Summary
合成氟-18（18F） 标记放射性药物进行正电子发射断层扫描通常需要几个月的经验。当集成到放射性跟踪器中时，硅氟化物接受器（SiFA）图案可实现简单的18F标签协议，独立于昂贵的设备和准备训练，同时减少所需的前体数量，并利用更温和的反应条件。
Abstract
副替代二-丁二氟二苯结构图案称为氟化硅接受器（SiFA），是放射性化学家工具包中用于将放射性+18氟化物纳入示踪剂以用于正电子发射断层扫描的有用标签。与传统的放射性标记策略相比，SiFA的氟-19与18氟化物的同位素交换在室温下进行，需要最少的反应参与者。因此，副产品的形成可以忽略不计，并且大大简化了纯化。然而，虽然用于标记的前体分子和最终的放射性标记产物是同位素离散的，但它们在化学上是相同的，因此在纯化过程中是不可分割的。SiFA 标签在加工和干燥 #18氟化物的基本条件下也容易降解。"4滴法"，其中仅使用固相萃取的前4滴洗脱剂=18氟化物，减少反应中的碱量，促进减少前体的摩尔量，并减少降解。
Introduction
氟-18（109分钟的半寿命，97%正电子发射）是正电子发射断层扫描（PET）最重要的放射性核素之一，这是一种非侵入性成像方法，用于可视化和量化各种疾病放射性标记示踪剂的生物分布1。肽和蛋白质特别难以用#18氟化物标记，因为它们需要由多步合成2形成的构建基块。为了降低18个F-放射性标签的复杂性，硅氟化物接受器（SiFA）最近被引入作为可靠的工具3。SiFA组由一个与两个三级丁基组相连的中央硅原子、一个衍生苯基甲酸和一个非放射性氟原子组成。三级丁基组为硅-氟化物粘结提供水解稳定性，这是SiFA结合作为成像剂在体内应用的关键特征。
当附着在小分子或生物分子上时，SiFA构建基块通过用氟-19在纳米摩尔浓度下交换氟-19来结合放射性+18氟化物离子，而不形成大量的放射性侧产物4。此外，通过在低温下在二极丙基溶剂中标记 SiFA moiety，可快速获得高放射性化学产量。这与传统的同位素交换反应形成鲜明对比，后者产生低特定活性5的放射性追踪器。在这些情况下，必须使用大量前体（在毫克范围内）获得合理加入的18氟化物。使用SiFA的同位素交换反应效率要高得多，动力学研究和密度函数理论计算6，7证实了这一点。标记的 SiFA 可通过固相萃取轻松纯化，因为标记的 SiFA 化合物和未标记的 SiFA 化合物在化学上都是相同的。这不同于传统的放射性标记示踪剂，其中前体分子和标记产物是两种不同的化学物种，必须在放射性标签后通过高性能液相色谱法（HPLC）分离。使用SiFA构建基块，小分子、蛋白质和肽可以通过一步和两步标记协议成功地标记18氟化物（图1）4、8、9。此外，一些SiFA标记化合物是可靠的体内成像剂的血流和肿瘤10。SiFA化学的简单性使即使是未经训练的调查员也能使用#18氟化物进行放射性跟踪器合成和开发。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
注意：人们必须记住，18F是放射性同位素，因此有必要在充分屏蔽后执行所有程序。铅屏蔽适用于此类辐射。请务必在整个过程中佩戴辐射检测徽章。此外，在合成后接触任何物品之前，立即处理手套，因为它们可能受到放射性活动的污染。利用手足监视器以及煎饼盖革计数器来检查袖子、手和脚的污染。
1. 18个F-一年期的抗热干燥
注：图 2A显示了此过程的工作流图，需要约 10 分钟。
- 预置四元甲基铵 （QMA） 阴离子交换盒（材料表），通过 0.5 M K2CO3 （10 mL） 通过碳粉盒，然后是去离子水 （10 mL）。
- 反向通过预置 QMA 盒的 [18F+F-/]18O+H2O （100*500 MBq） 的水溶液，使用公到公适配器。丢弃= 18O+H2O。
注：这些步骤可以使用自动合成模块执行，也可以通过在注射器上使用附加屏蔽执行。 - 将QMA盒中的固定[18F_氟化离子的前四滴）放入制备的溶液中，即[2.2.2]克奎坦（材料表）（10毫克）、0.2M K2CO3（50 μL，10μmol），以及厚壁V-vial中的醋酸酯（1 mL），并密封小瓶。
注：只有前四滴作为大多数放射性的 #18氟化物在这些滴中的 QMA 洗脱。这减少了在+18氟化物液溶液中结转的基量，这是避免 SiFA moiety 降解所必需的。 - 密封小瓶并放置在位于热板上的 90°C 矿物油槽中。将通风针和连接到一股气体流的针头插入小瓶盖的隔膜中。等待 5 分钟，在温和的龙流下蒸发溶剂。加入1 mL的醋酸酯，促进抗热共蒸发，去除任何残留的水痕。重复此步骤 2 倍以确保干燥。
- 一旦溶剂被明显去除，停止龙流，并从小瓶盖中取出注射器，然后从油浴中取出小瓶。
- 在选择的反应溶剂中重新悬浮干燥的 =18氟化物。
注： 在这种情况下，添加醋酸酯 （1 mL） 以创建高反应性 =18F-+F- （100*500 MBq）的库存溶液。此解决方案现在可用于标记。
2. 一步 SiFA-配体标签
注：图 2B显示了此过程的工作流图，需要 15 分钟。
- 预置C-18墨盒（材料表），用乙醇（10 mL）和蒸馏水（10 mL）进行浸化。
- 将 α18F-#氟化物溶液添加到含有 SiFA 标记前体（100 μL，20+100 nmol）的反应小瓶中。在室温下，让贴标反应持续 5 分钟，而不搅拌溶液。
注： 可以添加整个库存溶液或等分，具体取决于反应所需的活动量。 - 在含有0.1M磷酸盐缓冲液（9 mL）的20 mL注射器中抽取反应混合物，并通过预置C-18盒将溶液通过预置C-18盒，以捕获标记的示踪剂。
- 用蒸馏水（5 mL）清洗墨盒，然后用乙醇（300 μL）从C-18墨盒中清除滞留的示踪剂，然后用无菌磷酸盐缓冲液稀释注射液（3 mL）。
- 将纯化的 +18F_SiFA 示踪剂通过无菌过滤器。
注：为了获得用于小动物成像的清晰 PET 想象，分区患者剂量应在 5–8 MBq 之间。对于人类使用，分区患者剂量应在200~300 MBq之间。 - 将纯化的少量等分 （±4 MBq） 注入装有反向相位 C-18 柱的 HPLC 系统中，以确认放射化学纯度大于 95%。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
简单化的SiFA同位素交换可以实现高放射性化学加入[18氟化物（60~90%）]具有最少的合成复杂度 （图1）。大多数分子可以在一个步骤内用18氟化物进行放射性标记，而不涉及HPLC进行纯化（图2）。无线电-HPLC可用于质量控制目的，其中最终产品的紫外线（UV）吸收峰值应与其总峰值大于95%的无线电峰值重合（图3）。如果放射性-HPLC色谱图显示紫外线活性或放射性杂质的形成，则前体在轻度基本放射性标记条件下可能不稳定。在加入SiFA-前体之前，可在+18氟化物溶液中加入溶解在有机溶剂中的草酸稀释溶液，以降低其基本性;然而，降低太基本性将减少18氟化物的亲核性。因此，需要草酸的摩尔量必须事先通过实验确定。或者，如果杂质的形成显著但易于管理，则在步骤 2.3 之后，HPLC 可以纯化标记的 SiFA-配体。HPLC 纯化后，仍需要步骤 2.4 及更远，以便从纯化标记的 SiFA-配体中去除 HPLC 溶剂。
如果#18氟化物不轻易融入 SiFA-配体中，则可能存在溶解度问题，并且可以选择的另一种丙酸溶剂可用于代替乙酰乙酰胺进行反应。原溶剂，如乙醇，已成功使用，但可能需要加热。通过放射性薄层色谱（无线电-TLC）监测反应，可以迅速识别对标签协议所做的任何更改的结果，因为未合并 –18氟化物将粘附在标准二氧化硅 TLC 板上的基线上。
如果标记的 SiFA-配体通过步骤 2.3 中的 C18 墨盒，如洗脱溶液中（而不是墨盒中）中出现的大部分活动所示，则可能需要更改所用墨盒的相位。Polar SiFA-配体可能需要更大的 C18 墨盒或包含具有一定亲水特性的 C18 树脂的双相墨盒。
贴有标签的 SiFA-配体也可用于体内应用，如 PET。例如，标记的小分子 =18F_SiFA-PSMA（图 4A） 用于在小鼠模型中成像植入的肿瘤异种移植物（图 4B）。SiFA示踪剂显示有利的肿瘤接收超过60分钟，这可以通过竞争抑制剂阻塞（图4C）。更令人印象深刻的是，18F标记肽 =18F_SiFAlin-TATE（图 5A） 用于通过 PET（图 5B）和 PET/CT （图 5C）11对癌症患者的转移神经内分泌肿瘤进行成像。
图 1：SiFA 18F 无线电标签工作流程概述。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：典型SiFA 18F-无线电标签协议。（A）18氟化物的亚热干燥。（B） SiFA标签反应和纯化通过固相萃取。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：用于质量控制的固相萃取纯化后的最终放射性-HPLC色谱图。请点击此处查看此图的较大版本。
图4：贴有标签的SiFA-配体的应用。（A）18F_SiFA-PSMA 无线电跟踪器的结构。（B） 在左肩上携带LNCaP异种移植肿瘤的小鼠重建图像，注射后60分钟（p.i.），带18F_SiFA-PSMA。（C） 肿瘤和肌肉组织中超过60分钟的18F_SiFA-PSMA摄入量的时间活性曲线，无论是否事先将300μg DCFPyL作为阻断剂进行给法。请点击此处查看此图的较大版本。
图5：贴有标签的SiFA-配体的应用。（A）18F_SiFA-TATE 无线电跟踪器的结构.（B） 用 +18F_SiFA-TATE 重建人类癌症患者转移内分泌肿瘤的 PET 图像。（C） 同一患者在横向和下垂平面上的 PET/CT 图像。请点击此处查看此图的较大版本。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
SiFA 标签化学是首批18种 F 标记方法之一，采用可在室温下进行的极其高效的同位素交换反应。典型的放射性化学反应依赖于通过消除或替代途径，通过反应的#18氟化物与氟反应功能形成碳-氟键。这些反应条件通常很苛刻，在极端pH值或高温下进行，并且含有副产品或反应参与者，必须使用费力和耗时的技术（如HPLC）去除。使用 SiFA 标记技术，标记前体和18种 F 标记化合物在化学上是相同的。此外，通常不观察到任何副产物，因为反应在非常温和的条件下进行。这些特性使得标记更复杂的分子（即蛋白质、自由基发生器、金属化学制品、荧光草、生物发光前体）成为可能，这些分子在反应性条件或温度升高下通常可能分解或表皮。此外，使用简单的固相萃取技术，可快速纯化18种含 F 标记的 SiFA 化合物。
这种标记方法采用"4滴法"，其中，当从QMA墨盒中剥离被困的18氟化物时，只使用基本洗脱溶液的前4滴。进行此修改是为了减少18氟化物溶液中的基量，因为如果 *18氟化物库存包含洗脱溶液中的所有基液，则会降低 SiFA moiety。以前，草酸被添加到#18氟化物库存溶液中，以减少基本性，或者使用少量的等分，而不是整个溶液，这是浪费。"4 放置方法"表示 SiFA 标记协议的最新迭代。
由于前体分子和标记的最终产物在化学上是相同的，因此在纯化过程中不能相互分离，因此最终可注射的摩尔活性完全取决于用于同位素交换的前体的数量。由于与未标记前体的竞争，在最终溶液中未标记的前体中过高，将减少标记的SiFA-ligand将其预定的分子靶点结合的机会。因此，摩尔活性完全取决于用于标记的前体量。通常，可重复的标记反应需要20~100 nmol前体，并且仅对5 nmol的前体进行标记，以达到80GBq/μmol及以上的摩尔活性。
用SiFA基块衍生的小分子和肽（例如，SiFA-八度酸酯）可以一步地贴上18氟化物的标签;然而，蛋白质的SiFA标签需要两步协议。必须制备一个小型、高反应的SiFA-假体组（例如，= 18F_SiFB），并与给定的蛋白质进行反应，然后必须用HPLC纯化标记的蛋白质。
SiFA 标签方法非常适合放射性药物试剂盒合成，因为通常不需要 HPLC 纯化和广泛的反应操作。简单的"摇动和烘烤"式套件具有单一患者剂量的SiFA-配体，无线电药物技术人员可以轻松处理，需要比自动合成单元更小的学习曲线和时间/劳动力成本。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者没有承认。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| [18F]F-/H2[18O]O | (Cyclotron produced) | - | - |
| [2.2.2]Cryptand | Aldrich | 291110 | Kryptofix 2.2.2 |
| Acetonitrile anhydrous | Aldrich | 271004 | - |
| Deionized water | Baxter | JF7623 | - |
| Ethanol, anhydrous | Commercial Alcohols | - | |
| Potassium carbonate | Aldrich | 209619 | - |
| QMA cartridge | Waters | 186004540 | QMA SepPak Light (46 mg) cartridge |
| Equipment | |||
| C-18 cartridge | Waters | WAT023501 | C-18 SepPak Light cartridge |
| C18 column | Phenomenex | 00G-4041-N0 | HPLC Luna C18 250 x 10 mm, 5 µm |
| HPLC | Agilent Technologies | - | HPLC 1200 series |
| micro-PET Scanner | Siemens | - | micro-PET R4 Scanner |
| Radio-TLC plate reader | Raytest | - | Radio-TLC Mini Gita |
| Sterile filter 0.22µm | Millipore | SLGP033RS | - |
References
- Wahl, R. L., Buchanan, J. W. Principles and practice of positron emission tomography. , Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia, PA. (2002).
- Wängler, C., Schirrmacher, R., Bartenstein, P., Wängler, C. Click-chemistry reactions in radiopharmaceutical chemistry: Fast & easy introduction of radiolabels into biomolecules for in vivo imaging. Current Medical Chemistry. 17, 1092-1116 (2010).
- Schirrmacher, R., et al. 18F-labeling of peptides by means of an organosilicon-based fluoride acceptor. Angewandte Chemie International Edition. 45, 6047-6050 (2006).
- Kostikov, A. P., et al. Oxalic acid supported Si-18F-radiofluorination: One-step radiosynthesis of N-succinimidyl 3-(di-tert-butyl[18F]fluorosilyl)benzoate ([18F]SiFB) for protein labeling. Bioconjugate Chemistry. 23 (1), 106-114 (2012).
- Cacace, F., Speranza, M., Wolf, A. P., Macgregor, R. R. Nucleophilic aromatic substitution; kinetics of fluorine-18 substitution reactions in polyfluorobenzenes. Isotopic exchange between 18F- and polyfluorobenzenes in dimethylsulfoxide. A kinetic study. Journal of Fluorine Chemistry. 21, 145-158 (1982).
- Schirrmacher, E., et al. Synthesis of p-(di-tert-butyl[18F]fluorosilyl)benzaldehyde ([18F]SiFA-A) with high specific activity by isotopic exchange: A convenient labeling synthon for the 18F-labeling of N-amino-oxy derivatized peptides. Bioconjugate Chemistry. 18, 2085-2089 (2007).
- Kostikov, A., et al. N-(4-(di-tert-butyl[18F]fluorosilyl)benzyl)-2-hydroxy-N,N-dimethylethylammonium bromide ([18F]SiFAN+Br-): A novel lead compound for the development of hydrophilic SiFA-based prosthetic groups for 18F-labeling. Journal of Fluorine Chemistry. 132, 27-34 (2011).
- Wängler, B., et al. Kit-like 18F-labeling of proteins: Synthesis of 4-(di-tert-butyl[18F]fluorosilyl)benzenethiol (Si[18F]FA-SH) labeled rat serum albumin for blood pool imaging with PET. Bioconjugate Chemistry. 20, 317-321 (2009).
- Iovkova, L., et al. para-Functionalized aryl-di-tert-butylfluorosilanes as potential labeling synthons for 18F radiopharmaceuticals. Chemistry. 15, 2140-2147 (2009).
- Wängler, C., et al. One-step 18F-labeling of carbohydrate-conjugated octreotate-derivatives containing a silicon-fluoride-acceptor (SiFA): In vitro and in vivo evaluation as tumor imaging agents for positron emission tomography (PET). Bioconjugate Chemistry. 21, 2289-2296 (2010).
- Ilhan, H., et al. First-in-human 18F-SiFAlin-TATE PET/CT for NET imaging and theranostics. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 46, 2400-2401 (2019).
