Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

הקרנה עבור התרמוטוגה מארימה ממברנה מאוגדות פירופוספטאז מעכבי

Published: November 23, 2019 doi: 10.3791/60619
Automatic Translation
*1, *2, 2, 2, 2, 2, 2, 1,3
1Research Program in Molecular and Integrative Biosciences, University of Helsinki, 2Drug Research Program, Division of Pharmaceutical Chemistry and Technology, Faculty of Pharmacy, University of Helsinki, 3School of Biomedical Sciences and Astbury Centre for Structural Molecular Biology, University of Leeds
* These authors contributed equally

Summary

כאן אנו מציגים שיטת ההקרנה עבור פירופוספאז ממברנה הממברנה (מתוך מעכבי התרמוטוגה) על בסיס מוליבדן תגובה כחולה בפורמט 96 צלחת היטב.

Abstract

פירופוספטסיס ממברנה (mPPases) הם אנזימים dimeric המתרחשים בחיידקים, הארכאית, צמחים, וטפילים פרוטיסטים. חלבונים אלה קליב פירופוספט לשתי מולקולות אורתופהונאים, אשר בשילוב עם פרוטון ו/או נתרן שאיבה על פני קרום. מכיוון שאין חלבונים הומוולוגיים להופיע בבעלי חיים ובבני אדם, mPPases הם מועמדים טובים בעיצוב של מטרות סמים פוטנציאליים. כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט למסך עבור מעכבי mPPase ניצול מוליבדן תגובה כחולה במערכת 96 צלחת היטב. אנו משתמשים mPPase מן החיידק תרמופילית תרמוטוגה מארימה (tmppase) כאנזים מודל. פרוטוקול זה הוא פשוט וזול, הפקת תוצאה עקבית ואיתנה. זה לוקח רק שעה אחת כדי להשלים את פרוטוקול התאמת הפעילות מתחילתו של הסדר עד המדידה ספיגת. כיוון שהצבע הכחול המיוצר בתוך מעשה זה יציב למשך פרק זמן ארוך, ניתן לבצע את הפעולות הבאות מיד לאחר האצווה הקודמת, וניתן למדוד את הספיגה מאוחר יותר עבור כל הקבוצות בו. החיסרון של פרוטוקול זה הוא שזה נעשה באופן ידני ולכן יכול להיות מתיש, כמו גם לדרוש כישורים טובים של ליטוף ושמירה זמן. יתר על כן, התמיסה ארגיט-ציטראט המשמשת בטיפול זה מכילה נתרן ארגיט, שהוא רעיל ויש לטפל בו באמצעי זהירות נחוצים.

Introduction

כ -25% של החלבונים הסלולריים הכולל הם חלבונים ממברנה ו 60% מהם הם מטרות התרופה1,2. אחת ממטרות התרופה הפוטנציאלית3, ממברנה מאוגד פירופוספסים (mppases הם אנזימים dimeric המשאבה פרוטון ו/או נתרן יון על ידי הידרוליזה של פירופוספט לשניאורטופד 4. mPPases ניתן למצוא אורגניזמים שונים5 כגון חיידקים, הארכונים, צמחים, וטפילים פרוטיסטים, למעט בני אדם ובעלי חיים4. ב טפילים פרוטיסטים, למשל פלמודיום falciparum, טוקסופלזמה gondii ו טריאנוסומה ברוסייאי, mppasesהם חיוניים עבור התקפה ואלימה הטפיל6 ו נוקאאוט של ביטוי זה טפילים להוביל לכישלון בשמירה על חומציות תאיים על חשיפה ל-ph הבסיסי החיצוני7. בשל חשיבותם וחוסר חלבון הומולוגי המצויים בחוליות, ניתן להתייחס ל-mPPases כמטרות התרופות הפוטנציאליות עבור מחלות הפרוסטל3.

הקרנת חוץ גופית של מעכבי mPPase בעבודה זו מבוססת על מערכת מודל TmPPase. Tmppase הוא שאיבה יון נתרן ומיון אשלגן תלוי mppase מ T. קיסריה ויש לו פעילות אופטימלית ב 71 ° צ'8. היתרונות של אנזים זה הם למשל הקלות שלה בייצור וטיהור, יציבות תרמית טובה ופעילות מסוימת גבוהה. Tmppase מראה גם דמיון גבוה בנוסף על שימור מוחלט של העמדה, כמו גם זהות של כל שאריות קטליטי כדי mpp,התלת ממדי 3,9 ולמבנה פתרו של ויגו radiata10 mppase. המבנים הזמינים של TmPPase בקונמציות שונות הן גם שימושיות עבור ניסוי מבוסס מבנה התרופה עיצוב (כמו הקרנה וירטואלית דה נובו עיצוב).

כאן אנו מדווחים על פרוטוקול מפורט להקרנה של מעכבי TmPPase ב 96 בפורמט צלחת הבאר (איור 1). הפרוטוקול מבוסס על שיטת הצביעה של התגובה הכחולה מוליבדן, אשר פותחה לראשונה על ידי פיסק ו Subbarow11. שיטה זו כוללת את היווצרות של 12-פוספוליפוליב חומצה בmolybdate באמצעות מצבים חומציים, אשר מופחת אז לתת מינים אופייני בצבע כחול phosphomolybdenum12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת חלבון

הערה: הביטוי והטיהור של TmPPase תוארו במקום אחר13.

  1. הכינו 10 מ ל של פתרון מאגר ההפעלה מראש המכיל 20 מ"מ 2-(N-dodecyl olino) החומצה ethanesulfonic (MES) pH 6.5, 3.5% (v/v) גליצרול, 2 מ"מ dithioitol (dtt), ו 0.05% maltoside (ddm).
  2. הכינו 10 מ ל של תערובת התגובה המכילה 200 mM טריס-Cl pH 8.0, 8.0 mM MgCl2, 333 MM kcl, ו-67 Mm הנאל.
    הערה: Mg2 + נדרש כדי לאכול את הפירופוספט כמצע של Mppase, K+ נדרש כדי להגדיל את פעילות האנזים כמו Tmppase הוא mppase אשלגן תלוי, ו-Na+ נדרש עבור פעילות האנזים במהלך הטרנסלוקציה של הנתרן על ידי tmppase.
  3. הכינו 30 מ"ג/מ ג ליפוזומים לצורך אנזים ההפעלה.
    1. להוסיף 10 מ"ל של 20 מילימטר טריס-HCl pH 8.0 עם 1 מ"מ DTT כדי 0.3 g של L-α-פוספוליכולין מ סויה ל 10 מ ל של 20 מ"מ טריס-HCl pH 8.0 עם 1 מ"מ DTT.
    2. לשים את ליפומה על קרח, ו sonicate עם 1 מרווח הפעימה השנייה 1 דקה, הפסקה 1 דקה, ולחזור עד הפתרון הופך צהוב שקוף.
    3. הקפאת הליזומים, הקפא בחנקן נוזלי ואחסן ב-80 ° c עד שימוש.
  4. . הפעל מחדש את האנזים
    1. מערבבים 40 μL של הפתרון ליפוזומים עם 22.5 μL של 20% DDM.
    2. מחממים את התערובת ב-55 ° c למשך 15 דקות ומאפשרים לו להתקרר לטמפרטורת החדר.
    3. הוסף 36.5 μL של פתרון מאגר ההפעלה מראש, ערבב והוסף 1 μL של חלבון מרוכז (13 מ"ג/mL) כדי לבצע ריכוז מוחלט של 0.13 mg/mL.
      הערה: החלבון הוא קפוא בדרך כלל ב 10 μL ' ali, לאחר טיהור ולהפשיר על קרח לפני השימוש.
  5. קח 20 μL של האנזים שהפעיל מופעל ולהוסיף ל 1,480 μL של תערובת התגובה, ואז לערבב בעדינות.
    הערה: יש לבצע את התוספת של האנזים שהוא מופעל לתערובת הריאקציה בדיוק לפני שימוש בו.

2. הכנה מורכבת

  1. מפזר את תרכובות diמתיל סולפוקסיד (DMSO) כדי להפוך את הפתרונות מניות של 25 ל-100 מ"מ ב 50 ליטר μL, מבוסס על זמינות של תרכובות.
    הערה: כל התרכובות המשמשות כאן (איור 2א) פורסמו בעבר9. אם מסיסות מורכבים נמוך, ריכוז המניה ניתן לכוונן בהתאם.
  2. הכן שלושה ריכוזים שונים. של כל תרכובת במים
    הערה: הריכוזים הסופיים בתערובת התגובה יהיו 1, 5, ו-50 micromolar או 1, 5, ו 20 micromolar עבור תרכובות מסיסים ומסיסים בהתאמה.
    1. לדלל את הפתרון במניה עם מים כדי 1 mL ב microtubes לתת 2 μM, 10 μM ו 100 μM עבור תרכובות מסיסים, או לחילופין 2 μM, 10 μM ו 40 μM עבור תרכובות מסיסים בחסכנות.
    2. מערבולת הפתרון המורכב מיד לאחר דילול הפתרון מניות עבור ערבוב נאות.
  3. בדוק אם יש צבירה מורכבת באמצעות נפלומטר.
    הערה: זה נלמד כמו טריפליטים בשלושה ריכוזים (1 μM, 5 μM ו -20 μM) ו מנורמל לריק ב 96 צלחת היטב.
    1. לחלק 75 μL של תערובת התגובה לתוך כל טוב באמצעות הצנרת רב-ערוצי.
    2. הוסף 75 μL של כל תרכובת (עבור הריק, השתמש 75 μL של מים במקום) ולערבב על ידי ליטוף למעלה ולמטה 5 ×.
    3. למדוד כל טוב ב 300 V באמצעות אימונולוגיה נפלומטר.

3. ריאגנטים להכנת שיטת ההכנה

  1. הכינו את התמיסה הארגיט-ציטראט.
    1. שוקל 5 גר' נתרן ארגיט ו -5 גר' טרינתרן ציטראט.
      התראה: הנתרן ארגיט הוא רעיל, ובכך להשתמש בציוד הגנה נאותים ולטפל בטיפול מיוחד. כאמצעי זהירות, אל תטפל בפני כל אמצעי הזהירות הנחוצים של בטיחות שנקראו והובנו. לטפל רק בתוך מכסה המנוע על מנת לא לשאוף אבק/אדים של התרכובת או הפתרון (של). אם שאפו, עברו לאוויר צח והשיגו טיפול רפואי. ללבוש משקפי בטיחות כימיים מתאימים, כפפות מגן וביגוד כדי למנוע בליעה והעין/עור מגע. אם בלע, קרא מיד למרכז הרעלים או לרופא/רופא. אם הוא מקבל על העור או בעין (s), לשטוף עם הרבה מים ולקבל טיפול רפואי.
    2. מתמוסס לתוך 100 מ ל של מים.
    3. הוסף 5 מ ל של חומצה אצטית קרחוני, לערבב, ולהוסיף מים 250 mL.
    4. החנות בטמפרטורת החדר מוגנת מאור.
      הערה: הפתרון יציב למעלה משנה.
  2. הכינו פתרון A ופתרון B.
    1. עבור פתרון A, להוסיף 10 מ ל קרח קר 0.5 M HCl כדי 0.3 g של חומצה אסקורבית. מפזר את החומצה האסקורבית על ידי וורטקסנג.
    2. עבור פתרון B, להוסיף 1 מ ל של מים קרים קרח כדי 70 מ"ג של אמוניום הפיטאמאוליבתאריך ומערבולת להתמוסס.
      הערה: אחסן את שני הפתרונות בקרח עד לשימוש. לגבי עקביות תוצאת הסדר, ניתן לאחסן את שני הפתרונות בקרח למשך שבוע מקסימום.
  3. להכין את פוספט (Pi) תקן עם הריכוז של 0 μm, 62.5 μm, 250 μm ו 500 μm עבור כיול.
    1. הוסף 0 μL, 25 μL, 50 μL, ו 100 μL של 5 מ"מ2hpo4 דימיים עד ארבע מיקרוצינורות המכילים 370 μl של תערובת התגובה.
    2. למעלה עד 1 מ ל עם מים.

4. שיטת הפעילות עבור 1 96 צלחת הבאר

הערה: ראה איור 1 עבור זרימת העבודה הסכמטית של המנה.

  1. הוסף 1 mL של פתרון B כדי 10 מ ל של פתרון A, לערבב על ידי vortexing ולאחסן את הפתרון על קרח.
    הערה: פתרון זה צריך להיות שקוף וצהוב. שמור פתרון A + B על הקרח לפחות 30 דקות לפני השימוש. עם זאת, להשתמש בפתרון בתוך 3 h כפי שהוא ילך רע לאחר אחסון לטווח ארוך.
  2. הוסף 40 μL של 0 μM, 62.5 μM, 250 μM ו500 μM Pi רגיל לרצועות הצינורית בטריליפיטה באמצעות פיפטה רב-ערוצית.
    הערה: תערובת התגובה עם Pאני הוסיף ישמש ריק.
  3. הוסף 25 μL של פתרון מורכב לרצועות הצינור באמצעות מנקז רב-ערוצי.
    הערה: לכל תרכובת יש שלושה ריכוזים שונים בטריליפיאט, שמספיק להערכת הראשונית של הריכוז המקסימלי של חצי העכבות (IC50). For50 IC מדויק יותר הגדרה, שמונה ריכוזי מורכבות שונים ניתן להשתמש. עבור האנזים הבלתי מעוכב הפתרון המורכב מוחלף בכמות מים שווה. כמו שולטת חיובית 2.5 μM, 25 μM, ו 250 μM של שדדודיפוספט (IDP) מלח נתרן שימשו.
  4. הוסף 15 μL של תערובת התמיסה mPPase לפסי הצינור (למעט החצוצרות המכילות את התקן Pi ) באמצעות פיפטה רב-ערוצית.
  5. חותם את רצועות הצינורית באמצעות גיליון איטום מדבק. חותכים את גיליון האטימה כדי להפריד כל אחד ממפצל הצינורות.
  6. לפני הדגירה הדגימות עבור 5 דקות ב 71 ° c. מניחים את הדגימות על בלוק החימום עם מרווח של 20 s בין כל רצועה כדי למזער את צריכת הזמן במהלך השלבים הבאים.
  7. עבור כל רצועה, פתח את איטום דבק. הוסף 10 μL של 2 מ"מ נתרן פירופוספט dibasic באמצעות פיפטה רב-ערוצי ולערבב על ידי ליטוף למעלה ולמטה עבור 5 ×. אטום את רצועת הצינורית שוב באמצעות אותו איטום.
    הערה: שלב זה עשוי להיות קשה לביצוע במהלך 20 s; עם זאת, זה יהיה קל יותר לאחר כמה שאומר.
  8. מודקון ב 71 ° c עבור 5 דקות.
  9. מניחים את הדגימות על מנגנון הקירור עם מרווח של 20 s בין כל רצועה. תן להם להתקרר 10 דקות אבל צנטריפוגה כל רצועה בקצרה לאחר 5 דקות של קירור, כדי להוריד טיפות מים מתחת לסדין איטום, ואז לשים אותו בחזרה למנגנון הקירור ולהסיר את האיטום.
    הערה: מנגנון הקירור ניתן לעשות על ידי הצבת לוחית ה-PCR 96 היטב בקלקר צלחת פטרי (גודל 150 מ"מ × 15 מ"מ) מלא מים קפואים לפחות 1 h. יש להוציא את המנגנון מהמקפיא בערך 5 דקות לפני תחילת השיטת. אין להוציא את מנגנון הקירור ממש לפני קירור לדוגמה כפי שהוא להקפיא את תערובת התגובה ולעכב את התפתחות הצבע.
  10. לאחר 10 דקות של קירור, להוסיף 60 μL של הפתרון A + B, לערבב על ידי ליטוף למעלה ולמטה עבור 5 × ולשמור על פסי הצינור על מנגנון קירור עבור 10 דקות.
  11. הוסף 90 μL של הפתרון הארמיט-ציטראט ושמור בטמפרטורת החדר לפחות 30 דקות כדי לייצר צבע כחול יציב.
    התראה: בשל הרעילות שלה כל הפתרונות המכילים נתרן ארגיט צריך להיות מטופל עם טיפול נוסף בכל עת. לפיכך, יש לבצע את הוספת התמיסה של ארגיט-ציטראט בתוך מכסה המנוע.
  12. לוותר 180 μL של כל תערובת התגובה לתוך ברור 96 מיקרוצלחת פוליסטירן היטב.
  13. למדוד את ספיגת כל טוב ב 860 ננומטר באמצעות ספקטרוסקופיה מיקרופלטה.

5. ניתוח תוצאות

  1. ממוצע הטריליליטים של כל אחת מהדוגמאות והסטנדרטים של Pi . לאחר מכן הפחת עם הריק כדי לבטל את אות הרקע.
  2. בצע עקומת כיול על-ידי התוויית ערכי הספיגה (A860) כנגד כמות התקן Pi (nmol) וביצוע רגרסיה ליניארית כדי להשיג את פונקציית קו המגמה באמצעות הנוסחה הבאה:
    Equation 1
  3. חישוב כמות הפוספט (nmol) ששוחרר מהתגובה האנזימטית המבוססת על נוסחת הרגרסיה הליניארית לעיל.
  4. חשב את הפעילות הספציפית באמצעות הנוסחה הבאה:
    Equation 2
    כאשר nPאני כמות של פוספט שוחרר מן התגובה (nmol), t הוא זמן התגובה (דקות), ו- mtmppase הוא כמות tmppase טהור בשימוש בתוך השיטת (mg).
  5. חשב את אחוז הפעילות עבור כל ריכוז מעכבי באמצעות הנוסחה הבאה:
    Equation 3
    כאשר saאניזההפעילות הספציפית של מדגם עם מעכב ו- SAun היא הפעילות הספציפית של המדגם עצורים.
  6. חשב את הלוגיקה50 (הערכה) ו-IC50 (הערכה) עם התאמה רגרסיה לא לינארית מעקומת מינון ארבע פרמטרים באמצעות הנוסחה הבאה:
    Equation 4
    כאשר X הוא הרישום של ריכוז (μM), Y היא פעילות (%), העליון והתחתון הם רמות באותה יחידה כמו Y (100% ו-0%, בהתאמה), לוגיקה50 יש את אותו יחידות יומן כמו X, ו-הילדרון = גורם מדרון או מדרון הגבעה, שהוא unitless.
    הערה: תוכנה (רשימת חומרים) משמשת למדידה. השתמש בריכוז של 0.01 μM (במקום 0.00 μM) עבור המדגם ללא מעכב כאשר הלוגריתם של אפס אינו מוגדר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בפרוטוקול זה, שמונה תרכובות (1-8) נבדקו (איור 2 א) יחד עם idp, מעכבי נפוץ של פירופוספטיות, כשליטה חיובית. כל תרכובת נבדקה בשלושה ריכוזים שונים (1 μM, 5 μM ו-20 μM) בטרילקאט. זרימת העבודה של ההקרנה מתוארת באיור 1, החל ממדגם והכנה מגיב עד למדידה הספיגה ב 860 ננומטר.

בסוף פרוטוקול זה, לאחר תוספת של פתרון A + B ו-ארגיט-ציטראט, הפתרונות מפתחים צבע כחול יציב עם הספיגה המקסימלית ב709 ננומטר ו-860 nm14 בשל היווצרות מורכבות של יוני פוספט עם molybdate שניתן לצפות בה ומראה את התרחשות התגובה האנזימטית. עבור ניסוי זה, אנו משתמשים בספיגת ב 860 ננומטר למדידת סכום Pi שוחרר כפי שהוא יש מגבלת זיהוי טוב יותר ורגישות לעומת ספיגת ב 709 nm15. הצבע הכחול מפותח באופן מלא 30 דקות של דגירה בטמפרטורת החדר יציב לפחות 5 h14. היכולת לקיים את הרגישות עד לריכוז Pi של 10 μm והספיגה היא לינארית מעל טווח ריכוז של 10-800 μm14. בתור הנציג כאן, בארות E1-E3 (איור 2C) מכילות את תערובת הריאקציה ללא מעכב וניתן לצפות בפתרון הכחול בתום הבקשה. זה יכול להיות גם נצפתה בריכוזים מורכבים נמוך שבו עיכוב להשלים לא הגיע, כמו בארות F1 על-ידי F3 עבור IDP ובארות A4-A6 עבור מתחם 1 (האווירית, המעכב הידוע לאחרונה Unmppase9) בריכוז של 2.5 μm ו-1 μm, בהתאמה. הריכוז הגבוה ביותר של IDP ומתחם 1, לא ניתן לצפות בצבע כחול פחות (G1-G3 ו-H1-H3 ל-idp ו-B4-B6 ו-C4-C6 עבור מתחם 1) המציין עיכוב של פעילות אנזימטית. כל שלושת הריכוזים של תרכובות לא מעכבות (2, 3ו- 8) הציגו את אותה עוצמת צבע כחולה כמו בארות E1-E3 ללא כל מעכב (איור 2c).

לאחר מדידת הספיגה ב860 ננומטר, ניתן לעבד ולנתח את הנתונים (ראה נוהל מקטע 5). איור 2D מציג את עלילת הכיול של התקן Pi עם ההתאמה הליניארית שלה (y = 0.0576 x + 0.0019; r2 = 0.999). איור 3 מציג את העלילה של פעילות אנזימטית (%) נגד הריכוז של כל מתחם נבדק. עבור תרכובות עם פעילות מעכבות, התאמה עקומה לא לינארית מוצגת גם. IDP, המשמש כשליטה חיובית, מראה בבירור ירידה בפעילות בריכוז גבוה יותר. IC50 (אומדן) מחושב בהתבסס על שלושה ריכוזים שונים הוא 88.2 Μm (טבלה 1), אשר דומה למדידה הקודמת (80.0 μm) עם שמונה נקודות ריכוז14. תרכובות 1, 4, 5, 6, ו 7 הראה מגמה דומה כמו idp מאז הריכוז גדל עם IC50 (הערכה) של כ 1.3 μM, 7.4 μm, 19.0 μm, 37.4 Μm, ו-156.1 μm, בהתאמה (טבלה 1). עבור תרכובות 2, 3, ו 8 אין ירידה בפעילות או עיכוב ניתן לצפות בריכוזי השיטת הפעולה. שיטת מבחן נוספת עם שמונה נקודות ריכוז ניתן לעשות כדי ליצור מדויק IC50. איור 4 מציג את עקומת עכבות עבור תרכובות 1, 5, 6, 7 ו 8 עם IC50 של 1.7 μm, 21.4 μM, 58.8 μm, 239.0 μm ו-> 500 μm, בהתאמה9.

Figure 1
איור 1: זרימת עבודה סכמטית של TmPPase שיטת העיכוב ב 96 בפורמט צלחת לוחית. המספור האדום מציג את השלבים של המנה בהתאם לפרוטוקול והחיצים הכחולים מציגים את סדר המרווח. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: דגימות, הסידור שלהם ופיתוח צבע בצלחת 96 היטב. (א) מבנים של תרכובות 1-8 המשמשים לצורך השימוש. פעילות העיכוב של תרכובות אלה דווחה ב Vidilaseris ואח '9. (ב) הסדר לדוגמה. (ג) פיתוח צבע, 30 דקות לאחר הוספת התמיסה הארגיט-ציטראט. ריכוזים של מעכב שליטה (IDP) ודגימות בשימוש, מסודרים מלמעלה למטה, הם 2.5 μM, 25 μM, ו 250 μM ריכוז ו-1 μM, 5 μM, ו 20 הריכוז μM, בהתאמה. עוצמת הצבע הכחול מקבילה לכמות Pi ששוחררה עקב התגובה האנזימטית וחוסר הצבע מתאים לתגובה אנזימטית. (ד) כיול עקומת לתקן Pi (nmol) נגד860 עם התאמה ליניארית (y = 0.0576 x + 0.0019; r2 = 0.999). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: עקומת הפעילות TmPPase אחוז עבור שלושה ריכוזי מעכבי שונים. הרגרסיה לינארית עקומות כדי לחשב את IC50 (אומדן) מוצגים עבור idp כמו גם עבור תרכובות 1, 4, 5, 6 ו- 7 אבל לא עבור תרכובות 2, 3, ו 8 כפי שהם לא היו פעילות tmppase מעכב בריכוזים של שיטת החישוב. הלוגיקה50 ו-IC50 (הערכה) של כל תרכובת מוצג בטבלה 1. כל הנתונים מוצגים כממוצע ± SD עם שלוש משכפל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: עקומת עיכוב משמונה נקודות ריכוז של תרכובות 1, 5, 6, 7 ו-8. איור זה נלקח מווידילסקוס ואח '9 עם שינוי קל. כל הנתונים מוצגים כממוצע ± SD עם שלוש משכפל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

דוגמה לוגיקה50 IC50 (הערכה) (μm)
IDP 1.95 ± 0.0142 87.9 ± 2.46
1 0.112 ± 0.0274 1.29 ± 0.0816
2 − ללא עיכוב
3 − ללא עיכוב
4 0.870 ± 0.0447 7.39 ± 0.760
מיכל 5 1.28 ± 0.0296 19.0 ± 1.29
6 1.57 ± 0.0846 37.4 ± 7.29
7 2.19 ± 0.366 156 ± 131
8 − ללא עיכוב

טבלה 1: לוגיקה50 ו-IC50 (הערכה) של idp ותרכובות 1-8 בהתבסס על הנתונים מתוך איור 3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כאן אנו מדווחים על פרוטוקול מפורט עבור הקרנה פשוטה של מעכבי עבור פירופוספאז של קרום מאוגד מ T. קיסריה בפורמט 96 צלחת היטב מבוסס על vidilaseris ואח '14. פרוטוקול זה הוא זול ובעל בסיס של 12-פוספומוליפוליב חומצה, אשר נוצרת מאורתופדיה וmolybdate בתנאים חומציים ומופחתת למינים phosphomolybdenum עם צבע כחול ברור12. שיטה זו מועדפת על פני פרוטוקולים אחרים, כגון מלכית הירוק יותר רגיש16, כי שיטה זו אינה מראה הפרעה בנוכחות ריכוז פוספוליפיד גבוה הנדרש עבור TmPPase ההפעלה14.

זרימת העבודה של פרוטוקול ההקרנה מתוארת באיור 1 , ותהליך זה יכול להתבצע במלואו ב-1 h. פרוטוקול זה ממוטב עבור TmPPase עם טמפרטורת העבודה האופטימלית ב-71 ° c וזמן תגובה של 5 דקות. כאשר המים מתנדפים בטמפרטורה זו מתערובת התגובה, מיושמת סדין איטום מדבק (הפרוסות להתאמה ולכיסוי הרצועות) על מנת למנוע אידוי14 והמים המטאדו פשוט מצנטריפוגה. The 5 דקות דגירה הזמן נבחר כפי שהוא עדיין בטווח ליניארי של פוספט אנזימטי שוחרר מספיק עבור הקרנה אמין14. בפרוטוקול זה, מיומנויות התזמון והליטוף הן גורמים חשובים להשגת תוצאה טובה ואמינה. תוספת של ריאגנטים במהלך הקיום עם מרווח של 20 s בין רצועות היא אפשרות תזמון אופטימיזציה עבור קלות ביצוע השלבים הבאים.

עבור mPPases הטמפרטורה האופטימלית ואת זמן הדגירה צריך להיקבע בנפרד לפני השימוש בתוך שיטת העיכוב. פרוטוקול ההפעלה מחדש של האנזים לעיל ממוטב עבור TmPPase ומסוגי Mpp, אחרים עשויים להזדקק לפרוטוקול שונה להפעלה מחדש. לדוגמה, אין להוסיף את DDM להפעלה מראש של mPPase מ- Pyrobaculum מאחר שהיא תפחית את פעילותה האנזימטית17. ככל שהאנזים יהפוך לפחות פעיל אם הוא מוכן מראש, יש להוסיף את התוספת של האנזים המופעל מופעל לתערובת הריאקציה זמן קצר לפני שהסיפוח מתחיל. לאחר הוספת התמיסה הארגיט-ציטראט, מוצר התגובה יציב לפחות 5 שעות14. לפיכך ניתן לבצע את האצווה הבאה באופן מיידי, וניתן לעשות זאת מאוחר יותר לכל הקבוצות בו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

עבודה זו נתמכת על ידי המענקים מקרן ג'יין ואטוס Erkko ו-BBSRC (BB/M021610) לאדריאן גולדמן, האקדמיה של פינלנד (No. 308105) ל Keni Vidilaseris, (מס ' 310297) לאנרי Xhaard, ו (No. 265481) כדי Jari Yli-Kauhaluoma, ואת אוניברסיטת הלסינקי כספי מחקר כדי גוסטב Boije af Gennäs. המחברים מודים לברנדט גהל על עזרתה הטכנית במהלך הפרויקט.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adhesive sealing sheet Thermo Scientific AB0558
Ammonium heptamolybdate tetrahydrate Merck F1412481 636
Ascorbic acid Sigma-Aldrich 95212-250G
BioLite 96Well Multidish Thermo Scientific 130188
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Merck 1167431000
8-well PCR Tube Strips 0.2 ml without caps (120) Nippon genetics FG-028
Dodecyl maltoside (DDM) Melford B2010-100G
Ethanol Merck 1009901001
Glacial acetic acid Merck 1000631011
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 258148-500ML
Imidodiphosphate sodium salt Sigma-Aldrich I0631-1G
L-α-Phosphatidyl choline from soybean lecithin Sigma 429415-100GM
Magnesium chloride Sigma-Aldrich 8147330500
Multiplate 96-Well PCR Plates Bio-Rad MLL9651
MultiSkan Go Thermo Scientific 10680879
Nepheloskan Ascent (Type 750) Labsystems
Polystyrene Petri dish (size 150 mm x 15 mm) Sigma-Aldrich P5981-100EA
Potassium chloride Merck 104936
Prism 6 software GraphPad
QBT2 Heating block Grant Instruments
Sodium meta-arsenite Fisher Chemical 12897692
Sodium phosphate dibasic (Pi) Sigma S0876-1KG
Sodium pyrophosphate dibasic Fluka 71501-100G
Trisodium citrate dihydrate Fluka 71404-1KG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Terstappen, G. C., Reggiani, A. In silico research in drug discovery. Trends in Pharmacological Sciences. 22 (1), 23-26 (2001).
  2. Rask-Andersen, M., Almen, M. S., Schioth, H. B. Trends in the exploitation of novel drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (8), 579-590 (2011).
  3. Shah, N. R., Vidilaseris, K., Xhaard, H., Goldman, A. Integral membrane pyrophosphatases: a novel drug target for human pathogens. AIMS Biophysics. 3 (1), 171-194 (2016).
  4. Baykov, A. A., Malinen, A. M., Luoto, H. H., Lahti, R. Pyrophosphate-Fueled Na+ and H+ Transport in Prokaryotes. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 77 (2), 267-276 (2013).
  5. Serrano, A., Perez-Castineira, J. R., Baltscheffsky, M., Baltscheffsky, H. H+-PPases: yesterday, today and tomorrow. IUBMB Life. 59 (2), 76-83 (2007).
  6. Liu, J., et al. A vacuolar-H+-pyrophosphatase (TgVP1) is required for microneme secretion, host cell invasion, and extracellular survival of Toxoplasma gondii. Molecular Microbiology. 93 (4), 698-712 (2014).
  7. Lemercier, G., et al. A pyrophosphatase regulating polyphosphate metabolism in acidocalcisomes is essential for Trypanosoma brucei virulence in mice. Journal of Biological Chemistry. 279 (5), 3420-3425 (2004).
  8. Belogurov, G. A., et al. Membrane-bound pyrophosphatase of Thermotoga maritima requires sodium for activity. Biochemistry. 44 (6), 2088-2096 (2005).
  9. Vidilaseris, K., et al. Asymmetry in catalysis by Thermotoga maritima membrane-bound pyrophosphatase demonstrated by a nonphosphorus allosteric inhibitor. Science Advances. 5 (5), (2019).
  10. Lin, S. M., et al. Crystal structure of a membrane-embedded H+-translocating pyrophosphatase. Nature. 484 (7394), 399-403 (2012).
  11. Fiske, C. H., Subbarow, Y. The colorimetric determination of phosphorus. Journal of Biological Chemistry. 66 (2), 375-400 (1925).
  12. Nagul, E. A., McKelvie, I. D., Worsfold, P., Kolev, S. D. The molybdenum blue reaction for the determination of orthophosphate revisited: Opening the black box. Analytica Chimica Acta. 890, 60-82 (2015).
  13. Kellosalo, J., Kajander, T., Palmgren, M. G., Lopez-Marques, R. L., Goldman, A. Heterologous expression and purification of membrane-bound pyrophosphatases. Protein Expression and Purification. 79 (1), 25-34 (2011).
  14. Vidilaseris, K., Kellosalo, J., Goldman, A. A high-throughput method for orthophosphate determination of thermostable membrane-bound pyrophosphatase activity. Analytical Methods. 10 (6), 646-651 (2018).
  15. He, Z. Q., Honeycutt, C. W. A modified molybdenum blue method for orthophosphate determination suitable for investigating enzymatic hydrolysis of organic phosphates. Communications in Soil Science and Plant Analysis. 36 (9-10), 1373-1383 (2005).
  16. Martin, B., Pallen, C. J., Wang, J. H., Graves, D. J. Use of fluorinated tyrosine phosphates to probe the substrate specificity of the low molecular weight phosphatase activity of calcineurin. Journal of Biological Chemistry. 260 (28), 14932-14937 (1985).
  17. Strauss, J., Wilkinson, C., Vidilaseris, K., Harborne, S. P. D., Goldman, A. A simple strategy to determine the dependence of membrane-bound pyrophosphatases on K+ as a cofactor. Methods in Enzymology. 607, 131-156 (2018).

Tags

ביוכימיה סוגיה 153 פירופוספטאז ממברנה ממברנות מרימה תרמוtima הקרנת מעכבי מוליבדן תגובה כחולה מחלות פרוטיסטים עיצוב תרופות
הקרנה עבור <em>התרמוטוגה מארימה</em> ממברנה מאוגדות פירופוספטאז מעכבי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vidilaseris, K., Johansson, N. G.,… More

Vidilaseris, K., Johansson, N. G., Turku, A., Kiriazis, A., Boije af Gennäs, G., Yli-Kauhaluoma, J., Xhaard, H., Goldman, A. Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors. J. Vis. Exp. (153), e60619, doi:10.3791/60619 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter