Summary
Denne protokollen beskriver kirurgisk generering av orthotopic bukspyttkjertel svulster og rask fordøyelse av fersk isolert murine bukspyttkjertel svulster. Etter fordøyelsen, kan levedyktige immun celle populasjoner brukes til videre nedstrøms analyse, inkludert ex vivo stimulering av T-celler for intracellulære cytokin deteksjon ved flyt flowcytometri.
Abstract
In vivo modeller av kreft i bukspyttkjertelen gir uvurderlig verktøy for å studere sykdom dynamikk, uimottakelig infiltrasjon og nye terapeutiske strategier. Den orthotopic murine modellen kan utføres på store kohorter av immunkompetente mus samtidig, er relativt billig og bevarer beslektet vevet mikromiljøet. Den kvantifisering av T celle infiltrasjon og cytotoksisk aktivitet innen orthotopic svulster gir en nyttig indikator på en antitumoral respons.
Denne protokollen beskriver metodikken for kirurgisk generering av orthotopic bukspyttkjertelen svulster ved injeksjon av et lavt antall syngeneic tumorceller resuspendert i 5 μL kjeller membran direkte inn i bukspyttkjertelen. Mus peiling orthotopic svulster ta ca 30 dager å nå endepunktet, på hvilket tidspunkt svulster kan høstes og behandles for karakterisering av tumor-infiltrere T celle aktivitet. Rapid enzymatisk fordøyelsen bruker kollagenase og DNase tillater en enkelt celle suspensjon å bli Hentet fra svulster. Levedyktigheten og celleoverflaten markører for immunceller utvunnet fra svulsten er bevart; Derfor er det hensiktsmessig for flere nedstrøms applikasjoner, inkludert Flow-assistert celle sortering av immunceller for kultur eller RNA utvinning, flyt flowcytometri analyse av immun celle populasjoner. Her beskriver vi ex vivo stimulering av T celle populasjoner for intracellulære cytokin kvantifisering (IFNγ og TNFα) og degranulering aktivitet (CD107a) som et mål på total cytotoksisitet. Hel svulst fordøyer ble stimulert med phorbol isopropylmyristat acetate og ionomycin for 5 h, i nærvær av anti-CD107a antistoff for å upregulate cytokin produksjon og degranulering. Tillegg av brefeldin A og monensin for den siste 4 h ble utført for å blokkere ekstracellulære transport og maksimere cytokin deteksjon. Ekstra-og intra-Cellular farging av celler ble deretter utført for Flow flowcytometri analyse, der andelen IFNγ+, TNFα+ og CD107a+ CD4+ og CD8+ T celler ble kvantifisert.
Denne metoden gir et utgangspunkt for å utføre omfattende analyse av tumor mikromiljøet.
Introduction
Denne metoden detaljer, fra Start-til-avslutning, den kirurgiske prosedyren for generering av orthotopic bukspyttkjertel svulster ved hjelp av en minimal mengde av cellulære materiale og den påfølgende raske dissosiasjon av etablerte svulster for omfattende flyt flowcytometri analyse av immun celle populasjoner, inkludert ex vivo analyse av T celle funksjon.
Bukspyttkjertelen ductal adenokarsinom (PDAC) er en aggressiv kreft med bare 8% av pasientene overlevende 5 år1. Som mindre enn 20% av pasientene er kvalifisert for kirurgisk reseksjon2, fersk pasientprøver er ikke lett tilgjengelig for forskning og dermed in vivo -modeller gir viktige verktøy for å undersøke denne sykdommen. Det er flere murine modeller av PDAC: orthotopic, subkutan, transgene, intravenøs og pasient-avledet xenograft (PDX), beskrevet her3. Den orthotopic modellen som beskrives her, tillater injeksjon av syngeneic PDAC-celler inn i bukspyttkjertelen av immunkompetente mus. Dette kan utføres i store kohorter av ville-type eller mutant mus, og dermed gir en kostnadseffektiv og konsistent modell for sammenligning av terapeutiske midler. Viktigere, den orthotopic modellen gir beslektet mikromiljøet for tumor cellevekst og metastasizes i våre hender og andre4 til klinisk relevante nettsteder (for eksempel lever), noe som gjør det mer klinisk relevant enn subkutan eller kjemisk indusert modeller. Orthotopic svulster vise viktige funksjoner i PDAC, for eksempel en sterk desmoplastic reaksjon med en overflod av fibroblaster og ekstracellulære matrise deponering5. Transgene-modeller av PDAC er gullstandarden for murine-modellen, og den mest brukte er KPC-modellen, som uttrykker mutant KrasG12D/+ og Trp53R172H/+ under den bukspyttkjertel spesifikke PDX-1-grobunn promoter6. Ytterligere KPC og andre in vivo PDAC modeller er gjennomgått her7. KPC mus spontant utvikle bukspyttkjertel svulster med en sykdomsprogresjon som trofast replikerer funksjoner av menneskelig PDAC6. Men, som for alle transgene-modeller, er avl programmet kostbart, tumorprogresjon er variabel og derfor ofte krever store kohorter av mus. PDX-modeller bruker pasient-avledede tumorceller eller brikker som deretter dyrkes enten orthotopically eller oftere subkutant i immunsupprimerte mus. Xenograft modeller gir nyttige verktøy for screening terapeutiske forbindelser og konto for pasient heterogenitet. Men de gir ikke en komplett uimottakelig mikromiljøet, og dermed begrense sine søknader8,9.
Når etablert, orthotopic svulster vanligvis ta rundt 1 måned eller mer å vokse (avhengig av cellelinjen brukes) og danne store svulster som kan lett avbildet ved ultralyd eller MRI å spore progresjon og bestemme behandling effekt4,5,10. Men en gang i eksponentiell vekst, den siste fasen av tumor vekst kan være rask, så de fleste behandlingsregimer er påbegynt relativt tidlig (f. eks, 14 dager)11,12. Immunsystemet spiller en avgjørende rolle i tumor utvikling, blant annet i PDAC, som er preget av en immunsuppressiv svulst infiltrere med relative mangelen av T-celler og hyppig tilstedeværelse av myelogen celler13. En høy tilstedeværelse av T celler i PDAC tildeler en bedre prognose14,15. Men som enkelt agenter, immun kontrollpunkt hemmere som avlaste T celle immunsuppresjon, slik som anti-CTLA-416 og anti-PD-L117, har ikke vist klinisk nytte i PDAC pasienter, mest sannsynlig fordi den samlede T celle reaktivitet er svært lav. Men agenter som Prime T celle svar, for eksempel anti-CD40, kan overvinne anti-PD-L1/CTLA-4 motstand18,19 og vaksinasjon med GM-CSF-sekresjon allogene PDAC vaksine (GVAX) kan øke immunogenisitet av PDAC svulster20, noe som indikerer at styrking T celle svar former viktig terapeutisk Avenue.
Kritisk til en antitumoral T celle respons er erkjennelsen av tumor-avledet antigener via T-celle reseptor (TCR) og den påfølgende produksjon av cytotoksisk cytokiner og granulater. Mens T celle antigen-anerkjennelse kan bestemmes av TCR sekvensering, denne tilnærmingen er kostbart og tidkrevende. Men kvantifisering av tumor-infiltrere T-celle delsett gir en god indikasjon på en anti-tumoral respons. Videre undersøkelse av T celle aktivitet ex vivo i form av degranulering, cytokin produksjon og andre cytotoksisk faktorer gir en dypere funksjonell analyse. Disse analysene kan utføres på fersk tumor prøver og mange parametre for T-celle-funksjonen kan måles raskt ved å flyte flowcytometri.
CD8+ og CD4+ T celler produserer cytokiner slike IFNγ og TNFα å forsterke en immunrespons21. IFNɣ induserer MHCI oppregulering på målceller, induserer differensiering og rekruttering av immunceller og hjelpemidler celle død. IFNγ produksjon av CD8+ T celler er godt preget til å være en del av en antitumoral respons og samsvarer med tumor regresjon22,23. TNFα er en annen proinflammatoriske cytokin produsert av både CD8+ og CD4+ T celler. Det forbedrer TCR-avhengige aktivering og spredning av T-celler, hjelpe anti-tumoral respons. Ved TCR engasjement, cytotoksisk CD8+ T celler kan gjennomgå degranulering, der pre-formet sekretoriske lysosomer inneholder cytotoksisk molekyler slippes ut i immunologiske synapse å forårsake mål-celle degradering21. Disse molekylene inkluderer Perforin, et protein som binder seg til målet cellemembranen, danner porer som deretter forstyrrer membran integritet og tillater diffusjon21 eller endocytose24 av andre cytotoksisk molekyler, slik som Granzyme B, direkte inn i cytoplasma av målcellen. Granzyme B er en protease som enacts nedbrytningen av flere proteiner i målcellen, noe som fører til celle død21. Utgivelsen av slike molekyler krever exocytosis av endosomes til celleoverflaten, der endosomal markør CD107a (også kjent som LAMP-1) er midlertidig innlemmet i cellemembranen25.
Målingen av cytokin sekresjon av T-celler krever deres isolasjon av enten Flow-assistert celle sortering eller perle-baserte separasjon analyser, som ikke kan lett utføres på stort antall prøver samtidig. Måling av intracellulære cytokiner krever imidlertid ikke noen forhånds isolasjons trinn og kan enkelt utføres på flere prøver samtidig, noe som gir en tilnærming med høyere gjennomstrømning. Som cytokiner er raskt skilles ut av T-celler, kan intracellulære nivåer være undetectable og dermed T-cellen krever stimulering for å øke basal cytokin produksjon. For å vurdere antigen-drevet cytokin produksjon, antigen anerkjent av TCR må presenteres til T-cellen ved en primet APC in vitro. I tilfeller der antigen spesifisitet er ikke kjent, en bred stimulering tilnærming er nødvendig. TCR stimulering kan etterlignet ved hjelp av anti-CD3/28 perler som gir både TCR aktivering og costimulation, som induserer cytokin produksjon og spredning. Men et mer kostnadseffektivt alternativ er bruk av PMA og ionomycin, som sammen bredt aktivere signalering trasé som fører til syntese og frigjøring av intracellulære cytokiner. Nærmere bestemt, PMA aktiverer protein kinase C (PKC) og ionomycin hever intracellulære ca2 + ioner, fører til økt celle signalering. For å bevare intracellulære innhold av cytokiner, kan denne stimulering effektivt kombineres med protein-transport hemmere brefeldin A og monensin, som blokkerer proteiner i Golgi og dermed hindre ekstracellulære utgivelse. Bruken av PMA/ionomycin er en veletablert metode for å stimulere T-celler og det er en sterk sammenheng mellom ekstracellulære-utgitt og intracellulære cytokiner26. Stimulering av T-celler med PMA og ionomycin øker også lysosome smugling til cellemembranen og dermed CD107a blir midlertidig integrert på celleoverflaten før den resirkuleres i cellen. Ved å inkludere et anti-CD107a antistoff under stimulering, er det mulig å bruke det som en markør for degranulering aktivitet25.
Denne metoden raskt fordøyer svulster for å gi en enkelt celle suspensjon. På dette punktet, kan enkelte populasjoner være direkte farget for Flow flowcytometri eller renset ved nedstrøms metoder: Flow-assistert celle sortering eller magnetisk-perle separasjon. Utarbeidelse av en enkelt celle suspensjon for flyt flowcytometri analyse gir høy gjennomstrømming analyse av flere immun celle populasjoner og deres fenotypiske markører, som gir en nøyaktig kvantifisering av immun celle nummer og fenotype.
Til slutt, fordøyelsen protokollen beskrevet her hindrer celle-overflaten markører tap og opprettholder immun celle levedyktighet, slik at immunceller til å gjennomgå ytterligere celle rensing trinn og kultur som kreves. Imidlertid har denne metoden ikke blitt testet for avledet epitelceller fra denne fordøyelsen.
Protocol
Orthotopic bukspyttkjertelen svulster ble generert som tidligere beskrevet10 i samsvar med den britiske hjemmekontor dyr og vitenskapelige prosedyrer Act 1986 og det europeiske direktivet 2010/63/EU. Alle mus ble overvåket perioperatively for tegn på smerte eller lidelse, inkludert men ikke begrenset til vekttap (> 15% i 72 h eller 20% i en gitt periode), piloereksjon, innsnevring av øyne, hevet gange, bøyd utseende, samt tegn på sårinfeksjon inkludert blødning, rødhet og sårdannelse. Tumor veksten ble overvåket av palpasjon, og ytterligere kliniske tegn som anstrengt pust, gulsott og kalde ekstremiteter ble også overvåket for å vurdere om tegn på endepunktet var nådd. Alle prosedyrer skal utføres under sterile forhold. Alle reagenser som brukes før strømnings flowcytometri farging bør tilberedes under sterile forhold.
1. utarbeidelse av tumorceller for injeksjon
- Ta en alikvot av kjeller membran fra-20 ° c og plasser på is ved 4 ° c over natten.
Merk: kjeller membran konsentrasjon kan variere fra batch til batch; Derfor må mye bestemt kjeller membran partier testes in vivo for å sikre reproduserbarhet. En ny gruppe med kjeller membran er tint på isen ved 4 ° c over natten og deretter aliquoted i brukerdefinerte alikvoter, på is, og deretter videre lagret i-20 ° c til nødvendig. Dette minimerer pipettering og fryse-tine ved bruk av kjeller membran.- Sted steril PBS ved 4 ° c over natten til chill.
- Plasser sterile 200 μL og 1000 μL pipette tips ved-20 ° c over natten til chill.
- Bruk tumorceller som er mycoplasma gratis, dyrket i minst 2-10 passasjer post-tine og i log-fase av vekst før innhøsting. Denne protokollen bruker den kvinnelige murine C57BL/6 KPC-avledet cellelinje: TB32048 gitt som en sjenerøs gave av laboratoriet til David Tuveson.
- Når tumorceller er nødvendig for innhøsting, fjerne medium fra flasken og vaske celler to ganger i PBS (forvarmet til 37 ° c).
- Legg til 2x Trypsin (forvarmet til 37 ° c) til flasken i 10 min ved 37 ° c (til en T175 kolbe, tilsett 5 mL).
- Etter 10 min, tilsett et lik volum av komplett medium (10% FBS, 1x penicillin, 1x Streptomycin i DMEM) til kolbe og distansere celler ved å forsiktig tappe kolbe og blanding godt i medium.
- Overfør cellene til et rør og sentrifuger for 5 min ved 300 x g og romtemperatur (RT).
- Fjern supernatanten og resuspend celler i fullstendig medium for celle telling.
- Sentrifuger celler igjen i 5 min ved 300 x g og RT, og fjern supernatanten.
- Resuspend celler i pre-kjølt PBS å oppnå en konsentrasjon av 1x106 celler/ml.
Merk: denne lager konsentrasjonen er klargjort for å oppnå en endelig injeksjons konsentrasjon på 1000 celler i 5 μL. Vi fant injeksjon av et lavere antall celler i en lav injeksjon volum minimert celle lekkasje og derfor økt reproduserbarhet imidlertid tumor vekst kan være celle-linje avhengig derfor brukere bør optimalisere hver cellelinje.
- Ved siden av dette plasserer en pre-aliquoted kjeller membran alikvot, på is, inn i panseret.
- Forholdet mellom den endelige løsningen av kjeller membran, PBS og tumorceller i PBS forberedt for injeksjon er 5:3:2. Derfor til en 500 μL alikvot med kjeller membran tilsett 300 μL av pre-kjølt PBS ved hjelp av en pre-kjølt 1000 μL pipette tip.
- Legg til PBS direkte til kjelleren membran alikvot å minimere pipettering.
- Hold P1000 satt til 300 μL og resuspend PBS og kjeller membranen, og pass på å holde røret på isen for å bevare kjeller membranen i flytende tilstand.
- Når du er ferdig å mate ut alle kjeller membranen fra P1000 spissen, la spissen i røret for å tillate noen kjeller membran/PBS å komme ned pipette spissen.
- Etter 5-10 min, kaste ut mer kjeller membran fra P1000 spissen tilbake i røret og la røret til å sitte på isen.
- Ta 200 μL av resuspendert tumorceller i PBS og Legg direkte til kjeller membranen ved hjelp av en pre-kjølt 200 μL pipette spissen.
- Ta en frisk pre-kjølt P1000 pipette spissen, sette pipette på 300 μL og resuspend 30-40 ganger. Et større pipette tips, satt på et lavt volum, er å foretrekke som kjeller membran kan reise opp spissen og berøre pipette spissen filteret under blanding.
- Tumorcellene er klare for injeksjon. Hold tumor celle/kjeller membran på isen under operasjonen.
2. Orthotopic injeksjon av tumorceller
- Acclimate musene i dyre anlegget i 7 dager.
- Rundt 2 h før operasjonen, barbere venstre side av magen og ryggen, deretter administrere pre-operative smertestillende subkutant under scruff av nakken (buprenorfin på 50-100 μg/kg).
- Forbered kirurgisk felt, med en varmematte å legge musen på og forheng for omkringliggende utstyr og over mus. Sterilisere alle kirurgiske verktøy; forberede nok sett med verktøy for hver mus.
- Plasser musen i en 5% isoflurane med O2 kammer til bevisstløs.
- Overfør musen, liggende på ryggen, på en varmematte og vedlikeholde anestesi ved hjelp av en maske, vanligvis på en lavere 2-3% isoflurane.
- Bekreft dyp anestesi; som er identifisert ved tap av pedal-uttak refleks når bakben er klemt og overvåke puste hastigheten forblir konstant.
- Dekk kroppen i gardin, med bare den barberte delen eksponert. Sørg for at musen er sikkert i anestesi masken.
- Ved hjelp av en steril bomulls knopp, tilsett jod løsning i en sirkulær bevegelse over barberte området: fra sentrum og sirkle ut til kanten. Gjenta prosessen igjen med frisk bomulls knopp og jod.
- Bruk skalpell til å lage et snitt på 1 cm rett over området for bukspyttkjertelen/milten (øvre venstre kvadrant). Steril saks kan også brukes til å gjøre snittet, hvis foretrukket.
- Trekk huden fra hverandre med tang. Med nye tang, finne bukhulen veggen og bruke saks for å gjøre en annen 1 cm snitt gjennom bukhulen veggen.
- Pakk bukspyttkjertelen, som kan komme med milten, fra kroppen ved hjelp av andre par tang.
- Vend forsiktig hetteglasset med tumorceller/kjeller membran flere ganger for å blande.
- Klargjør glass sprøyten med 5 μL som inneholder 1 000 tumorceller i kjeller membranen, og plasser den på varmematten i noen sekunder for å la den varmes opp.
Merk: den korte oppvarmingen av sprøyten vil tillate kjeller membranen å starte solidifying, for å gjøre det lettere å injisere uten lekker. Men dette må holdes kort, hvis igjen for lenge kjelleren membranen vil stivne helt og vil ikke bli injisert. Bruk av en glass sprøyte gjør at et lavt volum kan injiseres presist. - Hold bukspyttkjertelen på halen for å forlenge den og sett nålen direkte inn i midten av bukspyttkjertelen, parallelt med bukspyttkjertelen selv med et forsøk på å unngå synlige blodkar.
Merk: midten av bukspyttkjertelen har et stort område, og det er enklest å injisere. Imidlertid kan hodet eller halen i bukspyttkjertelen også være spesielt injisert hvis foretrukket. - Injiser langsomt 5 μL av kjeller membranen i bukspyttkjertelen og hold nålen stødig i bukspyttkjertelen i minst 30 s etter injeksjon for å la kjeller membranen stivne og forhindre lekkasjer. Kjelleren membranen skal være synlig som en liten klar boble vil ha dannet; Det kan imidlertid ikke være synlig.
Merk: større mengder tumorceller/kjeller membran kan injiseres; det nøyaktige volumet må imidlertid testes for å sikre at det ikke oppstår lekkasje. - Fjern nålen fra bukspyttkjertelen og vent for å bekrefte at det ikke har oppstått blødning. Forsiktig sette bukspyttkjertelen tilbake i bukhulen, ta vare ikke å røre kjelleren membran boblen.
- Trekk veggen sammen og utfør en enkelt Sutur, eller to avbrutte sting hvis nødvendig.
- Trekk de to sidene av huden innsnitt sammen og utføre flere avbrutte sting etter behov eller sette inn to kirurgiske klipp.
- Administrere en annen subkutan injeksjon av buprenorfin i scruff.
- Forflytning musa i en oppvarmet 37 ° c bur for det vil si 30 min stolpe-kirurgi å vedlikeholde kropp temperatur tidligere overfører rygg i en frisk bur.
- Forbered en mash diett tilgjengelig i buret, for å sikre rehydrering og kroppsvekt.
- Re-administrere postoperativ analgesi som anbefalt og se nøye etter tegn på sår åpning, smerte eller infeksjon og vekttap. Hvis du bruker kirurgiske klipp, disse kan fjernes 7-10 dager senere ved hjelp av et klipp Remover.
- Etter rundt 14 dager arret vevet vil ha helbredet tilstrekkelig til å begynne palpating magen. Monitor tumor størrelse tett via palpasjon til mus nå endepunktet.
- På endepunktet musen er hentet via cervical forvridning etterfulgt av halshogging. Huden og bukhulen åpnes ved hjelp av saks og bukspyttkjertelen tumor excised bruker tang for å holde svulsten, og saks for å fjerne omkringliggende vev.
3. fordøyelse av bukspyttkjertel svulster
- Plasser dissekert bukspyttkjertel svulst, metastatisk nettsted svulster, eller sunn bukspyttkjertelen vev i iskald PBS, og lagre på isen.
- Bruk tang til å overføre svulsten til en Petri parabolen.
- Tilsett 5,0 mL fordøyelses medium (2 mg/mL Kollagenase, 0,025 mg/mL DNase RPMI) til et 50 mL rør; Lagre på isen for å hindre at enzym aktivitet starter.
Merk: denne protokollen bruker Kollagenase type V, som har en aktivitet av ≥ 1 enheter/mg FALGPA og > 125 kollagen fordøyelsen enheter (CDU)/mg solid. Kollagenase og DNase alikvoter kan oppbevares ved-20 ° c og tint på is før bruk. Når begge er helt solubilized i sterile RPMI, kan de sendes gjennom et 0,2 μm filter for å fjerne forurensninger. Kollagenase må være fullstendig solubilized før filtrering for å unngå tap av materiale. - Ta en liten alikvot av denne løsningen for å dekke svulsten på Petri parabolen.
- Bruk sterile skalpell og tang for å kutte svulsten i små biter, omtrent mindre enn 3 mm i lengde.
- Skrap svulsten brikkene inn i røret og forsiktig invertere røret til alle brikkene er neddykket i fordøyelsen Media. Store på isen hvis andre tumor prøver må være forberedt i en batch.
- Overfør til en risting enhet i 20 min ved 37 ° c. Kontroller at alle biter av tumor er neddykket og ikke fast til kanten av røret. Hvis risting ikke er mulig, så Vortex prøven hver 5 min for å hjelpe fordøyelsen.
4. utarbeidelse av single-celle suspensjon fra fordøyd svulst
- Umiddelbart etter fordøyelsen trinn, plasserer røret på isen til langsom enzym aktivitet.
- Legg EDTA for å oppnå en endelig konsentrasjon på 20 mM og kort Vortex prøve å blande. Dette vil ytterligere langsom enzym aktivitet.
- Åpne røret og skyll eventuelle tumor fordøye av lokket på røret med friskt RPMI medium.
- Forbered en 70 μm sil (μm størrelsen på sil kan endres etter ønske) på en 50 mL åpen tube, på isen.
- Pre-Wet filteret med medium.
- Resuspend de fordøyd cellene og vaske sidene av røret ved hjelp av en 25 mL stripette, eller større. Den bredere åpningen av stripette er viktig å la den tykke fordøye å passere lett.
- Overfør alle fordøye, ved hjelp av 25 mL stripette, på sil.
- MOS svulsten på toppen av filteret ved hjelp av en 1 mL sprøyte stempel. MOS bare direkte opp og ned for å minimere skjær stress til celler.
- Vask cellene kontinuerlig gjennom sil med RPMI. Sørg for å vaske med nok kraft til å skyve celler gjennom.
- Hvis det er fortsatt materiale å mos, men RPMI stopper Flushing gjennom, vil sil bli mettet. Derfor kan du overføre prøven til et nytt filter og fortsette.
Merk: til slutt bare ekstracellulære matrise komponenter vil forbli i filteret, alle enkeltceller skal ha gått gjennom.
- Sentrifuger røret i 5 min ved 300 x g og 4 ° c.
- Forsiktig resuspend cellen pellet i fullstendig RPMI og gå direkte gjennom et annet filter for å fjerne eventuelle ekstracellulære matrise eller store celle klumper som ikke kan være tilstrekkelig resuspendert.
- På dette punktet, hvis ingen stimulering er nødvendig, umiddelbart flekker de isolerte cellene for flyt flowcytometri analyse ved å hoppe til trinn 6,1. Alternativt, resuspend dem i frysing medium (10% DMSO i FBS) og lagre ved-80 ° c etterfulgt av langtidslagring i flytende nitrogen.
Merk: fryse trinnet kan tillate rensing av immunceller på et senere tidspunkt; Imidlertid kan kvantifisering av immun celle undergrupper krever optimalisering for å bekrefte at celle tall og fenotype ikke påvirkes av fryse/tine prosessen. Ex vivo T celle stimulering er best utført på ferske tumor prøver. På dette punktet prøven kan bli ytterligere renset ved perle-baserte død-celle fjerning eller uimottakelig celle berikelse analyser om nødvendig.
5. klargjøre celler for ex vivo stimulering
- Tell cellene for å oppnå en konsentrasjon på 2 x 106/100 μL i komplett medium (RPMI 10% FBS, 1x penicillin og 1x Streptomycin).
Merk: det høye antallet av totalt celler belagt sikrer at det vil være tilstrekkelig T-celler i denne prøven til å analysere. Imidlertid kan antallet bli skalert opp eller ned avhengig av prøven tilgjengelighet og sjeldne natur T-celle delsett av interesse.- Plate 100 μL av celler i en U-bunn 96-brønn plate.
- Tilsett 100 μL av komplett medium som inneholder en 2x fremstilling av PMA/ionomycin (for å oppnå en endelig konsentrasjon 0,081 μM og 1,34 μM, som anbefalt av produsenten).
Merk: Hvis måling degranulering/exocytosis, også inkludere her en fluorescensmerkete bøyd anti-mus CD107a i Media. Et kontroll utvalg som ikke inneholder CD107a, må også utføres. - Plasser i 37 ° c inkubator med 5% CO2 for 1 time.
- Tilsett 20 μL av en 10x fremstilling av brefeldin A og monensin (for å oppnå en endelig konsentrasjon 1,06 μM og 2,0 μM, henholdsvis (som anbefalt av produsenten) i komplette medier.
Merk: Brefeldin A og monensin er protein transport hemmere og dermed blokkere ekstracellulære frigjøring av cytokiner, etc. tillater deres deteksjon av flyt flowcytometri. Hvis måling cytokin utgivelse i supernatanten av ELISA eller lignende metoder-så dette trinnet kan hoppes over. - Plasser platen i en 37 ° c inkubator med 5% CO2 for ytterligere 4 timer.
6. ekstracellulære og intracellulære farging for strømnings flowcytometri
- Fjern platen og resuspend hver brønn for å overføre alt materiale til en V-bunnplate, plassert på isen.
Merk: epitelceller, makrofager og andre tilhenger celler kan ikke fullt ut hentes av blanding. Men som nedstrøms analysen er bare på T-celler, er dette ikke et problem.- 6.1.1 sentrifuger platen i 5 minutter ved 300 x g og 4 ° c (Bruk disse betingelsene for påfølgende trinn med mindre det er oppgitt).
- Fjern supernatanten ved å sveipe platen opp ned i en skarp bevegelse.
- Resuspend i 50 μL av en fixable levedyktighet fargestoff, fremstilt i iskald PBS. Når du blanding, Still inn pipette til et lavere volum for å unngå å lage bobler.
- Ruge i 20 min ved 4 ° c, i mørket.
- Vask trinn: Tilsett 100 μL av FACS buffer, sentrifuger og fjern supernatanten.
- Resuspend hver brønn med 50 μL av anti-CD16/CD32 (2,5 μg/mL) i FACS-buffer (0,5% BSA, 2,0 mM EDTA i PBS) for å blokkere ikke-spesifikk binding av deteksjons antistoffer til FC-reseptorer.
- Ruge i 15 min ved 4 ° c, i mørket.
- Legg direkte til hver brønn en 2x mastermix av fluorokromkonjugert-bøyd anti-mus CD45, CD3, CD4 og CD8 (videre ekstracellulære markører kan legges til som ønsket) i FACS buffer.
- Ruge i 30 min ved 4 ° c, i mørket.
- Vask trinn: Tilsett 100 μL av FACS buffer, sentrifuger og fjern supernatanten.
- Tilsett 100 μL av 1x intracellulære (IC) fiksering buffer og ruge i 30 min ved RT, i mørket.
- Klargjør sentrifuger på RT.
- Tilsett 100 μL av FACS buffer, sentrifuge i 5 min ved 300 x g og RT og fjern supernatanten. Gjenta med 1x permeabilization buffer og sentrifuge i 5 min ved 300 x g; Fjern deretter supernatanten.
- Tilsett 50 μL av 1x mastermix av fluorokromkonjugert-bøyd anti-mus IFNγ, TNFα og andre intracellulære markører fremstilt i 1x permeabilization buffer.
- Ruge for 1 time ved RT, i mørket.
- Tilsett 100 μL av permeabilization buffer for å vaske. Deretter sentrifuge i 5 min på 300 x g og RT og fjern supernatanten.
- Tilsett 100 μL av FACS buffer å vaske, sentrifuger for 5 min ved 300 x g og RT og fjern supernatanten.
- Etter denne siste sentrifugering resuspend celler i et volum som er kompatibelt for strømnings flowcytometer. Det kan variere avhengig av størrelsen på FACS-rørene.
- Overfør dette volumet til egnede FACS-rør for oppkjøp.
- Dekk fra lys og lagre i kjøleskapet og skaffe prøvene innen 24 h.
Representative Results
Etter injeksjon 1000 TB32048 celler i bukspyttkjertelen, orthotopic svulster ta ca 30 dager å utvikle (figur 1A, B). Kjeller membran lekkasje under operasjonen kan føre til store svulster å danne direkte på bukhulen, som er fremtredende synlig gjennom huden (figur 1C). Vi ville fjerne disse musene fra studien. Men med gode kirurgiske ferdigheter er forekomsten av lekkasje minimert. Orthotopic svulster høstes på endepunktet kan vokse til en betydelig størrelse i C57BL/6 Wild-type mus (figur 1D). Høstet orthotopic svulster krever fordøyelsen i kollagenase/DNase i 20 min for å oppnå en enkelt celle suspensjon (figur 2). På dette punktet, tumor-avledede celler kan være belagt i en U-bunnplate ved 2 x 106 celler/brønn. Antall celler belagt kan endres avhengig av utbredelsen av T-celler i utvalget; celle nummeret kan senkes hvis T-celler er på en høy tetthet. Kontroller milt eller lymfe node prøver kan også være belagt på dette punktet for stimulering. Hver brønn stimuleres med PMA og ionomycin for 5 h og etter 1 h inkubasjons, brefeldin A og monensin tilsettes for å blokkere ekstracellulære utgivelsen av cytokiner (figur 2). Etter inkubasjons, er prøvene beiset for ekstracellulære epitopes og intracellulære cytokiner for analyse av Flow flowcytometri (figur 2).
Prøver av milt og svulster fra mus peiling orthotopic svulster ble analysert av Flow flowcytometri. Den gating strategien som brukes i Flow flowcytometri analyse for milten og orthotopic svulster utelukker rusk med FSC-A, SSC-A, doublets av FSC-A/FSC-H og SSC-A/SSC-W, så døde eller apoptotisk celler som positive for fixable levedyktighet fargestoff (Figur 3A). Immunceller er så gated på som CD45+, og T-celler videre gated på som CD3+ som CD4+ og CD8+ delsett er definert (Figur 3A). En fluorescens minus en (FMO) er utført for å bestemme bakgrunnen fluorescens for gating og en brefeldin A/monensin bare kontroll er utført for å bestemme basal produksjon av cytokiner (Figur 3B-D).
For IFNγ, inkubasjons med brefeldin A/monensin resulterte i ingen økning i IFNγ over FMO kontroll i både milt og tumor prøver. Men tillegg av PMA og ionomycin økte% av intracellulære IFNɣ oppdages i både milt og tumor-avledet CD4+ og CD8+ T celler.
Milt CD4+ og CD8+ T celler, brukes som en positiv kontroll, har en relativt høyere IFNγ produksjon enn tumor-infiltrere T celle delsett, med et gjennomsnitt på 6,60 ± 1,5% og 12,97 ± 3,4% sammenlignet med 4,81 ± 1,0% og 4,13 ± 1,3%, noe som indikerer immunsuppresjon oppstår i svulsten (Figur 3B og 4a). Ved hjelp av samme strategi for TNFα, vi visualisere at en høy andel av milt CD4+ T celler er positive for intracellulære TNFα (65,93 ± 2,3%), sammenlignet med tumor-infiltrere CD4+ T celler (22,45 ± 5,4%). Milt og tumor-infiltrere CD8+ T-celler produserer tilsvarende nivåer av TNFα (25,15 ± 3,7% og 19,91 ± 5,1%, henholdsvis) (Figur 3C, Figur 4B).
Til slutt, CD107a er en endosomal markør som uttrykkes midlertidig på celleoverflaten under exocytosis av cytotoksisk granulater og cytokiner, som sådan, er det brukt som et surrogat markør for cytotoksisitet. Fordelen med farging for CD107a under stimulering er at alle midlertidig celleoverflaten uttrykt CD107a vil bli fanget opp av fluorescerende-antistoff. De basale nivåer av CD107a er vist i brefeldin A/monensin bare behandlet celler. For milt CD8+ T celler, STIMULERING med PMA/ionomycin øker nivået av CD107a oppdaget, med den sterkeste OPPREGULERING i CD8+ celler som var 23,95 ± 3,5% CD107a+, sammenlignet med 5,8 ± 1,9% i tumor-infiltrere CD8+ celler, indikerer milt CD8+ hadde en større rate av degranulering. På den annen side, milt og tumor-infiltrere CD4+ uttrykt sammenlignbare nivåer av CD107a 9,37 ± 1,5% og 11,50 ± 1,8% (Figur 3D og 4c).
Samlet disse resultatene markere at orthotopic svulster kan genereres fra injeksjon av et svært lavt tall (1 000) av tumorceller inn i bukspyttkjertelen. Disse tumorer kan raskt fordøyd for isolering av T-celler for ex vivo stimulering. Påvisning av intracellulære cytokiner er mulig og fremhever basal nivået av immunsuppresjon av infiltrere T-celler, sammenlignet med T-celler i sekundære lymfoide organer.
Figur 1: generering av orthotopic bukspyttkjertelen svulster. (A) tidsplan for in vivo -eksperimenter. (B) makroskopisk utseende av orthotopic svulster i bukhulen (til venstre) og etter fjerning (til høyre) der svulsten som vises har blitt halvert. (C) bevis på kjeller membran lekkasje under operasjonen kan føre til svulster å utvikle som er synlige gjennom huden (øvre bilde) og form på bukhulen veggen (lavere bilde). (D) Orthotopic svulst vekter fra bukspyttkjertelen høstet fra mus som hadde nådd endepunktet (n = 22). Hvert datapunkt representerer en individuell mus, søylediagram viser bety ± SEM. Dataene i dette tallet er endret fra tidligere publisert arbeid10. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: skjematisk behandling av orthotopic svulster for ex vivo T celle stimulering. Etter høsting, bukspyttkjertel svulster er raskt fordøyd i Kollagenase (2 mg/mL) og DNase (0,025 mg/mL) for 20 min ved 37 ° c. Etter dette, celler er resuspendert ved 2 x 106/ml i komplett RPMI medier og belagt i en U-bunnplate. En stimulering cocktail av PMA og ionomycin er lagt til for 5 h, noe som peker anti-mus CD107a antistoff kan også legges til kulturen. Etter 1 h inkubasjons den intracellulære transport blokkere, brefeldin A og monensin, er lagt til. Etter ex vivo stimulering cellene overføres til en v-bunnplate for farging med fixable levedyktighet fargestoff (i PBS) i 20 min 4 ° c. Celler vaskes i FACS buffer og inkubert i anti-CD16/32 (FcR blokk) i 15 min (i FACS buffer) og deretter inkubert med ekstracellulære fluorescerende-bøyd antistoffer for ytterligere 30 min (i FACS buffer). Celler vaskes igjen i FACS buffer og resuspend i intracellulære fiksering buffer i 20 min. Etter dette er cellene vasket en gang i FACS buffer og en gang i 1x permeabilization buffer. Cellene er resuspendert for 1 h ved RT i intracellulære fluorescerende-bøyd antistoffer for 1 t (i 1x permeabilization buffer). Celler er vasket en gang i 1x permeabilization buffer og en gang i FACS buffer før blanding i FACS buffer for oppkjøp på flyten flowcytometer innen 24 h. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Flow flowcytometri analyse av ex vivo stimulert milt-og tumor-avledet T-celler. (A) Flow flowcytometri gating strategi som brukes for milt (positiv kontroll) og orthotopic svulster prøver. Celler er diskriminert fra rusk med FSC-A/SSC-A og enkeltceller er videre isolert ved hjelp av FSC-A/FSC-H og SSC-en/SSC-W. Døde eller apoptotisk celler er utelukket ved hjelp av fixable levedyktighet Dye-FVD506 og immunceller er gated on av CD45+. Etter denne CD3+ T celler og CD4+ og CD8+ delsett er definert. Data ble anskaffet på en BD-Fortessa. (B) gating strategien brukes til å kvantifisere IFNγ+ CD4+ og CD8+ T celler. En fluorescerende minus en (FMO)-kontroll brukes på fullt stimulert prøver (PMA/ionomycin/brefeldin A/monensin) for å bestemme bakgrunns fluorescens. En brefeldin A/monensin bare kontroll (B + M bare) brukes til å bestemme basal cytokin produksjon. Den fullt stimulert prøven blir deretter brukt til å beregne% IFNγ+ T celler. (C) gating strategien brukes til å kvantifisere TNFα+ CD4+ og CD8+ T celler. En FMO-kontroll brukes på fullt stimulert prøver (PMA/ionomycin/brefeldin A/monensin) for å bestemme bakgrunns fluorescens. En brefeldin A/monensin bare kontroll (B + M bare) brukes til å bestemme basal cytokin produksjon. Den fullt stimulert prøven blir deretter brukt til å beregne% TNFα+ T celler. (D) gating strategien brukes til å definere CD107a+ CD4+ og CD8+ T celler. En FMO-kontroll brukes på fullt stimulert prøver (PMA/ionomycin/brefeldin A/monensin) for å bestemme bakgrunns fluorescens. En brefeldin A/monensin bare-kontroll (kun B + M) brukes til å bestemme basal degranulering. Den fullt stimulert prøven blir deretter brukt til å beregne% CD107a+ T celler. All flyt flowcytometri data ble analysert på FlowJo Version 10.6.1. Dataene i dette tallet er endret fra tidligere publisert arbeid10. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: kvantifisering av ex vivo milt-og tumor-avledet T celle aktivitet. Andelen CD4+ og CD8+ T-celler positive for (A) IFNγ+ (B) TNFα+ og (C) CD107a+ ble kvantifisert i milten (n = 4) og tumor (n = 7) av orthotopic-tumor peiling mus. Hvert datapunkt representerer en individuell mus og feil stolper display bety ± SEM. statistisk betydning ble testet med en ikke-sammenkoblet t-test der * = p < 0,05 og * * * = p < 0.001. Alle data ble analysert ved hjelp av Prism 8. Dataene i dette tallet er endret fra tidligere publisert arbeid10. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
In vivo -modeller av kreft i bukspyttkjertelen gir uvurderlig verktøy for å forstå sykdomsprogresjon og vurdere nye legemiddel mål3. Spesielt den orthotopic modellen er en kostnadseffektiv og reproduserbar modell som kan brukes i store kohorter av mus samtidig4,27. Den orthotopic modellen gir også beslektet mikromiljøet og intakt immunsystem for tumor vekst, noe som gjør det mer hensiktsmessig enn subkutan og PDX-modeller. Vi har imidlertid funnet at noen elementer av immun infiltrasjon kan variere mellom orthotopic modellen og KPC mus, gull-standard murine modell10. En årsak til dette kan være akselerert tumorveksten sett i orthotopic modellen. Ytterligere forskjeller i tettheten av immun celle undergrupper har blitt beskrevet mellom orthotopic og subkutan modeller3,28. Selv om transgene KPC-modellen er mer kostbar og variabel6, bør derfor nøkkel funnene verifiseres i en liten KOHORT av KPC-mus der det er mulig.
Utarbeidelse av tumorceller for orthotopic kirurgi er et kritisk trinn i protokollen. Celler bør alltid være i loggen fase av vekst og mycoplasma-og smitte-fri. Orthotopic kirurgi bør utsettes hvis det er noen bekymringer over tumor cellevekst. Bruken av kjelleren membran forbedrer tumor forekomstrate over sprøytebruk celler uten den29 og reduserer celle lekkasje og dermed bukhulen spredt27. Men når suspendert i kjelleren membran, bør tumorceller raskt injiseres (innen 2 timer) for å unngå celle tap. Antall tumorceller som kreves for å generere svulster er sannsynlig å være celle-linje avhengig, og en rekke celle tall bør testes (f. eks, fra 100-100 000) som også kan bestemme tid til å nå endepunkt. Det er sannsynlig at det vil være en feilmargin når du forbereder 1 000 celler per mus for injeksjon; Derfor, hvis flere dager med kirurgi er nødvendig, behandling av grupper bør spres likt på tvers av dager for å kontrollere for batch effekter. De fleste kirurgiske skritt kan endres avhengig av preferanser; imidlertid må det utvises forsiktighet for ikke å forstyrre kjeller membranen ved utskifting av bukspyttkjertelen i bukhulen eller lukking av bukhulen. Kjeller membran lekkasje kan forårsake tumor cellevekst på bukhulen, som dannes raskt og kan resultere i å måtte ofre dyret tidligere.
Ideelt bør kreft i bukspyttkjertelen bli raskt fordøyd etter innhøsting og forberedt for ex vivo stimulering umiddelbart. Imidlertid, denne kunne ikke være mulig hvis det er en stor bakst av svulst å innhøsting, i dette tilfellet svulst burde være holdt opp på isen og oversikten inne bakst. Type, konsentrasjon og lengde på eksponering for fordøyelsesenzymer har alle blitt vist å påvirke et stort antall overflate molekyler på immunceller30,31,32. Fordøyelsen tiden er også bevisst kort til å begrense celle død33. Fordøyd celler kan fryses ned i frysing medium for langtidslagring; imidlertid vil noen celle tap oppstå når tine. Fordøyelsen prosessen kan være mindre enn optimal hvis svulsten brikkene er ikke tilstrekkelig terninger før kollagenase inkubasjons og dette vil være tydelig så hardt tumor brikker vil forbli i filteret etter fordøyelsen. Den kollagenase konsentrasjon kan senkes hvis arbeider med sunne bukspyttkjertel eller tidlig-stadium svulster; rapporter om utvinning av sunne bukspyttkjertelen ductal celler bruker betydelig lavere konsentrasjoner34. En høy grad av epitel celle død er å forvente under fordøyelsen; Imidlertid bør immunceller tolerere prosessen godt. Alternative metoder finnes for å isolere levedyktige epitelceller for organoid vekst35 eller for å bevare vevs arkitektur36.
Endringer i stimulering protokollen kan gjøres enkelt, avhengig av ønsket lese-ut og immun celle analysert (f. eks makrofager eller B-celler). Bruken av Pan-stimulering reagenser PMA/ionomycin ikke diskriminerer ikke for TCR-antigen spesifisitet, noe som gjør det nyttig når antigen er ikke kjent. Imidlertid er produksjonen av IFNɣ nært knyttet til TCR engasjement37 og både IFNɣ og TNFα produksjon er AVGJØRENDE i PDAC antitumoral responser38. PMA/ionomycin stimulering reflekterer maksimal kapasitet på T-celler til å produsere cytokiner, som kan eller ikke kan produseres av T-cellene i tumor mikromiljøet. Endogene produksjonen kan måles uten behov for stimulering; nivåer kan imidlertid være langt lavere eller umulig å oppdage. Det finnes alternative metoder for å stimulere T-celler: anti-CD3/28-belagte perler, som også ikke krever antigen eller faktisk andre immun celle populasjoner. Fordelen med denne metoden er å tillate kvantifisering av cytokin produksjon av bestemte T celle delsett uten behov for separasjon metoder. Andre markører for cytotoksisitet (granzyme B og Perforin A), aktivitet (IL-2) eller immunsuppresjon (IL-10) kan også legges til21. Høy kvalitet Flow flowcytometri antistoffer er imidlertid ikke tilgjengelig for å oppdage alle cytokiner og faktorer av interesse. Derfor, hvis det er andre programmer som ELISA krevde stimulering kan utføres uten inkludering av brefeldin A/monensin, slik at cytokin slipper inn i supernatanten. Men, av notatet, vil dette tillate total celle cytokin utgivelse og det vil ikke være mulig å bestemme hvilke celle populasjoner bidratt.
IFNγ produksjon er en dominerende funksjon i en antitumoral T celle respons, ofte brukt som en erstatning for TCR-antigen Recognition37,38. Andre in vivo -metoder som mer presist definerer antigen-spesifikke tiltak utnytte tumorceller uttrykker et kjent antigen, som OVALBUMIN eller SV40. Universal antigen kan deretter brukes ex vivo å teste T celle gjenkjennelse eller i kombinasjon med en TCR-begrenset vert mus. Alternativt, der antigen er ukjent, kvantifisering av T Cell klonal ekspansjon kan utføres av bulk-TCR sekvensering, eller mer nylig enkelt celle TCR sekvensering39,40. For å fullt ut forstå tilstanden til intratumoral T celle respons, markører indikasjon av utmattelse eller hemmende reseptorer bør også måles inkludert: CTLA-4, PD-1, LAG-3, TIM3, 2B4. I tillegg til markører for effektor T-celler (CD44 Hi, CD62lo) og proliferativ aktivitet, Ki67+ eller CSFE fortynning41,42,43,44. Samlet sett gir den orthotopic modellen en nyttig plattform for å raskt teste terapeutiske strategier, spesielt som kan modulere antitumoral T-celle respons, som deretter kan valideres på en mindre kohort av transgene, KPC, mus.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Animal Technician service og Dr. Alzbeta Talarovicova (Barthélemy Cancer Institute, Queen Mary University of London, London, Storbritannia) for deres assistanse under orthotopic kirurgi. Vi vil også gjerne takke Dr. Jennifer Morton (Beatson Institute for Cancer Research, Glasgow, Storbritannia) for hennes veiledning i kirurgisk teknikk, Dr. Cristina Ghirelli (-Barthélemy Cancer Institute, Queen Mary University of London, London, Storbritannia) for hennes råd om tumor fordøyelsen og Dr. Fabienne McClanahan (Barthélemy Cancer Institute, Queen Mary University of London, London, Storbritannia) for hennes råd om ex vivo T celle stimulering protokoller. Vi ønsker også å takke Medical Research Council (MRC), bukspyttkjertelen Cancer Research Fund (PCFR) og eggstokkene Cancer action som finansierte denne forskningen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6/0 gauge coated vicryl absorbable sutures | Ethicon | W9500T | |
| 70 μm pore-size cell strainer | Fisher Scientific | 11597522 | |
| 9 mm Clay Adams clips | VetTech Solutions | IN015A | |
| anti-CD107a PE (clone 1D4B) | Biolegend | 121612 | 1:100 to culture media |
| anti-CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | Use at final dilution 1:200 |
| anti-CD3 PerCP eFluor710 (clone 17A2) | Biolegend | 46-0032 | Use at final dilution 1:50 |
| anti-CD4 FITC (clone GK1.5) | eBioscience | 11-0041 | Use at final dilution 1:100 |
| anti-CD45 Brilliant Violet 605 (clone 30-F11) | Biolegend | 103140 | Use at final dilution 1:200 |
| anti-CD8 Brilliant Violet 421 (clone 53-6.7) | Biolegend | 100738 | Use at final dilution 1:100 |
| anti-IFN-gamma PE/Cy7 (clone XMG1.2) | Biolegend | 505826 | Use at final dilution 1:50 |
| anti-TNF-alpha Alexa Fluor 647 (clone MP6-X) | Biolegend | 506314 | Use at final dilution 1:50 |
| BD Matrigel Basement Membrane Matrix High Concentration | BD Biosciences | 354248 | Aliquot on ice and store in -20 °C |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Cell Stimulation Cocktail (500x) (phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) and ionomycin) | eBioscience | 00-4970-03 | 1x Final concentration PMA 0.081 μM, ionomycin 1.34 μM |
| Clay Adams Autoclip Applier | VetTech Solutions | IN015B | |
| Clay Adams Autoclip remover | VetTech Solutions | IN015B | |
| Collagenase Type V from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C9263 | 2 mg/mL in media |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650-100mL | |
| DMEM High glucose (4.5 g/L) with L-Glutamine | PAA | E15-810 | |
| DNase (Deoxyribonuclease I from bovine pancreas Type II-S) stock 10 mg/mL in 0.15 M NaCl | Sigma-Aldrich | D4513 | Final concentration in digestion media 0.025 mg/mL |
| Fixable Viability Dye 506 (FVD506) | eBioscience | 65-0866 | Use at 1:200 in PBS |
| Foetal calf-serum (FCS) | GE Healthcare | A15-104 | 10% in RPMI |
| Hamilton syringe 700 series, 25 μL volume, 22s gauge needle bevel tip | Fisher Scientific | 10100332 | |
| Intracellular Fixation buffer and Intracellular Permeabilisation Buffer | eBioscience | 88-8824-00 | Dilute permeabilisation buffer to 1x in H2O |
| Penicillin/streptomycin | PAA | 15140122 | 100 units/mL Penicillin, 100 μg/mL Streptomycin |
| Protein transport inhibitor cocktail (500x) (brefeldin A and monesin) | eBioscience | 00-4980-03 | 1x Final concentration Brefeldin A 10.6 μM, monensin 2 μM |
| RPMI-1640 (containing 0.3 g/L Glutamine) | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Surgical Scalpel Blade No.10 | Swann-Morton | 0501 | |
| Trypsin-EDTA Solution 10x | Sigma-Aldrich | 594-18C | Trypsin (0.1%) EDTA (0.4%) final concentration |
| U-bottomed 96 microwell plate | VWR | 734-2080 | |
| Universal Cotton Tipped Applicators - 6 inch x 100 | Medisave | UN982 | |
| V-bottomed 96 microwell plate | VWR | 735-0184 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).
- Conroy, T., et al. Current standards and new innovative approaches for treatment of pancreatic cancer. European Journal of Cancer. 57, 10-22 (2016).
- Lee, J. W., Komar, C. A., Bengsch, F., Graham, K., Beatty, G. L. Genetically engineered mouse models of pancreatic cancer: The KPC model (LSL-KrasG12D/+;LSL-Trp53R172H/+;Pdx-1-Cre), its variants, and their application in immuno-oncology drug discovery. Current Protocols in Pharmacology. 2016, (2016).
- Tseng, W. W., et al. Development of an Orthotopic Model of Invasive Pancreatic Cancer in an Immunocompetent Murine Host. Clinical Cancer Research. 16 (14), 3684-3695 (2010).
- Majumder, K., et al. A Novel Immunocompetent Mouse Model of Pancreatic Cancer with Robust Stroma: a Valuable Tool for Preclinical Evaluation of New Therapies. Journal of Gastrointestinal Surgery. 20 (1), 53-65 (2016).
- Hingorani, S. R., et al. Trp53R172H and KrasG12D cooperate to promote chromosomal instability and widely metastatic pancreatic ductal adenocarcinoma in mice. Cancer Cell. 7 (5), 469-483 (2005).
- Herreros-Villanueva, M., Hijona, E., Cosme, A., Bujanda, L. Mouse models of pancreatic cancer. World Journal of Gastroenterology. 18 (12), 1286-1294 (2012).
- Witkiewicz, A. K., et al. Integrated Patient-Derived Models Delineate Individualized Therapeutic Vulnerabilities of Pancreatic Cancer. Cell Reports. , (2016).
- Nicolle, R., et al. Pancreatic Adenocarcinoma Therapeutic Targets Revealed by Tumor-Stroma Cross-Talk Analyses in Patient-Derived Xenografts. Cell Reports. , (2017).
- Spear, S., et al. Discrepancies in the Tumor Microenvironment of Spontaneous and Orthotopic Murine Models of Pancreatic Cancer Uncover a New Immunostimulatory Phenotype for B Cells. Frontiers in Immunology. 10, 542 (2019).
- Zhu, Y., et al. CSF1/CSF1R blockade reprograms tumor-infiltrating macrophages and improves response to T-cell checkpoint immunotherapy in pancreatic cancer models. Cancer Research. , (2014).
- Lee, J. J., Huang, J., England, C. G., McNally, L. R., Frieboes, H. B. Predictive Modeling of In vivo Response to Gemcitabine in Pancreatic Cancer. PLoS Computational Biology. , (2013).
- Clark, C. E., et al. Dynamics of the Immune Reaction to Pancreatic Cancer from Inception to Invasion. Cancer Research. 67 (19), 9518-9527 (2007).
- Fukunaga, A., et al. CD8+ tumor-infiltrating lymphocytes together with CD4+ tumor-infiltrating lymphocytes and dendritic cells improve the prognosis of patients with pancreatic adenocarcinoma. Pancreas. 28 (1), 26-31 (2004).
- Tewari, N., et al. The presence of tumor-associated lymphocytes confers a good prognosis in pancreatic ductal adenocarcinoma: an immunohistochemical study of tissue microarrays. BMC Cancer. 13 (1), 436 (2013).
- Royal, R. E., et al. Phase 2 Trial of Single Agent Ipilimumab (Anti-CTLA-4) for Locally Advanced or Metastatic Pancreatic Adenocarcinoma. Journal of Immunotherapy. 33 (8), 828-833 (2010).
- Brahmer, J. R., et al. Safety and Activity of Anti–PD-L1 Antibody in Patients with Advanced Cancer. New England Journal of Medicine. 366 (26), 2455-2465 (2012).
- Winograd, R., et al. Induction of T-cell Immunity Overcomes Complete Resistance to PD-1 and CTLA-4 Blockade and Improves Survival in Pancreatic Carcinoma. Cancer Immunology Research. 3 (4), 399-411 (2015).
- Beatty, G. L., et al. CD40 Agonists Alter Tumor Stroma and Show Efficacy Against Pancreatic Carcinoma in Mice and Humans. Science. 331 (6024), 1612-1616 (2011).
- Lutz, E. R., et al. Immunotherapy converts nonimmunogenic pancreatic tumors into immunogenic foci of immune regulation. Cancer Immunology Research. 2 (7), 616-631 (2014).
- Barry, M., Bleackley, R. C. Cytotoxic T lymphocytes: all roads lead to death. Nature Reviews. Immunology. 2 (6), 401-409 (2002).
- Mojic, M., Takeda, K., Hayakawa, Y. The dark side of IFN-γ: Its role in promoting cancer immunoevasion. International Journal of Molecular Sciences. , (2018).
- Castro, F., Cardoso, A. P., Gonçalves, R. M., Serre, K., Oliveira, M. J. Interferon-gamma at the crossroads of tumor immune surveillance or evasion. Frontiers in Immunology. , (2018).
- Thiery, J., et al. Perforin pores in the endosomal membrane trigger the release of endocytosed granzyme B into the cytosol of target cells. Nature Immunology. , (2011).
- Betts, M. R., et al. Sensitive and viable identification of antigen-specific CD8+ T cells by a flow cytometric assay for degranulation. Journal of Immunological Methods. 281 (1-2), 65-78 (2003).
- Schuerwegh, A. J., De Clerck, L. S., Bridts, C. H., Stevens, W. J. Comparison of intracellular cytokine production with extracellular cytokine levels using two flow cytometric techniques. Cytometry. 55 (1), 52-58 (2003).
- Partecke, L. I., et al. A syngeneic orthotopic murine model of pancreatic adenocarcinoma in the C57/BL6 mouse using the panc02 and 6606PDA cell lines. European Surgical Research. , (2011).
- An, X., et al. Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry. Journal of Visualized Experiments. (140), (2018).
- Jiang, Y. J., et al. Establishment of an orthotopic pancreatic cancer mouse model: Cells suspended and injected in Matrigel. World Journal of Gastroenterology. , (2014).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. European Journal of Microbiology & Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).
- Trapecar, M., et al. An Optimized and Validated Method for Isolation and Characterization of Lymphocytes from HIV+ Human Gut Biopsies. AIDS Research and Human Retroviruses. , (2017).
- Liu, Q., et al. Effects of enzymatic digestion, cell culture and preservation conditions on surface CD62L expression of primary murine CD3+CD4+T cells. Biomedical Research (India). 29 (10), 2153-2159 (2018).
- Seaman, S. A., Tannan, S. C., Cao, Y., Peirce, S. M., Lin, K. Y. Differential effects of processing time and duration of collagenase digestion on human and murine fat grafts. Plastic and Reconstructive Surgery. , (2015).
- Huch, M., et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. EMBO Journal. , (2013).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. , (2015).
- Misra, S., et al. Ex vivo organotypic culture system of precision-cut slices of human pancreatic ductal adenocarcinoma. Scientific Reports. , (2019).
- Moran, A. E., Polesso, F., Weinberg, A. D. Immunotherapy Expands and Maintains the Function of High-Affinity Tumor-Infiltrating CD8 T Cells In Situ. The Journal of Immunology. , (2016).
- Stromnes, I. M., et al. T Cells Engineered against a Native Antigen Can Surmount Immunologic and Physical Barriers to Treat Pancreatic Ductal Adenocarcinoma. Cancer Cell. , (2015).
- Singh, M., et al. High-throughput targeted long-read single cell sequencing reveals the clonal and transcriptional landscape of lymphocytes. Nature Communications. 10 (1), 3120 (2019).
- Jiang, N., Schonnesen, A. A., Ma, K. Y. Opinion Ushering in Integrated T Cell Repertoire Profiling in Cancer. Trends in Cancer. 5, 85-94 (2019).
- Schietinger, A., et al. Tumor-Specific T Cell Dysfunction Is a Dynamic Antigen-Driven Differentiation Program Initiated Early during Tumorigenesis. Immunity. 45 (2), 389-401 (2016).
- Raghav, S. K., et al. Exhaustion of tumor-specific CD8+ T cells in metastases from melanoma patients. Journal of Clinical Investigation. , (2011).
- Gros, A., et al. PD-1 identifies the patient-specific in filtrating human tumors. The Journal of Clinical Investigation. , (2014).
- Miller, B. C., et al. Subsets of exhausted CD8 + T cells differentially mediate tumor control and respond to checkpoint blockade. Nature Immunology. , (2019).
