Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

Screening for Thermotoga Maritima membranbundne Pyrofosfatasehæmmere

doi: 10.3791/60619 Published: November 23, 2019
* These authors contributed equally

Summary

Her præsenterer vi en screeningmetode for membranbundne pyrofosfatase (fra Thermotoga Maritima) hæmmere baseret på molybdæn blå reaktion i en 96 brønd plade format.

Abstract

Membranbundne pyrofosfataser (Mppaser) er dikemeje enzymer, der forekommer i bakterier, archaea, planter og protist parasitter. Disse proteiner kløver pyrophosphat i to ortopæhosphat molekyler, som er kombineret med proton og/eller natrium ion pumpning på tværs af membranen. Da der ikke forekommer homologe proteiner hos dyr og mennesker, er mPPases gode kandidater i udformningen af potentielle stofmål. Her præsenterer vi en detaljeret protokol til skærmen for mPPase-hæmmere udnytte molybdæn blå reaktion i en 96 brønd plade system. Vi bruger mppase fra termofile bakterien thermotoga Maritima (tmppase) som en model enzym. Denne protokol er enkel og billig, hvilket giver et konsistent og robust resultat. Det tager kun ca. en time at fuldføre aktivitetsanalyse protokollen fra starten af analysen indtil absorbansmålingen. Da den blå farve, der produceres i denne analyse, er stabil i en længere periode, kan efterfølgende analyse (er) udføres umiddelbart efter det foregående parti, og absorbansen kan måles senere for alle batcher på samme tid. Ulempen ved denne protokol er, at det sker manuelt og dermed kan være udmattende samt kræve gode færdigheder af pipettering og tidsregistrering. Desuden indeholder arsenit-citrat-opløsningen, der anvendes i denne analyse, natriumarsenit, som er giftigt og bør håndteres med de nødvendige forholdsregler.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Ca. 25% af de samlede cellulære proteiner er membran proteiner og omkring 60% af dem er narkotika mål1,2. En af de potentielle Drug mål3, membran-bundne pyrofosfataser (mppases), er dikemeje enzymer, der pumper proton og/eller natrium ion på tværs af membranen ved hydrolyse af pyrophosphat i to fra4. mPPases kan findes i forskellige organismer5 såsom bakterier, archaea, planter og protist parasitter, med undtagelse af mennesker og dyr4. I protist parasitter, for eksempel Plasmodium falciparum, Toxoplasma gondii og Trypanosoma brucei, mppases er afgørende for parasitten virulens6 og knockout af dette udtryk i parasitter føre til svigt i at opretholde intracellulære pH ved udsættelse for den eksterne grundlæggende pH7. På grund af deres betydning og mangel på homologt protein til stede i hvirveldyr, kan mPPases betragtes som potentielle Drug mål for protistal sygdomme3.

In vitro-screeningen af Mppasehæmmere i dette arbejde er baseret på et TmPPase-model system. TmPPase er en natrium-ion-pumpe og kalium-ion-afhængig mPPase fra T. Maritima og har sin optimale aktivitet ved 71 °c8. Fordelene ved dette enzym er for eksempel dets lethed i produktion og rensning, god termisk stabilitet og høj specifik aktivitet. Tmppase viser både høj lighed ud over den fuldstændige bevaring af positionen samt identiteten af alle katalytiske rester til den protist mppases3,9 og til den løste struktur af Vigna radiata10 mppase. De tilgængelige strukturer af TmPPase i forskellige konstellationer er også nyttige for struktur-baserede Drug Design eksperiment (som virtuel screening og de Novo design).

Her rapporterer vi en detaljeret protokol for screening af TmPPase-hæmmere i en 96 brønd plade format (figur 1). Protokollen er baseret på den kolorimetriske metode til molybdæn blå reaktion, som først blev udviklet af fiske og Subbarow11. Denne metode indebærer dannelsen af 12-phosphomolybdic fra orthophosphat og molybdæn under sure forhold, som derefter reduceres til at give karakteristiske blåfarvede phosphomolybdenumarter12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. protein præparat

Bemærk: udtrykket og oprensningen af TmPPase er beskrevet andetsteds13.

  1. Der fremstilles 10 ml reaktiverings bufferopløsning indeholdende 20 mm 2-(N-morpholino) ethansulfonsyre (MES) pH 6,5, 3,5% (v/v) glycerol, 2 mm ditiotreitol (DTT) og 0,05% dodecyl maltoside (DDM).
  2. Der fremstilles 10 mL af reaktionsblandingen indeholdende 200 mM Tris-CL pH 8,0, 8,0 mM MgCl2, 333 mm KCl og 67 mm NaCl.
    Bemærk: mg2 + er forpligtet til at Chelat pyrofosfat som substrat af mppase, K+ er forpligtet til at øge enzymaktivitet som tmppase er en kalium afhængig mppase, og na+ er nødvendig for enzymaktivitet under natrium iontranslokation ved tmppase.
  3. Forbered 30 mg/mL Liposomer til enzym reaktivering.
    1. Tilsæt 10 mL af 20 mM Tris-HCl pH 8,0 med 1 mM DTT til 0,3 g L-α-phosphatidylcholin fra sojabønner til 10 mL af 20 mM Tris-HCl pH 8,0 med 1 mM DTT.
    2. Sæt Liposom på isen, og Sonik med 1 sekund puls interval i 1 minut, pause i 1 minut, og Gentag, indtil opløsningen bliver gennemsigtig gul.
    3. Alikvot Liposomer, fryse i flydende nitrogen og opbevares ved-80 °C, indtil det anvendes.
  4. Genaktiver enzymet.
    1. Bland 40 μL af Liposomer opløsningen med 22,5 μL 20% DDM.
    2. Blandingen opvarmes ved 55 °C i 15 minutter, og den kan afkøles til stuetemperatur.
    3. Tilsæt 36,5 μL af reaktiverings bufferopløsningen, bland, og tilsæt 1 μL koncentreret protein (13 mg/mL) for at lave en total koncentration på 0,13 mg/mL.
      Bemærk: protein er normalt frosset i 10 μL aliquoter efter rensning og optøet på is før brug.
  5. Tag 20 μL af det reaktiverede enzym, og tilsæt 1.480 μL af reaktionsblandingen, og bland forsigtigt.
    Bemærk: tilføjelsen af det reaktiverede enzym til reaktionsblandingen skal udføres lige før det anvendes.

2. sammensat præparat

  1. Forbindelserne i dimethylsulfoxid (DMSO) opløses for at gøre stamopløsninger på 25 − 100 mM i 50 − 200 μL baseret på tilgængeligheden af forbindelserne.
    Bemærk: alle forbindelser, der anvendes her (figur 2A) er blevet offentliggjort tidligere9. Hvis den sammensatte opløselighed er lav, kan Stam koncentrationen justeres i overensstemmelse hermed.
  2. Forbered tre forskellige koncentrationer af hver forbindelse i vand.
    Bemærk: de endelige koncentrationer i reaktionsblandingen vil være 1, 5 og 50 micromolar eller 1, 5 og 20 micromolar for opløselige og sparsomt opløselige forbindelser.
    1. Stamopløsningen fortyndes med vand til 1 mL i mikrorør for at give 2 μM, 10 μM og 100 μM for opløselige forbindelser eller alternativt 2 μM, 10 μM og 40 μM for sparsomt opløselige forbindelser.
    2. Vortex den sammensatte opløsning øjeblikkeligt efter fortynding af stamopløsningen for korrekt blanding.
  3. Kontroller for sammensat aggregering ved hjælp af et nephelometer.
    Bemærk: Dette blev undersøgt som triplicater i tre koncentrationer (1 μM, 5 μM og 20 μM) og normaliseret til blank i en 96 brønd plade.
    1. 75 μL af reaktionsblandingen dispenserer i hver brønd med en multikanalpipette.
    2. Tilsæt 75 μL af hver forbindelse (for blind, brug 75 μL vand i stedet) og bland ved pipettering op og ned 5 ×.
    3. Mål hver brønd ved 300 V ved hjælp af en Micro Plate nephelometer.

3. reagenser til analyse præparatet

  1. Forbered arsenit-citrat opløsningen.
    1. 5 g natriumarsenit og 5 g trinatrium citrat dihydrat vejes.
      Forsigtig: natrium arsenit er giftigt, og brug derfor korrekt beskyttelsesudstyr og håndtag med særlig omhu. Som forholdsregel skal de ikke håndteres, før alle nødvendige sikkerhedsforanstaltninger er blevet læst og forstået. Må kun håndteres i en stinkhætte for ikke at indånde støv/dampe fra forbindelsen eller dens opløsning (er). Hvis du indåndes, skal du flytte til frisk luft og få lægehjælp. Bær passende kemiske sikkerhedsbriller, beskyttende handsker og beklædning for at undgå indtagelse og øjen-/hudkontakt. Ved indtagelse, ring straks til en gift Center eller læge. Hvis det kommer på huden eller i øjet (s), vaskes med rigeligt vand og få lægehjælp.
    2. Opløses i 100 mL vand.
    3. Tilsæt 5 mL iseddike, bland, og tilsæt vand til 250 mL.
    4. Opbevares ved stuetemperatur beskyttet mod lys.
      Bemærk: opløsningen er stabil i mere end et år.
  2. Forbered opløsning A og opløsning B.
    1. For opløsning A tilsættes 10 mL iskold 0,5 M HCl til 0,3 g ascorbinsyre. Ascorbinsyren opløses ved vortexing.
    2. For opløsning B tilsættes 1 mL iskold vand til 70 mg ammoniumheptamolybdate tetrahydrat og vortex til opløsning.
      Bemærk: Opbevar begge opløsninger på is, indtil de bruges. For konsistensen af analyseresultatet kan begge opløsninger opbevares på is i højst en uge.
  3. Fosfat (Pi)-standarden forberedes med en koncentration på 0 μM, 62,5 μm, 250 μm og 500 μM til kalibrering.
    1. Der tilsættes 0 μL, 25 μL, 50 μL og 100 μL 5 mM na2HPO4 dihydrat til fire mikrorør indeholdende 370 μl af reaktionsblandingen.
    2. Top op til 1 mL med vand.

4. aktivitetsanalyse for 1 96 brønd plade

Bemærk: Se figur 1 for den skematiske arbejdsgang for analysen.

  1. Der tilsættes 1 mL opløsning B til 10 mL opløsning A, blandes ved vortexning, og opløsningen opbevares på is.
    Bemærk: denne opløsning skal være gennemsigtig og gul. Hold opløsningen A + B på is i mindst 30 minutter før brug. Men, bruge opløsningen inden for 3 h, da det vil gå dårligt efter langsigtet opbevaring.
  2. Der tilsættes 40 μL 0 μM, 62,5 μM, 250 μM og 500μm P i standard til rørstrimlerne i tre eksemplarer ved hjælp af en multikanals pipette.
    Bemærk: reaktionsblandingen uden tilsat Pi vil blive brugt som blank.
  3. Der tilsættes 25 μL sammensat opløsning til rørstrimlerne ved hjælp af en multikanals pipette.
    Bemærk: hver forbindelse har tre forskellige koncentrationer i triplicat, hvilket er tilstrækkeligt til den første vurdering af den halve maksimale hæmmende koncentration (IC50). For en mere nøjagtig IC50 bestemmelse kan der anvendes otte forskellige sammensatte koncentrationer. For det uhæmmede enzym erstattes den sammensatte opløsning med samme mængde vand. Som positive kontroller blev der anvendt 2,5 μM, 25 μM og 250 μM imidodiphosphat (IDP) natriumsalt.
  4. Der tilsættes 15 μL mPPase-opløsning til rørstrimlerne (undtagen de rør, der indeholder Pi -standarden) ved hjælp af en multikanals pipette.
  5. Forsegl slange strimlerne med en klæbende tætningsplade. Skær tætnings arket for at adskille hver rørstrimmel.
  6. Præinkubatprøverne i 5 min ved 71 °C. Placer prøverne på varme blokken med 20 s interval mellem hver strimmel for at minimere tidsforbruget i de efterfølgende trin.
  7. Åbn klæbe forseglingen for hver strimmel. Tilsæt 10 μl 2 mm natriumpyrofosfat dibasisk ved hjælp af en multikanals pipette og bland ved pipettering op og ned i 5 ×. Forsegl rørstrimlen igen med den samme forsegling.
    Bemærk: dette trin kan i første omgang være vanskeligt at udføre i 20 s; Men, det vil blive lettere efter nogle assays.
  8. Inkuber ved 71 °C i 5 minutter.
  9. Placer prøverne på køleapparatet med 20 s interval mellem hver strimmel. Lad dem køle i 10 minutter, men centrifuger hver strimmel kort efter 5 minutters afkøling, til deant vanddråber under tætnings arket, og sæt den derefter tilbage til køleapparatet og fjern forseglingen.
    Bemærk: køleapparatet kan ganske enkelt laves ved at anbringe en 96 Well PCR-plade på en polystyren Petri skål (størrelse 150 mm × 15 mm) fyldt med vand og frosset i mindst 1 time. Apparatet skal tages ud af fryseren ca. 5 min før begyndelsen af analysen. Tag ikke køleapparatet lige før prøve køling, da det vil fryse reaktionsblandingen og hæmme farve udvikling.
  10. Efter 10 min køling tilsættes 60 μL opløsning A + B, blandes ved pipettering op og ned i 5 × og holder rørstrimlerne på køleapparatet i 10 min.
  11. Der tilsættes 90 μL arsenit-citrat opløsningen og opbevares ved stuetemperatur i mindst 30 minutter for at producere en stabil blå farve.
    Forsigtig: på grund af sin toksicitet bør alle opløsninger, der indeholder natriumarsenit, håndteres med ekstra omhu på alle tidspunkt. Således bør tilsætning af arsenit-citratopløsning ske i en røg hætte.
  12. Der dispenserer 180 μL af hver reaktionsblanding til en klar 96 brønd polystyren mikropladen.
  13. Absorbansen måles for hver brønd ved 860 nm ved hjælp af et spektrofotometer af mikropladen.

5. resultatanalyse

  1. Gennemsnitligt tre eksemplarer af hver prøve og Pi -standarderne. Træk derefter med blank for at eliminere baggrunds signalet.
  2. Lav en kalibreringskurve ved at afbilde absorbans (A860) værdier i forhold til mængden af Pi standard (nmol) og Udfør en lineær regression for at opnå Trendline-funktionen ved hjælp af følgende formel:
    Equation 1
  3. Fosfat mængden (nmol), som frigøres fra den enzymatiske reaktion, beregnes ud fra den lineære regressions formel ovenfor.
  4. Beregn den specifikke aktivitet ved hjælp af følgende formel:
    Equation 2
    hvor NPi er mængden af fosfat frigivet fra reaktionen (nmol), t er reaktionstiden (min), og mTmPPase er mængden af den rene tmppase, der anvendes i analysen (mg).
  5. Beregn den procentvise aktivitet for hver inhibitor koncentration ved hjælp af følgende formel:
    Equation 3
    hvor saijegs den specifikke aktivitet af en prøve med inhibitor og saun er den specifikke aktivitet af den uhæmmede prøve.
  6. Beregn logikken50 (estimat) og IC50 (estimat) med en ikke-lineær regression, der passer fra den fire parameter dosis-respons kurve ved hjælp af følgende formel:
    Equation 4
    hvor X er log af koncentration (μM), Y er aktivitet (%), top og bund er plateauer i samme enhed som Y (henholdsvis 100% og 0%), logIC50 har de samme logenheder som X, og hillslope = hældnings faktor eller Hill Slope, som er unitless.
    Bemærk: software (tabel over materialer) anvendes til montering. Brug koncentrationen af 0,01 μM (i stedet for 0,00 μM) til prøven uden inhibitor, da logaritmen på nul ikke er defineret.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

I denne protokol blev otte forbindelser (1 − 8) testet (figur 2a) sammen med IDP, en almindelig hæmmer af pyrophosphataser, som en positiv kontrol. Hver forbindelse blev testet i tre forskellige koncentrationer (1 μM, 5 μM og 20 μM) i triplicat. Arbejdsforløbet for screeningen er afbildet i figur 1, begyndende fra prøve og reagens præparat indtil absorbansmålingen ved 860 nm.

I slutningen af denne protokol, efter tilsætning af opløsning A + B og arsenite-citrat, løsningerne udvikle en stabil blå farve med den maksimale absorption ved 709 nm og 860 nm14 på grund af den komplekse dannelse af fosfat ioner med molybden, der kan observeres og viser forekomsten af den enzymatiske reaktion. Til dette eksperiment bruger vi absorbansen ved 860 nm til måling af Pi -mængde, der frigives, da den har en bedre detektionsgrænse og-følsomhed sammenlignet med absorbansen ved 709 nm15. Den blå farve er fuldt udviklet i 30 min af inkubation ved stuetemperatur og stabil i mindst 5 h14. Analysen har følsomhed ned til Pi -koncentration på 10 μM, og absorbansen er lineær over et koncentrationsområde på 10 − 800 μM14. I det repræsentative resultat her indeholder Wells E1 − E3 (figur 2c) reaktionsblandingen uden inhibitor, og den blå opløsning kan observeres i slutningen af analysen. Dette kan også observeres ved lave sammensatte koncentrationer, hvor fuldstændig hæmning ikke er nået, som i brønde F1 − F3 for IDP og brønde A4 − A6 for sammensatte 1 (ATC, en nyligt kendt ikke-konkurrencedygtig hæmmer af TmPPase9) ved koncentrationen af henholdsvis 2,5 μm og 1 μm. Den højere koncentration af IDP og sammensatte 1, jo mindre at ingen blå farve kan observeres (G1 − G3 og H1 − H3 for IDP og B4-B6 og C4 − C6 for sammensatte 1) indikerer hæmning af den enzymatiske aktivitet. Alle tre koncentrationer af ikke-hæmmende forbindelser (2, 3og 8) viste den samme blå farveintensitet som Wells E1 − E3 uden nogen inhibitor (figur 2c).

Efter absorbansmålingen ved 860 nm kan dataene behandles og analyseres (Se protokol afsnit 5). Figur 2D viser kalibrerings plottet i Pi standard med dens lineære montering (y = 0.0576 x + 0,0019; r2 = 0,999). Figur 3 viser grunden til enzymatisk aktivitet (%) koncentrationen af hvert afprøvet stof. For forbindelser med hæmnings aktivitet vises også en ikke-lineær kurve montering. IDP, der anvendes som en positiv kontrol, viser tydeligt et fald i aktiviteten ved højere koncentration. IC50 (skøn) beregnet på grundlag af tre forskellige koncentrationer er 88,2 ΜM (tabel 1), som svarer til den tidligere måling (80,0 μM) med otte koncentrationspunkter14. Forbindelser 1, 4, 5, 6og 7 viste en lignende tendens som IDP, da koncentrationen steg med IC50 (skøn) på henholdsvis ca. 1,3 μM, 7,4 μm, 19,0 μm, 37,4 μm og 156,1 μm (tabel 1). For forbindelser 2, 3og 8 kan der ikke observeres nogen reduktion i aktivitet eller hæmning ved analyse koncentrationerne. En yderligere analyse med otte koncentrationspunkter kan gøres for at generere præcise IC50. Figur 4 viser hæmnings kurven for forbindelser 1, 5, 6, 7 og 8 med en IC50 på 1,7 μm, 21,4 μm, 58,8 μm, 239,0 μm og > 500 μm, henholdsvis9.

Figure 1
Figur 1: en skematisk arbejdsgang af TmPPase hæmning analyse i en 96 brønd plade format. Den røde nummerering viser trinene i analysen i henhold til protokollen, og de blå pile viser interval rækkefølgen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: prøver, deres arrangement og farve udvikling i en 96 brønd plade. A) strukturerne for forbindelser 18 , der anvendes til analysen. Inhibering aktivitet af disse forbindelser er blevet rapporteret i Vidilaseris et al.9. B) prøve arrangement. (C) farve udvikling, 30 min efter tilsætning af arsenit-citratopløsning. Koncentrationerne af Control inhibitor (IDP) og prøver, der anvendes, arrangeret fra top til bund, er 2,5 μM, 25 μM, og 250 μM koncentration og 1 μM, 5 μM, og 20 μM koncentration, hhv. Intensiteten af den blå farve svarer til mængden af Pjeg frigivet på grund af den enzymatiske reaktion og den manglende farve svarer til ingen enzymatisk reaktion. D) kalibreringskurve for Pi -standard (nmol) mod en860 med lineær montering (y = 0.0576 x + 0,0019; r2 = 0,999). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: kurve over aktiviteten af TmPPase-procenten for tre forskellige inhibitor koncentrationer. De ikke-lineære regressions kurver til beregning af IC50 (estimat) vises for IDP samt for forbindelser 1, 4, 5, 6 og 7 , men ikke for forbindelser 2, 3og 8 , da de ikke hæmmer tmppase-aktiviteten ved analyse koncentrationerne. Logikken50 og IC50 (estimat) for hver forbindelse er vist i tabel 1. Alle data vises som middelværdien ± SD med tre replikater. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: hæmnings kurven fra otte koncentrationspunkter af forbindelser 1, 5, 6, 7 og 8. Dette tal er taget fra Vidilaseris et al.9 med mindre modifikation. Alle data vises som middelværdien ± SD med tre replikater. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Prøve LogIC50 IC50 (estimat) (μM)
Idp 1,95 ± 0,0142 87,9 ± 2,46
1 0,112 ± 0,0274 1,29 ± 0,0816
2 ingen hæmning
3 ingen hæmning
4 0,870 ± 0,0447 7,39 ± 0,760
5 1,28 ± 0,0296 19,0 ± 1,29
6 1,57 ± 0,0846 37,4 ± 7,29
7 2,19 ± 0,366 156 ± 131
8 ingen hæmning

Tabel 1: logik50 og IC50 (skøn) af IDP og forbindelser 1 − 8 baseret på data fra figur 3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Her rapporterer vi en detaljeret protokol til simpel screening af hæmmere for membranbundne pyrofosfatase fra T. Maritima i en 96 brønd plade format baseret på Vidilaseris et al.14. Denne protokol er billig og baseret på 12-phosphomolybdic, som er dannet af orthophosphat og molybdaten under sure betingelser og reduceret til phosphomolybdenumarter med en distinkt blå farve12. Denne metode foretrækkes frem for andre protokoller, såsom den mere følsomme malachite grøn analyse16, fordi denne metode ikke viser interferens i tilstedeværelsen af høj phospholipid koncentration, som er nødvendig for TmPPase reaktivering14.

Arbejdsgangen i Screenings protokollen er afbildet i figur 1 , og denne proces kan udføres fuldt ud i 1 time. Denne protokol er optimeret til TmPPase med den optimale arbejdstemperatur ved 71 °C og en 5 min reaktionstid. Da vand vil fordampe ved denne temperatur fra reaktionsblandingen, påføres en klæbende tætningsplade (skåret til at passe og dække strimlerne) for at forhindre fordampning14 , og det fordampede vand er simpelthen erindret med centrifugering. Inkubationstiden på 5 min er valgt, da den stadig er i den lineære række af den enzymatisk frigivne fosfat og tilstrækkelig til pålidelig screening14. I denne protokol er timing og pipette Rings færdigheder vigtige faktorer for at opnå et godt og pålideligt resultat. Tilsætning af reagenser under analysen med 20 s interval mellem strips er en optimeret timing mulighed for nem at udføre de efterfølgende trin.

For forskellige Mppaser bør den optimale temperatur og inkubationstiden bestemmes separat inden brug i hæmnings analysen. Enzymet reaktiverings protokol ovenfor er optimeret til TmPPase og andre mPPases kan have brug for en anden reaktiverings protokol. For eksempel bør DDM ikke tilsættes til reaktivering af mPPase fra Pyrobaculum aerophilum , da det vil nedsætte dets enzymatiske aktivitet17. Da enzymet bliver mindre aktivt, hvis det forberedes i god tid, bør tilsætning af reaktiveret enzym tilsættes til reaktionsblandingen kort før analysen påbegyndes. Efter tilsætning af arsenit-citrat opløsningen er reaktionsproduktet stabilt i mindst 5 h14. Derfor kan det næste parti af analysen udføres med det samme, og absorbansmålingen kan foretages senere til alle batcher på én gang.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af tilskuddene fra Jane og Aatos Erkko Foundation og BBSRC (BB/M021610) til Adrian Goldman, det finske Akademi (nr. 308105) til Keni Vidilaseris, (nr. 310297) til Henri Xhaard og (nr. 265481) til Jari Yli-Kauhaluoma og universitetet i Helsinki forskningsmidler til Gustav Boije af Gennäs. Forfatterne takker Bernadette Gehl for hendes tekniske hjælp under projektet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adhesive sealing sheet Thermo Scientific AB0558
Ammonium heptamolybdate tetrahydrate Merck F1412481 636
Ascorbic acid Sigma-Aldrich 95212-250G
BioLite 96Well Multidish Thermo Scientific 130188
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Merck 1167431000
8-well PCR Tube Strips 0.2 ml without caps (120) Nippon genetics FG-028
Dodecyl maltoside (DDM) Melford B2010-100G
Ethanol Merck 1009901001
Glacial acetic acid Merck 1000631011
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 258148-500ML
Imidodiphosphate sodium salt Sigma-Aldrich I0631-1G
L-α-Phosphatidyl choline from soybean lecithin Sigma 429415-100GM
Magnesium chloride Sigma-Aldrich 8147330500
Multiplate 96-Well PCR Plates Bio-Rad MLL9651
MultiSkan Go Thermo Scientific 10680879
Nepheloskan Ascent (Type 750) Labsystems
Polystyrene Petri dish (size 150 mm x 15 mm) Sigma-Aldrich P5981-100EA
Potassium chloride Merck 104936
Prism 6 software GraphPad
QBT2 Heating block Grant Instruments
Sodium meta-arsenite Fisher Chemical 12897692
Sodium phosphate dibasic (Pi) Sigma S0876-1KG
Sodium pyrophosphate dibasic Fluka 71501-100G
Trisodium citrate dihydrate Fluka 71404-1KG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Terstappen, G. C., Reggiani, A. In silico research in drug discovery. Trends in Pharmacological Sciences. 22, (1), 23-26 (2001).
  2. Rask-Andersen, M., Almen, M. S., Schioth, H. B. Trends in the exploitation of novel drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 10, (8), 579-590 (2011).
  3. Shah, N. R., Vidilaseris, K., Xhaard, H., Goldman, A. Integral membrane pyrophosphatases: a novel drug target for human pathogens. AIMS Biophysics. 3, (1), 171-194 (2016).
  4. Baykov, A. A., Malinen, A. M., Luoto, H. H., Lahti, R. Pyrophosphate-Fueled Na+ and H+ Transport in Prokaryotes. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 77, (2), 267-276 (2013).
  5. Serrano, A., Perez-Castineira, J. R., Baltscheffsky, M., Baltscheffsky, H. H+-PPases: yesterday, today and tomorrow. IUBMB Life. 59, (2), 76-83 (2007).
  6. Liu, J., et al. A vacuolar-H+-pyrophosphatase (TgVP1) is required for microneme secretion, host cell invasion, and extracellular survival of Toxoplasma gondii. Molecular Microbiology. 93, (4), 698-712 (2014).
  7. Lemercier, G., et al. A pyrophosphatase regulating polyphosphate metabolism in acidocalcisomes is essential for Trypanosoma brucei virulence in mice. Journal of Biological Chemistry. 279, (5), 3420-3425 (2004).
  8. Belogurov, G. A., et al. Membrane-bound pyrophosphatase of Thermotoga maritima requires sodium for activity. Biochemistry. 44, (6), 2088-2096 (2005).
  9. Vidilaseris, K., et al. Asymmetry in catalysis by Thermotoga maritima membrane-bound pyrophosphatase demonstrated by a nonphosphorus allosteric inhibitor. Science Advances. 5, (5), (2019).
  10. Lin, S. M., et al. Crystal structure of a membrane-embedded H+-translocating pyrophosphatase. Nature. 484, (7394), 399-403 (2012).
  11. Fiske, C. H., Subbarow, Y. The colorimetric determination of phosphorus. Journal of Biological Chemistry. 66, (2), 375-400 (1925).
  12. Nagul, E. A., McKelvie, I. D., Worsfold, P., Kolev, S. D. The molybdenum blue reaction for the determination of orthophosphate revisited: Opening the black box. Analytica Chimica Acta. 890, 60-82 (2015).
  13. Kellosalo, J., Kajander, T., Palmgren, M. G., Lopez-Marques, R. L., Goldman, A. Heterologous expression and purification of membrane-bound pyrophosphatases. Protein Expression and Purification. 79, (1), 25-34 (2011).
  14. Vidilaseris, K., Kellosalo, J., Goldman, A. A high-throughput method for orthophosphate determination of thermostable membrane-bound pyrophosphatase activity. Analytical Methods. 10, (6), 646-651 (2018).
  15. He, Z. Q., Honeycutt, C. W. A modified molybdenum blue method for orthophosphate determination suitable for investigating enzymatic hydrolysis of organic phosphates. Communications in Soil Science and Plant Analysis. 36, (9-10), 1373-1383 (2005).
  16. Martin, B., Pallen, C. J., Wang, J. H., Graves, D. J. Use of fluorinated tyrosine phosphates to probe the substrate specificity of the low molecular weight phosphatase activity of calcineurin. Journal of Biological Chemistry. 260, (28), 14932-14937 (1985).
  17. Strauss, J., Wilkinson, C., Vidilaseris, K., Harborne, S. P. D., Goldman, A. A simple strategy to determine the dependence of membrane-bound pyrophosphatases on K+ as a cofactor. Methods in Enzymology. 607, 131-156 (2018).
Screening for <em>Thermotoga Maritima</em> membranbundne Pyrofosfatasehæmmere
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vidilaseris, K., Johansson, N. G., Turku, A., Kiriazis, A., Boije af Gennäs, G., Yli-Kauhaluoma, J., Xhaard, H., Goldman, A. Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors. J. Vis. Exp. (153), e60619, doi:10.3791/60619 (2019).More

Vidilaseris, K., Johansson, N. G., Turku, A., Kiriazis, A., Boije af Gennäs, G., Yli-Kauhaluoma, J., Xhaard, H., Goldman, A. Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors. J. Vis. Exp. (153), e60619, doi:10.3791/60619 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter