mPPase 溶液混合物添加到管条中(含有 Pi标准的管除外)。
  5. 用粘合密封板密封管条。切割密封板以分离每个管条。
  6. 在71°C下预孵育样品5分钟。将样品放在加热块上,每个条带间隔为 20 秒,以便在接下来的步骤中最大程度地消耗时间。
  7. 对于每个条,打开胶粘剂密封。使用多通道移液器添加 10 μL 的 2 mM 焦磷酸钠二基基,并通过上下移液混合 5°。使用相同的密封再次密封管条。
    注意:此步骤最初可能很难在 20 s 内完成;然而,经过一些检测后,它会变得更容易。
  8. 在71°C孵育5分钟。
  9. 将样品放在冷却装置上,每个条带之间间隔为 20 秒。让他们冷却10分钟,但离心机每条后5分钟的冷却,将滴水滴在密封片下,然后放回冷却装置并去除密封。
    注:冷却装置只需在聚苯乙烯培养皿(尺寸为 150 mm × 15 mm)上放置一个 96 孔 PCR 板即可制成,该盘装满了水和冷冻至少 1 小时。在开始测定前约 5 分钟,应从冰箱中取出该装置。在样品冷却前不要拿出冷却装置,因为冷却装置会冻结反应混合物并阻碍颜色的发育。
  10. 冷却 10 分钟后,加入 60 μL 溶液 A + B,上下移液 5°,并将管条放在冷却装置上 10 分钟。
  11. 加入90 μL的青基铝溶液,在室温下保持至少30分钟,以产生稳定的蓝色。
    注意:由于其毒性,所有含有醋酸钠的溶液应始终格外小心处理。因此,在烟气罩中应添加紫锥酸盐溶液。
  12. 将每种反应混合物的180 μL放入透明96孔聚苯乙烯微孔板中。
  13. 使用微板分光光度计测量每口井在 860 nm 处的吸光度。

5. 结果分析

  1. 平均每个样本的三次和 Pi标准。然后用空格减去以消除背景信号。
  2. 通过根据 Pi标准 (nmol) 的量绘制吸收率 (A860)值来绘制校准曲线,并使用以下公式执行线性回归以获取趋势线函数:
    Equation 1
  3. 根据上述线性回归公式计算酶反应释放的磷酸盐量(nmol)。
  4. 使用以下公式计算特定活动:
    Equation 2
    其中nPi是从反应 (nmol) 释放的磷酸盐的量,t 是反应时间(分钟),m TmPPase是测定中使用的纯 TmPPase 的量(mg)。
  5. 使用以下公式计算每种抑制剂浓度的活性百分比:
    Equation 3
    其中SAi是具有抑制剂的样品的特定活性,SAun是未抑制样品的特定活性。
  6. 使用以下公式使用四参数剂量-响应曲线的非线性回归拟合计算 logIC50(估计)和 IC50(估计):
    Equation 4
    其中 X 是浓度的日志 (μM),Y 是活动 (%),顶部和底部是与 Y(分别为 100% 和 0%)相同的单位中的高原,对数 IC50具有与 X 相同的日志单位,而希尔斜率 = 坡度因子或坡度,无单位。
    注: 软件 (材料表) 用于配件.在没有抑制剂的样品使用0.01 μM(而不是0.00μM)的浓度,因为未定义零对数。

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Representative Results

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在本协议中,八种化合物(图2A)与IDP(热磷酶的常见抑制剂)一起作为阳性对照物进行了测试(图2A)。每种化合物在三次试用中测试三种不同的浓度(1 μM、5 μM和20 μM)。筛选的工作流程如图1所示,从样品和试剂制备开始,直到860nm的吸光度测量。

在该协议结束时,在添加溶液A+B和阿森酸盐-酸盐后,由于磷酸离子的形成具有可观察到的磷酸离子的复杂形成,并且显示了酶反应的发生,因此溶液形成稳定的蓝色,最大吸收在709nm和860 nm14。对于这个实验,我们使用860nm的吸收率来测量释放的Pi量,因为它具有更好的检测极限和灵敏度,而709nm15的吸收率。蓝色在室温下30分钟的孵育中完全发育,稳定至少5小时14小时。测定的灵敏度下降到Pi浓度为10μM,吸光度在10~800μM14的浓度范围内是线性的。在此具有代表性的结果中,井E1_E3(图2C)含有无抑制剂的反应混合物,在测定结束时可以观察到蓝色溶液。在未达到完全抑制的低化合物浓度下也可以观察到这一点,如IDP的F1+F3井和化合物1的A4+A6井(ATC,最近已知的TmPPase9的无竞争力抑制剂),浓度分别为2.5μM和1μM。IDP和化合物1的浓度越高,可以观察到的蓝色越少(G1+G3和H1+H3代表IDP,B4+B6和C4+C6表示抑制酶活性)。 所有三种浓度的非抑制化合物(2、3和8)都表现出相同的蓝色强度,E1+E3没有任何抑制剂(图2C)。

在 860 nm 处测量吸光度后,可以处理和分析数据(参见协议第 5 节)。图 2D显示了 Pi标准的校准图及其线性拟合(y = 0.0576x = 0.0019;r2 = 0.999)。图 3显示了酶活性图 (%)针对每个测试化合物的浓度。对于具有抑制活性的化合物,还显示非线性曲线拟合。用作正对照的国内流离失所者清楚地表明,在浓度较高时活动减少。基于三种不同浓度计算的IC50(估计值)为88.2 μM(表1),这与先前的测量值(80.0 μM)相似,有8个浓度点14。化合物1、4、5、6和7显示出与IDP相似的趋势,因为浓度随着IC50(估计值)分别增加约1.3μM、7.4μM、19.0μM、37.4μM和156.1 μM(表1)。 对于化合物2、3和8,在测定浓度下不能观察到活性或抑制的减少。 附加的测定有8个浓度点,可以产生精确的IC50。图4显示了化合物1、5、6、7和8的抑制曲线,其IC50分别为1.7μM、21.4μM、58.8μM、239.0μM和>500μM,分别为9

Figure 1
图1:TmPPase抑制测定的原理图工作流程,采用96孔板格式。红色编号显示根据协议进行检测的步骤,蓝色箭头显示间隔顺序。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图2:样品,其排列和颜色发展在96孔板。A) 用于测定的化合物1+8的结构.这些化合物的抑制活性已在维迪拉泽里斯等人9报告。(B) 样品排列。(C) 颜色开发,30分钟后加入阿森特-酸盐溶液。控制抑制剂(IDP)和样品的浓度分别为2.5μM、25μM和250μM浓度和1μM、5μM和20μM浓度。蓝色的强度对应于由于酶反应而释放的Pi的量,而缺乏颜色对应于无酶反应。(D) Pi标准 (nmol) 的校准曲线与带线性拟合的 A860(y = 0.0576x = 0.0019;r2 = 0.999)。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图3:三种不同抑制剂浓度的TmPPase活性曲线。计算IC50(估计值)的非线性回归曲线为IDP以及化合物1、4、5、6和7显示,但化合物2、3和8则不显示,因为它们在测定浓度下没有抑制TmPPase活性。每个化合物的对数50和IC50(估计值)如表1所示。所有数据均值 = SD,有三个复制。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 4
图4:化合物1、5、6、7和8的8个浓度点的抑制曲线。这个数字取自维迪拉泽里斯等人9号,稍作修改。所有数据均值 = SD,有三个复制。请点击此处查看此图的较大版本。

样品 日志50 IC50 (估计) (μM)
国内流离失所者 1.95 × 0.0142 87.9 × 2.46
1 0.112 × 0.0274 1.29 ± 0.0816
2 · 无抑制
3 · 无抑制
4 0.870 × 0.0447 7.39 ± 0.760
5 1.28 ± 0.0296 19.0 ± 1.29
6 1.57 × 0.0846 37.4 × 7.29
7 2.19 ± 0.366 156 × 131
8 · 无抑制

表1:基于图3的数据,IDP和化合物1+8的LogIC50和IC50(估计值)。

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Discussion

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在这里,我们报告一个详细的协议,用于简单筛选从T.Maritima膜结合热磷酶的抑制剂在96井板格式基于Vidilaseris等人14。该协议是廉价的,基于12磷酸,这是由正磷酸盐和乙基在酸性条件下形成的,并减少到具有明显蓝色12的磷脂树种。此方法比其他协议更可取,如更敏感的马拉奇特绿色测定16,因为这种方法不显示干扰存在高磷脂浓度,这是TMPPase重新激活14所必需的。

筛选协议的工作流程如图1所示,此过程可在 1 h 内完全完成。该协议针对TmPPase进行了优化,最佳工作温度为71°C,反应时间为5分钟。由于水会从这个温度下从反应混合物中蒸发,因此应用粘合密封片(切片以适合和覆盖条体)以防止蒸发14,并且蒸发的水只需通过离心回收即可。选择5分钟的孵育时间,因为它仍然在酶释放磷酸盐的线性范围内,足以进行可靠的筛选14。在此协议中,定时和移液技术是获得良好、可靠的结果的重要因素。在检测过程中添加试剂,在条带之间间隔为 20 秒,是一种优化的定时选项,便于执行后续步骤。

对于不同的mPPas,在抑制测定中使用之前,应分别确定最佳温度和孵育时间。上述酶重新激活协议针对 TmPPase 进行了优化,其他 mPPas 可能需要不同的重新激活协议。例如,不应添加DDM以重新激活来自Pyrobaculum的嗜热杆菌的mPPase,因为它将减少其酶活性17。由于如果事先做好充分准备,酶的活性会降低,因此在开始测定前不久,应在反应混合物中加入再活性酶。加入阿森酸盐-酸盐溶液后,反应产物稳定至少5 h14。因此,可以立即执行下一批的测定,并且稍后可以一次对所有批次进行吸光度测量。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

这项工作得到了简和Aatos Erkko基金会和BBSRC(BB/M021610)对阿德里安·戈德曼的资助, 芬兰学院(第308105号)给基尼·维迪拉利斯,(第310297号)到亨利·夏德,(第265481号)到贾里·伊利-考哈卢马,赫尔辛基大学研究基金给古斯塔夫·博伊耶·阿夫·根纳斯。作者感谢伯纳黛特·盖尔在项目期间提供的技术帮助。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adhesive sealing sheet Thermo Scientific AB0558
Ammonium heptamolybdate tetrahydrate Merck F1412481 636
Ascorbic acid Sigma-Aldrich 95212-250G
BioLite 96Well Multidish Thermo Scientific 130188
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Merck 1167431000
8-well PCR Tube Strips 0.2 ml without caps (120) Nippon genetics FG-028
Dodecyl maltoside (DDM) Melford B2010-100G
Ethanol Merck 1009901001
Glacial acetic acid Merck 1000631011
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 258148-500ML
Imidodiphosphate sodium salt Sigma-Aldrich I0631-1G
L-α-Phosphatidyl choline from soybean lecithin Sigma 429415-100GM
Magnesium chloride Sigma-Aldrich 8147330500
Multiplate 96-Well PCR Plates Bio-Rad MLL9651
MultiSkan Go Thermo Scientific 10680879
Nepheloskan Ascent (Type 750) Labsystems
Polystyrene Petri dish (size 150 mm x 15 mm) Sigma-Aldrich P5981-100EA
Potassium chloride Merck 104936
Prism 6 software GraphPad
QBT2 Heating block Grant Instruments
Sodium meta-arsenite Fisher Chemical 12897692
Sodium phosphate dibasic (Pi) Sigma S0876-1KG
Sodium pyrophosphate dibasic Fluka 71501-100G
Trisodium citrate dihydrate Fluka 71404-1KG

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References

  1. Terstappen, G. C., Reggiani, A. In silico research in drug discovery. Trends in Pharmacological Sciences. 22, (1), 23-26 (2001).
  2. Rask-Andersen, M., Almen, M. S., Schioth, H. B. Trends in the exploitation of novel drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 10, (8), 579-590 (2011).
  3. Shah, N. R., Vidilaseris, K., Xhaard, H., Goldman, A. Integral membrane pyrophosphatases: a novel drug target for human pathogens. AIMS Biophysics. 3, (1), 171-194 (2016).
  4. Baykov, A. A., Malinen, A. M., Luoto, H. H., Lahti, R. Pyrophosphate-Fueled Na+ and H+ Transport in Prokaryotes. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 77, (2), 267-276 (2013).
  5. Serrano, A., Perez-Castineira, J. R., Baltscheffsky, M., Baltscheffsky, H. H+-PPases: yesterday, today and tomorrow. IUBMB Life. 59, (2), 76-83 (2007).
  6. Liu, J., et al. A vacuolar-H+-pyrophosphatase (TgVP1) is required for microneme secretion, host cell invasion, and extracellular survival of Toxoplasma gondii. Molecular Microbiology. 93, (4), 698-712 (2014).
  7. Lemercier, G., et al. A pyrophosphatase regulating polyphosphate metabolism in acidocalcisomes is essential for Trypanosoma brucei virulence in mice. Journal of Biological Chemistry. 279, (5), 3420-3425 (2004).
  8. Belogurov, G. A., et al. Membrane-bound pyrophosphatase of Thermotoga maritima requires sodium for activity. Biochemistry. 44, (6), 2088-2096 (2005).
  9. Vidilaseris, K., et al. Asymmetry in catalysis by Thermotoga maritima membrane-bound pyrophosphatase demonstrated by a nonphosphorus allosteric inhibitor. Science Advances. 5, (5), (2019).
  10. Lin, S. M., et al. Crystal structure of a membrane-embedded H+-translocating pyrophosphatase. Nature. 484, (7394), 399-403 (2012).
  11. Fiske, C. H., Subbarow, Y. The colorimetric determination of phosphorus. Journal of Biological Chemistry. 66, (2), 375-400 (1925).
  12. Nagul, E. A., McKelvie, I. D., Worsfold, P., Kolev, S. D. The molybdenum blue reaction for the determination of orthophosphate revisited: Opening the black box. Analytica Chimica Acta. 890, 60-82 (2015).
  13. Kellosalo, J., Kajander, T., Palmgren, M. G., Lopez-Marques, R. L., Goldman, A. Heterologous expression and purification of membrane-bound pyrophosphatases. Protein Expression and Purification. 79, (1), 25-34 (2011).
  14. Vidilaseris, K., Kellosalo, J., Goldman, A. A high-throughput method for orthophosphate determination of thermostable membrane-bound pyrophosphatase activity. Analytical Methods. 10, (6), 646-651 (2018).
  15. He, Z. Q., Honeycutt, C. W. A modified molybdenum blue method for orthophosphate determination suitable for investigating enzymatic hydrolysis of organic phosphates. Communications in Soil Science and Plant Analysis. 36, (9-10), 1373-1383 (2005).
  16. Martin, B., Pallen, C. J., Wang, J. H., Graves, D. J. Use of fluorinated tyrosine phosphates to probe the substrate specificity of the low molecular weight phosphatase activity of calcineurin. Journal of Biological Chemistry. 260, (28), 14932-14937 (1985).
  17. Strauss, J., Wilkinson, C., Vidilaseris, K., Harborne, S. P. D., Goldman, A. A simple strategy to determine the dependence of membrane-bound pyrophosphatases on K+ as a cofactor. Methods in Enzymology. 607, 131-156 (2018).
<em>热通菌膜-</em>双磷酶抑制剂的筛选
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Vidilaseris, K., Johansson, N. G., Turku, A., Kiriazis, A., Boije af Gennäs, G., Yli-Kauhaluoma, J., Xhaard, H., Goldman, A. Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors. J. Vis. Exp. (153), e60619, doi:10.3791/60619 (2019).More

Vidilaseris, K., Johansson, N. G., Turku, A., Kiriazis, A., Boije af Gennäs, G., Yli-Kauhaluoma, J., Xhaard, H., Goldman, A. Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors. J. Vis. Exp. (153), e60619, doi:10.3791/60619 (2019).

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