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Cancer Research

ऑर्थोटोपिक अग्नाशय ट्यूमर की पीढ़ी और ट्यूमर के पूर्व वीवो लक्षण वर्णन-घुसपैठ टी सेल साइटोटॉक्सिकिटी

Published: December 7, 2019 doi: 10.3791/60622
Automatic Translation
1,2, 1, 2,3
1Division of Cancer, Department of Surgery and Cancer, Imperial College London, 2Centre for Cancer and Inflammation, Barts Cancer Institute, Queen Mary University of London, 3German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE)

Summary

यह प्रोटोकॉल ऑर्थोटोपिक अग्नाशय ट्यूमर की शल्य चिकित्सा पीढ़ी और हौसले से अलग मूत्र अग्नाशय ट्यूमर के तेजी से पाचन का वर्णन करता है। पाचन के बाद, व्यवहार्य प्रतिरक्षा कोशिका आबादी का उपयोग आगे डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए किया जा सकता है, जिसमें प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा इंट्रासेलर साइटोकिन का पता लगाने के लिए टी कोशिकाओं की पूर्व वीवो उत्तेजना शामिल है।

Abstract

अग्नाशय के कैंसर के वीवो मॉडल में रोग गतिशीलता, प्रतिरक्षा घुसपैठ और नई चिकित्सीय रणनीतियों का अध्ययन करने के लिए अमूल्य उपकरण प्रदान करते हैं। ऑर्थोटोपिक म्यूरन मॉडल को इम्यूनोसक्षम चूहों के बड़े साथियों पर एक साथ किया जा सकता है, अपेक्षाकृत सस्ती है और कॉग्नेट ऊतक माइक्रोएनवायरमेंट को बरकरार रखता है। ऑर्थोटोपिक ट्यूमर के भीतर टी सेल घुसपैठ और साइटोटॉक्सिक गतिविधि का क्वांटिफिकेशन एंटीट्यूमरल प्रतिक्रिया का एक उपयोगी संकेतक प्रदान करता है।

यह प्रोटोकॉल सिंजेनिक ट्यूमर कोशिकाओं की एक कम संख्या के इंजेक्शन द्वारा ऑर्थोटॉपिक अग्नाशय ट्यूमर की शल्य चिकित्सा पीढ़ी के लिए पद्धति का वर्णन करता है 5 μL तहखाने झिल्ली में सीधे अग्न्याशय में निलंबित कर दिया । ऑर्थोटोपिक ट्यूमर वाले चूहों को एंडपॉइंट तक पहुंचने में लगभग 30 दिन लगते हैं, जिस पर ट्यूमर को काटा जा सकता है और ट्यूमर-घुसपैठ टी सेल गतिविधि के लक्षण वर्णन के लिए संसाधित किया जा सकता है। कोलेजेनेज और DNase का उपयोग कर तेजी से एंजाइमैटिक पाचन ट्यूमर से निकाले जाने के लिए एक एकल सेल निलंबन की अनुमति देता है। ट्यूमर से निकाली गई प्रतिरक्षा कोशिकाओं की व्यवहार्यता और कोशिका सतह मार्कर संरक्षित हैं; इसलिए, यह कई डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त है, जिसमें संस्कृति या आरएनए निष्कर्षण के लिए प्रतिरक्षा कोशिकाओं की प्रवाह-सहायता प्राप्त सेल छंटाई, प्रतिरक्षा कोशिका आबादी के प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण शामिल हैं। यहां, हम इंट्रासेलर साइटोकिन क्वांटिफिकेशन (IFNο और TNFα) और डिग्रेनुअलेशन गतिविधि (CD107a) के लिए टी सेल आबादी के पूर्व विवो उत्तेजना का वर्णन समग्र साइटोटॉक्सिकिसिटी के उपाय के रूप में करते हैं। साइटोकिन उत्पादन और डिग्रेनुलेशन को अपरेज़ करने के लिए एंटी-सीडी107a एंटीबॉडी की उपस्थिति में पूरे ट्यूमर डाइजेस्ट को 5 एच के लिए phorbol myristate एसीटेट और आयनमाइसिन के साथ प्रेरित किया गया था। अंतिम 4 घंटे के लिए ब्रेफेल्डिन ए और मोनेसिन के अलावा एक्स्ट्रासेलुलर परिवहन को ब्लॉक करने और साइटोकाइन डिटेक्शन को अधिकतम करने के लिए किया गया था। कोशिकाओं के अतिरिक्त और अंतर-सेलुलर धुंधला तो प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए प्रदर्शन किया गया था, जहां IFNο+, TNFα+ और CD107a+ CD4+ और CD8+ टी कोशिकाओं के अनुपात की मात्रा निर्धारित की गई थी ।

यह विधि ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट का व्यापक विश्लेषण करने के लिए एक प्रारंभिक आधार प्रदान करती है।

Introduction

इस विधि विवरण, स्टार्ट-टू-फिनिश से, सेलुलर सामग्री की न्यूनतम मात्रा का उपयोग करके ऑर्थोटोपिक अग्नाशय ट्यूमर पैदा करने के लिए शल्य प्रक्रिया और टी सेल फ़ंक्शन के पूर्व वीवो विश्लेषण सहित प्रतिरक्षा कोशिका आबादी के व्यापक प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए स्थापित ट्यूमर का बाद में तेजी से विच्छेदन।

अग्नाशय के डक्टल एडेनोकार्सिनोमा (पीडीएसी) एक आक्रामक कार्सिनोमा है जिसमें केवल 8% रोगियों को 5 साल1जीवित हैं। चूंकि 20% से कम रोगी सर्जिकल रिसेक्शन2के लिए पात्र हैं, इसलिए ताजा रोगी के नमूने अनुसंधान के लिए आसानी से सुलभ नहीं हैं और इस प्रकार वीवो मॉडल इस बीमारी की जांच के लिए आवश्यक उपकरण प्रदान करते हैं। पीडीएसी के कई मूत्र मॉडल हैं: ऑर्थोटोपिक, चमड़े के नीचे, ट्रांसजेनिक, नसों में और रोगी-व्युत्पन्न विद्वेष (पीडीएक्स), बड़े पैमाने पर यहां3वर्णित हैं। यहां वर्णित ऑर्थोटोपिक मॉडल इम्यूनोसक्षम चूहों के अग्न्याशय में सिंजेनिक पीडीएसी कोशिकाओं के इंजेक्शन की अनुमति देता है। यह जंगली प्रकार या उत्परिवर्ती चूहों के बड़े साथियों में किया जा सकता है, और इस प्रकार चिकित्सीय एजेंटों की तुलना के लिए एक लागत प्रभावी और सुसंगत मॉडल प्रदान करता है। महत्वपूर्ण बात, ऑर्थोटोपिक मॉडल ट्यूमर सेल विकास और हमारे हाथों में मेटास्टेसाइज के लिए कॉग्नेट माइक्रोएनवायरमेंट प्रदान करता है और अन्य4 चिकित्सकीय प्रासंगिक साइटों (जैसे, यकृत) के लिए, यह चमड़े के नीचे या रासायनिक रूप से प्रेरित मॉडलों की तुलना में अधिक चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक बनाता है। ऑर्थोटोपिक ट्यूमर पीडीएसी की प्रमुख विशेषताओं को प्रदर्शित करते हैं, जैसे कि फाइब्रोब्लास्ट और एक्स्ट्रासेलुलर मैट्रिक्स जमाव5की बहुतायत के साथ एक मजबूत डेस्मोप्लास्टिक प्रतिक्रिया। पीडीएसी के ट्रांसजेनिक मॉडल मूत्र मॉडल के सोने के मानक हैं और सबसे अधिक उपयोग किया जाने वाला केपीसी मॉडल है, जो अग्न्याशय-विशिष्ट Pdx-1-क्रे प्रमोटर6के तहत उत्परिवर्ती KrasG12D/+ और Trp53R172H/+ को व्यक्त करता है । अतिरिक्त केपीसी और वीवो पीडीएसी मॉडल में अन्य की समीक्षा यहां7. केपीसी चूहों अनायास एक रोग प्रगति है कि ईमानदारी से मानव PDAC6की सुविधाओं को दोहराने के साथ अग्नाशय ट्यूमर विकसित । हालांकि, सभी ट्रांसजेनिक मॉडल के लिए, प्रजनन कार्यक्रम महंगा है, ट्यूमर प्रगति चर है और इसलिए अक्सर चूहों के बड़े साथियों की आवश्यकता होती है। पीडीएक्स मॉडल रोगी-व्युत्पन्न ट्यूमर कोशिकाओं या टुकड़ों का उपयोग करते हैं जो तब या तो ऑर्थोटोपिक रूप से या अधिक बार इम्यूनोसमझौता चूहों में चमड़े के नीचे उगाए जाते हैं। Xenograft मॉडल चिकित्सकीय यौगिकों की स्क्रीनिंग और रोगी विषमता के लिए खाते के लिए उपयोगी उपकरण प्रदान करते हैं। हालांकि, वे एक पूर्ण प्रतिरक्षा माइक्रोएनवायरमेंट प्रदान नहीं करते हैं, इस प्रकार उनके अनुप्रयोगों8,9को सीमित करते हैं।

एक बार स्थापित होने के बाद, ऑर्थोटोपिक ट्यूमर को बढ़ने में आम तौर पर लगभग 1 महीने या उससे अधिक समय लगता है (उपयोग की जाने वाली सेल लाइन के आधार पर) और बड़े ट्यूमर बनाते हैं जिन्हें प्रगति को ट्रैक करने और उपचार प्रभावकारिता4,5,10निर्धारित करने के लिए अल्ट्रासाउंड या एमआरआई द्वारा आसानी से चित्रित किया जा सकता है। हालांकि, एक बार घातीय विकास में, ट्यूमर के विकास का अंतिम चरण तेजी से हो सकता है, इसलिए अधिकांश उपचार आहार अपेक्षाकृत जल्दी शुरू किए जाते हैं (जैसे, 14 दिन)11,12। प्रतिरक्षा प्रणाली ट्यूमर के विकास में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है, जिसमें पीडीएसी शामिल है, जो टी कोशिकाओं की सापेक्ष कमी और माइलॉयड कोशिकाओं13की लगातार उपस्थिति के साथ घुसपैठ करने वाले इम्यूनोसप्रेसिव ट्यूमर की विशेषता है। पीडीएसी में टी कोशिकाओं की उच्च उपस्थिति एक बेहतर पूर्वानुमान14,15प्रदान करती है । हालांकि, एकल एजेंटों के रूप में, प्रतिरक्षा चेकपॉइंट अवरोधक जो टी सेल इम्यूनोदमन को राहत देते हैं, जैसे एंटी-सीटीएलए-416 और एंटी-पीडी-एल 117,ने पीडीएसी रोगियों में नैदानिक लाभ नहीं दिखाया है, सबसे अधिक संभावना है क्योंकि समग्र टी सेल प्रतिक्रियाशीलता बहुत कम है। हालांकि, एजेंटों कि इस तरह के विरोधी CD40 के रूप में प्रधानमंत्री टी सेल प्रतिक्रियाओं, विरोधी पीडी-L1/CTLA-4 प्रतिरोध18,19 और जीएम-सीएसएफ के साथ टीकाकरण-एलोजेनिक PDAC वैक्सीन (GVAX) पीडीएसी ट्यूमर20की इम्यूनोजेनिकिटी में वृद्धि कर सकते हैं, यह दर्शाता है कि टी सेल प्रतिक्रियाओं को बढ़ाने महत्वपूर्ण चिकित्सीय एवेंयू रूपों ।

एंटीट्यूमरल टी सेल प्रतिक्रिया के लिए महत्वपूर्ण टी-सेल रिसेप्टर (टीसीआर) के माध्यम से ट्यूमर-व्युत्पन्न एंटीजन की मान्यता और साइटोटॉक्सिक साइटोकिन्स और कणिकाओं के बाद के उत्पादन है। जबकि टी सेल एंटीजन-मान्यता टीसीआर अनुक्रमण द्वारा निर्धारित की जा सकती है, यह दृष्टिकोण महंगा और समय लेने वाला है। हालांकि, ट्यूमर घुसपैठ टी सेल सबसेट का परिमाणीकरण एक विरोधी ट्यूमर प्रतिक्रिया का एक अच्छा संकेत प्रदान करता है । डिग्रेनुशन, साइटोकाइन उत्पादन और अन्य साइटोटॉक्सिक कारकों के संदर्भ में टी सेल गतिविधि पूर्व वीवो की आगे की परीक्षा एक गहरी कार्यात्मक विश्लेषण प्रदान करती है। ये परख ताजा ट्यूमर के नमूनों पर किया जा सकता है और टी सेल समारोह के कई मापदंडों प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा तेजी से मापा जा सकता है।

सीडी8+ और सीडी 4+ टी कोशिकाएं एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया21को शक्तिशाली बनाने के लिए इस तरह के IFNο और TNFα का उत्पादन करती हैं । आईएफएन लक्ष्य कोशिकाओं पर एमएचसीआई अपरेगुलेशन को प्रेरित करता है, प्रतिरक्षा कोशिकाओं और एड्स सेल मौत के भेदभाव और भर्ती को प्रेरित करता है। सीडी 8+ टी कोशिकाओं द्वारा IFNο उत्पादन अच्छी तरह से एक एंटीट्यूमरल प्रतिक्रिया का हिस्सा है और ट्यूमर प्रतिगमन22,23के साथ सहसंबंधित है । TNFα सीडी 8+ और सीडी 4+ टी कोशिकाओं दोनों द्वारा उत्पादित एक और भड़काऊ साइटोकिन है। यह टीसीआर-निर्भर सक्रियण और टी कोशिकाओं के प्रसार को बढ़ाता है, जो ट्यूमर विरोधी प्रतिक्रिया को सहायता करता है। टीसीआर सगाई पर, साइटोटॉक्सिक सीडी 8+ टी कोशिकाएं डिग्रेनुशेशन से गुजर सकती हैं, जहां साइटोटॉक्सिक अणुओं वाले पूर्व-गठित गुप्त लिसोसोम्स को लक्ष्य-कोशिका क्षरण21का कारण बनने के लिए इम्यूनोलॉजिकल सिनैप्स में जारी किया जाता है। इन अणुओं में पेरफोइन शामिल है, एक प्रोटीन जो लक्ष्य कोशिका झिल्ली को बांधता है, छिद्रों का निर्माण करता है जो तब झिल्ली अखंडता को बाधित करता है और अन्य साइटोटॉक्सिक अणुओं में से24 कोप्रसार की अनुमति देता है, जैसे कि ग्रैनज़िम बी, सीधे लक्ष्य कोशिका के साइटोप्लाज्म में। ग्रैनज़ीम बी एक प्रोटीज़ है जो लक्ष्य कोशिका के भीतर कई प्रोटीन के क्षरण को अधिनियमित करता है, जिससे सेल डेथ21हो जाती है। ऐसे अणुओं की रिहाई के लिए कोशिका की सतह पर एंडोसोम के बहिर्वेस की आवश्यकता होती है, जहां एंडोसोमल मार्कर सीडी107a (जिसे लैंप-1 के रूप में भी जाना जाता है) को कोशिका झिल्ली25में क्षणिक रूप से शामिल किया जाता है।

टी कोशिकाओं द्वारा साइटोकिन स्राव की माप या तो प्रवाह की सहायता से सेल छंटाई या मनका आधारित जुदाई परख, जो आसानी से नमूनों की बड़ी संख्या पर एक साथ प्रदर्शन नहीं किया जा सकता द्वारा उनके अलगाव की आवश्यकता है । हालांकि, इंट्रासेलर साइटोकिन्स की माप के लिए किसी भी पूर्व-अलगाव चरणों की आवश्यकता नहीं होती है और एक समय में कई नमूनों पर आसानी से किया जा सकता है, जिससे उच्च-थ्रूपुट दृष्टिकोण की अनुमति मिलती है। चूंकि साइटोकिन्स टी कोशिकाओं द्वारा तेजी से स्रावित होते हैं, इंट्रासेलर स्तर अज्ञेय हो सकते हैं और इस प्रकार टी सेल को बेसल साइटोकिन उत्पादन बढ़ाने के लिए उत्तेजना की आवश्यकता होती है। एंटीजन संचालित साइटोकिन उत्पादन का आकलन करने के लिए, टीसीआर द्वारा मान्यता प्राप्त एंटीजन को विट्रो में एक प्राइमेड एपीसी द्वारा टी सेल में प्रस्तुत किया जाना चाहिए। ऐसे मामलों में जहां एंटीजन विशिष्टता ज्ञात नहीं है, एक व्यापक उत्तेजना दृष्टिकोण की आवश्यकता होती है। टीसीआर उत्तेजना विरोधी सीडी 3/28 मोतियों का उपयोग करके नकल की जा सकती है जो टीसीआर सक्रियण और कॉस्टिमुलेशन दोनों प्रदान करते हैं, जो साइटोकिन उत्पादन और प्रसार को प्रेरित करता है । हालांकि, एक अधिक लागत प्रभावी विकल्प पीएमए और आयनोमाइसिन का उपयोग है, जो एक साथ मोटे तौर पर सिग्नलिंग रास्तों को सक्रिय करता है जो संश्लेषण और इंट्रासेलर साइटोकिन्स की रिहाई का कारण बनते हैं। विशेष रूप से, पीएमए प्रोटीन किनेज सी (पीकेसी) को सक्रिय करता है और आयनमाइसिन इंट्रासेलर सीए2 + आयनों को उठाता है, जिससे सेल सिग्नलिंग में वृद्धि होती है। साइटोकिन्स की इंट्रासेलर सामग्री को संरक्षित करने के लिए, इस उत्तेजना को प्रभावी ढंग से प्रोटीन-परिवहन अवरोधक ब्रेफेल्डिन ए और मोनेसिन के साथ जोड़ा जा सकता है, जो गोलगी में प्रोटीन को अवरुद्ध करते हैं और इस प्रकार एक्स्ट्रासेलुलर रिलीज को रोकते हैं। पीएमए/आयनमाइसिन का उपयोग टी कोशिकाओं को उत्तेजित करने के लिए एक सुस्थापित विधि है और एक्सट्रासेलुलर-रिलीज और इंट्रासेलर साइटोकिंस26के बीच एक मजबूत संबंध है । पीएमए और आयनमाइसिन के साथ टी कोशिकाओं की उत्तेजना भी कोशिका झिल्ली के लिए lysosome तस्करी बढ़ जाती है और इस तरह CD107a सेल में पुनर्नवीनीकरण होने से पहले सेल की सतह पर क्षणिक रूप से एकीकृत हो जाता है । उत्तेजना के दौरान एक एंटी-सीडी107a एंटीबॉडी को शामिल करके, इसे डिग्रेनुलेशन गतिविधि25के मार्कर के रूप में उपयोग करना संभव है।

यह विधि ट्यूमर को एक एकल-कोशिका निलंबन प्रदान करने के लिए तेजी से पचाती है। इस बिंदु पर, व्यक्तिगत आबादी सीधे प्रवाह साइटोमेट्री के लिए दाग या डाउनस्ट्रीम तरीकों से शुद्ध किया जा सकता है: प्रवाह की सहायता से सेल छंटाई या चुंबकीय मनका जुदाई । प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए एकल-सेल निलंबन की तैयारी कई प्रतिरक्षा कोशिका आबादी और उनके फेनोटाइपिक मार्कर के उच्च-थ्रूपुट विश्लेषण की अनुमति देती है, जो प्रतिरक्षा सेल संख्या और फेनोटाइप का सटीक मात्रा प्रदान करती है।

अंत में, यहां वर्णित पाचन प्रोटोकॉल सेल-सतह मार्कर हानि को रोकता है और प्रतिरक्षा कोशिका व्यवहार्यता को बनाए रखता है, जिससे प्रतिरक्षा कोशिकाओं को आवश्यकतानुसार आगे कोशिका शुद्धि चरणों और संस्कृति से गुजरना पड़ता है। हालांकि, इस विधि को इस पाचन से एपिथेलियल कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए परीक्षण नहीं किया गया है।

Protocol

ऑर्थोटोपिक अग्नाशय ट्यूमर के रूप में पहले ब्रिटेन के गृह कार्यालय पशु और वैज्ञानिक प्रक्रिया अधिनियम १९८६ और यूरोपीय निर्देश 2010/63/यूरोपीय संघ के अनुसार10 वर्णित उत्पन्न किया गया । सभी चूहों को दर्द या पीड़ा के संकेतों के लिए पेरिऑपरेटिव रूप से निगरानी की गई थी, जिसमें वजन घटाने तक सीमित नहीं था (> 72 घंटे में 15%या किसी भी अवधि में 20%), पिलोइरिटेशन, आंखों को संकुचित करना, उठाया गया चाल, कूबड़ उपस्थिति, साथ ही रक्तस्राव, लालिमा और छालों सहित घाव संक्रमण के लक्षणभी शामिल थे। ट्यूमर के विकास टटोलना द्वारा निगरानी की गई थी, और अतिरिक्त नैदानिक संकेत जैसे परिश्रम श्वास, पीलिया और ठंडे हाथ-पैरों पर भी नजर रखी गई ताकि यह आकलन किया जा सके कि एंडपॉइंट के संकेत पहुंच गए थे या नहीं। सभी प्रक्रियाओं को बाँझ परिस्थितियों में किया जाना चाहिए। साइटोमेट्री धुंधला प्रवाह से पहले इस्तेमाल किए जाने वाले सभी अभिकर्मकों को बाँझ परिस्थितियों में तैयार किया जाना चाहिए।

1. इंजेक्शन के लिए ट्यूमर कोशिकाओं की तैयारी

  1. -20 डिग्री सेल्सियस से बेसमेंट झिल्ली का एक बहाना लें और रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर बर्फ पर रखें।
    नोट: तहखाने झिल्ली एकाग्रता बैच से बैच के लिए भिन्न हो सकते हैं; इसलिए, प्रजनन क्षमता सुनिश्चित करने के लिए वीवो में बहुत विशिष्ट तहखाने झिल्ली बैचों का परीक्षण किया जाना चाहिए। बेसमेंट झिल्ली का एक नया बैच रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर बर्फ पर गल जाता है फिर बर्फ पर उपयोगकर्ता-परिभाषित एलिकोट्स में, बर्फ पर, और फिर आवश्यकता होने तक -20 डिग्री सेल्सियस में आगे संग्रहीत किया जाता है। यह तहखाने झिल्ली का उपयोग करते समय पाइपिंग और फ्रीज-विगलन को कम करता है।
    1. ठंडा करने के लिए रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर बाँझ पीबीएस रखें।
    2. ठंडा करने के लिए रात भर -20 डिग्री सेल्सियस पर बाँझ 200 माइक्रोन और 1000 माइक्रोन पिपेट टिप्स रखें।
  2. ट्यूमर कोशिकाओं का उपयोग करें जो माइकोप्लाज्मा मुक्त हैं, कम से कम 2-10 मार्ग के बाद विगलन और फसल से पहले विकास के लॉग-चरण में उगाए जाते हैं। यह प्रोटोकॉल महिला मूत्र C57BL/6 KPC-व्युत्पन्न सेल लाइन का उपयोग करता है: TB32048 डेविड Tuveson की प्रयोगशाला द्वारा एक उदार उपहार के रूप में प्रदान की ।
    1. जब फसल के लिए ट्यूमर कोशिकाओं की आवश्यकता होती है, तो पीबीएस (37 डिग्री सेल्सियस तक पूर्व गर्म) में फ्लास्क और धोने वाली कोशिकाओं से मध्यम को हटा दें।
    2. 37 डिग्री सेल्सियस (T175 फ्लास्क करने के लिए, 5 मिलीएल) पर 10 मिन के लिए फ्लास्क में 2x ट्रिप्सिन (पूर्व-गरम से 37 डिग्री सेल्सियस) जोड़ें।
    3. 10 min के बाद, फ्लास्क को धीरे-धीरे टैप करके और मध्यम में अच्छी तरह से निलंबित करके फ्लास्क और अलग कोशिकाओं में पूर्ण माध्यम (10% एफबीएस, 1x पेनिसिलिन, डीएमईएम में 1x स्ट्रेप्टोमाइसिन) की बराबर मात्रा जोड़ें।
    4. कोशिकाओं को एक ट्यूब में स्थानांतरित करें और 300 x ग्राम और कमरे के तापमान (आरटी) पर 5 न्यूनतम के लिए अपकेंद्री रखें।
    5. सेल गिनती के लिए पूर्ण माध्यम में अधिनेता और पुनर्निलंबित कोशिकाओं को हटा दें।
    6. 300 x g और आरटी पर 5 मिन के लिए फिर से अपकेंद्रित्र कोशिकाओं, और supernatant हटा दें।
    7. 1x106 कोशिकाओं/mL की एकाग्रता प्राप्त करने के लिए पूर्व ठंडा पीबीएस में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें ।
      नोट: यह स्टॉक एकाग्रता 5 μl में 1000 कोशिकाओं की अंतिम इंजेक्शन एकाग्रता प्राप्त करने के लिए तैयार है। हमें कम इंजेक्शन की मात्रा में कम संख्या में कोशिकाओं का इंजेक्शन मिला सेल रिसाव को कम किया गया और इसलिए प्रजनन क्षमता में वृद्धि हुई है, ट्यूमर विकास सेल-लाइन निर्भर हो सकता है इसलिए उपयोगकर्ताओं को प्रत्येक सेल लाइन का अनुकूलन करना चाहिए।
  3. इसके साथ, एक पूर्व-aliquoted तहखाने झिल्ली aliquot, बर्फ पर, हुड में जगह है ।
    1. इंजेक्शन के लिए तैयार पीबीएस में बेसमेंट झिल्ली, पीबीएस और ट्यूमर कोशिकाओं के अंतिम समाधान का अनुपात 5:3:2 है। इसलिए तहखाने झिल्ली के 500 माइक्रोन एलिकोट में पूर्व-ठंडा 1000 माइक्रोन पिपेट टिप का उपयोग करके पूर्व-ठंडा पीबीएस के 300 माइक्रोन जोड़ें।
    2. पाइपिंग को कम करने के लिए पीबीएस को सीधे बेसमेंट झिल्ली एलिकोट में जोड़ें।
    3. पी1000 सेट को 300 माइक्रोन तक रखें और पीबीएस और बेसमेंट झिल्ली को फिर से निलंबित करें, जिससे तरल राज्य में तहखाने झिल्ली को संरक्षित करने के लिए बर्फ पर ट्यूब रखना सुनिश्चित हो सके।
    4. जब p1000 टिप से सभी तहखाने झिल्ली बेदखल समाप्त हो गया, ट्यूब में टिप छोड़ किसी भी तहखाने झिल्ली/
    5. 5-10 किमी के बाद, p1000 टिप से अधिक तहखाने झिल्ली को वापस ट्यूब में निकालें और बर्फ पर बैठने के लिए ट्यूब छोड़ दें।
  4. पीबीएस में पुनः निलंबित ट्यूमर कोशिकाओं के 200 μL ले लो और एक पूर्व ठंडा 200 μL पिपेट टिप का उपयोग कर तहखाने झिल्ली में सीधे जोड़ें।
    1. एक ताजा पूर्व ठंडा p1000 पिपेट टिप ले लो, 300 μL पर पिपेट सेट और 30-40 बार फिर से निलंबित। एक बड़ा पिपेट टिप, कम मात्रा पर सेट, बेहतर है क्योंकि तहखाने झिल्ली टिप की यात्रा कर सकती है और पुनर्निलंबन के दौरान पिपेट टिप फिल्टर को छू सकती है।
    2. ट्यूमर कोशिकाएं इंजेक्शन के लिए तैयार हैं। सर्जरी के दौरान बर्फ पर ट्यूमर सेल/बेसमेंट झिल्ली रखें।

2. ट्यूमर कोशिकाओं का ऑर्थोटोपिक इंजेक्शन

  1. 7 दिनों के लिए पशु सुविधा में चूहों को acclimate।
    1. सर्जरी से पहले लगभग 2 घंटे, पेट और पीठ के बाएं हाथ की ओर दाढ़ी, तो गर्दन के स्क्रफ के तहत पूर्व ऑपरेटिव एनाल्जेसिक चमड़े का प्रशासन (50-100 μg/kg पर Buprenorphine) ।
    2. सर्जिकल क्षेत्र तैयार करें, एक गर्मी चटाई के साथ पर माउस बिछाने और आसपास के उपकरणों के लिए और माउस पर पर्दे । सभी सर्जिकल उपकरणों को स्टरलाइज करें; प्रत्येक माउस के लिए उपकरणों के पर्याप्त सेट तैयार करें।
    3. माउस को बेहोश होने तक ओ2 कक्ष के साथ 5% आइसोफ्लोरीन में रखें।
    4. माउस को स्थानांतरित करें, एक गर्मी की चटाई पर, अपनी पीठ पर झूठ बोलना और मास्क का उपयोग करके संज्ञाहरण बनाए रखें, आमतौर पर कम 2-3% आइसोफ्लोरीन पर।
    5. गहरे संज्ञाहरण की पुष्टि करें; के रूप में पेडल वापसी पलटा के नुकसान से पहचान की जब हिंद पंजा चुटकी है और निगरानी श्वास दर स्थिर रहता है ।
    6. शरीर को ड्रेप में ढक कर रखें, जिसमें केवल मुंडा हुआ हिस्सा उजागर होता है। सुनिश्चित करें कि माउस संज्ञाहरण मुखौटा में सुरक्षित रूप से है।
    7. एक बाँझ कपास कली का उपयोग करना, मुंडा क्षेत्र पर एक परिपत्र गति में आयोडीन समाधान जोड़ें: केंद्र से शुरू और किनारे करने के लिए बाहर चक्कर । ताजा कपास कली और आयोडीन के साथ फिर से प्रक्रिया दोहराएं।
  2. अग्न्याशय/तिल्ली स्थान (ऊपरी-बाएं चतुर्भुज) के ऊपर सीधे 1 सेमी चीरा बनाने के लिए स्केलपेल का उपयोग करें। बाँझ कैंची भी चीरा बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, अगर पसंद किया ।
    1. संदंश का उपयोग करके त्वचा को अलग खींचें। नए संदंश के साथ, पेरिटोनियल दीवार का पता लगाएं और पेरिटोनियल दीवार के माध्यम से एक और 1 सेमी चीरा बनाने के लिए कैंची का उपयोग करें।
    2. संदंश की दूसरी जोड़ी का उपयोग करशरीर से, तिल्ली के साथ आ सकता है, जो अग्न्याशय निकालें।
    3. धीरे ट्यूमर कोशिकाओं की शीशी उलटा/
    4. 5 माइक्रोन के साथ ग्लास सिरिंज तैयार करें जिसमें तहखाने झिल्ली में 1,000 ट्यूमर कोशिकाएं होती हैं और इसे गर्म करने की अनुमति देने के लिए कुछ सेकंड के लिए हीट चटाई पर रखें।
      नोट: सिरिंज के संक्षिप्त वार्मिंग तहखाने झिल्ली जमना शुरू करने के लिए अनुमति देगा, ताकि यह आसान लीक के बिना सुई करने के लिए बनाने के लिए । हालांकि, यह संक्षिप्त रखा जाना चाहिए, अगर बहुत लंबे समय तक छोड़ दिया तहखाने झिल्ली पूरी तरह से जमना होगा और इंजेक्शन नहीं किया जाएगा । कांच की सिरिंज का उपयोग कम मात्रा को ठीक से इंजेक्ट करने की अनुमति देता है।
    5. इसे विस्तारित करने के लिए पूंछ पर अग्न्याशय को पकड़ें और दिखाई देने वाली रक्त वाहिकाओं से बचने के प्रयास के साथ अग्न्याशय के समानांतर, सीधे अग्न्याशय के केंद्र में सुई डालें।
      नोट: अग्न्याशय के केंद्र में एक बड़ा क्षेत्र है और इंजेक्शन लगाना सबसे आसान है। हालांकि, अग्न्याशय के सिर या पूंछ को भी विशेष रूप से इंजेक्ट किया जा सकता है यदि पसंद किया जाता है।
    6. धीरे-धीरे अग्न्याशय में तहखाने झिल्ली के 5 μL इंजेक्ट और इंजेक्शन के बाद कम से कम 30 एस के लिए अग्न्याशय में स्थिर सुई पकड़ तहखाने झिल्ली जमना और लीक को रोकने के लिए अनुमति देने के लिए। तहखाने झिल्ली एक छोटे से स्पष्ट बुलबुले का गठन किया जाएगा के रूप में दिखाई देना चाहिए; हालांकि, यह दिखाई नहीं दे सकता है।
      नोट: ट्यूमर कोशिकाओं की बड़ी मात्रा/तहखाने झिल्ली इंजेक्शन किया जा सकता है; हालांकि, रिसाव न होने के लिए सटीक मात्रा का परीक्षण किया जाना चाहिए।
    7. अग्न्याशय से सुई निकालें और कोई रक्तस्राव नहीं हुआ है की पुष्टि करने के लिए प्रतीक्षा करें। धीरे-धीरे अग्न्याशय को पेट की गुहा में वापस डालें, जिससे तहखाने झिल्ली बुलबुले को छूने के लिए ध्यान न दिया जा सके।
    8. पेरिटोनियल दीवार को एक साथ खींचें और जरूरत पड़ने पर एक ही सीवन, या दो बाधित टांके करें।
    9. त्वचा चीरा के दो पक्षों को एक साथ खींचें और जरूरत के रूप में कई बाधित टांके प्रदर्शन या दो सर्जिकल क्लिप डालें।
  3. स्क्रफ में बुप्रेनोरफिन का एक और चमड़े के नीचे इंजेक्शन प्रशासन।
    1. माउस को एक ताजा पिंजरे में वापस स्थानांतरित करने से पहले शरीर के तापमान को बनाए रखने के लिए सर्जरी के बाद कम से कम 30 न्यूनतम के लिए एक गर्म 37 डिग्री सेल्सियस पिंजरे में स्थानांतरित करें।
    2. रिहाइड्रेशन और शरीर के वजन को सुनिश्चित करने के लिए, पिंजरे में उपलब्ध एक मैश आहार तैयार करें।
    3. अनुशंसित के रूप में पोस्ट-ऑपरेटिव एनालजेसिया को फिर से प्रशासित करें और घाव खोलने, दर्द या संक्रमण और वजन घटाने के संकेतों के लिए बारीकी से देखें। यदि सर्जिकल क्लिप का उपयोग कर रहे हैं, तो इन्हें 7-10 दिनों बाद क्लिप रिमूवर का उपयोग करके हटाया जा सकता है।
    4. लगभग 14 दिनों के बाद निशान ऊतक पेट को टटोलना शुरू करने के लिए पर्याप्त रूप से ठीक हो जाएगा। चूहों के अंत बिंदु तक पहुंचने तक टटोलने के माध्यम से ट्यूमर के आकार की बारीकी से निगरानी करें।
    5. अंत बिंदु पर माउस को गर्भाशय ग्रीवा के स्थान के माध्यम से मारी जाती है जिसके बाद डेपुटेशन होता है। त्वचा और पेरिटोनियल गुहा कैंची का उपयोग कर खोला जाता है और अग्न्याशय ट्यूमर ट्यूमर को पकड़ने के लिए संदंश का उपयोग करके उत्पादित किया जाता है, और आसपास के ऊतकों को हटाने के लिए कैंची।

3. अग्नाशय के ट्यूमर का पाचन

  1. विच्छेदित अग्नाशय ट्यूमर, मेटास्टैटिक साइट ट्यूमर, या बर्फ-ठंडे पीबीएस में स्वस्थ अग्नाशय के ऊतकों को रखें, और बर्फ पर स्टोर करें।
    1. पेट्री डिश पर ट्यूमर को स्थानांतरित करने के लिए संदंश का उपयोग करें।
    2. पाचन माध्यम के 5.0 मिलीग्राम जोड़ें (2 मिलीग्राम/mL कोलेजेनेज़, 0.025 मिलीग्राम/mL DNase RPMI) एक 50 मिलीग्राम ट्यूब में; शुरू होने वाली एंजाइम गतिविधि को रोकने के लिए बर्फ पर स्टोर करें।
      नोट: यह प्रोटोकॉल कोलेजेनेज टाइप वी का उपयोग करता है, जिसमें ‧1 इकाइयों/एमजी फागपा और > 125 कोलेजन पाचन इकाइयों (सीडीयू)/एमजी ठोस की गतिविधि है। कोलेजेनेज और DNase aliquots -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है और उपयोग से पहले बर्फ पर गल सकता है। जब दोनों बाँझ RPMI में पूरी तरह से घुलनशील हैं, वे संदूषकों को दूर करने के लिए एक 0.2 μm फिल्टर के माध्यम से पारित किया जा सकता है । सामग्री के नुकसान से बचने के लिए फ़िल्टर करने से पहले कोलेजेनेस को पूरी तरह से घुलना चाहिए।
    3. पेट्री डिश पर ट्यूमर को कवर करने के लिए इस समाधान का एक छोटा सा aliquot लें।
    4. छोटे टुकड़ों में ट्यूमर को काटने के लिए बाँझ स्केलपेल और संदंश का उपयोग करें, लगभग लंबाई में 3 मिमी से कम।
    5. ट्यूमर के टुकड़ों को ट्यूब में परिमार्जन करें और धीरे-धीरे ट्यूब को उलटें जब तक कि सभी टुकड़े पाचन मीडिया में डूबे न हों। बर्फ पर स्टोर अगर अन्य ट्यूमर के नमूनों को एक बैच में तैयार करने की जरूरत है।
    6. 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिन के लिए एक मिलाते हुए डिवाइस पर स्थानांतरण। सुनिश्चित करें कि ट्यूमर के सभी टुकड़े जलमग्न हैं और ट्यूब के किनारे पर अटके नहीं हैं। यदि मिलाते हुए संभव नहीं है, तो पाचन सहायता के लिए हर 5 मिन का नमूना भंवर।

4. पचा ट्यूमर से एकल सेल निलंबन की तैयारी

  1. पाचन कदम के तुरंत बाद, ट्यूब को धीमी गति से एंजाइम गतिविधि करने के लिए बर्फ पर रखें।
    1. 20 mM की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए EDTA जोड़ें और मिश्रण करने के लिए संक्षेप में भंवर नमूना। इससे एंजाइम एक्टिविटी और धीमी होगी।
    2. ट्यूब खोलें और ताजा RPMI माध्यम के साथ ट्यूब के ढक्कन से पचाने किसी भी ट्यूमर कुल्ला।
    3. बर्फ पर 50 मिलीआर खुली ट्यूब पर 70 माइक्रोन छलनी (छलनी के माइक्रोन आकार को वांछित के रूप में बदला जा सकता है) तैयार करें।
    4. फिल्टर को मीडियम से प्री-वेट करें।
    5. पचाने वाली कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और 25 मिलील स्ट्राइकेट या उससे बड़े का उपयोग करके ट्यूब के किनारों को धोएं। स्ट्रिपलेट का व्यापक उद्घाटन मोटी डाइजेस्ट को आसानी से पारित करने की अनुमति देने के लिए महत्वपूर्ण है।
    6. छन्नी पर 25 मिलीआर स्ट्राइकेट का उपयोग करके, सभी डाइजेस्ट को स्थानांतरित करें।
    7. 1 मिलीजर सिरिंज प्लंजर का उपयोग करके ट्यूमर को फिल्टर के शीर्ष पर मैश करें। कोशिकाओं को कतरनी तनाव को कम करने के लिए केवल सीधे ऊपर और नीचे मैश करें।
    8. लगातार आरपीएमआई के साथ छलनी के माध्यम से कोशिकाओं को धोएं। कोशिकाओं को पुश करने के लिए पर्याप्त बल के साथ धोना सुनिश्चित करें।
    9. यदि अभी भी मैश करने के लिए सामग्री है, लेकिन आरपीएमआई के माध्यम से फ्लशिंग बंद हो जाता है, छलनी संतृप्त हो जाएगा । इसलिए, नमूने को एक नए फ़िल्टर में स्थानांतरित करें और जारी रखें।
      नोट: अंततः केवल अतिरिक्त मैट्रिक्स घटक फिल्टर में रहेंगे, सभी एकल कोशिकाओं के माध्यम से पारित किया जाना चाहिए था ।
  2. 300 x जी और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए ट्यूब को सेंट्रलाइज करें।
    1. ध्यान से पूर्ण RPMI में सेल गोली को फिर से निलंबित करें और किसी भी एक्स्ट्रासेलुलर मैट्रिक्स या बड़े सेल झुरमुट ों को हटाने के लिए सीधे किसी अन्य फ़िल्टर के माध्यम से गुजरें जिसे पर्याप्त रूप से निलंबित नहीं किया जा सकता है।
    2. इस बिंदु पर, यदि कोई उत्तेजना की आवश्यकता नहीं है, तो तुरंत चरण 6.1 पर लंघन करके प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए अलग कोशिकाओं को दाग दें। वैकल्पिक रूप से, उन्हें फ्रीजिंग मीडियम (एफबीएस में 10% डीएमएसओ) में फिर से निलंबित करें और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें और इसके बाद तरल नाइट्रोजन में दीर्घकालिक भंडारण करें।
      नोट: ठंड कदम बाद की तारीख में प्रतिरक्षा कोशिकाओं की शुद्धि की अनुमति दे सकता है; हालांकि, प्रतिरक्षा कोशिका सबसेट के परिमाणीकरण के लिए अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है पुष्टि करने के लिए कि सेल संख्या और फेनोटाइप फ्रीज/गल प्रक्रिया से प्रभावित नहीं है । पूर्व वीवो टी सेल उत्तेजना ताजा ट्यूमर के नमूनों पर सबसे अच्छा प्रदर्शन किया जाता है। इस बिंदु पर नमूना आगे bead आधारित मृत सेल हटाने या प्रतिरक्षा सेल संवर्धन परख अगर जरूरत द्वारा शुद्ध किया जा सकता है ।

5. पूर्व वीवो उत्तेजना के लिए कोशिकाओं की तैयारी

  1. पूर्ण माध्यम में 2 x 106/100 μL की एकाग्रता प्राप्त करने के लिए कोशिकाओं की गणना करें (आरपीएमआई 10% एफबीएस, 1X पेनिसिलिन और 1X स्ट्रेप्टोमाइसिन)।
    नोट: चढ़ाया कुल कोशिकाओं की उच्च संख्या सुनिश्चित करता है कि इस नमूने के भीतर पर्याप्त टी कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए होगा । हालांकि, नमूना उपलब्धता और ब्याज के टी-सेल सबसेट की दुर्लभ प्रकृति के आधार पर संख्या को ऊपर या नीचे बढ़ाया जा सकता है।
    1. एक यू-तली 96-अच्छी प्लेट में कोशिकाओं की प्लेट 100 माइक्रोन।
    2. पूर्ण माध्यम के 100 μL जोड़ें जिसमें पीएमए/आयनोमाइसिन की 2x तैयारी (निर्माता द्वारा अनुशंसित क्रमशः अंतिम एकाग्रता 0.081 माइक्रोन और 1.34 माइक्रोन प्राप्त करने के लिए) ।
      नोट: यदि degranulation/exocytosis को मापने, यहां भी शामिल है एक फ्लोरोसेंटी विरोधी माउस CD107a मीडिया में । एक नियंत्रण नमूना जिसमें CD107a नहीं होता है, भी किया जाना चाहिए।
    3. 1 घंटे के लिए 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें।
    4. पूरी मीडिया में क्रमशः (निर्माता द्वारा अनुशंसित) अंतिम एकाग्रता 1.06 माइक्रोन और 2.0 माइक्रोन प्राप्त करने के लिए ब्रेफेल्डिन ए और मोनेसिन (अंतिम एकाग्रता 1.06 माइक्रोन और 2.0 माइक्रोन प्राप्त करने के लिए) की 10x तैयारी के 20 माइक्रोन जोड़ें।
      नोट: ब्रेफेलिन ए और मोनोनसिन प्रोटीन परिवहन अवरोधक हैं और इस प्रकार साइटोकिन्स की बाह्य रिहाई को अवरुद्ध करते हैं, आदि प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा उनके पहचानने की अनुमति देते हैं। यदि एलिसा या इसी तरह के तरीकों से सुपरनेटेंट में साइटोकिन रिलीज को मापने - तो इस कदम को छोड़ दिया जा सकता है।
    5. प्लेट को आगे 4 घंटे के लिए 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें।

6. प्रवाह साइटोमेट्री के लिए एक्स्ट्रासेलुलर और इंट्रासेल्युलर धुंधला

  1. प्लेट निकालें और बर्फ पर रखी वी-तली प्लेट में सभी सामग्री को स्थानांतरित करने के लिए प्रत्येक कुएं को फिर से निलंबित करें।
    नोट: एपिथेलियल कोशिकाओं, मैक्रोफेज और अन्य अनुयायी कोशिकाओं को फिर से निलंबित करके पूरी तरह से प्राप्त नहीं किया जा सकता है। हालांकि डाउनस्ट्रीम विश्लेषण केवल टी कोशिकाओं पर है, यह कोई समस्या नहीं है।
    1. 6.1.1 300 x ग्राम और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए प्लेट को अपकेंद्रित करें (बाद के चरणों के लिए इन शर्तों का उपयोग करें जब तक कि कहा न जाए)।
    2. एक तेज आंदोलन में प्लेट को उल्टा करके अधिनेत को हटा दें।
  2. बर्फ-ठंडा पीबीएस में तैयार एक स्थिर व्यवहार्यता रंग के 50 माइक्रोन में फिर से निलंबित करें। फिर से निलंबित करते समय, बुलबुले बनाने से बचने के लिए पिपेट को कम मात्रा में सेट करें।
    1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिन के लिए इनक्यूबेट, अंधेरे में।
    2. वॉश स्टेप: 100 माइक्रोन ऑफ एफएसीएस बफर, सेंट्रलाइज जोड़ें और सुपरनेटेंट को हटा दें।
  3. प्रत्येक कुएं को एंटी-सीडी16/सीडी32 (2.5 μg/mL) के 50 माइक्रोन के साथ एफएसीएस बफर (0.5% बीएसए, पीबीएस में 2.0 मीटर ईटीए) के साथ निलंबित करें ताकि एफसी रिसेप्टर्स को एंटीबॉडी का पता लगाने के गैर-विशिष्ट बाध्यकारी को अवरुद्ध किया जा सके।
    1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिन के लिए इनक्यूबेट, अंधेरे में।
  4. प्रत्येक अच्छी तरह से फ्लोरोक्रोम-कॉन्जुगेल्ड एंटी-माउस सीडी45, सीडी 3, सीडी 4 और सीडी 8 (आगे एक्स्ट्रासेलुलर मार्कर के रूप में जोड़ा जा सकता है) FACS बफर में एक 2x मास्टरमिक्स में सीधे जोड़ें।
    1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिन के लिए इनक्यूबेट, अंधेरे में।
    2. वॉश स्टेप: 100 माइक्रोन ऑफ एफएसीएस बफर, सेंट्रलाइज जोड़ें और सुपरनेटेंट को हटा दें।
  5. 1x इंट्रासेलर (आईसी) फिक्सेशन बफर के 100 माइक्रोन जोड़ें और अंधेरे में आरटी में 30 सीन के लिए इनक्यूबेट करें।
    1. आरटी में अपकेंद्री तैयार करें।
  6. FACS बफर के 100 μL जोड़ें, 300 x ग्राम और आरटी पर 5 मिन के लिए अपकेंद्री और supernatant हटा दें। 300 x ग्रामपर 5 मिन के लिए 1x परमीबिलाइजेशन बफर और सेंट्रलाइज के साथ दोहराएं ; इसके बाद अधिवत्थान को हटा दें।
  7. फ्लोरोक्रोम-कॉन्जुर्बेड एंटी-माउस IFNο, TNFα, और 1x permeabilization बफर में तैयार अन्य इंट्रासेल्युलर मार्कर के 1x मास्टरमिक्स के 50 μL जोड़ें।
    1. आर टी में 1 एच के लिए इनक्यूबेट, अंधेरे में ।
    2. धोने के लिए परमीबिलाइजेशन बफर के 100 माइक्रोन जोड़ें। फिर 300 x जी और आरटी पर 5 मिन के लिए अपकेंद्रित्र और अतिशयोक्ति को हटा दें।
    3. धोने के लिए FACS बफर के 100 μL जोड़ें, 300 x ग्राम और आरटी पर 5 मिन के लिए अपकेंद्री और supernatant हटा दें।
  8. इस अंतिम केंद्रीकरण के बाद, प्रवाह साइटोमीटर के लिए संगत मात्रा में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। यह FACS ट्यूबों के आकार के आधार पर भिन्न हो सकता है।
    1. अधिग्रहण के लिए उपयुक्त FACS ट्यूबों में इस मात्रा हस्तांतरण।
    2. फ्रिज में प्रकाश और स्टोर से कवर और 24 घंटे के भीतर नमूने प्राप्त करते हैं ।

Representative Results

अग्न्याशय में 1000 TB32048 कोशिकाओं को इंजेक्शन लगाने के बाद, ऑर्थोटोपिक ट्यूमर को विकसित होने में लगभग 30 दिन लगते हैं(चित्रा 1ए, बी)। सर्जरी के दौरान बेसमेंट झिल्ली रिसाव बड़े ट्यूमर को सीधे पेरिटोनियल दीवार पर बना सकता है, जो त्वचा के माध्यम से प्रमुखता से दिखाई देते हैं(चित्रा 1सी)। हम इन चूहों को अध्ययन से निकालेंगे। हालांकि, अच्छे सर्जिकल कौशल के साथ रिसाव की घटनाओं को कम किया जाता है। एंडपॉइंट पर काटे गए ऑर्थोटोपिक ट्यूमर C57BL/6 जंगली प्रकार के चूहों(चित्रा 1डी)में पर्याप्त आकार तक बढ़ सकते हैं । काटा आर्थोटोपिक ट्यूमर एक एकल सेल निलंबन(चित्रा 2)प्राप्त करने के लिए 20 मेंस के लिए कोलेजेनेज/DNase में पाचन की आवश्यकता होती है । इस बिंदु पर, ट्यूमर से व्युत्पन्न कोशिकाओं को 2 x 106 कोशिकाओं/अच्छी तरह से यू-तली प्लेट में चढ़ाया जा सकता है। नमूने के भीतर टी कोशिकाओं की व्यापकता के आधार पर प्लेटकी गई कोशिकाओं की संख्या को बदला जा सकता है; यदि टी कोशिकाएं उच्च घनत्व पर हैं तो सेल संख्या को कम किया जा सकता है। तिल्ली या लिम्फ नोड नमूनों को नियंत्रित करें उत्तेजना के लिए इस बिंदु पर भी चढ़ाया जा सकता है। प्रत्येक अच्छी तरह से पीएमए और आयनोमाइसिन के साथ 5 घंटे के लिए प्रेरित किया जाता है और 1 घंटे ऊष्मायन के बाद, साइटोकिन्स(चित्रा 2)की बाह्यीय रिहाई को अवरुद्ध करने के लिए ब्रेफेल्डिन ए और मोनेसिन जोड़े जाते हैं। ऊष्मायन के बाद, नमूनों को प्रवाह साइटोमेट्री(चित्रा 2)द्वारा विश्लेषण के लिए बाह्य एपिटोप और इंट्रासेलुलर साइटोकिन्स के लिए दाग दिया जाता है।

चूहों से तिल्ली और ट्यूमर के नमूनों का विश्लेषण फ्लो साइटोमेट्री द्वारा किया गया । तिल्ली और ऑर्थोटोपिक ट्यूमर के लिए प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण में इस्तेमाल की जाने वाली गेटिंग रणनीति में एफएससी-ए, एसएससी-ए, एफएससी-ए/एफएससी-एच और एसएससी-ए/एसएससी-डब्ल्यू द्वारा डबल्स का उपयोग करके मलबे को शामिल नहीं किया गया है, फिर फिक्सेबल व्यवहार्यता रंग(चित्रा 3ए)के लिए सकारात्मक के रूप में मृत या अपोप्टेटिक कोशिकाएं शामिल हैं । प्रतिरक्षा कोशिकाओं को तब सीडी 45+के रूप में गेट किया जाता है, और टी कोशिकाओं को सीडी 3+ के रूप में आगे किया जाता है जिसमें से सीडी 4+ और सीडी 8+ सबसेट परिभाषित किए जाते हैं(चित्रा 3ए)। गेटिंग के लिए पृष्ठभूमि फ्लोरेसेंस निर्धारित करने के लिए एक फ्लोरेसेंस माइनस वन (एफएमओ) किया जाता है और साइटोकिन्स(चित्रा 3बी-डी)के बेसल उत्पादन का निर्धारण करने के लिए एक ब्रेफेलिन ए/मोनोसिन केवल नियंत्रण किया जाता है।

IFNο के लिए, brefeldin A/monensin के साथ ऊष्मायन दोनों तिल्ली और ट्यूमर के नमूनों में FMO नियंत्रण पर IFNο में कोई वृद्धि हुई । हालांकि, पीएमए और आयनमाइसिन के अलावा प्लीनिक और ट्यूमर-व्युत्पन्न सीडी 4+ और सीडी 8+ टी कोशिकाओं दोनों में इंट्रासेलर IFNa का पता लगाने योग्य के% में वृद्धि हुई।

एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग की जाने वाली प्लीनिक सीडी 4+ और सीडी 8+ टी कोशिकाओं में ट्यूमर-घुसपैठ टी सेल सबसेट की तुलना में अपेक्षाकृत अधिक IFNο उत्पादन होता है, जिसमें औसतन 6.60 ± 1.5% और 12.97 ± 3.4% की तुलना में 4.81 ± 1.0% और 4.13 ± 1.3% होता है, जो इम्यूनोसप्रेसन का संकेत देताहै। TNFα के लिए एक ही रणनीति का उपयोग करते हुए, हमने कल्पना की कि ट्यूमर-घुसपैठ सीडी 4+ टी कोशिकाओं (22.45 ± 5.4%) की तुलना में स्प्लिक सीडी 4+ टी कोशिकाओं का एक उच्च प्रतिशत इंट्रासेलर टीएनएफα (65.93 ± 2.3%) के लिए सकारात्मक है। प्लीनिक और ट्यूमर-घुसपैठ सीडी 8+ टी कोशिकाएं TNFα (25.15 ± 3.7% और 19.91 ± 5.1%, क्रमशः)(चित्रा 3सी, चित्रा 4बी)के समान स्तर का उत्पादन करती हैं।

अंत में, CD107a एक एंडोसोमल मार्कर है जो साइटोटॉक्सिक कणिकाओं और साइटोकिन्स के एक्सोसाइटोसिस के दौरान कोशिका सतह पर क्षणिक रूप से व्यक्त किया जाता है, जैसे कि इसका उपयोग साइटोटॉक्सिकिटी के लिए सरोगेट मार्कर के रूप में किया जाता है। उत्तेजना के दौरान CD107a के लिए धुंधला का लाभ यह है कि सभी क्षणिक कोशिका सतह व्यक्त CD107a फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी द्वारा कब्जा कर लिया जाएगा । CD107a के बेसल स्तर brefeldin A/monensin केवल इलाज कोशिकाओं में दिखाए जाते हैं । प्लीनिक सीडी 8+ टी कोशिकाओं के लिए, पीएमए के साथ उत्तेजना/ दूसरी ओर, प्लीनिक और ट्यूमर-घुसपैठ सीडी4+ ने CD107a 9.37 ± 1.5% और 11.50 ± 1.8%(चित्रा 3डी और 4 C)के तुलनीय स्तर ों को व्यक्त किया।

कुल मिलाकर इन परिणामों पर प्रकाश डाला गया है कि ऑर्थोटोपिक ट्यूमर अग्न्याशय में ट्यूमर कोशिकाओं की एक बहुत कम संख्या (१,०००) के इंजेक्शन से उत्पन्न किया जा सकता है । इन ट्यूमर को पूर्व वीवो उत्तेजना के लिए टी कोशिकाओं के अलगाव के लिए तेजी से पचाया जा सकता है। इंट्रासेलुलर साइटोकिन्स का पता लगाना संभव है और माध्यमिक लिम्फोइड अंगों में टी कोशिकाओं की तुलना में टी कोशिकाओं में घुसपैठ के इम्यूनोसप्रेसिंग के बेसल स्तर पर प्रकाश डाला गया है।

Figure 1
चित्रा 1: ऑर्थोटोपिक अग्नाशय ट्यूमर की पीढ़ी। (क) वीवो प्रयोगों की अनुसूची। (ख)पेट गुहा (बाएं) के भीतर और एक्सिजन (दाएं) के बाद ऑर्थोटोपिक ट्यूमर की स्थूल उपस्थिति जहां दिखाया गया ट्यूमर आधे में काट दिया गया है । (ग)सर्जरी के दौरान तहखाने झिल्ली रिसाव के सबूत ट्यूमर विकसित करने के लिए जो त्वचा (ऊपरी तस्वीर) और पेरिटोनियल दीवार (निचले तस्वीर) पर फार्म के माध्यम से दिखाई दे रहे है पैदा कर सकता है । (D)ऑर्थोटोपिक अग्नाशय ट्यूमर वजन चूहों से काटा गया जो एंडपॉइंट (एन = 22) तक पहुंच गया था। प्रत्येक डेटा बिंदु एक व्यक्तिगत माउस का प्रतिनिधित्व करता है, बार ग्राफ का मतलब ± एसईएम दिखाता है। इस आंकड़े के आंकड़ों को पहले प्रकाशित कार्य10से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: पूर्व वीवो टी सेल उत्तेजना के लिए प्रसंस्करण ऑर्थोटोपिक ट्यूमर की योजनाबद्ध। कटाई के बाद, अग्नाशय के ट्यूमर कोलेजेनेज (2 मिलीग्राम/mL) और DNase (०.०२५ मिलीग्राम/mL) में 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिन के लिए तेजी से पचा रहे हैं । इसके बाद, कोशिकाओं को पूर्णआरपीएमआई मीडिया में 2 x 10 6/mL पर फिर से निलंबित कर दिया जाता है और यू-तली प्लेट में चढ़ाया जाता है। पीएमए और आयनमाइसिन का एक उत्तेजना कॉकटेल 5 घंटे के लिए जोड़ा जाता है, जिस पर एंटी-माउस सीडी107a एंटीबॉडी को भी संस्कृति में जोड़ा जा सकता है। 1 एच ऊष्मायन के बाद इंट्रासेलर ट्रांसपोर्ट ब्लॉकर्स, ब्रेफेलिन ए और मोनेसिन को जोड़ा जाता है। पूर्व वीवो उत्तेजना के बाद कोशिकाओं को 20 मिन 4 डिग्री सेल्सियस के लिए स्थिर व्यवहार्यता रंग (पीबीएस में) के साथ धुंधला करने के लिए एक वी-तली प्लेट में स्थानांतरित कर दिया जाता है। कोशिकाओं को FACS बफर में धोया जाता है और 15 मिन (FACS बफर में) के लिए एंटी-सीडी16/32 (एफसीआर ब्लॉक) में इनक्यूबेटेड किया जाता है और फिर एक और 30 मिन (FACS बफर में) के लिए एक्स्ट्रासेलुलर फ्लोरोसेंट-कंफ्यूजएंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेटेड किया जाता है । कोशिकाओं को फिर से FACS बफर में धोया जाता है और 20 मिन के लिए इंट्रासेलुलर फिक्सेशन बफर में फिर से निलंबित किया जाता है। इसके बाद, कोशिकाओं को एक बार एफएसीएस बफर में और एक बार 1x परमीबिलाइजेशन बफर में धोया जाता है। कोशिकाओं को 1 एच (1x परमीबिलाइजेशन बफर में) के लिए इंट्रासेलुलर फ्लोरोसेंट-कंजुगेट एंटीबॉडी में आरटी में 1 एच के लिए फिर से निलंबित कर दिया जाता है। कोशिकाओं को 1x परमीबिलाइजेशन बफर में एक बार धोया जाता है और एक बार 24 घंटे के भीतर प्रवाह साइटोमीटर पर अधिग्रहण के लिए FACS बफर में फिर से निलंबित करने से पहले FACS बफर में । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: पूर्व वीवो उत्तेजित तिल्ली के प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण- और ट्यूमर-व्युत्पन्न टी कोशिकाएं। (ए)तिल्ली (सकारात्मक नियंत्रण) और ऑर्थोटोपिक ट्यूमर के नमूनों के लिए उपयोग की जाने वाली फ्लो साइटोमेट्री गेटिंग रणनीति। एफएससी-ए/एसएससी-ए का उपयोग करके मलबे से कोशिकाओं के साथ भेदभाव किया जाता है और एफएससी-ए/एफएससी-एच और एसएससी-ए/एसएससी-डब्ल्यू का उपयोग करके एकल कोशिकाओं को और अलग-थलग कर दिया जाता है । मृत या अपोप्टिक कोशिकाओं को स्थिर व्यवहार्यता रंग -FVD506 का उपयोग करके बाहर रखा जाता है और प्रतिरक्षा कोशिकाओं को CD45+द्वारा गेट किया जाता है । इस सीडी 3+ टी कोशिकाओं और सीडी 4+ और सीडी 8+ सबसेट के बाद परिभाषित किया गया है। एक बीडी फोर्टेसा पर डेटा हासिल किया गया था । (ख)गेटिंग रणनीति IFNο+ CD4+ और CD8+ टी कोशिकाओं की मात्रा निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया । पृष्ठभूमि फ्लोरेसेंस निर्धारित करने के लिए पूरी तरह से उत्तेजित नमूनों (पीएमए/आयनोमाइसिन/ब्रेफेलिन ए/मोनोसिन) पर फ्लोरोसेंट माइनस वन (एफएमओ) नियंत्रण का उपयोग किया जाता है । एक ब्रेफेलिन ए/मोनोसिन केवल नियंत्रण (केवल बी + एम) का उपयोग बेसल साइटोकिन उत्पादन निर्धारित करने के लिए किया जाता है। पूरी तरह से उत्तेजित नमूना तो % IFNο+ टी कोशिकाओं की गणना करने के लिए प्रयोग किया जाता है। (ग)गेटिंग रणनीति का उपयोग TNFα+ CD4+ और CD8+ टी कोशिकाओं की मात्रा निर्धारित करने के लिए किया जाता है। पृष्ठभूमि फ्लोरेसेंस का निर्धारण करने के लिए पूरी तरह से उत्तेजित नमूनों (पीएमए/आयनोमाइसिन/ब्रेफेलिन ए/मोनोसिन) पर एक FMO नियंत्रण का उपयोग किया जाता है । एक ब्रेफेलिन ए/मोनोसिन केवल नियंत्रण (केवल बी + एम) का उपयोग बेसल साइटोकिन उत्पादन निर्धारित करने के लिए किया जाता है। पूरी तरह से उत्तेजित नमूना तो % TNFα+ टी कोशिकाओं की गणना करने के लिए प्रयोग किया जाता है। (D)गैटिंग रणनीति CD107a+ CD4+ और CD8+ टी कोशिकाओं को परिभाषित करने के लिए इस्तेमाल किया । पृष्ठभूमि फ्लोरेसेंस का निर्धारण करने के लिए पूरी तरह से उत्तेजित नमूनों (पीएमए/आयनोमाइसिन/ब्रेफेलिन ए/मोनोसिन) पर एक FMO नियंत्रण का उपयोग किया जाता है । एक ब्रेफेलिन ए/मोनोसिन केवल नियंत्रण (केवल बी + एम) का उपयोग बेसल डिग्रेनुलेशन निर्धारित करने के लिए किया जाता है। पूरी तरह से उत्तेजित नमूना तो % CD107a+ टी कोशिकाओं की गणना करने के लिए प्रयोग किया जाता है। फ्लोजो संस्करण 10.6.1 पर सभी प्रवाह साइटोमेट्री डेटा का विश्लेषण किया गया था। इस आंकड़े के आंकड़ों को पहले प्रकाशित कार्य10से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: पूर्व वीवो तिल्ली का परिमाणीकरण- और ट्यूमर-व्युत्पन्न टी सेल गतिविधि। CD4+ और CD8+ टी कोशिकाओं के अनुपात के लिए सकारात्मक(ए)IFNο+ (बी)TNFα+ और(C)CD107a+ तिल्ली (n = 4) और ट्यूमर (n = 7) में क्वान्टोटोपिक-ट्यूमर असर चूहों की मात्रा निर्धारित किया गया था । प्रत्येक डेटा पॉइंट एक व्यक्तिगत माउस का प्रतिनिधित्व करता है और त्रुटि बार डिस्प्ले का मतलब ± एसईएम। सांख्यिकीय महत्व का परीक्षण एक अनपेयर टी-टेस्ट का उपयोग करके किया गया था जहां *= पीएंडएलटी;0.05 और ***= पीएंडएलटी;0.001। सभी डेटा चश्मे 8 का उपयोग कर विश्लेषण किया गया था । इस आंकड़े के आंकड़ों को पहले प्रकाशित कार्य10से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

अग्नाशय के कैंसर के वीवो मॉडल रोग प्रगति को समझने और नए चिकित्सीय लक्ष्य3का आकलन करने के लिए अमूल्य उपकरण प्रदान करते हैं । विशेष रूप से ऑर्थोटोपिक मॉडल एक लागत प्रभावी और प्रजनन योग्य मॉडल है जिसे चूहों के बड़े साथियों में एक साथ4,27को लागू किया जा सकता है। ऑर्थोटोपिक मॉडल ट्यूमर के विकास के लिए कॉग्नेट माइक्रोएनवायरमेंट और बरकरार प्रतिरक्षा प्रणाली भी प्रदान करता है, जिससे यह चमड़े के नीचे और पीडीएक्स-मॉडल की तुलना में अधिक उपयुक्त हो जाता है। हालांकि, हमने पाया है कि प्रतिरक्षा घुसपैठ के कुछ तत्व ऑर्थोटोपिक मॉडल और केपीसी चूहों, सोने के मानक मूत्र मॉडल10के बीच भिन्न हो सकते हैं। इसका एक कारण ऑर्थोटोपिक मॉडल में देखी गई त्वरित ट्यूमर वृद्धि हो सकती है। प्रतिरक्षा कोशिका के सबसेटों के घनत्व में और अंतर ऑर्थोटोपिक और चमड़े के नीचे मॉडल3,28के बीच वर्णित किया गया है । इसलिए, हालांकि ट्रांसजेनिक केपीसी मॉडल अधिक महंगा और चर6है, प्रमुख निष्कर्षों को जहां संभव हो केपीसी चूहों की एक छोटी सी पलटन में सत्यापित किया जाना चाहिए।

ऑर्थोटोपिक सर्जरी के लिए ट्यूमर कोशिकाओं की तैयारी प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम है। कोशिकाओं को हमेशा विकास और माइकोप्लाज्मा के लॉग चरण में होना चाहिए- और संक्रमण मुक्त। यदि ट्यूमर सेल के विकास पर कोई चिंता है तो ऑर्थोटोपिक सर्जरी स्थगित की जानी चाहिए। बेसमेंट झिल्ली के उपयोग से ट्यूमर की घटना दर में सुधार होता है , जो29 बिना कोशिकाओं को इंजेक्ट करता है और कोशिका रिसाव को कम करता है और इस प्रकार पेरिटोनियलफैलता है 27। हालांकि, एक बार तहखाने झिल्ली में निलंबित, ट्यूमर कोशिकाओं को किसी भी कोशिका हानि से बचने के लिए तेजी से (2 घंटे के भीतर) इंजेक्शन दिया जाना चाहिए। ट्यूमर उत्पन्न करने के लिए आवश्यक ट्यूमर कोशिकाओं की संख्या सेल-लाइन निर्भर होने की संभावना है, और सेल संख्या की एक श्रृंखला का परीक्षण किया जाना चाहिए (उदाहरण के लिए, 100 - 100,000 से) जो एंडपॉइंट तक पहुंचने का समय भी निर्धारित कर सकता है। यह संभावना है कि इंजेक्शन के लिए प्रति माउस 1,000 कोशिकाओं को तैयार करते समय त्रुटि का मार्जिन होगा; इसलिए, यदि सर्जरी के कई दिनों की आवश्यकता होती है, तो बैच प्रभावों के लिए नियंत्रित करने के लिए समूहों के उपचार को दिनों में समान रूप से फैलाया जाना चाहिए। अधिकांश सर्जिकल चरणों को वरीयताओं के आधार पर संशोधित किया जा सकता है; हालांकि, पेट की गुहा में अग्न्याशय की जगह या पेरिटोनियल दीवार को बंद करते समय तहखाने झिल्ली को परेशान करने के लिए देखभाल नहीं की जानी चाहिए। तहखाने झिल्ली रिसाव पेरिटोनियल दीवार पर ट्यूमर सेल विकास का कारण बन सकता है, जो तेजी से बनता है और इसके परिणामस्वरूप पहले जानवर का बलिदान हो सकता है।

आदर्श रूप से, अग्नाशय के ट्यूमर को फसल के बाद तेजी से पचाया जाना चाहिए और तुरंत पूर्व वीवो उत्तेजना के लिए तैयार किया जाना चाहिए। हालांकि, यह संभव नहीं हो सकता है अगर वहां ट्यूमर का एक बड़ा बैच फसल के लिए है, इस मामले में ट्यूमर बर्फ पर रखा जाना चाहिए और बैचों में पचा । पाचन एंजाइमों के संपर्क में आने वाले प्रकार, एकाग्रता और लंबाई को प्रतिरक्षा कोशिकाओं30,31,32पर सतह के अणुओं की एक बड़ी संख्या को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया है । पाचन समय भी जानबूझकर सेल मौत33को सीमित करने के लिए कम है . पचाकोशिकाओं को दीर्घकालिक भंडारण के लिए ठंड माध्यम में नीचे जमे हुए किया जा सकता है; हालांकि, कुछ सेल हानि तब होगी जब विगलन। पाचन प्रक्रिया इष्टतम से कम हो सकती है यदि ट्यूमर के टुकड़े कोलेजेनेस ऊष्मायन से पहले पर्याप्त रूप से नहीं हैं और यह स्पष्ट हो जाएगा क्योंकि पाचन के बाद फिल्टर में हार्ड ट्यूमर टुकड़े रहेंगे। यदि स्वस्थ अग्न्याशय या प्रारंभिक चरण के ट्यूमर के साथ काम कर रहे हैं तो कोलेजेनेस एकाग्रता को कम किया जा सकता है; स्वस्थ अग्नाशय डक्टल कोशिकाओं को निकालने पर रिपोर्ट काफी कम सांद्रता34का उपयोग करें . पाचन के दौरान उच्च स्तर की एपिथेलियल सेल मृत्यु की उम्मीद की जानी है; हालांकि, प्रतिरक्षा कोशिकाओं को प्रक्रिया को अच्छी तरह से सहन करना चाहिए। ऑर्गनॉइड विकास35 के लिए व्यवहार्य एपिथेलियल कोशिकाओं को अलग करने या ऊतक वास्तुकला36को संरक्षित करने के लिए वैकल्पिक तरीके मौजूद हैं।

उत्तेजना प्रोटोकॉल में संशोधन आसानी से किए जा सकते हैं, वांछित रीड-आउट और प्रतिरक्षा कोशिका के आधार पर विश्लेषण किया गया (जैसे, मैक्रोफेज या बी कोशिकाएं)। पैन-उत्तेजना अभिकर्मकों का उपयोग पीएमए/आयनोमाइसिन टीसीआर-एंटीजन विशिष्टता के लिए भेदभाव नहीं करता है, जिससे एंटीजन की जानकारी नहीं होने पर यह उपयोगी हो जाता है । हालांकि, आईएफएन का उत्पादन टीसीआर सगाई37 से निकटता से जुड़ा हुआ है और आईएफएन और टीएनफ्लेम दोनों उत्पादन पीडीएसी एंटीट्यूमरल प्रतिक्रियाओं38में महत्वपूर्ण हैं। पीएमए/आयनमाइसिन उत्तेजना साइटोकिन्स का उत्पादन करने के लिए टी कोशिकाओं की अधिकतम क्षमता को दर्शाती है, जो ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट के भीतर टी कोशिकाओं द्वारा उत्पादित हो सकती है या नहीं हो सकती है । उत्तेजना की आवश्यकता के बिना एंडोजेनस उत्पादन को मापा जा सकता है; हालांकि, स्तर अभी तक कम या अज्ञेय हो सकते हैं। टी कोशिकाओं को प्रोत्साहित करने के लिए वैकल्पिक तरीके हैं: एंटी-सीडी 3/28-लेपित मोतियों, जो एंटीजन या वास्तव में अन्य प्रतिरक्षा सेल आबादी की आवश्यकता नहीं है। इस विधि का लाभ पृथक्करण विधियों की आवश्यकता के बिना विशिष्ट टी सेल सबसेट द्वारा साइटोकिन उत्पादन की मात्रा निर्धारित करने की अनुमति दे रहा है। साइटोटॉक्सिकिटी (ग्रैनज़ीम बी और पेर्फोरिन ए), गतिविधि (आईएल-2) या इम्यूनोसप्रेसन (आईएल-10) के अन्य मार्कर भी21जोड़े जा सकते हैं। हालांकि, उच्च गुणवत्ता वाले प्रवाह साइटोमेट्री एंटीबॉडी सभी साइटोकिन्स और ब्याज के कारकों का पता लगाने के लिए उपलब्ध नहीं हैं। इसलिए, यदि एलिसा जैसे अन्य अनुप्रयोगों की आवश्यकता है तो उत्तेजना को ब्रेफेलिन ए/मोनोसिन को शामिल किए बिना किया जा सकता है, जिससे साइटोकिन को अधिनेचिता में छोड़ने की अनुमति मिलती है । हालांकि, ध्यान दें, यह कुल सेल साइटोकाइन रिलीज की अनुमति देगा और यह निर्धारित करना संभव नहीं होगा कि किस सेल आबादी ने योगदान दिया।

IFNο उत्पादन एक एंटीट्यूमरल टी सेल प्रतिक्रिया की एक प्रमुख विशेषता है, जिसे अक्सर टीसीआर-एंटीजन मान्यता37,38के विकल्प के रूप में उपयोग किया जाता है। वीवो विधियों में अन्य जो एंटीजन-विशिष्ट प्रतिक्रियाओं को अधिक सटीक रूप से परिभाषित करते हैं, ट्यूमर कोशिकाओं का उपयोग करते हैं जो ओवएलबमिन या एसवी40 जैसे ज्ञात एंटीजन को व्यक्त करते हैं। यूनिवर्सल एंटीजन तो पूर्व वीवो टी सेल मांयता का परीक्षण करने के लिए या एक टीसीआर प्रतिबंधित मेजबान माउस के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया जा सकता है । वैकल्पिक रूप से, जहां एंटीजन अज्ञात है, टी सेल क्लोनल विस्तार का परिमाणीकरण थोक-टीसीआर अनुक्रमण, या हाल ही में एकल-सेल टीसीआर अनुक्रमण39,40द्वारा किया जा सकता है। पूरी तरह से अंतरंग नैतिक टी सेल प्रतिक्रिया की स्थिति को समझने के लिए, थकावट या निषेधात्मक रिसेप्टर्स के संकेत मार्कर भी शामिल मापा जाना चाहिए: CTLA-4, पीडी-1, LAG-3, TIM3, 2B4 । साथ ही प्रभावक टी कोशिकाओं (सीडी 44हाय,सीडी62लो)और प्रसार गतिविधि, Ki67+ या CSFE कमजोर पड़ने41,42,43,44के मार्कर। कुल मिलाकर, ऑर्थोटोपिक मॉडल चिकित्सकीय रणनीतियों का तेजी से परीक्षण करने के लिए एक उपयोगी मंच प्रदान करता है, विशेष रूप से जो एंटीट्यूमरल टी-सेल प्रतिक्रिया को मिलासकता है, जिसे ट्रांसजेनिक, केपीसी, चूहों के छोटे पलटन पर मान्य किया जा सकता है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम आर्थोटोपिक सर्जरी के दौरान उनकी सहायता के लिए एनिमल टेक्नीशियन सर्विस और डॉ अल्जबबीटा तालारोविचोवा (बार्ट्स कैंसर इंस्टीट्यूट, क्वीन मैरी यूनिवर्सिटी ऑफ लंदन, लंदन, यूनाइटेड किंगडम) का शुक्रिया अदा करना चाहेंगे । हम सर्जिकल तकनीक में उनके मार्गदर्शन के लिए डॉ जेनिफर मॉर्टन (बीटसन इंस्टीट्यूट फॉर कैंसर रिसर्च, ग्लासगो, यूनाइटेड किंगडम) का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं, डॉ क्रिस्टीना घीरेली (बार्ट्स कैंसर इंस्टीट्यूट, क्वीन मैरी यूनिवर्सिटी ऑफ लंदन, लंदन, यूनाइटेड किंगडम) ट्यूमर पाचन और डॉ फैबियन मैकक्लानहान (बार्ट्स कैंसर इंस्टीट्यूट, क्वीन मैरी यूनिवर्सिटी ऑफ लंदन, लंदन, यूनाइटेड किंगडम) को एक्स विवो ट्नो टी, यूनाइटेड किंगडम के बारे में उनकी सलाह के लिए हम इस शोध को वित्तपोषित करने वाले मेडिकल रिसर्च काउंसिल (एमआरसी), अग्नाशय कैंसर अनुसंधान कोष (पीसीएफआर) और ओवेरियन कैंसर एक्शन का भी शुक्रिया अदा करना चाहेंगे ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6/0 gauge coated vicryl absorbable sutures Ethicon W9500T
70 μm pore-size cell strainer Fisher Scientific 11597522
9 mm Clay Adams clips VetTech Solutions IN015A
anti-CD107a PE (clone 1D4B) Biolegend 121612 1:100 to culture media
anti-CD16/CD32 BD Biosciences 553142 Use at final dilution 1:200
anti-CD3 PerCP eFluor710 (clone 17A2) Biolegend 46-0032 Use at final dilution 1:50
anti-CD4 FITC (clone GK1.5) eBioscience 11-0041 Use at final dilution 1:100
anti-CD45 Brilliant Violet 605 (clone 30-F11) Biolegend 103140 Use at final dilution 1:200
anti-CD8 Brilliant Violet 421 (clone 53-6.7) Biolegend 100738 Use at final dilution 1:100
anti-IFN-gamma PE/Cy7 (clone XMG1.2) Biolegend 505826 Use at final dilution 1:50
anti-TNF-alpha Alexa Fluor 647 (clone MP6-X) Biolegend 506314 Use at final dilution 1:50
BD Matrigel Basement Membrane Matrix High Concentration BD Biosciences 354248 Aliquot on ice and store in -20 °C
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A4503
Cell Stimulation Cocktail (500x) (phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) and ionomycin) eBioscience 00-4970-03 1x Final concentration PMA 0.081 μM, ionomycin 1.34 μM
Clay Adams Autoclip Applier VetTech Solutions IN015B
Clay Adams Autoclip remover VetTech Solutions IN015B
Collagenase Type V from Clostridium histolyticum Sigma-Aldrich C9263 2 mg/mL in media
Dimethyl sulphoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650-100mL
DMEM High glucose (4.5 g/L) with L-Glutamine PAA E15-810
DNase (Deoxyribonuclease I from bovine pancreas Type II-S) stock 10 mg/mL in 0.15 M NaCl Sigma-Aldrich D4513 Final concentration in digestion media 0.025 mg/mL
Fixable Viability Dye 506 (FVD506) eBioscience 65-0866 Use at 1:200 in PBS
Foetal calf-serum (FCS) GE Healthcare A15-104 10% in RPMI
Hamilton syringe 700 series, 25 μL volume, 22s gauge needle bevel tip Fisher Scientific 10100332
Intracellular Fixation buffer and Intracellular Permeabilisation Buffer eBioscience 88-8824-00 Dilute permeabilisation buffer to 1x in H2O
Penicillin/streptomycin PAA 15140122 100 units/mL Penicillin, 100 μg/mL Streptomycin
Protein transport inhibitor cocktail (500x) (brefeldin A and monesin) eBioscience 00-4980-03 1x Final concentration Brefeldin A 10.6 μM, monensin 2 μM
RPMI-1640 (containing 0.3 g/L Glutamine) Sigma-Aldrich R8758
Surgical Scalpel Blade No.10 Swann-Morton 0501
Trypsin-EDTA Solution 10x Sigma-Aldrich 594-18C Trypsin (0.1%) EDTA (0.4%) final concentration
U-bottomed 96 microwell plate VWR 734-2080
Universal Cotton Tipped Applicators - 6 inch x 100 Medisave UN982
V-bottomed 96 microwell plate VWR 735-0184

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References

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).
  2. Conroy, T., et al. Current standards and new innovative approaches for treatment of pancreatic cancer. European Journal of Cancer. 57, 10-22 (2016).
  3. Lee, J. W., Komar, C. A., Bengsch, F., Graham, K., Beatty, G. L. Genetically engineered mouse models of pancreatic cancer: The KPC model (LSL-KrasG12D/+;LSL-Trp53R172H/+;Pdx-1-Cre), its variants, and their application in immuno-oncology drug discovery. Current Protocols in Pharmacology. 2016, (2016).
  4. Tseng, W. W., et al. Development of an Orthotopic Model of Invasive Pancreatic Cancer in an Immunocompetent Murine Host. Clinical Cancer Research. 16 (14), 3684-3695 (2010).
  5. Majumder, K., et al. A Novel Immunocompetent Mouse Model of Pancreatic Cancer with Robust Stroma: a Valuable Tool for Preclinical Evaluation of New Therapies. Journal of Gastrointestinal Surgery. 20 (1), 53-65 (2016).
  6. Hingorani, S. R., et al. Trp53R172H and KrasG12D cooperate to promote chromosomal instability and widely metastatic pancreatic ductal adenocarcinoma in mice. Cancer Cell. 7 (5), 469-483 (2005).
  7. Herreros-Villanueva, M., Hijona, E., Cosme, A., Bujanda, L. Mouse models of pancreatic cancer. World Journal of Gastroenterology. 18 (12), 1286-1294 (2012).
  8. Witkiewicz, A. K., et al. Integrated Patient-Derived Models Delineate Individualized Therapeutic Vulnerabilities of Pancreatic Cancer. Cell Reports. , (2016).
  9. Nicolle, R., et al. Pancreatic Adenocarcinoma Therapeutic Targets Revealed by Tumor-Stroma Cross-Talk Analyses in Patient-Derived Xenografts. Cell Reports. , (2017).
  10. Spear, S., et al. Discrepancies in the Tumor Microenvironment of Spontaneous and Orthotopic Murine Models of Pancreatic Cancer Uncover a New Immunostimulatory Phenotype for B Cells. Frontiers in Immunology. 10, 542 (2019).
  11. Zhu, Y., et al. CSF1/CSF1R blockade reprograms tumor-infiltrating macrophages and improves response to T-cell checkpoint immunotherapy in pancreatic cancer models. Cancer Research. , (2014).
  12. Lee, J. J., Huang, J., England, C. G., McNally, L. R., Frieboes, H. B. Predictive Modeling of In vivo Response to Gemcitabine in Pancreatic Cancer. PLoS Computational Biology. , (2013).
  13. Clark, C. E., et al. Dynamics of the Immune Reaction to Pancreatic Cancer from Inception to Invasion. Cancer Research. 67 (19), 9518-9527 (2007).
  14. Fukunaga, A., et al. CD8+ tumor-infiltrating lymphocytes together with CD4+ tumor-infiltrating lymphocytes and dendritic cells improve the prognosis of patients with pancreatic adenocarcinoma. Pancreas. 28 (1), 26-31 (2004).
  15. Tewari, N., et al. The presence of tumor-associated lymphocytes confers a good prognosis in pancreatic ductal adenocarcinoma: an immunohistochemical study of tissue microarrays. BMC Cancer. 13 (1), 436 (2013).
  16. Royal, R. E., et al. Phase 2 Trial of Single Agent Ipilimumab (Anti-CTLA-4) for Locally Advanced or Metastatic Pancreatic Adenocarcinoma. Journal of Immunotherapy. 33 (8), 828-833 (2010).
  17. Brahmer, J. R., et al. Safety and Activity of Anti–PD-L1 Antibody in Patients with Advanced Cancer. New England Journal of Medicine. 366 (26), 2455-2465 (2012).
  18. Winograd, R., et al. Induction of T-cell Immunity Overcomes Complete Resistance to PD-1 and CTLA-4 Blockade and Improves Survival in Pancreatic Carcinoma. Cancer Immunology Research. 3 (4), 399-411 (2015).
  19. Beatty, G. L., et al. CD40 Agonists Alter Tumor Stroma and Show Efficacy Against Pancreatic Carcinoma in Mice and Humans. Science. 331 (6024), 1612-1616 (2011).
  20. Lutz, E. R., et al. Immunotherapy converts nonimmunogenic pancreatic tumors into immunogenic foci of immune regulation. Cancer Immunology Research. 2 (7), 616-631 (2014).
  21. Barry, M., Bleackley, R. C. Cytotoxic T lymphocytes: all roads lead to death. Nature Reviews. Immunology. 2 (6), 401-409 (2002).
  22. Mojic, M., Takeda, K., Hayakawa, Y. The dark side of IFN-γ: Its role in promoting cancer immunoevasion. International Journal of Molecular Sciences. , (2018).
  23. Castro, F., Cardoso, A. P., Gonçalves, R. M., Serre, K., Oliveira, M. J. Interferon-gamma at the crossroads of tumor immune surveillance or evasion. Frontiers in Immunology. , (2018).
  24. Thiery, J., et al. Perforin pores in the endosomal membrane trigger the release of endocytosed granzyme B into the cytosol of target cells. Nature Immunology. , (2011).
  25. Betts, M. R., et al. Sensitive and viable identification of antigen-specific CD8+ T cells by a flow cytometric assay for degranulation. Journal of Immunological Methods. 281 (1-2), 65-78 (2003).
  26. Schuerwegh, A. J., De Clerck, L. S., Bridts, C. H., Stevens, W. J. Comparison of intracellular cytokine production with extracellular cytokine levels using two flow cytometric techniques. Cytometry. 55 (1), 52-58 (2003).
  27. Partecke, L. I., et al. A syngeneic orthotopic murine model of pancreatic adenocarcinoma in the C57/BL6 mouse using the panc02 and 6606PDA cell lines. European Surgical Research. , (2011).
  28. An, X., et al. Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry. Journal of Visualized Experiments. (140), (2018).
  29. Jiang, Y. J., et al. Establishment of an orthotopic pancreatic cancer mouse model: Cells suspended and injected in Matrigel. World Journal of Gastroenterology. , (2014).
  30. Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. European Journal of Microbiology & Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).
  31. Trapecar, M., et al. An Optimized and Validated Method for Isolation and Characterization of Lymphocytes from HIV+ Human Gut Biopsies. AIDS Research and Human Retroviruses. , (2017).
  32. Liu, Q., et al. Effects of enzymatic digestion, cell culture and preservation conditions on surface CD62L expression of primary murine CD3+CD4+T cells. Biomedical Research (India). 29 (10), 2153-2159 (2018).
  33. Seaman, S. A., Tannan, S. C., Cao, Y., Peirce, S. M., Lin, K. Y. Differential effects of processing time and duration of collagenase digestion on human and murine fat grafts. Plastic and Reconstructive Surgery. , (2015).
  34. Huch, M., et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. EMBO Journal. , (2013).
  35. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. , (2015).
  36. Misra, S., et al. Ex vivo organotypic culture system of precision-cut slices of human pancreatic ductal adenocarcinoma. Scientific Reports. , (2019).
  37. Moran, A. E., Polesso, F., Weinberg, A. D. Immunotherapy Expands and Maintains the Function of High-Affinity Tumor-Infiltrating CD8 T Cells In Situ. The Journal of Immunology. , (2016).
  38. Stromnes, I. M., et al. T Cells Engineered against a Native Antigen Can Surmount Immunologic and Physical Barriers to Treat Pancreatic Ductal Adenocarcinoma. Cancer Cell. , (2015).
  39. Singh, M., et al. High-throughput targeted long-read single cell sequencing reveals the clonal and transcriptional landscape of lymphocytes. Nature Communications. 10 (1), 3120 (2019).
  40. Jiang, N., Schonnesen, A. A., Ma, K. Y. Opinion Ushering in Integrated T Cell Repertoire Profiling in Cancer. Trends in Cancer. 5, 85-94 (2019).
  41. Schietinger, A., et al. Tumor-Specific T Cell Dysfunction Is a Dynamic Antigen-Driven Differentiation Program Initiated Early during Tumorigenesis. Immunity. 45 (2), 389-401 (2016).
  42. Raghav, S. K., et al. Exhaustion of tumor-specific CD8+ T cells in metastases from melanoma patients. Journal of Clinical Investigation. , (2011).
  43. Gros, A., et al. PD-1 identifies the patient-specific in filtrating human tumors. The Journal of Clinical Investigation. , (2014).
  44. Miller, B. C., et al. Subsets of exhausted CD8 + T cells differentially mediate tumor control and respond to checkpoint blockade. Nature Immunology. , (2019).

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ऑर्थोटोपिक अग्नाशय ट्यूमर की पीढ़ी और ट्यूमर के <i>पूर्व वीवो</i> लक्षण वर्णन-घुसपैठ टी सेल साइटोटॉक्सिकिटी
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Spear, S., McNeish, I. A., Capasso, M. Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity. J. Vis. Exp. (154), e60622, doi:10.3791/60622 (2019).

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