Summary
陽電子放出断層撮影のためのフッ素-18(18F)標識放射性医薬品の合成は、典型的には数ヶ月の経験を必要とする。放射性トレーサーに組み込まれると、フッ化ケイ素アクセプター(SiFA)モチーフは、高価な機器や準備トレーニングに依存しないシンプルな18Fラベリングプロトコルを可能にする一方で、必要な前駆体量を削減し、より穏やかな反応条件を利用します。
Abstract
シリコンフッ化物アクセプタ(SiFA)として知られるパラ置換ジテルト-ブチルフルオロイベンゼン構造モチーフは、放射性[18F]フッ化物を陽電子放出断層撮影に使用するためにトレーサーに組み込むための放射性化学者ツールキットに有用なタグです。従来の放射線標識戦略と比較して、SiFAから[18F]フッ化物とのフッ素-19の同位体交換は室温で行われ、最小限の反応参加者を必要とする。従って副産物の形成は無視でき、精製は大幅に簡素化される。しかし、標識に使用される前駆体分子と最終的な放射性標識生成物は同位体的に離散的であるが、それらは化学的に同一であり、したがって精製手順中に切り離すことができない。SiFAタグはまた、[18F]フッ化物の処理および乾燥に起因する基本的な条件下で分解されやすい。「4滴法」とは、溶出した[18F]フッ化物の最初の4滴のみが固相抽出から使用され、反応中の塩基量を減少させ、前駆体のモル量を低下させ、分解を低減する。
Introduction
フッ素-18(109分半減期、97%陽電子放出)は、陽電子放射断層撮影(PET)のための最も重要な放射性核種の一つであり、種々の疾患に対する放射性標識トレーサーの生体分布を可視化および定量化する非侵襲的イメージング法1.ペプチドおよびタンパク質は、多段階合成2によって形成されたビルディングブロックを必要とするため、[18F]フッ化物でラベル付けすることは特に困難である。18のFラジオ標識の複雑さを軽減するために、フッ化ケイ素アクセプタ(SiFA)が最近信頼性の高いツール3として導入された。SiFA群は、2つの第三次ブチル基に接続された中心シリコン原子、誘導体化フェニル部分、および非放射性フッ素原子からなる。第三次ブチル基は、蛍光剤としてSiFAコンジュゲートの生体内用途に重要な特徴である炭化水素化結合に加水分解安定性を付与する。
小分子または生体分子に結合すると、SiFAビルディングブロックは、放射性側産物4のかなりの量を形成することなく、ナノモル濃度でフッ素-18に対するフッ素-19を交換することにより放射性[18F]フッ化アニオンに結合する。さらに、高い放射性化学的収率は、低温で二極陽極溶媒中のSiFA部分を標識することによって迅速に達成される。これは、低比活性5の放射性トレーサーを生成する古典的な同位体交換反応とは対照的である。これらの場合、大量の前駆体(ミリグラムの範囲)を使用して、[18F]フッ化物の合理的な組み込みを得る必要があります。SiFAを用いた同位体交換反応は、運動学的研究と密度関数理論計算によって確認されるように、はるかに効率的である6,7.標識されたSiFA化合物と非標識SiFA化合物の両方が化学的に同一であるため、標識されたSiFAは固相抽出によって容易に精製される。これは、前駆体分子と標識された生成物が2つの異なる化学種であり、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)による放射性標識後に分離されなければならない従来の放射性標識トレーサーとは異なります。SiFA構成要素を用いて、小分子、タンパク質、およびペプチドを、複雑な精製手順を欠いた1段階および2段階の標識プロトコルによって[18F]フッ化物で正常に標識することができる(図1)4、8、9。さらに、いくつかのSiFA標識化合物は、血流および腫瘍10のための生体内イメージング剤において信頼性がある。SiFA化学のシンプルさは、訓練を受けていない研究者でさえ、放射性トレーサーの合成と開発に[18F]フッ化物を使用することを可能にします。
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Protocol
注意:18Fは放射性同位体であるため、適切なシールドの背後にあるすべての手順を実行する必要があることに留意する必要があります。リードシールドは、このタイプの放射線に適しています。この手順全体を通して放射線検出バッジを着用してください。さらに、放射性活性で汚染される可能性があるため、合成後に何かに触れる前に手袋を直ちに処分してください。ハンドフットモニターとパンケーキガイガーカウンターを利用して、袖、手、足の汚染をチェックします。
1. 18Fアニオンの共沸乾燥
注:図 2Aは、この手順のワークフロー グラフを示しています。
- 第4級メチルアンモニウム(QMA)アニオン交換カートリッジ(材料表)を、カートリッジを通して0.5 M K2CO3(10 mL)を通過させ、続いて脱イオン水(10mL)を付けます。
- [18F]F-/[18O]H2O (100-500 MBq) の水溶液を、男性アダプタに男性アダプタを使用して、あらかじめ調整された QMA カートリッジを逆に通して渡します。[18O]H2Oを破棄します。
注: これらの手順は、自動合成モジュールを使用するか、シリンジの追加シールドを使用して実行できます。 - 固定[18F]フッ化アニオンの最初の4滴をQMAカートリッジから[2.2.2]クリプトアンド(材料表)(10mg)、0.2 M K2CO 3(50μL、10μmol)、アセトニトリル(1mL)の調製溶液に溶出し、バイアルをシールします。
注:放射性[18F]フッ化物の大部分として最初の4滴のみが使用され、これらの滴ではQMAから溶出される。これにより、[18F]フッ化物原液中で繰り越される塩基の量が減少し、SiFA部分の劣化を避けるために必要となる。 - バイアルを密封し、ホットプレートに置かれた90°ミネラルオイルバスに入れます。バイアルキャップの中隔にアルゴンガスの流れに接続されたベント針と針を挿入します。アルゴンの穏やかな流れの下で溶媒を蒸発させるために5分待ちます。1 mL のアセトニトリルを加えて水の残りの痕跡を取り除き、共蒸発を促進します。この手順 2x を繰り返して、乾燥を確認します。
- 溶媒が目に見えて取り除かれたら、アルゴンの流れを止め、バイアルキャップから注射器を取り出し、オイルバスからバイアルを取り除きます。
- 乾燥した[18F]フッ化物を選択した反応溶媒に再サスペンドします。
注:この場合、アセトニトリル(1 mL)を追加して反応性の高い[18F-]F-(100−500 MBq)のストックソリューションを作成します。このソリューションをラベリングに使用できるようになりました。
2. ワンステップSiFA-リガンドラベリング
注:図 2Bは、この手順のワークフロー グラフを示しています。
- C-18カートリッジ(材料表)をエタノール(10mL)と蒸留水(10mL)ですすいで事前に調整します。
- SiFA標識前駆体(100μL、20−100nmol)を含む反応バイアルに[18F-]フッ化物原液を加える。標識反応を溶液をかき混ぜることなく室温で5分間進行させる。
注:反応に必要な活性の程度に応じて、原液全体を添加したり、アリコートを加えたりすることができます。 - 0.1 Mリン酸緩衝液(9mL)を含む20 mLシリンジに反応混合物を引き出し、予め調整されたC-18カートリッジを通して溶液を通過させ、標識されたトレーサーをトラップします。
- 蒸留水(5mL)でカートリッジを洗浄し、C-18カートリッジからトレーサーをエタノール(300μL)で溶出し、注射用の滅菌リン酸緩衝液(3mL)で希釈します。
- 精製した[18F]SiFAトレーサーを滅菌フィルターに通します。
注:小動物イメージングのための明確なPETの想像を得るために、分割された患者の用量は5−8 MBqの間でなければなりません。人間の使用のために、区分された忍耐強い線量は200−300 MBqの間でなければならない。 - 精製した[18F]SiFA-トレーサーの小さなアリコート(〜4 MBq)を逆相C-18カラムを搭載したHPLCシステムに注入し、放射化学純度が95%を超えることを確認します。
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Representative Results
単純なSiFA同位体交換は、[18F]フッ化物(60−90%)の高い放射性化学的組み込みを達成することができる合成の複雑さの最小量 (図 1) 。ほとんどの分子は、精製のためにHPLCを使用することなく、1ステップで[18F]フッ化物で放射性標識することができます(図2)。無線HPLCは品質管理の目的で使用することができ、最終生成物の紫外線(UV)吸光度ピークは、その無線ピークが総ピーク面積の95%を超える無線ピークと一致する必要があります(図3)。無線HPLCクロマトグラムがUV活性または放射性不純物の有意な形成を明らかにした場合、前駆体は軽度の基本的な放射線標識条件下で安定しない可能性がある。有機溶媒に溶解したシュウ酸の希薄溶液は、塩基性を低下させる努力でSiFA前駆体に添加する前に[18F]フッ化物原液に添加され得る。しかし、塩基性を下げすぎると、[18F]フッ化アニオンの求核性が低下する。したがって、必要なシュウ酸のモル量は、事前に実験的に決定する必要があります。あるいは、標識されたSiFA-リガンドは、不純物の形成が有意であるが管理可能である場合、ステップ2.3後にHPLCによって精製することができる。精製されたSiFA-リガンドからHPLC溶媒を除去するためには、HPLC精製後のステップ2.4以降が引き続き必要となります。
[18F]フッ化物が容易にSiFA-リガンドに組み込まれていない場合、溶解性に問題があり、反応にアセトニトリルの代わりに別の陽鼻腔溶媒が使用され得る。エタノールなどのプロティック溶媒は正常に使用されていますが、加熱が必要な場合があります。ラジオ薄層クロマトグラフィー(無線TLC)による反応を監視することで、ラベリングプロトコルに加えられた変更の結果を非組み込みとして特定する際に迅速に補助できる[18F]フッ化物は、標準的なシリカTLCプレート上のベースラインに付着します。
ラベル付けされた SiFA-ligand がステップ 2.3 で C18 カートリッジを通過する場合は、カートリッジではなく、溶出溶液に現れる活動の大部分によって示されるように、使用されるカートリッジの位相を変更する必要があります。Polar SiFA-リガンドは、より大きなC18カートリッジまたは親水性特性を有するC18樹脂を含む二相カートリッジを必要とする場合があります。
ラベル付きSiFA-リガンドは、PETなどの生体内アプリケーションにも使用できます。例えば、標識された小分子[18F]SiFA-PSMA(図4A)を用いて、マウスモデルに移植腫瘍異種移植片を画像化した(図4B)。SiFAトレーサーは、60分以上の良好な腫瘍取り込みを示し、競合阻害剤によって遮断される可能性がある(図4C)。より印象的なことに、18個のF標識ペプチド[18F]SiFAlin-TATE(図5A)を用いて、PET(図5B)およびPET/CT(図5C)11を介して癌患者における転移性神経内分泌腫瘍を画像化した。
図 1: SiFA 18F 無線標識ワークフローの概要この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:典型的なSiFA 18Fラジオラベル付けプロトコル(A)フッ化物[18F]の共沸乾燥。(B)SiFA標識反応及び固相抽出による精製。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:[18F]SiFA-PSMAの固相抽出精製後の最終無線-HPLCクロマトグラムを、品質管理のために採取した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:標識SiFA-リガンドの適用(A)[18F]SiFA-PSMAラジオトレーサの構造。(B)左肩上にLNCaP異種移植片腫瘍を担持するマウスの再構成画像、60分後注射(p.i.)を[18F]SiFA-PSMAと共に。(C)[18F]SiFA-PSMAが60分間以上の腫瘍および筋肉組織における取り込みのための時間活性曲線、ブロッキング剤として300μg DCFPyLの事前投与の有無にかかわらず。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:標識SiFA-リガンドの適用(A)[18F]SiFA-TATEラジオトレーサーの構造。(B)[18F]SiFA-TATEを有する転移性内分泌腫瘍を有するヒト癌患者のPET像を再構成した。(C)横面および矢状面における同じ患者のPET/CT画像。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
SiFA標識化学は、室温で行うことができる非常に効率的な同位体交換反応を採用した最初の18F標識法の1つを表す。典型的な放射性化学反応は、除去または置換経路を介してフッ化物反応性機能を有する[18F]フッ化物の反応を介して炭素フッ素結合の形成に依存する。これらの反応条件は、多くの場合、過酷であり、極端なpHまたは高温で行われ、HPLCのような手間のかかる時間のかかる技術を使用して除去されなければならない副産物または反応参加者と一緒に積み重ねられる。SiFA標識技術では、標識前駆体と18個のF標識化合物は化学的に同一である。さらに、反応が非常に穏やかな条件下で進行するので、副産物は通常観察されません。これらの特徴により、より複雑な分子(すなわち、タンパク質、フリーラジカル発生剤、金属キレート、蛍光葉、生物発光前駆体)を標識することが可能になり、より反応性の高い条件下で通常分解またはエピメ体が発生する可能性があります。さらに、18個のF標識SiFA含有化合物は、単純な固相抽出技術を用いて迅速に精製することができる。
この標識方法は「4滴法」を利用し、QMAカートリッジからフッ化物を溶出する際に、塩基性溶出液の最初の4滴のみが使用される。この改変は、[18F]フッ化物原液中の塩基量を減らすために行われた。以前は、塩基性を低下させるために[18F]フッ化物原液にシュウ酸を添加し、または溶液全体の代わりにストックの小さなアリコートを使用したが、無駄であった。'4 ドロップ方式' は、SiFA ラベリング プロトコルの最新のイテレーションを表します。
前駆体分子と標識された最終生成物は化学的に同一であるため、精製中に互いに分離することはできず、最終的な注射のモル活性は、したがって、同位体交換に使用される前駆体の量に完全に依存する。最終溶液中のラベルなし前駆体の一部が高すぎると、標識されていない前駆体との競合により、標識されたSiFA-リガンドがその意図した分子標的に結合する機会が減少する。したがって、モル活性は、標識に使用される前駆体の量に完全に依存する。典型的には、再現可能な標識反応には20−100nmolの前駆体が必要であり、前駆体の5nmolは80 GBq/μmol以上のモル活性を達成するために正常に標識された。
SiFAビルディングブロックで誘導体化された小分子およびペプチド(例えば、SiFA-オクトレオテート)は、1つのステップで[18F]フッ化物で標識することができる。しかし、タンパク質のSiFA標識には2段階のプロトコルが必要です。小さく反応性の高いSiFA-補綴基(例えば、[18F]SiFB)は、所定のタンパク質を調製して反応させなければならず、標識タンパク質はHPLCによって精製されなければならない。
SiFA標識方法論は、HPLC精製および広範な反応操作が通常必要とされないので、放射性医薬品キット合成に適しています。SiFA-ligandの単一の患者線量を持つシンプルな「シェイクとベーク」スタイルのキットは、無線薬局の技術者によって簡単に処理することができ、自動合成ユニットよりもはるかに小さな学習曲線と時間/人件費を必要とします。
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Disclosures
著者たちは何も開示する必要はない。
Acknowledgments
著者には謝辞がない。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| [18F]F-/H2[18O]O | (Cyclotron produced) | - | - |
| [2.2.2]Cryptand | Aldrich | 291110 | Kryptofix 2.2.2 |
| Acetonitrile anhydrous | Aldrich | 271004 | - |
| Deionized water | Baxter | JF7623 | - |
| Ethanol, anhydrous | Commercial Alcohols | - | |
| Potassium carbonate | Aldrich | 209619 | - |
| QMA cartridge | Waters | 186004540 | QMA SepPak Light (46 mg) cartridge |
| Equipment | |||
| C-18 cartridge | Waters | WAT023501 | C-18 SepPak Light cartridge |
| C18 column | Phenomenex | 00G-4041-N0 | HPLC Luna C18 250 x 10 mm, 5 µm |
| HPLC | Agilent Technologies | - | HPLC 1200 series |
| micro-PET Scanner | Siemens | - | micro-PET R4 Scanner |
| Radio-TLC plate reader | Raytest | - | Radio-TLC Mini Gita |
| Sterile filter 0.22µm | Millipore | SLGP033RS | - |
References
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