Summary
Syntesen af fluor-18 (18F) mærkede radioaktive lægemidler til Positron emission tomografi typisk kræver måneders erfaring. Når Silicon-fluorid acceptor (SiFA)-motivet inkorporeres i et radiotracer, muliggør det en simpel 18F-mærknings protokol, der er uafhængig af dyrt udstyr og forberedende træning, samtidig med at det er nødvendigt at reducere prækursorer og udnytte mildere reaktionsbetingelser.
Abstract
Den para-substituerede di-tert-butylfluorosilylbenzen strukturelle motiv kendt som Silicon-fluorid acceptor (sifa) er en nyttig tag i radio kemiker værktøjssæt til inkorporering af radioaktivt [18F] fluorid i røbestoffer til brug i Positron emission Tomography. Sammenlignet med konventionelle radioaktive strategier, isotop udveksling af fluor-19 fra SiFA med [18F] fluorid udføres ved stuetemperatur og kræver minimal reaktion deltagere. Dannelsen af biprodukter er således ubetydelig, og rensningen er meget forenklet. Men mens forløberen molekyle anvendes til mærkning og det endelige radioaktivt mærkede produkt er isotopisk diskret, de er kemisk identiske og er således uadskillelige under rensningsprocedurer. SiFA-mærket er også udsat for nedbrydning under de grundlæggende betingelser, der opstår ved behandling og tørring af [18F] fluorid. Den ' 4 drop metode ', hvor kun de første 4 dråber elueret [18F] fluorid anvendes fra solid-fase ekstraktion, reducerer mængden af base i reaktionen, letter lavere molære mængder af forløber, og reducerer nedbrydning.
Introduction
Fluor-18 (109-minutters halveringstid, 97% Positron emission) er blandt de vigtigste radionukleider til Positron emission tomografi (PET), en ikke-invasiv billeddannelses metode, der visualiserer og kvantificerer bio-distribution af radioaktivt mærkede røbestoffer til forskellige sygdomme1. Peptider og proteiner er særligt svære at mærke med [18F] fluorid, fordi de kræver byggeklodser dannet af multi-step synteser2. For at reducere kompleksiteten af 18F-radioaktiv mærkning, silicium-fluorid acceptor (sifa) blev for nylig introduceret som pålidelige værktøjer3. SiFA-Gruppen består af et centralt silicium Atom, der er forbundet med to tertiære butylgrupper, en derivatiseret phenyl-delen og et ikke-radioaktivt fluor Atom. De tertiære butyl-grupper er en hydrolytisk stabilitet i silicium fluorid-båndet, som er et kritisk træk ved in vivo-anvendelser af SiFA-konjugater som billedbehandlings midler.
Når SiFA-byggestenene er fastgjort til et lille molekyle eller biomoletin binder de radioaktive [18F] fluorid anioner ved at udveksle fluor-19 for fluor-18 ved nanomolære koncentrationer uden at danne betydelige mængder radioaktive side produkter4. Desuden opnås et højt radiokemisk udbytte hurtigt ved at beskrive sifa-delen i dipolære aprotisk opløsningsmidler ved lave temperaturer. Dette er i skarp kontrast til klassiske isotop udvekslings reaktioner, som producerer radio Tracers af lav specifik aktivitet5. I disse tilfælde skal der anvendes store mængder af prækursorer (i intervallet milligram) for at opnå en rimelig inkorporering af [18F] fluorid. Isotop udvekslings reaktioner ved hjælp af sifas er langt mere effektive, som bekræftet af kinetiske undersøgelser og tæthed funktionelle teori beregninger6,7. Mærkede SiFAs renses let ved massiv fase ekstraktion, da både de mærkede og ikke-mærkede SiFA forbindelser er kemisk identiske. Dette adskiller sig fra traditionelle radioaktivt mærkede røbestoffer, hvor forstadiet molekyle og det mærkede produkt er to forskellige kemiske arter og skal adskilles efter radioaktiv mærkning med højtydende væskekromatografi (HPLC). Ved hjælp af sifa byggeklodser, små-molekyler, proteiner og peptider kan med succes mærkes med [18F] fluorid ved en-og to-trins mærknings protokoller blottet for komplicerede rensningsprocedurer (figur 1)4,8,9. Desuden, nogle SiFA-mærket forbindelser er pålidelige in vivo Imaging agenter for blodgennemstrømning og tumorer10. Enkelheden i SiFA kemi gør det muligt for selv uuddannede efterforskere at bruge [18F] fluorid til radiotracer syntese og udvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forsigtig: man skal huske på, at 18F er en radioaktiv isotop, og derfor er det nødvendigt at udføre alle procedurer bag passende afskærmning. Bly afskærmning er passende for denne type stråling. Sørg for at bære strålings detekterings emblemer under hele denne procedure. Derudover skal du straks kassere handsker, før du rører ved noget efter syntesen, da de kan være forurenet med radioaktiv aktivitet. Udnyt hånd-Foot monitorer samt pandekage Geiger tællere til at kontrollere for forurening af ærmer, hænder og fødder.
1. azeotropisk tørring af 18F-anion
Bemærk: figur 2a viser en arbejdsproces graf over denne procedure, som tager ~ 10 min.
- Forudsæt en kvaternære methylammonium (QMA) anionbytnings patron (tabel over materialer) ved at passere 0,5 M K2Co3 (10 ml) gennem cylinderampullen efterfulgt af deioniseret vand (10 ml).
- En vandig opløsning af [18f] f-/[18o] H2o (100 − 500 MBq) gennem den forkonditionerede QMA-patron i omvendt rækkefølge med en mand til mandlig adapter. Kassér [18o] H2o.
Bemærk: disse trin kan udføres ved hjælp af et automatiseret syntese modul eller ved at bruge yderligere afskærmning på sprøjten. - Elute de første fire dråber af de faste [18F] fluorid anioner fra QMA-patronen til en forberedt opløsning på [2.2.2] Cryptand (tabel over materialer) (10 mg), 0,2 M K2Co3 (50 μl, 10 μmol) og acetonitril (1 ml) i et v-hætteglas med tyk væg, og forsegl hætteglasset.
Bemærk: kun de første fire dråber bruges, da størstedelen af det radioaktive [18F] fluorid eluppes fra QMA i disse dråber. Dette reducerer mængden af base, der fremføres i [18F] fluorid stamopløsning, hvilket er nødvendigt for at undgå nedbrydning af sifa-delen. - Forsegl hætteglasset, og Anbring det i et 90 °C mineral oliebad placeret på en kogeplade. Indsæt en udluftnings kanyle og en nål, der er forbundet med en strøm af argon-gas, ind i septum af hætteglas hætten. Vent 5 min til at fordampe opløsningsmidlerne under den blide strøm af argon. Fjern eventuelle rester af vand ved at tilsætte 1 mL acetonitril for at lette den azeotropiske Co-fordampning. Gentag dette trin 2x for at sikre tørhed.
- Når opløsningsmidlet er synligt fjernet, stop argon-strømmen, og fjern sprøjterne fra hætteglasset, og tag hætteglasset ud af olie badet.
- Resuspension af den tørrede [18F] fluorid i det foretrukne reaktions opløsningsmiddel.
Bemærk: i dette tilfælde tilsættes acetonitril (1 mL) for at skabe en stamopløsning af stærkt reaktiv [18f-] F- (100 − 500 MBq). Denne løsning kan nu bruges til mærkning.
2. et-trins SiFA-ligand mærkning
Bemærk: figur 2B viser en arbejdsproces graf over denne procedure, som tager ~ 15 min.
- Forudsætningen for en C-18 cylinderampul (tabel over materialer) ved skylning med ethanol (10 ml) og destilleret vand (10 ml).
- Tilsæt [18F-] fluorid stamopløsningen til et reaktionshætteglas, der indeholder en sifa-mærket forløber (100 μl, 20 − 100 nmol). Lad mærknings reaktionen fortsætte i 5 minutter ved stuetemperatur uden at røre opløsningen.
Bemærk: hele stamopløsningen kan tilsættes eller en alikvot, afhængigt af hvor meget aktivitet der ønskes for reaktionen. - Tegn reaktionsblandingen op i en 20 mL sprøjte, der indeholder 0,1 M fosfatbuffer (9 mL), og passere opløsningen gennem den konditionerede C-18-cylinderampul for at fælde den mærkede Tracer.
- Cylinderampullen vaskes med destilleret vand (5 mL), hvorefter den afspærrede røbestof fra C-18-patronen eluseres med ethanol (300 μL) og fortyndes med steril fosfatbuffer til injektion (3 mL).
- Den rensede [18F] sifa-Tracer passerer gennem et sterilt filter.
Bemærk: for at få et klart kæledyr forestille sig for små dyr billeddannelse, bør den partitionerede Patientdosis være mellem 5 − 8 MBq. Til human brug skal den partitionerede Patientdosis være mellem 200 − 300 MBq. - Der indsprøjtes en lille alikvot (~ 4 MBq) af den rensede [18F] sifa-Tracer på et HPLC-system udstyret med en omvendt fase C-18-søjle for at bekræfte, at den radiokemiske renhed er større end 95%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den forenklede SiFA isotop udveksling kan opnå en høj grad af radiokemisk inkorporering af [18F] fluorid (60 − 90%) med en minimal mængde syntetisk kompleksitet (figur 1). De fleste molekyler kan radioaktivt mærkes med [18F] fluorid i et trin uden at involvere HPLC til rensning (figur 2). Radio-HPLC kan anvendes til kvalitetskontrol formål, hvor det endelige produkts ultraviolette (UV) absorbans peak skal falde sammen med dets Radio højde på mere end 95% af det samlede spids areal (figur 3). Hvis radio-HPLC kromatogrammet afslører en signifikant dannelse af UV aktiv eller radioaktive urenheder, kan forløberen ikke være stabil under de mildt grundlæggende radiolabeling betingelser. En fortyndet opløsning af oxalsyre opløst i et organisk opløsningsmiddel kan tilsættes til [18F] fluorid stamopløsning før tilsætning til sifa-forløber i et forsøg på at sænke basibyen; sænkning af basiciten for meget vil imidlertid mindske den nukleolicity af [18F] fluorid anion. Således skal den molære mængde af oxalsyre, der skal eksperimentelt bestemmes på forhånd. Alternativt kan den mærkede SiFA-ligand renses af HPLC efter trin 2,3, hvis dannelsen af urenheder er signifikant, men håndterbar. Trin 2,4 og derover vil stadig være påkrævet efter HPLC-rensning for at fjerne HPLC-opløsningsmidlet fra det rensede mærkede SiFA-ligand.
Hvis [18F] fluorid ikke let inkorporeres i sifa-ligand, kan der være problemer med opløselighed, og et andet aprotisk opløsningsmiddel kan anvendes i stedet for acetonitril til reaktionen. Protic opløsningsmidler, såsom ethanol, er blevet brugt med succes, men kan kræve opvarmning. Overvågning af reaktionen med radio-tyndtlagkromatografi (Radio-TLC) kan hurtigt aide i at identificere resultatet af eventuelle ændringer i mærknings protokollen som uindarbejdet [18F] fluorid vil overholde baseline på en standard silica TLC plade.
Hvis den mærkede sifa-ligand passerer gennem C18-patronen i trin 2,3, som det fremgår af hovedparten af den aktivitet, der optræder i elueret-opløsningen og ikke i cylinderampullen, kan det være nødvendigt at ændre den anvendte cylinderampul. Polar SiFA-ligands kan have brug for en større C18-patron eller en dual-Phase-patron, der indeholder en C18-harpiks med nogle hydrofile egenskaber.
Mærket SiFA-ligands kan også bruges til in vivo applikationer såsom PET. For eksempel blev det mærkede lille molekyle[18F] sifa-PSMA (figur 4A) anvendt til at afbilde en implanteret tumor xenograft i en musemodel (figur 4B). SiFA-Tracer viste gunstige tumor optagelse over 60 min, som kunne blokeres af en konkurrencedygtig inhibitor (figur 4C). Mere imponerende, den 18f-mærkede peptid [18f] sifaLin-TATE (figur 5A) blev brugt til at billed metastaserende Neuroendokrine tumorer i en kræftpatient via PET (figur 5B) og PET/CT (figur 5C)11.
Figur 1: oversigt over arbejdsgangen for SiFA 18F-radiolabeling. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: typisk SiFA 18F-radiolabeling-protokol. A) azeotropisk tørring af [18F] fluorid. (B) sifa mærkning reaktion og rensning via solid-fase ekstraktion. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: endelig radio-HPLC-kromatogram efter massiv fase ekstraktion rensning af [18F] SIFA-PSMA, taget til kvalitetskontrol. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: anvendelse af mærkede SiFA-ligands. A) strukturen af [18F] SIFA-PSMA radiotracer. B) rekonstrueret billede af en mus, der bærer en lncap xenograft tumor over venstre skulder, 60 min efter injektion (p.i.) med [18F] SIFA-PSMA. C) tids aktivitets kurver for [18F] SIFA-PSMA-optagelse i tumor-og muskelvæv over 60 min, med eller uden forudgående indgift af 300 μg dcfpyl som blokerende middel. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: anvendelse af mærkede SiFA-ligands. A) strukturen af [18F] sifa-TATE radiotracer. B) REKONSTRUERET Pet-billede af en human cancerpatient med metastatiske endokrine tumorer med [18F] sifa-TATE. C) PET/CT billeder af den samme patient i tværgående og sagittale fly. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
SiFA mærkning kemi repræsenterer en af de første 18F-mærkning metoder, der anvender en usædvanlig effektiv isotop udveksling reaktion, som kan udføres ved stuetemperatur. En typisk radiokemisk reaktion er afhængig af dannelsen af et Carbon-fluor-bånd via reaktionen på [18F] fluorid med en fluorid-reaktiv funktionalitet gennem en Eliminerings-eller substitutions pathway. Disse reaktionsbetingelser er ofte barske, udføres ved ekstrem pH eller høj temperatur, og er lastet med biprodukter eller reaktions deltagere, der skal fjernes ved hjælp af omstændelig og tidskrævende teknikker som HPLC. Med SiFA-mærknings teknikken er mærknings forløberen og 18F-mærket sammensatte kemisk identiske. Desuden, ingen side produkter er normalt observeret, da reaktionen provenuet under meget milde betingelser. Disse funktioner gør det muligt at mærke mere komplicerede molekyler (dvs. proteiner, frie radikaler generatorer, metal-chelater, fluorophorer, bioluminescerende prækursorer), der normalt kan nedbrydes eller epimerize under mere reaktive forhold eller forhøjede temperaturer. Derudover kan 18F-mærkede sifa-holdige forbindelser renses hurtigt ved hjælp af simple solid-fase ekstraktionsteknikker.
Denne mærkningsmetode udnytter "4 drop-metoden", hvor kun de første 4 dråber af den grundlæggende elueringsopløsning anvendes, når der undslipper fanget [18F] fluorid fra en QMA-patron. Denne ændring blev foretaget for at reducere mængden af base i [18f] fluorid stamopløsning, da det ville forringe sifa-delen, hvis [18f] fluorid-bestanden indeholdt hele basen fra elueringsopløsningen. Tidligere blev oxalsyre tilsat til [18F] fluorid stamopløsning for at reducere basicity, eller en lille alikvot af bestanden blev brugt i stedet for hele løsningen, som var spild. ' 4 drop metode ' repræsenterer den seneste iteration af SiFA-mærkning protokol.
Da forstadiet molekyle og det mærkede slutprodukt er kemisk identiske, kan de ikke adskilles fra hinanden under rensning, og den molære aktivitet af den endelige injicerbare er således helt afhængig af den mængde forløber, der anvendes til isotop udvekslingen. At have for høj af en brøkdel af ikke-mærket forløber i den endelige løsning vil mindske muligheden for den mærkede SiFA-ligand at binde sit tilsigtede molekylære mål på grund af konkurrence med den ikke-mærkede forløber. Således, molær aktivitet er helt afhængig af mængden af forløber, der bruges til mærkning. Typisk er 20 − 100 nmol af forløber påkrævet for reproducerbare mærknings reaktioner, og så lidt som 5 nmol af forløber er blevet mærket med succes for at opnå molære aktiviteter af 80 GBq/μmol og højere.
Små molekyler og peptider derivatized med SiFA byggesten (f. eks SiFA-octreotate) kan mærkes med [18F] fluorid i et trin; men SiFA mærkning af proteiner kræver en to-trins protokol. En lille, meget reaktiv SiFA-proteser gruppe (f. eks. [18F] sifb) skal forberedes og omsættes med det givne protein, og det mærkede protein skal derefter RENSES af HPLC.
SiFA-mærknings metoden egner sig godt til radiofarmaceutiske kit-synteser, da HPLC-rensning og omfattende reaktions manipulation typisk ikke er nødvendig. Simple ' Shake and bake ' stil kits med enkelt Patientdosis mængder af en SiFA-ligand kunne let håndteres af radioaktive teknikere-der kræver en meget mindre indlæringskurve og tid/arbejdskraft omkostninger end med en automatiseret syntese enhed.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne har ingen bekræftelser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| [18F]F-/H2[18O]O | (Cyclotron produced) | - | - |
| [2.2.2]Cryptand | Aldrich | 291110 | Kryptofix 2.2.2 |
| Acetonitrile anhydrous | Aldrich | 271004 | - |
| Deionized water | Baxter | JF7623 | - |
| Ethanol, anhydrous | Commercial Alcohols | - | |
| Potassium carbonate | Aldrich | 209619 | - |
| QMA cartridge | Waters | 186004540 | QMA SepPak Light (46 mg) cartridge |
| Equipment | |||
| C-18 cartridge | Waters | WAT023501 | C-18 SepPak Light cartridge |
| C18 column | Phenomenex | 00G-4041-N0 | HPLC Luna C18 250 x 10 mm, 5 µm |
| HPLC | Agilent Technologies | - | HPLC 1200 series |
| micro-PET Scanner | Siemens | - | micro-PET R4 Scanner |
| Radio-TLC plate reader | Raytest | - | Radio-TLC Mini Gita |
| Sterile filter 0.22µm | Millipore | SLGP033RS | - |
References
- Wahl, R. L., Buchanan, J. W. Principles and practice of positron emission tomography. , Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia, PA. (2002).
- Wängler, C., Schirrmacher, R., Bartenstein, P., Wängler, C. Click-chemistry reactions in radiopharmaceutical chemistry: Fast & easy introduction of radiolabels into biomolecules for in vivo imaging. Current Medical Chemistry. 17, 1092-1116 (2010).
- Schirrmacher, R., et al. 18F-labeling of peptides by means of an organosilicon-based fluoride acceptor. Angewandte Chemie International Edition. 45, 6047-6050 (2006).
- Kostikov, A. P., et al. Oxalic acid supported Si-18F-radiofluorination: One-step radiosynthesis of N-succinimidyl 3-(di-tert-butyl[18F]fluorosilyl)benzoate ([18F]SiFB) for protein labeling. Bioconjugate Chemistry. 23 (1), 106-114 (2012).
- Cacace, F., Speranza, M., Wolf, A. P., Macgregor, R. R. Nucleophilic aromatic substitution; kinetics of fluorine-18 substitution reactions in polyfluorobenzenes. Isotopic exchange between 18F- and polyfluorobenzenes in dimethylsulfoxide. A kinetic study. Journal of Fluorine Chemistry. 21, 145-158 (1982).
- Schirrmacher, E., et al. Synthesis of p-(di-tert-butyl[18F]fluorosilyl)benzaldehyde ([18F]SiFA-A) with high specific activity by isotopic exchange: A convenient labeling synthon for the 18F-labeling of N-amino-oxy derivatized peptides. Bioconjugate Chemistry. 18, 2085-2089 (2007).
- Kostikov, A., et al. N-(4-(di-tert-butyl[18F]fluorosilyl)benzyl)-2-hydroxy-N,N-dimethylethylammonium bromide ([18F]SiFAN+Br-): A novel lead compound for the development of hydrophilic SiFA-based prosthetic groups for 18F-labeling. Journal of Fluorine Chemistry. 132, 27-34 (2011).
- Wängler, B., et al. Kit-like 18F-labeling of proteins: Synthesis of 4-(di-tert-butyl[18F]fluorosilyl)benzenethiol (Si[18F]FA-SH) labeled rat serum albumin for blood pool imaging with PET. Bioconjugate Chemistry. 20, 317-321 (2009).
- Iovkova, L., et al. para-Functionalized aryl-di-tert-butylfluorosilanes as potential labeling synthons for 18F radiopharmaceuticals. Chemistry. 15, 2140-2147 (2009).
- Wängler, C., et al. One-step 18F-labeling of carbohydrate-conjugated octreotate-derivatives containing a silicon-fluoride-acceptor (SiFA): In vitro and in vivo evaluation as tumor imaging agents for positron emission tomography (PET). Bioconjugate Chemistry. 21, 2289-2296 (2010).
- Ilhan, H., et al. First-in-human 18F-SiFAlin-TATE PET/CT for NET imaging and theranostics. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 46, 2400-2401 (2019).
