Summary
Burada membrana bağlı pirofosfataz (Thermotoga maritimadan) inhibitörleri için 96 kuyu plaka biçiminde mobibdenum mavi reaksiyonu dayalı bir tarama yöntemi salıyoruz.
Abstract
Membrana bağlı pirofosfatazlar (mPPases) bakterilerde, arkelerde, bitkilerde ve protist parazitlerde oluşan dimerik enzimlerdir. Bu proteinler pirofosfatı iki ortofosfat molekülüne ayırırlar, bu moleküller proton ve/veya sodyum iyonile birleştiğinde membran boyunca pompalanırlar. Hayvanlarda ve insanlarda homolog protein oluşmadığından, mPPP'ler potansiyel ilaç hedeflerinin tasarımında iyi adaylardır. Burada 96 kuyu plaka sisteminde mobibdenmavi reaksiyon kullanan mPPase inhibitörleri için ayrıntılı bir protokol sayılmaktadır. Termofilik bakteri Thermotoga maritima (TmPPase) mPPase'yi model enzim olarak kullanıyoruz. Bu protokol basit ve ucuzdur ve tutarlı ve sağlam bir sonuç verir. Testin başlangıcından emici ölçüme kadar etkinlik test protokolünü tamamlamak sadece bir saat sürer. Bu çıktıda üretilen mavi renk uzun bir süre için kararlı olduğundan, sonraki tsay(lar) önceki toplu işlemden hemen sonra gerçekleştirilebilir ve emicilik daha sonra tüm gruplar için aynı anda ölçülebilir. Bu protokolün dezavantajı, elle yapılır ve böylece yorucu yanı sıra pipetting ve zaman tutma iyi beceriler gerektirir olabilir. Ayrıca, bu istihda kullanılan arsenit-sitrat çözeltisi sodyum arsenit içerir, toksik ve gerekli önlemler ile ele alınmalıdır.
Introduction
Toplam hücresel proteinlerin yaklaşık %25'i membran proteinleridir ve bunların yaklaşık %60'ı ilaç hedefleri1,2'dir. Potansiyel ilaç hedeflerinden biri3, membrana bağlı pirofosfatlar (mPPases), iki ortofosfat içine pirofosfat hidrolizi ile membran boyunca proton ve / veya sodyum iyon pompa dimerik enzimlervardır 4. mPPases çeşitli organizmalarda bulunabilir5 bakteri gibi, arke, bitkiler, ve protist parazitler, insanlar ve hayvanlar hariç4. Protist parazitlerde, örneğin Plasmodium falciparum, Toxoplasma gondii ve Trypanosoma brucei, mPPases parazit virülans için gerekli 6 ve parazitlerde bu ifadenin nakavt dış temel pH maruz kalma sırasında hücre içi pH bakımında başarısızlığa yol açar7. Omurgalılarda homolog protein ve önemi nedeniyle, mPPases protistal hastalıklar için potansiyel ilaç hedefleri olarak kabul edilebilir3.
Bu çalışmada mPPase inhibitörlerinin in vitro taraması TmPPase model sistemine dayanmaktadır. TmPPase, T. maritima'dan gelen sodyum iyon pompalama ve potasyum iyne bağımlı mPPase olup 71 °C8'deoptimum aktiviteye sahiptir. Bu enzimin faydaları örneğin üretim ve arınma kolaylığı, iyi termal stabilite ve yüksek özgül aktivite vardır. TmPPase pozisyon tam koruma yanı sıra protist mPPases3,9 ve Vigna radiata10 mPPase çözülmüş yapısına tüm katalitik artıkların kimliğini yanı sıra yüksek benzerlik gösterir. Farklı konformasyonlarda TmPPase mevcut yapıları da yapı tabanlı uyuşturucu tasarım deneyi için yararlıdır (sanal tarama ve de novo tasarım olarak).
Burada TmPPase inhibitörlerinin 96 kuyu plaka biçiminde taranması için ayrıntılı bir protokol sunarız (Şekil 1). Protokol ilk Fiske ve Subbarow11tarafından geliştirilen mobibdenum mavi reaksiyon, kolorimetrik yöntemine dayanmaktadır. Bu yöntem, ortofosfat ve molybdate asidik koşullar altında 12 fosfathomolybdic asit oluşumunu içerir, daha sonra karakteristik mavi renkli fosfathomolybdenum türleri vermek için azalır12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Protein hazırlama
NOT: TmPPase'nin ifadesi ve arınması başka bir yerde13olarak tanımlanmıştır.
- 20 mM 2-(N-morfolino)etanesulfonik asit (MES) pH 6.5, %3.5 (v/v) gliserol, 2 mM dithiothreitol (DTT) ve %0.05 dodecyl maltoside (DDM) içeren reaktivasyon tampon çözeltisinin 10 mL'sini hazırlayın.
- 200 mM Tris-Cl pH 8.0, 8.0 mM MgCl2,333 mM KCl ve 67 mM NaCl içeren reaksiyon karışımının 10 mL'sini hazırlayın.
NOT: Mg2+ mPPPAz substrat olarak pirofosfat chelate gereklidir, K+ TmPPase potasyum bağımlı mPPase olduğu gibi enzim aktivitesini artırmak için gereklidir, ve Na+ TmPPase tarafından sodyum iyon translokasyonu sırasında enzim aktivitesi için gereklidir. - Enzim reaktivasyonu için 30 mg/mL lipozom hazırlayın.
- 10 mL 20 mM Tris-HCl pH 8.0 ile 1 mM DTT ile 0.3 g L-α-fosfatidilkolin in 10 mL 20 mM Tris-HCl pH 8.0 1 mM DTT ile ekleyin.
- Lipozom'u buza koyun ve 1 dakika boyunca 1 saniyelik darbe aralığıyla sonicate edin, 1 dakika duraklayın ve çözelti saydam sarı olana kadar tekrarlayın.
- Aliquot lipozomlar, sıvı nitrojen dondurun ve kullanılana kadar -80 °C'de saklayın.
- Enzimi yeniden çalıştırın.
- Lipozom çözeltisinin 40 μL'sini %20 DDM'nin 22,5 μL'si ile karıştırın.
- Karışımı 55 °C'de 15 dk ısıtın ve oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin.
- Reaktivasyon tampon çözeltisinin 36.5 μL'sini ekleyin, karıştırın ve toplam 0.13 mg/mL konsantrasyon yapmak için 1 μL konsantre protein (13 mg/mL) ekleyin.
NOT: Protein genellikle saflaştırma dan sonra 10 μL aliquots dondurulur ve kullanmadan önce buz üzerinde çözülür.
- Yeniden aktive edilen enzimin 20 μL'sini alın ve reaksiyon karışımının 1.480°L'sine ekleyin, sonra hafifçe karıştırın.
NOT: Reaksiyon karışımına yeniden aktive edilen enzimin eklenmesi kullanılmadan hemen önce yapılmalıdır.
2. Bileşik hazırlama
- Bileşiklerin kullanılabilirliğine bağlı olarak 25−100 mM'lik stok çözeltilerini 50−200 μL'de yapmak için bileşikleri dimetil sülfoksit (DMSO) olarak çözün.
NOT: Burada kullanılan tüm bileşikler(Şekil 2A) daha önce 9 olarak yayınlanmıştır. Bileşik çözünürlük düşükse, stok konsantrasyonu buna göre ayarlanabilir. - Suda her bileşiğin üç farklı konsantrasyonları hazırlayın.
NOT: Reaksiyon karışımındaki son konsantrasyonlar sırasıyla 1, 5 ve 50 mikromolar veya 1, 5 ve 20 mikromolar olacaktır.- Çözünen bileşikler için 2 μM, 10 μM ve 100 μM veya alternatif olarak 2 μM, 10 μM ve 40 μM'yi az çözünen bileşikler için vermek için stok çözeltisini mikrotüplerde 1 mL'ye kadar suile seyreltin.
- Uygun karıştırma için stok çözeltisi seyreltilmesinden sonra anında bileşik çözelti girdap.
- Nephelometre kullanarak bileşik toplama olup olmadığını kontrol edin.
NOT: Bu üç konsantrasyonda (1 μM, 5 μM ve 20 μM) triplicate olarak incelendi ve 96 kuyu plakasında boşa normalleştirildi.- Çok kanallı bir pipet kullanarak reaksiyon karışımının 75°L'sini her kuyuya dağıtın.
- Her bileşiğin 75 μL'sini ekleyin (boş için, bunun yerine 75°L su kullanın) ve 5×'lik yukarı ve aşağı borular oluşturarak karıştırın.
- Mikroplaka nephelometre kullanarak her kuyu300 V'de ölçün.
3. Asayi hazirlama için reaktifler
- Arsenit-sitrat çözeltisini hazırlayın.
- Tartmak 5 g sodyum arsenit ve trisodyum sitrat dihidrat 5 g.
DİkKAT: Sodyum arsenit toksiktir, bu nedenle uygun koruyucu ekipman kullanın ve özel bir özenle saplanır. Önlem olarak, gerekli tüm güvenlik önlemleri okunmadan ve anlaşılmadan işlemeyin. Bileşiğin veya çözeltisinin tozunu/buharını teneffüs etmemek için sadece bir duman kaputunda teşrinverin. Solunduğunda, temiz havaya geçin ve tıbbi yardım alın. Yutma ve göz/cilt temasından kaçınmak için uygun kimyasal güvenlik gözlüğü, koruyucu eldiven ve giysi takın. Yutulursa, hemen bir zehir merkezi veya doktor /doktor arayın. Deriye veya göze girerse, bol su yla yıkayın ve tıbbi yardım alın. - 100 mL suya çözün.
- 5 mL buzul asetik asit ekleyin, karıştırın ve 250 mL su ekleyin.
- Işıktan korunan oda sıcaklığında saklayın.
NOT: Çözüm bir yıldan uzun süredir stabildir.
- Tartmak 5 g sodyum arsenit ve trisodyum sitrat dihidrat 5 g.
- A çözeltisi ve B çözeltisi hazırlayın.
- A çözeltisi için, 0,5 M HCl ile 0,3 g askorbik asit için 10 mL buz soğuk ekleyin. Girdap ederek askorbik asidi çözün.
- B çözeltisi için, 70 mg amonyum heptamolybdate tetrahidrat ve girdap çözünmek için buz soğuk su 1 mL ekleyin.
NOT: Her iki çözümü de kullanıma kadar buz üzerinde saklayın. Sonuç sonuçlarının tutarlılığı için, her iki çözüm de en fazla bir hafta boyunca buzda saklanabilir.
- Kalibrasyon için 0 μM, 62,5 μM, 250 μM ve 500 μM konsantrasyonu ile fosfat (Pi)standardını hazırlayın.
- Reaksiyon karışımının 370 μL'sini içeren dört mikrotüpe 0 μL, 25 μL, 50 μL ve 100 μL 5 mM Na2HPO4 dihidrat ekleyin.
- 1 mL'ye kadar su ile toplayın.
4. Bir 96 kuyu plakası için faaliyet telbettei
NOT: Tişin şematik iş akışı için Şekil 1'e bakınız.
- 1 mL b çözeltisi ekleyin 10 mL çözelti A, girdap ile karıştırın ve çözeltiyi buz üzerinde saklayın.
NOT: Bu çözüm saydam ve sarı olmalıdır. A + B çözeltisini kullanmadan önce en az 30 dakika boyunca buzüzerinde tutun. Ancak, uzun süreli depolama sonra kötü gidecek gibi 3 saat içinde çözüm kullanın. - Çok kanallı bir pipet kullanarak trikifat taki tüp şeritlere 40 μL 0 μM, 62,5 mM, 250 μM ve 500 μM Pi standardı ekleyin.
NOT:P olmayan reaksiyon karışımı boş olarak kullanılacaktır. - Çok kanallı pipet kullanarak tüp şeritlere 25 μL bileşik çözelti ekleyin.
NOT: Her bileşiğin triplicate üç farklı konsantrasyonu olan yarım maksimal inhibitör konsantrasyonu (IC50)ilk tahmini için yeterlidir. Daha doğru bir IC50 tayini için sekiz farklı bileşik konsantrasyonu kullanılabilir. Sınır tanımayan enzim için bileşik çözelti eşit miktarda su ile değiştirilir. Pozitif kontroller olarak 2.5 μM, 25 μM ve 250 μM imidodiphosphate (IDP) sodyum tuzu kullanıldı. - Çok kanallı pipet kullanarak tüp şeritlere (Pi standardı içeren tüpler hariç) 15 μL mPPase çözeltikarışımı ekleyin.
- Boru şeritlerini yapışkan sızdırmazlık levhasıyla kapatın. Her tüp şerit ayırmak için sızdırmazlık levha kesin.
- Numuneleri 71 °C'de 5 dk kuluçkaya yatırın. Sonraki adımlarda zaman tüketimini en aza indirmek için numuneleri her şerit arasında 20 s aralığı olan ısıtma bloğuna yerleştirin.
- Her şerit için yapışkan sızdırmazlığı açın. Çok kanallı bir pipet kullanarak 10 μL 2 mM sodyum pirofosfat dibasic ekleyin ve 5× için yukarı ve aşağı boru ile karıştırın. Aynı sızdırmazlığı kullanarak tüp şeridini tekrar kapatın.
NOT: Bu adımı başlangıçta 20 s gerçekleştirmek zor olabilir; ancak, bazı tahliller sonra daha kolay olacaktır. - 71 °C'de 5 dk kuluçkaya yatırın.
- Numuneleri her şerit arasında 20 s aralığı olan soğutma aparatı üzerine yerleştirin. Onları 10 dakika soğutun ama kısa bir süre soğutma 5 dakika sonra her şerit santrifüj, sızdırmazlık levha altında su damlaları decant, sonra soğutma aparatı geri koymak ve sızdırmazlık kaldırın.
NOT: Soğutma aparatı, su yla doldurulmuş ve en az 1 saat dondurulmuş polistiren Petri kabına (boyut 150 mm × 15 mm) 96 iyi PCR plaka yerleştirilerek yapılabilir. Cihaz, tayın başlamasından yaklaşık 5 dakika önce dondurucudan çıkarılmalıdır. Reaksiyon karışımını donduracak ve renk gelişimini engelleyecek şekilde numune soğutmadan hemen önce soğutma aparatı çıkarmayın. - 10 dk soğuduktan sonra 60 μL çözelti A + B ekleyin, 5× için yukarı ve aşağı borular karıştırarak karıştırın ve 10 dakika boyunca soğutma aparatı üzerinde tüp şeritler tutun.
- Arsenit-sitrat çözeltisinin 90 μL'sini ekleyin ve sabit bir mavi renk üretmek için en az 30 dakika oda sıcaklığında tutun.
DİkKAT: Toksisitesi nedeniyle sodyum arsenit içeren tüm çözeltiler her zaman ekstra özenle kullanılmalıdır. Bu nedenle, arsenit-sitrat çözeltisi ilavesi bir duman başlık yapılmalıdır. - Her reaksiyon karışımından 180 μL'yi 96 kuyu polistiren mikroplakaya dağıtın.
- Mikroplaka spektrofotometre kullanarak her kuyunun emiciliğini 860 nm olarak ölçün.
5. Sonuç analizi
- Her numunenin ve Pi standartlarının ortalama triplicates'i. Ardından arka plan sinyalini ortadan kaldırmak için boş ile çıkarın.
- Pi standardı (nmol) miktarına göre emicilik (A860)değerlerini çizerek bir kalibrasyon eğrisi yapın ve aşağıdaki formülü kullanarak eğilim çizgisi işlevini elde etmek için doğrusal bir regresyon gerçekleştirin:
- Yukarıdaki doğrusal regresyon formülüne göre enzimatik reaksiyondan salınan fosfat miktarını (nmol) hesaplayın.
- Aşağıdaki formülü kullanarak belirli etkinliği hesaplama:
nPi reaksiyondan salınan fosfat miktarı (nmol), t reaksiyon süresidir (min) ve mTmPPPase ise, istiyatuarında (mg) kullanılan saf TmPPPPaz miktarıdır. - Aşağıdaki formülü kullanarak her inhibitör konsantrasyonu için yüzde aktivitesini hesaplayın:
saiinhibitör ve SAun ile bir örnek özel aktivite s sınır tanımayan numunenin özgül aktivitesidir. - LogIC50 (tahmin) ve IC50 (tahmin) aşağıdaki formülü kullanarak dört parametredoz-yanıt eğrisi bir doğrusal olmayan regresyon uygun hesaplayın:
X'in konsantrasyon kütüğü olduğu (μM), Y aktivite (%), Üst ve Alt y ile aynı birimdeki platolardır (%sırasıyla %100 ve %0), logIC50 X ile aynı log birimlerine sahiptir ve HillSlope = eğim faktörü veya birbiri olmayan tepe eğimi.
NOT: Montaj için yazılım(Malzeme Tablosu)kullanılır. Sıfırloarithm tanımlı olmadığı gibi inhibitör olmadan örnek için 0,01 μM (0,00 μM yerine) konsantrasyonu kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokolde, pirofosfatazların ortak inhibitörü olan IDP ile birlikte sekiz bileşik (Şekil2A)pozitif kontrol olarak test edildi. Her bileşik üç farklı konsantrasyonda (1 μM, 5 μM ve 20 μM) trilikat olarak test edildi. Taramanın iş akışı Şekil 1'degösterilmiştir , numune ve reaktif hazırlığından başlayarak 860 nm'de emici ölçüme kadar.
Bu protokolün sonunda, Çözelti A + B ve arsenit-sitrat eklendikten sonra, çözeltiler gözlemlenebilir ve enzimatik reaksiyon oluşumunu gösteren molybdate ile fosfat iyonlarının karmaşık oluşumu nedeniyle 709 nm ve 860 nm14 maksimum emilimi ile istikrarlı bir mavi renk geliştirmek. Bu deney için, 709 nm15de emiciliğe göre daha iyi algılama sınırı ve hassasiyeti olduğu için serbest bırakılan Pi miktarının ölçümü için 860 nm'de emicilik kullanıyoruz. Mavi renk tam olarak oda sıcaklığında kuluçka 30 dakika içinde geliştirilmiştir ve en az 5 saat14için kararlı. Tizin 10 μM Pi konsantrasyonuna kadar hassasiyeti vardır ve absorbans 10−800 μM14konsantrasyon aralığında doğrusaldır. Buradaki temsili sonuç olarak, e1−E3 (Şekil 2C)kuyuları inhibitörsüz reaksiyon karışımını içerir ve tayın sonunda mavi çözelti gözlemlenebilir. Bu durum, idp için F1−F3 ve bileşim 1 (TmPPase9'unyakın zamanda bilinen rekabetçi olmayan inhibitörü OLAN ATC 9) için A4−A6 kuyularında olduğu gibi, tam inhibisyonun sağlanamadığı düşük bileşik konsantrasyonlarda da görülebilir. IDP ve bileşik 1'indaha yüksek konsantrasyonu, enzimatik aktivitenin inhibisyonunu gösteren mavi renkte o kadar az (IDP için G1−G3 ve H1−H3 ve Bileşik 1için B4−B6 ve C4−C6) gözlemlenebilir. İnhibe etmeyen bileşiklerin üç konsantrasyonu da(2, 3, ve 8) aynı mavi renk yoğunluğunu sergilerken, E1−E3'ü herhangi bir inhibitör olmaksızın(Şekil 2C).
860 nm'de emiciölçümden sonra veriler işlenebilir ve analiz edilebilir (bkz. protokol bölüm 5). Şekil 2B, doğrusal montajı ile Pi standardının kalibrasyon çizimini gösterir (y = 0.0576x + 0.0019; r2 = 0,999). Şekil 3 enzimatik aktivitenin çizimini gösterir (%) her test bileşiğin konsantrasyonuna karşı. İnhibisyon aktivitesi olan bileşikler için doğrusal olmayan bir eğri uydurması da gösterilir. Pozitif kontrol olarak kullanılan IDP, yüksek konsantrasyonda aktivitede azalma olduğunu açıkça göstermektedir. Üç farklı konsantrasyona göre hesaplanan IC50 (tahmini) 88,2 μM(Tablo 1),sekiz konsantrasyon noktası14olan bir önceki ölçüme (80,0 μM) benzer. Bileşikler 1, 4, 5, 6, ve 7, konsantrasyon ic50 ile arttığı için IDP olarak benzer bir eğilim gösterdi (tahmini) yaklaşık 1.3 μM, 7.4 μM, 19.0 μM, 37.4 μM, ve 156.1 μM, sırasıyla (Tablo 1). Bileşikler için 2, 3, ve 8 aktivite veya inhibisyon hiçbir azalma istif konsantrasyonlarında görülebilir. Sekiz konsantrasyon noktaları ile ek bir titret hassas IC50oluşturmak için yapılabilir. Şekil 4, 1, 5, 6, 7 ve 8 bileşimleri için inhibisyon eğrisini gösterir, ic50 ile 1,7 μM, 21,4 μM, 58,8 μM, 239,0 μM ve >500 μM, sırasıyla9.
Şekil 1: TmPPase inhibisyonu 96 iyi plaka formatında şematik bir iş akışı. Kırmızı numaralandırma protokole göre test adımlarını gösterir ve mavi oklar aralık sırasını gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Örnekler, 96 kuyu plakası içinde düzenlenmesi ve renk gelişimi. (A) 1 −8 bileşimlerinin yapıları titreşme için kullanılır. Bu bileşiklerin inhibisyon aktivitesi Vidilaseris ve ark.9bildirilmiştir. (B) Örnek düzenlemesi. (C) Renk gelişimi, arsenit-sitrat çözeltisi ilavesi sonra 30 dk. Kontrol inhibitörü (IDP) konsantrasyonları ve kullanılan numuneler sırasıyla 2,5 μM, 25 μM ve 250 μM konsantrasyonve 1 μM, 5M ve 20 μM konsantrasyondur. Mavi rengin yoğunluğu enzimatik reaksiyon nedeniyleserbest bırakılan P miktarına karşılık gelir ve renk eksikliği hiçbir enzimatik reaksiyona karşılık gelir. (D) Doğrusal montajlı A860'a karşı Pi standardı (nmol) için kalibrasyon eğrisi (y = 0,0576x + 0,0019; r2 = 0,999). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Üç farklı inhibitör konsantrasyonu için TmPPase yüzde aktivitesieğrisi. IC50 'yi hesaplamak için doğrusal olmayan regresyon eğrileri (tahmini) IDP'nin yanı sıra 1, 4, 5, 6 ve 7 bileşikleri için de gösterilmiştir, ancak 2, 3ve 8 bileşimleri için değil, tsay konsantrasyonlarında TmPPase aktivitesini inhibe etmedikleri için. LogIC50 ve IC50 (tahmini) her bileşiğin Tablo 1'degösterilmiştir. Tüm veriler ortalama ± SD olarak üç çoğaltma ile gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: 1, 5, 6, 7 ve 8 bileşimlerinin sekiz konsantrasyon noktasından inhibisyon eğrisi. Bu rakam Vidilaseris ve ark.9 hafif modifikasyon ile alınır. Tüm veriler ortalama ± SD olarak üç çoğaltma ile gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Örnek | LogIC50 | IC50 (tahmini) (μM) |
| ıdp | 1,95 ± 0,0142 | 87.9 ± 2.46 |
| 1 | 0,112 ± 0,0274 | 1.29 ± 0.0816 |
| 2 | − | inhibisyonu yok |
| 3 | − | inhibisyonu yok |
| 4 | 0,870 ± 0,0447 | 7.39 ± 0.760 |
| 5 | 1,28 ± 0,0296 | 19.0 ± 1.29 |
| 6 | 1,57 ± 0,0846 | 37.4 ± 7.29 |
| 7 | 2.19 ± 0.366 | 156 ± 131 |
| 8 | − | inhibisyonu yok |
Tablo 1: IDP'nin LogIC50 ve IC50 (tahmini) ve Şekil 3'teki verilere göre 1−8 bileşikleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada Vidilaseris ve ark14dayalı bir 96 iyi plaka formatında T. maritima membran bağlı pirofosfatse için inhibitörleri basit tarama için ayrıntılı bir protokol rapor . Bu protokol ucuz dur ve asidik koşullarda ortofosfat ve molybdate oluşan ve farklı bir mavi renk 12 ile fosfathomolybdenum türlerine indirgenmiş12fosfathomolybdic asit, dayanmaktadır. Bu yöntem diğer protokoller üzerinde tercih edilir, daha hassas malakit yeşil test16gibi , Bu yöntem TmPPase reaktivasyonu için gerekli olan yüksek fosfolipid konsantrasyonu varlığında girişim göstermez çünkü14.
Tarama protokolünün iş akışı Şekil 1'de gösterilmiştir ve bu işlem 1 saat içinde tam olarak gerçekleştirilebilir. Bu protokol 71 °C'de en uygun çalışma sıcaklığı ve 5 dk reaksiyon süresi ile TmPPase için optimize edilebiyir. Reaksiyon karışımından bu sıcaklıkta su buharlaşacağı için,buharlaşmayı önlemek için yapışkan bir sızdırmazlık levhası (şeritleri sığdırmak ve kaplayacak şekilde dilimlenmiş) uygulanır ve buharlaşan su sadece santrifüj le geri toplanır. 5 dk kuluçka süresi hala enzimatik olarak salınan fosfatın doğrusal aralığında olduğu ve güvenilir tarama için yeterli olduğu için seçilir14. Bu protokolde, iyi ve güvenilir bir sonuç elde etmek için zamanlama ve pipetleme becerileri önemli faktörlerdir. Şeritler arasında 20 s aralığı ile tsurel sırasında reaktiflerin eklenmesi sonraki adımları gerçekleştirme kolaylığı için optimize edilmiş bir zamanlama seçeneğidir.
Farklı mPPP'ler için, inhibisyon teşbinin kullanımından önce optimum sıcaklık ve kuluçka süresi ayrı ayrı belirlenmelidir. Yukarıdaki enzim reaktivasyon protokolü TmPPase için optimize edilmiş ve diğer mPPases farklı bir reaktivasyon protokolü gerekebilir. Örneğin, Pyrobaculum aerophilum'dan mPPase'nin yeniden aktivasyonu için DDM eklenmemelidir, çünkü enzimatikaktivitesini azaltacaktır 17. Enzim önceden iyi hazırlanırsa daha az aktif olacağından, tekrar aktive edilen enzimin eklenmesi, tsurel asyona başlamadan kısa bir süre önce reaksiyon karışımına eklenmelidir. Arsenit-sitrat çözeltisi ilave edildikten sonra reaksiyon ürünü en az 5 saat14oranında stabildir. Bu nedenle, bir sonraki tsay toplu hemen yapılabilir ve emme ölçümü daha sonra tüm toplu tek bir kerede yapılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Jane ve Aatos Erkko Vakfı ve BBSRC (BB/M021610) adrian Goldman hibe tarafından desteklenmiştir, Finlandiya Akademisi (No. 308105) Keni Vidilaseris, (No. 310297) Henri Xhaard ve (No. 265481) Jari Yli-Kauhaluoma ve Helsinki Üniversitesi Araştırma Fonları Gustav Boije af Gennäs için. Yazarlar bernadette Gehl'e proje sırasında ki teknik yardımları için teşekkür eder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesive sealing sheet | Thermo Scientific | AB0558 | |
| Ammonium heptamolybdate tetrahydrate | Merck | F1412481 636 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | 95212-250G | |
| BioLite 96Well Multidish | Thermo Scientific | 130188 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Merck | 1167431000 | |
| 8-well PCR Tube Strips 0.2 ml without caps (120) | Nippon genetics | FG-028 | |
| Dodecyl maltoside (DDM) | Melford | B2010-100G | |
| Ethanol | Merck | 1009901001 | |
| Glacial acetic acid | Merck | 1000631011 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148-500ML | |
| Imidodiphosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | I0631-1G | |
| L-α-Phosphatidyl choline from soybean lecithin | Sigma | 429415-100GM | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 8147330500 | |
| Multiplate 96-Well PCR Plates | Bio-Rad | MLL9651 | |
| MultiSkan Go | Thermo Scientific | 10680879 | |
| Nepheloskan Ascent (Type 750) | Labsystems | ||
| Polystyrene Petri dish (size 150 mm x 15 mm) | Sigma-Aldrich | P5981-100EA | |
| Potassium chloride | Merck | 104936 | |
| Prism 6 software | GraphPad | ||
| QBT2 Heating block | Grant Instruments | ||
| Sodium meta-arsenite | Fisher Chemical | 12897692 | |
| Sodium phosphate dibasic (Pi) | Sigma | S0876-1KG | |
| Sodium pyrophosphate dibasic | Fluka | 71501-100G | |
| Trisodium citrate dihydrate | Fluka | 71404-1KG |
References
- Terstappen, G. C., Reggiani, A. In silico research in drug discovery. Trends in Pharmacological Sciences. 22 (1), 23-26 (2001).
- Rask-Andersen, M., Almen, M. S., Schioth, H. B. Trends in the exploitation of novel drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (8), 579-590 (2011).
- Shah, N. R., Vidilaseris, K., Xhaard, H., Goldman, A. Integral membrane pyrophosphatases: a novel drug target for human pathogens. AIMS Biophysics. 3 (1), 171-194 (2016).
- Baykov, A. A., Malinen, A. M., Luoto, H. H., Lahti, R. Pyrophosphate-Fueled Na+ and H+ Transport in Prokaryotes. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 77 (2), 267-276 (2013).
- Serrano, A., Perez-Castineira, J. R., Baltscheffsky, M., Baltscheffsky, H. H+-PPases: yesterday, today and tomorrow. IUBMB Life. 59 (2), 76-83 (2007).
- Liu, J., et al. A vacuolar-H+-pyrophosphatase (TgVP1) is required for microneme secretion, host cell invasion, and extracellular survival of Toxoplasma gondii. Molecular Microbiology. 93 (4), 698-712 (2014).
- Lemercier, G., et al. A pyrophosphatase regulating polyphosphate metabolism in acidocalcisomes is essential for Trypanosoma brucei virulence in mice. Journal of Biological Chemistry. 279 (5), 3420-3425 (2004).
- Belogurov, G. A., et al. Membrane-bound pyrophosphatase of Thermotoga maritima requires sodium for activity. Biochemistry. 44 (6), 2088-2096 (2005).
- Vidilaseris, K., et al. Asymmetry in catalysis by Thermotoga maritima membrane-bound pyrophosphatase demonstrated by a nonphosphorus allosteric inhibitor. Science Advances. 5 (5), (2019).
- Lin, S. M., et al. Crystal structure of a membrane-embedded H+-translocating pyrophosphatase. Nature. 484 (7394), 399-403 (2012).
- Fiske, C. H., Subbarow, Y. The colorimetric determination of phosphorus. Journal of Biological Chemistry. 66 (2), 375-400 (1925).
- Nagul, E. A., McKelvie, I. D., Worsfold, P., Kolev, S. D. The molybdenum blue reaction for the determination of orthophosphate revisited: Opening the black box. Analytica Chimica Acta. 890, 60-82 (2015).
- Kellosalo, J., Kajander, T., Palmgren, M. G., Lopez-Marques, R. L., Goldman, A. Heterologous expression and purification of membrane-bound pyrophosphatases. Protein Expression and Purification. 79 (1), 25-34 (2011).
- Vidilaseris, K., Kellosalo, J., Goldman, A. A high-throughput method for orthophosphate determination of thermostable membrane-bound pyrophosphatase activity. Analytical Methods. 10 (6), 646-651 (2018).
- He, Z. Q., Honeycutt, C. W. A modified molybdenum blue method for orthophosphate determination suitable for investigating enzymatic hydrolysis of organic phosphates. Communications in Soil Science and Plant Analysis. 36 (9-10), 1373-1383 (2005).
- Martin, B., Pallen, C. J., Wang, J. H., Graves, D. J. Use of fluorinated tyrosine phosphates to probe the substrate specificity of the low molecular weight phosphatase activity of calcineurin. Journal of Biological Chemistry. 260 (28), 14932-14937 (1985).
- Strauss, J., Wilkinson, C., Vidilaseris, K., Harborne, S. P. D., Goldman, A. A simple strategy to determine the dependence of membrane-bound pyrophosphatases on K+ as a cofactor. Methods in Enzymology. 607, 131-156 (2018).
