Summary
La synthèse des produits radiopharmaceutiques étiquetés fluor-18(18F) pour la tomographie par émission de positrons nécessite généralement des mois d'expérience. Lorsqu'il est incorporé dans un radiotraceur, le motif de l'accepteur de silicium-fluorure (SiFA) permet un simple protocole d'étiquetage F 18indépendant de l'équipement coûteux et de la formation préparatoire, tout en réduisant la quantité de précurseurs nécessaire et en utilisant des conditions de réaction plus douces.
Abstract
Le motif structurel para-substitué di-tert-butylfluorosilylbenzene connu sous le nom d'accepteur de silicium-fluorure (SiFA) est une étiquette utile dans la boîte à outils du radiochimiste pour incorporer le fluorure radioactifdansles traceurs pour l'utilisation dans la tomographie d'émission de positon. Par rapport aux stratégies conventionnelles d'étiquetage radio, l'échange isotopique de fluor-19 de SiFA avec [18F]fluorure est effectué à température ambiante et nécessite un minimum de participants à réaction. La formation de sous-produits est donc négligeable, et la purification est grandement simplifiée. Cependant, alors que la molécule précurseur utilisée pour l'étiquetage et le produit radio-étiqueté final sont isotopiquement discrets, ils sont chimiquement identiques et sont donc inséparables lors des procédures de purification. L'étiquette SiFA est également susceptible de dégradation dans les conditions de base découlant du traitement et du séchage du fluorure[18F]. La «méthode 4 gouttes», dans laquelle seulement les 4 premières gouttes de l'éluté [18F]fluorure sont utilisés à partir de l'extraction en phase solide, réduit la quantité de base dans la réaction, facilite les quantités molaires inférieures de précurseur, et réduit la dégradation.
Introduction
Fluorine-18 (109 minutes demi-vie, 97% émission de positrons) est l'un des radionucléides les plus importants pour la tomographie par émission de positrons (TEP), une méthode d'imagerie non invasive qui visualise et quantifie la biodistribution de traceurs radio-étiquetés pour diverses maladies1. Les peptides et les protéines sont particulièrement difficiles à étiqueter avec [18F]fluorure parce qu'ils nécessitent des blocs de construction formés par des synthèses en plusieurs étapes2. Pour réduire la complexité de 18F-radiolabeling, l'accepteur de silicium-fluorure (SiFA) a été récemment introduit comme outils fiables3. Le groupe SiFA se compose d'un atome central de silicium relié à deux groupes tertiaires de butyl, d'un moiety dérivé de phényl, et d'un atome fluor non radioactif. Les groupes tertiaires de butyle confèrent la stabilité hydrolytique au lien de silicium-fluorure, qui est une caractéristique critique pour des applications in vivo des conjugués de SiFA comme agents d'imagerie.
Lorsqu'ils sont attachés à une petite molécule ou biomolécule, les blocs de construction SiFA lient les anions radioactifs [18F]fluorure en échangeant du fluor-19 contre du fluor-18 à des concentrations nanomolaires sans former de quantités significatives de produits secondaires radioactifs4. En outre, un rendement radiochimique élevé est rapidement atteint en étiquetant la moiety SiFA dans les solvants aprotiques dipolar à basse température. Ceci est en contraste frappant avec les réactions d'échange isotopique classique, qui produisent des radiotraceurs de faible activité spécifique5. Dans ces cas, de grandes quantités de précurseurs (de l'ordre de milligrammes) doivent être utilisées pour obtenir une incorporation raisonnable de [18F]fluorure. Les réactions d'échange isotopique s'appliquant aux SiFA sont beaucoup plus efficaces, comme le confirment les études cinétiques et les calculs de théorie fonctionnelle de densité6,7. Les SiFA étiquetés sont facilement purifiés par l'extraction en phase solide puisque les composés SiFA étiquetés et non étiquetés sont chimiquement identiques. Cela diffère des traceurs radio-étiquetés traditionnels, où la molécule précurseur et le produit étiqueté sont deux espèces chimiques différentes et doivent être séparés après radioétiquetage par chromatographie liquide de haute performance (HPLC). L'utilisation de blocs de construction SiFA, de petites molécules, de protéines et de peptides peut être étiquetée avec succès avec [18F]fluorure par des protocoles d'étiquetage en une et deux étapes dépourvus de procédures de purification compliquées (Figure 1)4,8,9. En outre, certains composés étiquetés SiFA sont fiables agents d'imagerie in vivo pour le flux sanguin et les tumeurs10. La simplicité de la chimie SiFA permet même aux chercheurs non formés d'utiliser [18F]fluorure pour la synthèse et le développement des radiotraceurs.
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Protocol
CAUTION: Il faut garder à l'esprit que 18F est un isotope radioactif, et il est donc nécessaire d'effectuer toutes les procédures derrière un blindage adéquat. Le blindage au plomb est approprié pour ce type de rayonnement. Assurez-vous de porter des badges de détection de rayonnement tout au long de cette procédure. En outre, jetez immédiatement les gants avant de toucher quoi que ce soit après la synthèse, car ils peuvent être contaminés par une activité radioactive. Utilisez des moniteurs de pieds à la main ainsi que des compteurs Geiger à crêpes pour vérifier la contamination des manches, des mains et des pieds.
1. Séchage azéotropique de 18F-anion
REMARQUE : La figure 2A montre un graphique de flux de travail de cette procédure, qui prend 10 min.
- Préconditionner une cartouche d'échange d'anion de méthyle quaternaire (QMA)(Tableau des matériaux)en passant 0,5 M K2CO3 (10 ml) à travers la cartouche, suivie de l'eau déionisée (10 ml).
- Passer une solution aqueuse de [18F]F-/[18O]H2O (100-500 MBq) à travers la cartouche QMA préconditionnée à l'envers, à l'aide d'un adaptateur mâle à mâle. Jeter le [18O]H2O.
REMARQUE : Ces étapes peuvent être effectuées à l'aide d'un module de synthèse automatisé ou en utilisant un blindage supplémentaire sur la seringue. - Éluter les quatre premières gouttes de l'anions fixes [18F]fluorure de la cartouche QMA dans une solution préparée de [2.2.2]cryptand (Table of Materials) (10 mg), 0,2 M K2CO3 (50 L, 10 'mol), et acetonitrile (1 mL) dans un v-vial à parois épaisses, et sceller le flacon.
REMARQUE : Seules les quatre premières gouttes sont utilisées car la majorité du fluorure radioactif [18F]est élifié de l'AMQ dans ces gouttes. Cela réduit la quantité de base reportée dans la solution de stock de fluorure [18F], ce qui est nécessaire pour éviter la dégradation de la moiety SiFA. - Sceller le flacon et le placer dans un bain d'huile minérale de 90 oC placé sur une plaque chaude. Insérez une aiguille d'évent et une aiguille reliée à un jet de gaz d'argon dans le septum du bouchon de flacon. Attendez 5 min pour évaporer les solvants sous le doux flux d'argon. Enlever les traces d'eau restantes en ajoutant 1 ml d'acétonitrile pour faciliter la co-évaporation azéotrope. Répétez cette étape 2x pour assurer la sécheresse.
- Une fois que le solvant est visiblement enlevé, arrêter le flux d'argon, et retirer les seringues du bouchon de flacon, et retirer le flacon du bain d'huile.
- Resuspendre le fluorure séché [18F]dans le solvant de réaction de choix.
REMARQUE: Dans ce cas, l'acétonitrile (1 mL) est ajouté pour créer une solution de stock de très réactif [18F-]F- (100-500 MBq). Cette solution peut maintenant être utilisée pour l'étiquetage.
2. Étiquetage SiFA-ligand en une seule étape
REMARQUE : La figure 2B montre un graphique de flux de travail de cette procédure, qui prend 15 min.
- Préconditionner une cartouche C-18(Tableau des matériaux) en la rinçant à l'éthanol (10 ml) et à l'eau distillée (10 ml).
- Ajouter la solutiondestock de fluorure à une fiole de réaction contenant un précurseur étiqueté SiFA (100 l, 20 à 100 nmol). Laisser la réaction d'étiquetage se poursuivre pendant 5 min à température ambiante sans remuer la solution.
REMARQUE: La solution stock entier peut être ajouté ou un aliquot, en fonction de la quantité d'activité souhaitée pour la réaction. - Dessinez le mélange de réaction dans une seringue de 20 ml contenant un tampon de phosphate de 0,1 M (9 ml) et passez la solution à travers la cartouche C-18 préconditionnée pour piéger le traceur étiqueté.
- Laver la cartouche avec de l'eau distillée (5 ml), puis élinir le traceur piégé de la cartouche C-18 avec de l'éthanol (300 l), et diluer avec un tampon de phosphate stérile pour l'injection (3 mL).
- Passer le purifié [18F]SiFA-tracer à travers un filtre stérile.
REMARQUE : Pour obtenir une TEP claire imaginez pour l'imagerie de petit animal, la dose de patient cloisonnée devrait être entre 5-8 MBq. Pour un usage humain, la dose de patient cloisonnée devrait être entre 200-300 MBq. - Injecter un petit aliquot (4 MBq) du traceur purifié [18F]SiFA sur un système HPLC équipé d'une colonne C-18 en phase inversée pour confirmer que la pureté radiochimique est supérieure à 95 %.
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Representative Results
L'échange isotopique simpliste SiFA peut atteindre un degré élevé d'incorporation radiochimique de [18F]fluorure (60-90%) avec un minimum de complexité synthétique (Figure 1). La plupart des molécules peuvent être radio-étiquetées avec [18F]fluorure en une seule étape sans impliquer HPLC pour la purification (Figure 2). Radio-HPLC peut être utilisé à des fins de contrôle de la qualité, où le pic d'absorption ultraviolet (UV) du produit final devrait coïncider avec son pic radio supérieur à 95% de la surface de pointe totale (figure 3). Si le chromatogramme radio-HPLC révèle une formation significative d'impuretés actives ou radioactives UV, le précurseur peut ne pas être stable dans les conditions de radioétiquetage légèrement basiques. Une solution diluée d'acide oxalique dissous dans un solvant organique peut être ajoutée à la solution de stock de fluorure[18F]avant l'ajout à SiFA-précurseur dans un effort pour abaisser la base ; cependant, l'abaissement trop de la base diminuera la nucléophilicité de l'anion[18F]fluoride. Ainsi, la quantité molaire d'acide oxalique nécessaire devra être déterminée expérimentalement à l'avance. Alternativement, le SiFA-ligand étiqueté peut être purifié par HPLC après l'étape 2.3 si la formation d'impuretés est significative mais gérable. Les étapes 2.4 et au-delà seront toujours nécessaires après la purification de HPLC afin d'enlever le solvant DePLC de l'étiquette purifiée SiFA-ligand.
Si le[18F]fluorure n'est pas facilement incorporé dans SiFA-ligand, il peut y avoir des problèmes avec la solubilité et un autre solvant aprotique de choix peut être utilisé à la place de l'acétonitrile pour la réaction. Les solvants protiques, comme l'éthanol, ont été utilisés avec succès, mais peuvent nécessiter un chauffage. La surveillance de la réaction par chromatographie radio-mince (radio-TLC) peut rapidement aider à identifier les résultats de tout changement apporté au protocole d'étiquetage comme non incorporé [18F]fluorure adhérera à la ligne de base sur une plaque Standard de silice TLC.
Si l'étiquette SiFA-ligand passe à travers la cartouche C18 à l'étape 2.3, comme l'indique la majeure partie de l'activité apparaissant dans la solution éludée et non dans la cartouche, alors la phase de la cartouche utilisée peut devoir être modifiée. Polar SiFA-ligands peut avoir besoin d'une cartouche C18 plus grande ou d'une cartouche à deux phases contenant une résine C18 avec certaines caractéristiques hydrophiles.
Les SiFA-ligands étiquetés peuvent également être utilisés pour des applications in vivo telles que le PET. Par exemple, la petite molécule étiquetée [18F]SiFA-PSMA (Figure 4A) a été utilisée pour l'image d'une tumeur implantée xénogreffe dans un modèle de souris (Figure 4B). Le SiFA-tracer a montré l'acceptation favorable de tumeur plus de 60 min, qui pourrait être bloquée par un inhibiteur concurrentiel (figure 4C). Plus impressionnant encore, le peptide 18étiqueté F [18F]SiFAlin-TATE (Figure 5A) a été utilisé pour l'image de tumeurs neuroendocrines métastatiques chez un patient cancéreux via PET (Figure 5B) et PET/CT ( Figure5C)11.
Figure 1 : Aperçu du flux de travail de radioétiquetage F SiFA 18. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Protocole typique de radioétiquetage F SiFA 18. (A) Séchage azéotropique du fluorure [18F]. (B) Réaction d'étiquetage et de purification de SiFA par l'extraction de phase solide. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Chromatogramme radio-HPLC final après purification d'extraction en phase solide de [18F]SiFA-PSMA, pris pour le contrôle de la qualité. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Application de SiFA-ligands étiquetés. (A) Structure de la [18F]SiFA-PSMA radiotracer. (B) Image reconstruite d'une souris portant une tumeur de xénogreffe de LNCaP au-dessus de l'épaule gauche, 60 min post injection (p.i.) avec [18F]SiFA-PSMA. (C) Courbes d'activité temporelle pour [18F]SiFA-PSMA prise dans les tissus tumoraux et musculaires de plus de 60 min, avec ou sans administration préalable de 300 g DCFPyL comme agent de blocage. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Application de siFA-ligands étiquetés. (A) Structure du [18F]SiFA-TATE radiotracer. (B) Image reconstituée de PET d'un patient humain de cancer avec des tumeurs endocriniennes métastatiques avec [18F]SiFA-TATE. (C) PET/CT images du même patient dans les plans transversaux et sagittal. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
La chimie d'étiquetage DeFA représente l'une des 18premières méthodes d'étiquetage F utilisant une réaction d'échange isotopique extraordinairement efficace qui peut être effectuée à température ambiante. Une réaction radiochimique typique repose sur la formation d'une liaison carbone-fluore par réaction de [18F]fluorure avec une fonctionnalité fluorure-réactive par une voie d'élimination ou de substitution. Ces conditions de réaction sont souvent dures, effectuées à un pH extrême ou à haute température, et sont chargées de sous-produits ou de participants de réaction qui doivent être enlevés en utilisant des techniques laborieuses et chronophages telles que HPLC. Avec la technique d'étiquetage SiFA, le précurseur d'étiquetage et 18composés étiquetés F sont chimiquement identiques. En outre, aucun produit latéral n'est généralement observé puisque la réaction se déroule dans des conditions très douces. Ces caractéristiques permettent d'étiqueter des molécules plus compliquées (c.-à-d. protéines, générateurs de radicaux libres, chélates métalliques, fluorophores, précurseurs bioluminescents) qui peuvent normalement se décomposer ou épimeriser dans des conditions plus réactives ou des températures élevées. En outre, 18composés contenant du SiFA étiquetés F peuvent être purifiés rapidement à l'aide de simples techniques d'extraction en phase solide.
Cette méthode d'étiquetage utilise la « méthode 4 gouttes », dans laquelle seules les 4 premières gouttes de la solution d'élution de base sont utilisées lors de l'élunage piégé [18F]fluorure hors d'une cartouche QMA. Cette modification a été apportée pour réduire la quantité de base dans la solution de stock[18F]fluorure car elle dégraderait la moiety SiFA si le stock de[18F]fluorure contenait toute la base de la solution d'élution. Auparavant, l'acide oxalique a été ajouté à la solution de stock de fluorure[18F]pour réduire la base, ou un petit aliquot du stock a été utilisé au lieu de la solution entière, qui était inutile. La « méthode 4 gouttes » représente la dernière itération du protocole d'étiquetage SiFA.
Comme la molécule précurseur et le produit final étiqueté sont chimiquement identiques, ils ne peuvent pas être séparés les uns des autres pendant la purification et l'activité molaire de l'injectable final dépend donc entièrement de la quantité de précurseur utilisée pour l'échange isotopique. Le fait d'avoir une fraction trop élevée de précurseur non étiqueté dans la solution finale diminuera l'occasion pour le SiFA-ligand étiqueté de lier sa cible moléculaire prévue en raison de la concurrence avec le précurseur non étiqueté. Ainsi, l'activité molaire dépend entièrement de la quantité de précurseur qui est utilisée pour l'étiquetage. Typiquement, 20 à 100 nmol de précurseur est nécessaire pour les réactions d'étiquetage reproductibles, et aussi peu que 5 nmol de précurseur a été étiqueté avec succès pour réaliser des activités molaires de 80 GBq/mol et plus élevé.
Les petites molécules et peptides dérivés du bloc de construction SiFA (p. ex., SiFA-octreotate) peuvent être étiquetés avec [18F]fluorure en une seule étape; cependant, l'étiquetage DeFA des protéines nécessite un protocole en deux étapes. Un petit groupe siFA-prothétique hautement réactif (p. ex., [18F]SiFB) doit être préparé et réagi avec la protéine donnée, et la protéine étiquetée doit ensuite être purifiée par HPLC.
La méthodologie d'étiquetage SiFA se prête bien aux synthèses de kit radiopharmaceutiques car la purification de HPLC et la manipulation étendue de réaction ne sont généralement pas nécessaires. De simples kits de style «secouer et cuire» avec des quantités de dose patiente unique d'un SiFA-ligand pourraient être facilement manipulés par des techniciens de radiopharmacie, nécessitant une courbe d'apprentissage beaucoup plus petite et le coût du temps/ du travail qu'avec une unité de synthèse automatisée.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Les auteurs n'ont aucune reconnaissance.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| [18F]F-/H2[18O]O | (Cyclotron produced) | - | - |
| [2.2.2]Cryptand | Aldrich | 291110 | Kryptofix 2.2.2 |
| Acetonitrile anhydrous | Aldrich | 271004 | - |
| Deionized water | Baxter | JF7623 | - |
| Ethanol, anhydrous | Commercial Alcohols | - | |
| Potassium carbonate | Aldrich | 209619 | - |
| QMA cartridge | Waters | 186004540 | QMA SepPak Light (46 mg) cartridge |
| Equipment | |||
| C-18 cartridge | Waters | WAT023501 | C-18 SepPak Light cartridge |
| C18 column | Phenomenex | 00G-4041-N0 | HPLC Luna C18 250 x 10 mm, 5 µm |
| HPLC | Agilent Technologies | - | HPLC 1200 series |
| micro-PET Scanner | Siemens | - | micro-PET R4 Scanner |
| Radio-TLC plate reader | Raytest | - | Radio-TLC Mini Gita |
| Sterile filter 0.22µm | Millipore | SLGP033RS | - |
References
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