Summary
Syntesen av fluor-18 (18F) merket radiofarmaka for positron utslipps tomografi krever vanligvis måneders erfaring. Når innlemmet i en radiotracer, det Silicon-fluor Acceptor (SiFA) motiv setter i stand til en enkel 18F-merking protokollen det er selvstendig av kostbar utstyret og forberedende lærer opp, stund slankende forløper antallet behøvde og bruker mildere reaksjonen vilkårene.
Abstract
Den para-erstattet di-tert-butylfluorosilylbenzene strukturelle motiv kjent som silisium-fluor Acceptor (SiFA) er en nyttig kode i radiochemist verktøykasse for å innlemme radioaktivt [18F] fluor i Bevegelsesuskarphet for bruk i positron utslipp tomografi. I forhold til konvensjonelle radiolabeling strategier, isotopanrikning utveksling av fluor-19 fra SiFA med [18F] fluor utføres ved romtemperatur og krever minimal reaksjon deltakere. Dannelsen av biprodukter er dermed ubetydelig, og rensing er sterkt forenklet. Men mens Forløperen molekylet brukes til merking og det endelige radiolabeled produktet er isotopically diskret, de er kjemisk identiske og er dermed uatskillelig under rensing prosedyrer. Den SiFA koden er også utsatt for fornedrelse under de grunnleggende forholdene som oppstår ved behandling og tørking av [18F] fluor. The ' 4 drop metoden, hvor bare de første 4 dråper eluert [18F] fluor brukes fra den solide fase ekstraksjon, reduserer mengden av basen i reaksjonen, forenkler lavere molar mengder forløper, og reduserer degradering.
Introduction
Fluor-18 (109-minutters halveringstid, 97% positron utslipp) er blant de viktigste Radionuklider for positron utslipps tomografi (PET), en ikke-invasiv bilde metode som visualiserer og kvantifiserer bio-fordelingen av radiolabeled Bevegelsesuskarphet for ulike sykdommer1. Peptider og proteiner er spesielt vanskelig å merke med [18F] fluor fordi de krever byggeklosser dannet av multi-Step synteser2. For å redusere kompleksiteten av 18F-radiolabeling, silisium-fluor Acceptor (SiFA) ble nylig introdusert som pålitelige verktøy3. Det SiFA gruppe består av en sentral Silicon Atom koplet å to tertiær butyl holdene, en derivatized fenyl moiety, og en ingen-radioaktiv fluor Atom. Den tertiær butyl grupper formidle hydrolytisk stabilitet til silisium-fluor obligasjon, som er en kritisk funksjon for in vivo anvendelser av SiFA konjugater som tenkelig agenter.
Når festet til et lite molekyl eller biomolekyler, SiFA byggesteinene binde radioaktivt [18F] fluor anioner ved å utveksle fluor-19 for fluor-18 ved nanomolar konsentrasjoner uten å danne betydelige mengder radioaktive side produkter4. Videre oppnås en høy radio kjemisk avkastning raskt ved å merke SiFA moiety i dipolar aprotiske løsemidler ved lave temperaturer. Dette er i sterk kontrast til klassiske isotopanrikning utveksle reaksjoner, som produserer radiotracers av lav spesifikk aktivitet5. I disse tilfellene må store mengder forløper (i størrelsesområdet milligram) brukes til å oppnå rimelig innlemmelse av [18F] fluor. Isotopanrikning Exchange-reaksjoner ved hjelp av SiFAs er langt mer effektive, som bekreftet av kinetisk studier og tetthet funksjonell teori beregninger6,7. Benevnt SiFAs er lett renset av robust-Phase trekking siden begge to det benevnt og umerkede SiFA forbindelser er kjemisk identisk. Dette er forskjellig fra tradisjonelle radiolabeled bevegelsesuskarphet, der forløper molekylet og det merkede produktet er to forskjellige kjemiske arter og må skilles etter radiolabeling av høy ytelse flytende kromatografi (HPLC). Ved hjelp av SiFA byggeklosser, små molekyler, proteiner og peptider kan med hell merkes med [18F] fluor med ett og to-trinns merking protokoller blottet for kompliserte rensing prosedyrer (figur 1)4,8,9. Videre, noen SiFA-merket forbindelser er pålitelige in vivo Imaging agenter for blodstrøm og svulster10. Enkelheten i SiFA kjemi gjør at selv uerfarne etterforskere til å bruke [18F] fluor for radiotracer syntese og utvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
FORSIKTIG: man må huske på at 18F er en radioaktiv isotop, og derfor er det nødvendig å utføre alle prosedyrer bak tilstrekkelig skjerming. Bly skjerming er hensiktsmessig for denne type stråling. Sørg for å bruke merker for strålings deteksjon gjennom hele denne prosedyren. I tillegg, umiddelbart kast hansker før du berører noe etter syntese, som de kan være forurenset med radioaktiv aktivitet. Bruk hånd-fots skjermer samt pannekake Geiger tellere for å se etter forurensning av ermer, hender og føtter.
1. Azeotropic tørking av 18F-anion
Merk: figur 2a viser en arbeidsflyt graf av denne prosedyren, som tar ~ 10 min.
- Forutsetning en kvartær methyl ammonium (QMA) anion utvekslings patron (tabell av materialer) ved å passere 0,5 M K2co3 (10 ml) gjennom patronen, etterfulgt av deionisert vann (10 ml).
- Passerer en vandig løsning av [18F] F-/[18O] H2O (100 − 500 MBq) gjennom preconditioned QMA kassetten i revers, ved hjelp av en mannlig til mannlig adapter. Kast [18O] H2o.
Merk: disse trinnene kan utføres ved hjelp av en automatisert syntese modul, eller ved hjelp av ekstra skjerming på sprøyten. - Eluere de fire første dråper av faste [18F] fluor ANIONER fra QMA kassetten til en forberedt løsning av [2.2.2] Cryptand (tabell over materialer) (10 mg), 0,2 M K2co3 (50 μL, 10 mikromol), og acetonitril (1 ml) i en tykk-vegger v-hetteglass, og forsegle hetteglasset.
Merk: bare de første fire dråper brukes som flertallet av radioaktivt [18F] fluor er ELUERT av QMA i disse dråpene. Dette reduserer mengden av basen båret frem i [18F] fluor lagerløsning, som er nødvendig for å unngå degradering av SiFA moiety. - Forsegle hetteglasset og plasser i et 90 ° c mineralolje bad plassert på en varm plate. Sett en lufte nål og en nål koblet til en strøm av Argon-gass i septum på hetteglass lokket. Vent 5 min for å fordampe løsemidler under den milde strømmen av Argon. Fjern eventuelle gjenværende spor av vann ved å tilsette 1 mL acetonitril for å lette azeotropic co-fordampning. Gjenta dette trinnet 2x for å sikre tørrhet.
- Når løsningsmidlet er synlig fjernet, stans Argon-flyten og fjern sprøyter fra hetteglass lokket, og ta hetteglasset ut av olje badet.
- Resuspend den tørkede [18F] fluor i reaksjonen løsemiddel av valget.
Merk: i dette tilfellet tilsettes acetonitril (1 mL) for å lage en lagerløsning av svært reaktiv [18f-] F- (100 − 500 MBq). Denne løsningen kan nå brukes til merking.
2. ett-trinns SiFA-ligand merking
Merk: figur 2B viser en arbeidsflyt graf av denne prosedyren, som tar ~ 15 min.
- Forutsetning en C-18 kassett (tabell av materialer) ved å skylle den med etanol (10 ml) og destillert vann (10 ml).
- Legg til [18F-] fluor Stock-løsningen i et reaksjons hetteglass som inneholder en SiFA forløper (100 μL, 20 − 100 nmol). La merkings reaksjonen fortsette i 5 minutter ved romtemperatur uten å røre løsningen.
Merk: hele lager løsningen kan legges til eller en alikvot, avhengig av hvor mye aktivitet som ønskes for reaksjonen. - Tegn opp reaksjonsblandingen i en 20 mL sprøyte som inneholder 0,1 M fosfat buffer (9 mL) og Send løsningen gjennom den preconditioned C-18-kassetten for å overtrykke merket Tracer.
- Vask kassetten med destillert vann (5 mL), deretter eluere fanget Tracer fra C-18 kassett med etanol (300 μL), og fortynne med steril fosfat buffer for injeksjon (3 mL).
- Pass renset [18F] SiFA-Tracer gjennom et sterilt filter.
Merk: for å få et klart kjæledyr forestille seg for små dyr Imaging, bør partisjonert pasienten dosen være mellom 5 − 8 MBq. For menneskelig bruk bør partisjonert pasientdose være mellom 200 − 300 MBq. - Injiser en liten alikvot (~ 4 MBq) av renset [18F] SiFA-Tracer på et HPLC system utstyrt med en reversert-fase C-18 kolonne for å bekrefte at radio kjemisk renhet er større enn 95%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den forenklede SiFA isotopanrikning utveksling kan oppnå høy grad av radio kjemisk inkorporering av [18F] fluor (60 − 90%) med et minimum av syntetisk kompleksitet (figur 1). De fleste molekyler kan være radiolabeled med [18F] fluor i ett trinn uten å involvere HPLC for rensing (figur 2). Radio-HPLC kan brukes til kvalitetskontroll, karakterisert ved at den ultrafiolette (UV) absorbansen toppen av det endelige produktet bør falle sammen med sin radio topp større enn 95% totalt topp område (Figur 3). Hvis radio-HPLC kromatogram avslører en betydelig dannelse av UV aktive eller radioaktive urenheter, kan forløperen ikke være stabil under mildt grunnleggende radiolabeling forhold. En fortynnet løsning av oksalsyre syre oppløst i en organisk løsemiddel kan tilsettes til [18F] fluor lagerløsning før tillegg til SiFA-forløperen i et forsøk på å senke basicitet; men senke basicitet for mye vil minske nucleophilicity av [18F] fluor anion. Dermed vil molar mengden av oksalsyre syre nødvendig må eksperimentelt bestemmes på forhånd. Alternativt kan den merkede SiFA-ligand renses ved HPLC etter trinn 2,3 Hvis dannelsen av urenheter er betydelig, men håndterlig. Trinn 2,4 og utover vil fortsatt være nødvendig etter HPLC rensing for å fjerne HPLC løsemiddel fra renset merket SiFA-ligand.
Hvis [18F] fluor ikke er lett innlemmet i SiFA-ligand, kan det være problemer med løselighet og en annen aprotiske løsemiddel av valget kan brukes i stedet for acetonitril for reaksjonen. Protic løsemidler, som etanol, har blitt brukt med hell, men kan kreve oppvarming. Overvåking reaksjonen av radio-tynne-lags kromatografi (radio-TLC) kan raskt aide å identifisere utfallet av eventuelle endringer i merkings protokollen som kommunefritt [18F] fluor vil følge Baseline på en standard silica TLC plate.
Hvis merket SiFA-ligand passerer gjennom C18 kassetten i trinn 2,3, som indikert av mesteparten av aktiviteten som vises i den eluert løsningen og ikke i kassetten, kan det hende at fase av kassetten som brukes må endres. Polar SiFA-ligander kan trenge en større C18 kassett eller en dual-fase kassett som inneholder en C18 harpiks med noen hydrofile egenskaper.
Merket SiFA-ligander kan også brukes til in vivo-programmer, for eksempel PET. For eksempel, det merkede lille molekylet [18F] SIFA-PSMA (Figur 4A) ble brukt til å avbilde en implantert tumor Xenograft i en musemodell (Figur 4B). Den SiFA-Tracer vist gunstige tumor opptak over 60 min, som kan bli blokkert av en konkurransedyktig inhibitor (Figur 4C). Mer imponerende, de 18f-merket peptid [18F] SiFALin-TATE (figur 5A) ble brukt til bildet metastatisk Nevroendokrine svulster i en kreft pasient via kjæledyr (figur 5B) og pet/CT (figur 5C)11.
Figur 1: oversikt over SiFA 18F-radiolabeling arbeidsflyt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: typisk SiFA 18F-radiolabeling protokoll. (A) Azeotropic tørking av [18F] fluor. (B) SiFA merking reaksjon og rensing via solid-fase ekstraksjon. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Final radio-HPLC kromatogram etter en solid fase utvinnings rensing av [18F] SiFA-PSMA, tatt for kvalitetskontroll. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: anvendelse av merket SiFA-ligander. (A) strukturen i [18F] SiFA-PSMA radiotracer. (B) rekonstruert bilde av en mus som bærer en LNCaP xenograft svulst over venstre skulder, 60 min innlegg injeksjon (p.i.) med [18F] SiFA-PSMA. (C) tid-aktivitet kurver for [18F] SiFA-PSMA opptak i tumor og muskel vev over 60 min, med eller uten tidligere administrering av 300 μg DCFPyL som en blokkerings agent. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: anvendelse av merket SiFA-ligander. (A) strukturen i [18F] SiFA-TATE radiotracer. (B) rekonstruert pet bilde av en menneskelig kreft pasient med metastatisk endokrine svulster med [18F] SiFA-TATE. (C) pet/CT bilder av samme pasient i tverrgående og sagittal fly. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
SiFA merking kjemi representerer en av de første 18F-merking metoder ansette en usedvanlig effektiv isotopanrikning utveksling reaksjon som kan utføres ved romtemperatur. En typisk radio kjemisk reaksjon er avhengig av dannelsen av en karbon-fluor obligasjon via reaksjonen til [18F] fluor med en fluor-reaktiv funksjonalitet gjennom en eliminering eller substitusjon sti. Disse reaksjons forholdene er ofte tøffe, utføres ved ekstrem pH eller høy temperatur, og er lastet med biprodukter eller reaksjons deltakere som må fjernes ved hjelp av arbeidskrevende og tidkrevende teknikker som HPLC. Med SiFA-merking teknikk, merking forløper og 18F-merket sammensatte er kjemisk identiske. Dessuten er ingen side produkter vanligvis observert siden reaksjonen fortsetter under svært milde forhold. Disse funksjonene gjør det mulig å merke mer kompliserte molekyler (dvs. proteiner, frie radikaler generatorer, metall-Chelates, fluorophores, Puerto Mosquito forløpere) som normalt kan brytes ned eller epimerize under mer reaktive forhold eller forhøyede temperaturer. I tillegg kan 18F-merket SiFA-inneholdende forbindelser bli renset raskt ved hjelp av enkle solid-fase utvinning teknikker.
Dette merking metodikk utnytter ' 4 drop metoden, hvor bare de første 4 dråper av grunnleggende eluering løsningen brukes når tent fanget [18F] fluor ut av en QMA kassett. Denne endringen ble gjort for å redusere mengden av base i [18F] fluor lagerløsning som det ville svekke SiFA moiety hvis [18F] fluor lager inneholdt alle base fra eluering løsning. Tidligere ble oksalsyre syre lagt til [18F] fluor lagerløsning for å redusere basicitet, eller en liten alikvot av aksjen ble brukt i stedet for hele løsningen, som var bortkastet. Metoden ' 4 drop ' representerer den siste gjentakelsen av protokollen for SiFA-merking.
Som forløperen molekyl og merket endelige produktet er kjemisk identiske, kan de ikke skilles fra hverandre under rensing og molar aktivitet av den endelige injectable er dermed helt avhengig av mengden av forløperen som brukes for isotopanrikning utveksling. Etter å ha for høyt av en brøkdel av umerkede forløper i den endelige løsningen vil redusere muligheten for den merkede SiFA-ligand å binde sin tiltenkte molekylære målet på grunn av konkurranse med umerkede forløper. Dermed er molar aktiviteten helt avhengig av mengden av forløperen som brukes for merking. Vanligvis er 20 − 100 nmol av forløperen kreves for reproduserbar merking reaksjoner, og så lite som 5 nmol av forløperen er merket med hell for å oppnå molar aktiviteter 80 GBq/mikromol og høyere.
Små molekyler og peptider som derivatized med SiFA (f.eks. SiFA-octreotate) kan merkes med [18F] fluor i ett trinn; SiFA merking av proteiner krever imidlertid en to-trinns protokoll. En liten, svært reaktiv SiFA-protese gruppe (f. eks, [18F] SiFB) må være forberedt og reagerte med det gitte proteinet, og det merkede proteinet skal deretter renses av HPLC.
Den SiFA-merking metodikk egner seg godt til radiofarmaka Kit synteser som HPLC rensing og omfattende reaksjon manipulasjon er vanligvis ikke nødvendig. Simple ' riste og bake ' stil kits med enkelt pasientdose mengder av en SiFA-ligand kan lett håndteres av Farmasi teknikere-krever en mye mindre læringskurve og tid/arbeidskraftkostnader enn med en automatisert syntese enhet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne har ingen bekreftelser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| [18F]F-/H2[18O]O | (Cyclotron produced) | - | - |
| [2.2.2]Cryptand | Aldrich | 291110 | Kryptofix 2.2.2 |
| Acetonitrile anhydrous | Aldrich | 271004 | - |
| Deionized water | Baxter | JF7623 | - |
| Ethanol, anhydrous | Commercial Alcohols | - | |
| Potassium carbonate | Aldrich | 209619 | - |
| QMA cartridge | Waters | 186004540 | QMA SepPak Light (46 mg) cartridge |
| Equipment | |||
| C-18 cartridge | Waters | WAT023501 | C-18 SepPak Light cartridge |
| C18 column | Phenomenex | 00G-4041-N0 | HPLC Luna C18 250 x 10 mm, 5 µm |
| HPLC | Agilent Technologies | - | HPLC 1200 series |
| micro-PET Scanner | Siemens | - | micro-PET R4 Scanner |
| Radio-TLC plate reader | Raytest | - | Radio-TLC Mini Gita |
| Sterile filter 0.22µm | Millipore | SLGP033RS | - |
References
- Wahl, R. L., Buchanan, J. W. Principles and practice of positron emission tomography. , Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia, PA. (2002).
- Wängler, C., Schirrmacher, R., Bartenstein, P., Wängler, C. Click-chemistry reactions in radiopharmaceutical chemistry: Fast & easy introduction of radiolabels into biomolecules for in vivo imaging. Current Medical Chemistry. 17, 1092-1116 (2010).
- Schirrmacher, R., et al. 18F-labeling of peptides by means of an organosilicon-based fluoride acceptor. Angewandte Chemie International Edition. 45, 6047-6050 (2006).
- Kostikov, A. P., et al. Oxalic acid supported Si-18F-radiofluorination: One-step radiosynthesis of N-succinimidyl 3-(di-tert-butyl[18F]fluorosilyl)benzoate ([18F]SiFB) for protein labeling. Bioconjugate Chemistry. 23 (1), 106-114 (2012).
- Cacace, F., Speranza, M., Wolf, A. P., Macgregor, R. R. Nucleophilic aromatic substitution; kinetics of fluorine-18 substitution reactions in polyfluorobenzenes. Isotopic exchange between 18F- and polyfluorobenzenes in dimethylsulfoxide. A kinetic study. Journal of Fluorine Chemistry. 21, 145-158 (1982).
- Schirrmacher, E., et al. Synthesis of p-(di-tert-butyl[18F]fluorosilyl)benzaldehyde ([18F]SiFA-A) with high specific activity by isotopic exchange: A convenient labeling synthon for the 18F-labeling of N-amino-oxy derivatized peptides. Bioconjugate Chemistry. 18, 2085-2089 (2007).
- Kostikov, A., et al. N-(4-(di-tert-butyl[18F]fluorosilyl)benzyl)-2-hydroxy-N,N-dimethylethylammonium bromide ([18F]SiFAN+Br-): A novel lead compound for the development of hydrophilic SiFA-based prosthetic groups for 18F-labeling. Journal of Fluorine Chemistry. 132, 27-34 (2011).
- Wängler, B., et al. Kit-like 18F-labeling of proteins: Synthesis of 4-(di-tert-butyl[18F]fluorosilyl)benzenethiol (Si[18F]FA-SH) labeled rat serum albumin for blood pool imaging with PET. Bioconjugate Chemistry. 20, 317-321 (2009).
- Iovkova, L., et al. para-Functionalized aryl-di-tert-butylfluorosilanes as potential labeling synthons for 18F radiopharmaceuticals. Chemistry. 15, 2140-2147 (2009).
- Wängler, C., et al. One-step 18F-labeling of carbohydrate-conjugated octreotate-derivatives containing a silicon-fluoride-acceptor (SiFA): In vitro and in vivo evaluation as tumor imaging agents for positron emission tomography (PET). Bioconjugate Chemistry. 21, 2289-2296 (2010).
- Ilhan, H., et al. First-in-human 18F-SiFAlin-TATE PET/CT for NET imaging and theranostics. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 46, 2400-2401 (2019).
