Summary
A síntese de florina-18(18F) rotulada de radiofármacos para tomografia de emissão de pósitrons normalmente requer meses de experiência. Quando incorporado em um radiotracer, o motivo do acceptor do silicone-fluoreto (SiFA) permite um protocolo simples da 18F-etiquetagem que seja independente do equipamento caro e do treinamento preparatório, ao reduzir a quantidade do precursor necessário e a utilizar umas condições mais suaves da reação.
Abstract
O motivo estrutural para-substituídodi-tert-butilfluorosilylbenzee conhecido como o aceitador de silício-flúor (SiFA) é uma marca útil no kit de ferramentas do radioquímico para incorporar radioativo [18F] flúor em traçadores para uso em tomografia de emissão de pósitron. Em comparação com as estratégias convencionais de rotulagem de rádio, a troca isotópica de flúor-19 da SiFA com o flúor [18F] é realizada à temperatura ambiente e requer participantes de reação mínima. A formação de subprodutos é, portanto, insignificante, e a purificação é muito simplificada. No entanto, enquanto a molécula precursora usada para rotulagem e o produto radiorotulado final são isoticamente discretos, eles são quimicamente idênticos e são, portanto, inseparáveis durante os procedimentos de purificação. A etiqueta SiFA também é suscetível à degradação as condições básicas decorrentes do processamento e secagem do flúor [18F]. O 'método de queda 4', em que apenas as primeiras 4 gotas de flúor eluted [18F] são usadas a partir da extração de fase sólida, reduz a quantidade de base na reação, facilita menores quantidades de molar de precursores e reduz a degradação.
Introduction
A fluorina-18 (109 minutos de meia-idade, 97% de emissão de pósitrons) está entre os radionuclídeos mais importantes para a tomografia por emissão de pósitrons (PET), um método de imagem não invasivo que visualiza e quantifica a biodistribuição de traçadores com rótulo sorão de rádio para várias doenças1. Peptídeos e proteínas são especialmente difíceis de rotular com [18F] flúor, porque eles exigem blocos de construção formados por sínteses de várias etapas2. Para reduzir a complexidade de 18f-radiolabeling, silicon-fluoreto acceptor (SiFA) foi recentemente introduzido como ferramentas confiáveis3. O grupo SiFA consiste em um átomo central de silício conectado a dois grupos de butil terciário, uma moiety fenil derivada e um átomo de flúor não radioativo. Os grupos de butilos terciários transmitem estabilidade hidrolítica ao vínculo silício-flúor, que é uma característica crítica para aplicações in vivo de conjuga ções in vivo como agentes de imagem.
Quando ligado a uma pequena molécula ou biomolécula, os blocos de construção SiFA ligam anions radioativos [18F]fluoretados trocando flúor-19 por flúor-18 em concentrações nanomolar sem formar quantidades significativas de produtos laterais radioativos4. Além disso, um alto rendimento radioquímico é rapidamente alcançado rotulando a moiety SiFA em solventes aprotic dipolares em baixas temperaturas. Isto está em contraste gritante com as reações clássicas de troca isotópica, que produzem radiotraers de baixa atividade específica5. Nesses casos, grandes quantidades de precursores (na faixa de miligramas) devem ser usadas para obter incorporação razoável de [18F] flúor. As reações de troca isotópicas usando SiFAs são muito mais eficientes, como confirmado por estudos cinéticos e cálculos de teoria funcional de densidade6,7. SiFAs rotulados são facilmente purificados pela extração de fase sólida, uma vez que os compostos SiFA rotulados e não rotulados são quimicamente idênticos. Isso difere dos traçadores tradicionais com rótulos de rádio, onde a molécula precursora e o produto rotulado são duas espécies químicas diferentes e devem ser separados após a rotulagem por cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC). Usando blocos de construção SiFA, pequenas moléculas, proteínas e peptídeos podem ser rotulados com sucesso com [18F] flúor por protocolos de rotulagem de uma e duas etapas desprovidos de procedimentos complicados de purificação (Figura 1)4,8,9. Além disso, alguns compostos rotulados por SiFA são agentes de imagem in vivo confiáveis para o fluxo sanguíneo e tumores10. A simplicidade da química SiFA permite que até mesmo investigadores não treinados para usar [18F] flúor para síntese radiotracer e desenvolvimento.
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Protocol
CUIDADO: Deve-se ter em mente que 18F é um isótopo radioativo e, portanto, é necessário realizar todos os procedimentos por trás da blindagem adequada. A blindagem do chumbo é apropriada para este tipo de radiação. Certifique-se de usar crachás de detecção de radiação durante toda a totalidade deste procedimento. Além disso, imediatamente dispor de luvas antes de tocar em qualquer coisa após a síntese, como eles podem estar contaminados com a atividade radioativa. Utilize monitores de pé de mão, bem como contadores Geiger panqueca para verificar se há contaminação de mangas, mãos e pés.
1. Secagem azeotrópica de 18F-anion
NOTA: Figura 2A mostra um gráfico de fluxo de trabalho deste procedimento, que leva ~ 10 min.
- Pré-condição de um cartucho de troca de anion metílico quaternary (QMA)(Mesa de Materiais),passando 0,5 M K2CO3 (10 mL) através do cartucho, seguido por água desionizada (10 mL).
- Passe uma solução aquosa de [18F]F-/[18O]H2O (100-500 MBq) através do cartucho QMA pré-condicionado em sentido inverso, usando um adaptador masculino para masculino. Descarte o [18O]H2O.
NOTA: Essas etapas podem ser executadas usando um módulo de síntese automatizado ou usando blindagem adicional na seringa. - Elute as quatro primeiras gotas do fixo [18F] anions fluoreto do cartucho QMA em uma solução preparada de [2,2,2]cryptand (Tabela de Materiais) (10 mg), 0,2 M K2CO3 (50 μL, 10 μmol), e acetonitrile (1 mL) em um v-vial de paredegrossa, e selar o frasco.
NOTA: Apenas as quatro primeiras gotas são usadas como a maioria do radioativo [18F] flúor é eluted fora do QMA nestas gotas. Isso reduz a quantidade de base transportada pela solução de ações fluoretadas [18F], o que é necessário para evitar a degradação da moiety SiFA. - Selar o frasco e coloque em um banho de óleo mineral de 90 °C posicionado em uma placa quente. Insira uma agulha de ventilação e uma agulha conectada a um fluxo de gás argônio no septo da tampa do frasco. Espere 5 min para evaporar os solventes o fluxo suave de argônio. Remova todos os traços restantes da água adicionando 1 mL do acetonitrile para facilitar a co-evaporação azeotropic. Repita este passo 2x para garantir a secura.
- Uma vez que o solvente é visivelmente removido, parar o fluxo de argônio, e retire as seringas da tampa do frasco, e retire o frasco do banho de óleo.
- Resuspenda o fluoreto seco [18F] no solvente de reação de escolha.
NOTA: Neste caso, acetonitrile (1 mL) é adicionado para criar uma solução de ações de altamente reativa [18F-] F- (100-500 MBq). Esta solução agora pode ser usada para rotulagem.
2. Rotulagem sifa-ligand de um passo
NOTA: Figura 2B mostra um gráfico de fluxo de trabalho deste procedimento, que leva ~ 15 min.
- Pré-condição de um cartucho C-18(Mesa de Materiais)enxaguando-o com etanol (10 mL) e água destilada (10 mL).
- Adicione a solução de ações de flúor [18F-] a um frasco de reação contendo um precursor rotulado pela SiFA (100 μL, 20 a 100 nmol). Permita que a reação de rotulagem prossiga para 5 min na temperatura ambiente sem agitar a solução.
NOTA: Toda a solução de estoque pode ser adicionada ou um alibamento, dependendo de quanta atividade é desejada para a reação. - Elabore a mistura de reação em uma seringa de 20 mL contendo tampão de fosfato de 0,1 M (9 mL) e passe a solução através do cartucho C-18 pré-condicionado para prender o rastreador rotulado.
- Lave o cartucho com água destilada (5 mL), em seguida, elute rastreador preso do cartucho C-18 com etanol (300 μL), e diluir com tampão de fosfato estéril para injeção (3 mL).
- Passe o purificado [18F] SiFA-tracer através de um filtro estéril.
NOTA: Para obter uma imagem pet clara para pequenas imagens de animais, a dose do paciente partitioned deve ser entre 5-8 MBq. Para uso humano, a dose do paciente partitioned deve estar entre 200-300 MBq. - Injete um pequeno alibador (~4 MBq) do purificado [18F]SiFA-tracer em um sistema HPLC equipado com uma coluna C-18 de fase invertida para confirmar que a pureza radioquímica é maior do que 95%.
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Representative Results
A troca isotópica simplista de SiFA pode alcançar um grau elevado de incorporação radioquímica do flúor[18F](60-90%) com uma quantidade mínima de complexidade sintética (Figura 1). A maioria das moléculas pode ser radioetiquetada com [18F] flúor em uma etapa sem envolver HPLC para purificação (Figura 2). O Radio-HPLC pode ser usado para fins de controle de qualidade, em que o pico de absorção ultravioleta (UV) do produto final deve coincidir com seu pico de rádio superior a 95% da área de pico total(Figura 3). Se o cromatograma radio-HPLC revelar uma formação significativa de impurezas ativas ou radioativas UV, o precursor pode não ser estável as condições de rotulagem de rádio levemente básicas. Uma solução diluída de ácido oxálico dissolvido em um solvente orgânico pode ser adicionada à solução de estoque de flúor [18F]antes da adição ao precursor da SiFA em um esforço para diminuir a base; no entanto, a redução do básico demais diminuirá a nucleoficidade do ânio fluoreto [18F]. Assim, a quantidade molar de ácido oxálico necessário terá que ser determinada experimentalmente de antemão. Alternativamente, o sifa-ligand rotulado pode ser purificado por HPLC após a etapa 2.3 se a formação de impurezas é significativa, mas gerenciável. Passos 2.4 e além ainda serão necessários após a purificação hplc, a fim de remover hplc solvente do purificado rotulado sifa-ligand.
Se o flúor [18F] não é facilmente incorporado em SiFA-ligand, pode haver problemas com a solubilidade e outro solvente aprotic de escolha pode ser usado no lugar de acetônio para a reação. Solventes protic, como etanol, têm sido usados com sucesso, mas podem exigir aquecimento. Monitorar a reação por cromatografia de camada fina de rádio (rádio-TLC) pode rapidamente auxiliar na identificação do resultado de quaisquer alterações feitas no protocolo de rotulagem como flúor não incorporado [18F], aderirá à linha de base em uma placa padrão de sílica TLC.
Se o sifa-ligand rotulado passa através do cartucho C18 na etapa 2.3, como indicado pela maior parte da atividade que aparece na solução eluted e não no cartucho, então a fase do cartucho usado pode ter que ser alterada. Os ligands Polar SiFA podem precisar de um cartucho C18 maior ou um cartucho de fase dupla contendo uma resina C18 com algumas características hidrofílicas.
Os ligands rotulados de SiFA também podem ser usados para aplicações in vivo, como PET. Por exemplo, a pequena molécula rotulada [18F]SiFA-PSMA (Figura 4A)foi usada para imagem de um xenoenxerto tumoral implantado em um modelo de mouse (Figura 4B). O sifa-tracer exibido captação tumoral favorável mais de 60 min, que poderia ser bloqueado por um inibidor competitivo (Figura 4C). Mais impressionante, o peptídeo 18F-rotulado [18F]SiFAlin-TATE(Figura 5A) foi usado para imagem tumores neuroendócrinos metastáticos em um paciente com câncer via PET (Figura 5B) e PET / CT ( Figura5C)11.
Figura 1: Visão geral do fluxo de trabalho de radiorotulagem F siFA 18. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 2: Protocolo típico de rotulagem de F SiFA 18. (A)Secagem azeotrópica de [18F] flúor. (B) SiFA rotulando reação e purificação através da extração de fase sólida. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 3: Cromatograma final de rádio-HPLC após purificação de extração em fase sólida de [18F]SiFA-PSMA, tomado para controle de qualidade. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 4: Aplicação de sifa-ligands rotulados. (A)Estrutura do radiotracer [18F]SiFA-PSMA. (B)Imagem reconstruída de um rato carregando um tumor de xenoenxerto LNCaP sobre o ombro esquerdo, 60 min injeção pós (p.i.) com [18F]SiFA-PSMA. (C) Curvas de atividade do tempo para a captação de[18F]SiFA-PSMA em tecidos tumorais e musculares com mais de 60 minutos, com ou sem administração prévia de 300 μg DCFPyL como agente de bloqueio. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 5: Aplicação de sifa-ligands rotulados. (A)Estrutura do radiotracer [18F]SiFA-TATE. (B)Imagem PET reconstruída de um paciente com câncer humano com tumores endócrinos metastáticos com [18F]SiFA-TATE. (C)PET/CT imagens do mesmo paciente nos aviões transversais e sonitivos. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
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Discussion
A química de rotulagem da SiFA representa um dos primeiros 18métodos de rotulagem F que empregam uma reação de troca isotópica extraordinariamente eficiente que pode ser realizada à temperatura ambiente. Uma reação radioquímica típica depende da formação de uma ligação carbono-flúor através da reação de [18F] flúor com uma funcionalidade reativa de flúor através de uma via de eliminação ou substituição. Essas condições de reação são muitas vezes duras, realizadas em pH extremo ou alta temperatura, e são carregadas de subprodutos ou participantes de reação que devem ser removidos usando técnicas trabalhosas e demoradas, como o HPLC. Com a técnica de rotulagem sifa, o precursor de rotulagem e 18 compostos com rótulo Sifa são quimicamente idênticos. Além disso, nenhum produto lateral é observado geralmente desde que a reação prosigue circunstâncias muito suaves. Estas características tornam possível rotular moléculas mais complicadas (ou seja, proteínas, geradores radicais livres, metal-queos, fluoroforres, precursores bioluminescentes) que normalmente podem se decompor ou epimerizar condições mais reativas ou temperaturas elevadas. Além disso, 18compostos contendo SiFA rotulados por F podem ser purificados rapidamente usando técnicas simples de extração de fase sólida.
Esta metodologia de rotulagem utiliza o 'método de queda 4', em que apenas as primeiras 4 gotas da solução básica de elução são usadas ao eluting preso [18F] fluoreto fora de um cartucho QMA. Esta modificação foi feita para reduzir a quantidade de base na solução de ações fluoretadas [18F], pois degradaria a moiety SiFA se o estoque de flúor [18F] continha toda a base da solução de elução. Anteriormente, o ácido oxálico foi adicionado à solução de ações de flúor [18F] para reduzir o básico, ou um pequeno alibato do estoque foi usado em vez de toda a solução, o que foi um desperdício. O 'método de queda 4' representa a mais recente iteração do protocolo de rotulagem da SiFA.
Como a molécula precursora e o produto final rotulado são quimicamente idênticos, eles não podem ser separados uns dos outros durante a purificação e a atividade molar do injetável final é, portanto, inteiramente dependente da quantidade de precursor usado para a troca isotópica. Ter uma fração muito alta de precursor esem rótulo na solução final diminuirá a oportunidade do sifa-ligand rotulado de vincular seu alvo molecular pretendido devido à concorrência com o precursor não rotulado. Assim, a atividade molar é inteiramente dependente da quantidade de precursor que é usada para rotulagem. Normalmente, 20 a 100 nmol de precursor é necessário para reações de rotulagem reproduzíveis, e tão pouco quanto 5 nmol de precursor foi rotulado com sucesso para alcançar atividades molar de 80 GBq/μmol e superior.
Pequenas moléculas e peptídeos derivados com o bloco de construção da SiFA (por exemplo, SiFA-octreotate) podem ser rotulados com flúor [18F] em um passo; no entanto, a rotulagem de proteínas da SiFA requer um protocolo de duas etapas. Um pequeno e altamente reativo grupo de próteses SiFA (por exemplo, [18F]SiFB) tem de ser preparado e reagido com a proteína dada, e a proteína rotulada deve então ser purificada pelo HPLC.
A metodologia de rotulagem SiFA presta-se bem às sínteses de kits radiofármacos, uma vez que a purificação de HPLC e a manipulação de reacção extensiva não são normalmente necessárias. Simples 'agitar e assar' kits de estilo com quantidades única dose de paciente de um Ligand SiFA poderia ser facilmente manipulado por técnicos de radiofarmácia, exigindo uma curva de aprendizagem muito menor e tempo / custo de trabalho do que com uma unidade de síntese automatizada.
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Disclosures
Os autores não têm nada a divulgar.
Acknowledgments
Os autores não têm reconhecimentos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| [18F]F-/H2[18O]O | (Cyclotron produced) | - | - |
| [2.2.2]Cryptand | Aldrich | 291110 | Kryptofix 2.2.2 |
| Acetonitrile anhydrous | Aldrich | 271004 | - |
| Deionized water | Baxter | JF7623 | - |
| Ethanol, anhydrous | Commercial Alcohols | - | |
| Potassium carbonate | Aldrich | 209619 | - |
| QMA cartridge | Waters | 186004540 | QMA SepPak Light (46 mg) cartridge |
| Equipment | |||
| C-18 cartridge | Waters | WAT023501 | C-18 SepPak Light cartridge |
| C18 column | Phenomenex | 00G-4041-N0 | HPLC Luna C18 250 x 10 mm, 5 µm |
| HPLC | Agilent Technologies | - | HPLC 1200 series |
| micro-PET Scanner | Siemens | - | micro-PET R4 Scanner |
| Radio-TLC plate reader | Raytest | - | Radio-TLC Mini Gita |
| Sterile filter 0.22µm | Millipore | SLGP033RS | - |
References
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