Summary
Синтез фтора-18(18F) помечены радиофармацевтические для позитронно-эмиссионной томографии обычно требует месяцев опыта. При включении в радиотрактор, кремниевый фтор приемник (SiFA) мотив позволяет простой 18F-маркировки протокол, который не зависит от дорогостоящего оборудования и подготовительной подготовки, при одновременном сокращении количества прекурсоров необходимо и с использованием более мягких условий реакции.
Abstract
Пара-заменители ди-терт-butylfluosilylbenzene структурный мотив, известный как кремниевый фтор приемник (SiFA) является полезным тегом в наборе инструментов радиохимика для включения радиоактивныхNo 18Фтор в трассировки для использования в позитронно-эмиссионной томографии. По сравнению с обычными стратегиями радиомаркировки, изотопный обмен фтора-19 от SiFA с фтором18F'fluoride осуществляется при комнатной температуре и требует минимальной реакции участников. Таким образом, формирование побочных продуктов является незначительным, а очистка значительно упрощается. Однако, в то время как молекула-предшественник, используемая для маркировки, и конечный радиомаркированный продукт изотопно дискретны, они химически идентичны и, таким образом, неотделимы во время процедур очистки. Тег SiFA также подвержен деградации в основных условиях, вытекающих из обработки и сушки фтораNo 18F'fluoride. Метод «4 капли», в котором только первые 4 капли элетационного й18Фхофорид используются из твердой фазы извлечения, уменьшает количество базы в реакции, облегчает более низкое количество моляров прекурсора, и уменьшает деградацию.
Introduction
Фтор-18 (109-минутный период полураспада, 97% позитронно-излучения) является одним из наиболее важных радионуклидов для позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ), неинвазивный метод визуализации, который визуализирует и количественно био-распределение радиомаркированных трассиров для различных заболеваний1. Пептиды и белки особенно трудно маркировать с помощьюфтора 18F'fluoride, потому что они требуют строительных блоков, образованных многоступенчатыми синтезами2. Чтобы уменьшить сложность 18F-радиомаркировки, кремниевый фтор приемник (SiFA) был недавно введен в качестве надежных инструментов3. Группа SiFA состоит из центрального атома кремния, соединенного с двумя третичных бутиловых групп, производно-фенилму и нерадиоактивного атома фтора. Третичные бутильные группы прививают гидролитическую стабильность кремниево-фторовой связи, которая является важной особенностью для in vivo приложений SiFA конъюгирует в качестве агентов изображений.
При прикреплении к небольшой молекуле или биомолекуле строительные блоки SiFA связывают радиоактивные анионы18Фтор, обменивая фтор-19 на фтор-18 в концентрациях наномолляров, не образуя значительного количества радиоактивных побочных продуктов4. Кроме того, высокий радиохимический выход быстро достигается путем маркировки SiFA moiety в диполярных апротических растворителей при низких температурах. Это резко контрастирует с классическими изотопными реакциями обмена, которые производят радиочастоты низкой специфической активности5. В этих случаях, большое количество прекурсора (в диапазоне миллиграммов) должны быть использованы для получения разумного включения18Фюртор. Изотопные реакции обмена с использованием SiFAs являются гораздо более эффективными, что подтверждается кинетические исследования и плотность функциональной теории расчеты6,7. Приклеенные этикетку SiFA легко очищаются путем извлечения твердой фазы, так как как маркированные, так и немаркированные соединения SiFA химически идентичны. Это отличается от традиционных радиомаркированных трассаторов, где молекула-предшественник и маркированный продукт являются двумя различными химическими видами и должны быть разделены после радиомаркировки высокопроизводительной жидкой хроматографией (HPLC). Используя строительные блоки SiFA, малые молекулы, белки и пептиды, можно успешно маркировать с помощью18фторсовых протоколов, разное и двухступенчатые протоколы маркировки, лишенные сложных процедур очистки (Рисунок 1)4,8,9. Кроме того, некоторые соединения с маркировкой SiFA являются надежными инвиво-визуальными агентами для кровотока и опухолей10. Простота химии SiFA позволяет даже неподготовленным следователям использовать18Фхофрида для синтеза и развития радиотраповского излжания.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ВНИМАНИЕ: Необходимо иметь в виду, что 18F является радиоактивным изотопом, и поэтому необходимо проводить все процедуры, лежащие в основе адекватного защиты. Защита свинца подходит для данного типа излучения. Обязательно носите значки обнаружения радиации на протяжении всей этой процедуры. Кроме того, немедленно утилизировать перчатки, прежде чем касаться ничего после синтеза, так как они могут быть загрязнены радиоактивной активностью. Используйте ручные ноги мониторы, а также блин Гейгер счетчики, чтобы проверить на загрязнение рукава, руки и ноги.
1. Азеотропная сушка 18F-анионов
ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 2А показан график рабочего процесса этой процедуры, который занимает 10 минут.
- Предварительное условие кватернаровметиловый аммоний (ЗМА) анион обмена картридж(Таблица материалов) путем прохождения 0,5 М K CO3 (10 мл) через картридж, а затем деионизированной воды (10 мл).
- Передайте ваковый раствор No18ФЗ-/18O'H2O (100-500 MBq) через предупорливый картридж зМА в обратном направлении, используя мужской адаптер. Отбросьте No18ОЗН2О.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти шаги могут быть выполнены с помощью автоматизированного модуля синтеза, или с помощью дополнительного экранирования на шприц. - Выделите первые четыре капли фиксированных анионов фтора18F'fluoride из картриджа зМА в подготовленный раствор из 2,2,2-криптовалюты(Таблица материалов)(10 мг), 0,2 М К СО23 (50 л, 10 моль) и ацетонитрил (1 мл) в толстой стенке v-vial, и виал.
ПРИМЕЧАНИЕ: Только первые четыре капли используются в качестве большинства радиоактивных no18Фютор является eluted от ЗМА в этих капель. Это уменьшает количество базы, перевозимых вперед в растворе фтораNo 18,что необходимо, чтобы избежать деградации SiFA moiety. - Запечатать флакон и поместить в ванну с минеральным маслом 90 градусов, расположенную на горячей тарелке. Вставьте вентиляционную иглу и иглу, соединенную с потоком аргонового газа, в перегородку флакона. Подождите 5 минут, чтобы испарить растворители под нежным потоком аргона. Удалите оставшиеся следы воды, добавив 1 мл ацетонитрила для облегчения ацеотропного совместного испарения. Повторите этот шаг 2x, чтобы обеспечить сухость.
- После того, как растворитель заметно удалены, остановить поток аргона, и удалить шприцы из флакона крышка, и удалить флакон из масляной ванны.
- Отдохните высушенный No18Фюфтор в растворителе реакции выбора.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом случае, ацетонитрил (1 мл) добавляется для создания акционерного раствора высокореактивного no18F-F- (100-500 MBq). Это решение теперь можно использовать для маркировки.
2. Одноступенчатая маркировка SiFA-ligand
ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 2B показан график рабочего процесса этой процедуры, который занимает 15 мин.
- Предварительное условие Картридж C-18(Таблица материалов) путем промывки его этанолом (10 мл) и дистиллированной воды (10 мл).
- Добавьте раствор фторированного запаса18F-в реакционный флакон, содержащий предшественник с маркировкой SiFA (100 л, 20–100 нмоль). Разрешить маркировки реакции продолжать в течение 5 минут при комнатной температуре, не помешивая раствор.
ПРИМЕЧАНИЕ: Весь фондовый раствор может быть добавлен или aliquot, в зависимости от того, сколько активности желательно для реакции. - Нарисуйте реакционную смесь в шприцу 20 мл, содержащем 0,1 М фосфатный буфер (9 мл) и передайте раствор через предусловную картридж C-18 для ловушки маркированного трассировщика.
- Вымойте картридж дистиллированной водой (5 мл), затем выветриваемый трассировщик из картриджа C-18 с этанолом (300 л) и разбавьте стерильным фосфатным буфером для инъекций (3 мл).
- Передайте очищенный No18F'SiFA-трассировщик через стерильный фильтр.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы получить четкое ПЭТ представить для маленьких изображений животных, разделенная доза пациента должна быть между 5'8 MBq. Для использования человеком, раздельная доза пациента должна быть между 200-300 MBq. - Введите небольшой аликот (No 4 МБК) очищенногоNo 18F'SiFA-трассировщика на систему HPLC, оснащенную оборотной фазой C-18, чтобы подтвердить, что радиохимическая чистота превышает 95%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Упрощенный изотопный обмен SiFA может достичь высокой степени радиохимического включения в размере18f-фтор (60–90%) с минимальным количеством синтетической сложности(рисунок 1). Большинство молекул могут быть радиомаркированы с помощью18Фтор фтор в один шаг без привлечения HPLC для очистки (Рисунок 2). Радио-HPLC может быть использован для целей контроля качества, в котором ультрафиолетовый (УФ) пик абсорбции конечного продукта должен совпадать с его радио пик более 95% общей пиковой площади(рисунок 3). Если хроматограмма радио-HPLC показывает значительное образование УФ-активных или радиоактивных примесей, то прекурсор может быть нестабильным в условиях мягкой радиомаркировки. Разбавленный раствор щавелевой кислоты, растворенный в органическом растворителе, может быть добавлен в раствор запаса ФхоридаNo18до добавления к прекурсорову SiFA в попытке снизить базовую часть; Тем не менее, снижение основы слишком много уменьшит нуклеофиливность аниона No18Фюрорид. Таким образом, необходимое количество молярной кислоты должно быть экспериментально определено заранее. Кроме того, помеченный SiFA-ligand может быть очищен HPLC после шага 2.3, если образование примесей является значительным, но управляемым. Шаги 2.4 и далее будут по-прежнему необходимы после очистки HPLC для того, чтобы удалить растворитель HPLC из очищенного помечены SiFA-лиганд.
Если фторNo 18фтор не будет легко включен в SiFA-лиганд, могут возникнуть проблемы с растворительностью, и вместо ацетонитрила для реакции может возникнуть другой апротический растворитель выбора. Протические растворители, такие как этанол, были успешно использованы, но может потребовать нагрева. Мониторинг реакции с помощью радиотонкой хроматографии (радио-TLC) может быстро помощник в определении результатов любых изменений, внесенных в протокол маркировки, как неинкорпорированныхNo 18Фтор будет придерживаться исходной линии на стандартной пластины кремнезема TLC.
Если помеченный SiFA-ligand проходит через картридж C18 в шаге 2.3, о чем свидетельствует основная часть активности, появляющейся в растворе, а не в картридже, то фаза используемого картриджа может быть изменена. Полярные SiFA-лиганды могут нуждаться в большем картридже C18 или двухфазном картридже, содержащем серан C18 с некоторыми гидрофильные характеристики.
Маркированные SiFA-лиганды также могут быть использованы для in vivo приложений, таких как ПЭТ. Например, помеченная малая молекула No18F'SiFA-PSMA(Рисунок 4A) была использована для изображения имплантированной опухоли ксенотрансплантата в модели мыши(рисунок 4B). SiFA-трассировщик показал благоприятный поглощение опухоли более 60 мин, которые могут быть заблокированы конкурентоспособным ингибитором(Рисунок 4C). Более впечатляюще, 18F-маркированный пептидNo 18F'SiFAлин-TATE(Рисунок 5A) был использован для изображения метастатических нейроэндокринных опухолей у больного раком через ПЭТ(Рисунок 5B) и ПЭТ / КТ (Рисунок 5C)11.
Рисунок 1: Обзор рабочего процесса SiFA 18F-radiolabeling. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Типичный протокол F-радиомаркировки SiFA 18. (A) Азеотропная сушка No18Фюртор. (B) Реакция маркировки siFA и очищение через твердую фазу извлечения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Окончательная радио-HPLC хроматограмма после твердой фазы очистки извлеченияNo 18F'SiFA-PSMA, принятых для контроля качества. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Применение маркированных SiFA-лигандов. (A) Структура радиотраиста No18F'SiFA-PSMA. (B) Реконструированное изображение мыши, несущей опухоль LNCaP xenograft через левое плечо, 60 мин после инъекции (p.i.) сNo 18F'SiFA-PSMA. (C) Кривые активности времени для поглощения18F'SiFA-PSMA в опухоли и мышечных тканях более 60 мин, с или без предварительного введения 300 мкг DCFPyL в качестве блокирующего агента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Применение маркированных SiFA-лигандов. (A) Структура радиотрактора No18F'SiFA-TATE. (B) Реконструированное ПЭТ-изображение больного раком человека с метастатическими эндокринными опухолями с No18F'SiFA-TATE. (C) ПЭТ / КТ изображения одного и того же пациента в поперечных и сагитталовых плоскостей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Химия маркировки SiFA представляет собой один из первых 18методов маркировки F, использующих чрезвычайно эффективную изотопную реакцию обмена, которая может быть выполнена при комнатной температуре. Типичная радиохимическая реакция опирается на формирование углеродно-фторовой связи через реакциюNo 18Фюрторид с фтором-реактивной функциональности путем ликвидации или замены пути. Эти условия реакции часто суровы, выполняются при экстремальных рН или высокой температуре, и нагружены побочными продуктами или реакции участников, которые должны быть удалены с помощью трудоемких и трудоемких методов, таких как HPLC. С техникой маркировки SiFA, предшественник маркировки и 18F-маркированных соединений химически идентичны. Кроме того, никаких побочных продуктов, как правило, наблюдается, так как реакция продолжается в очень мягких условиях. Эти особенности позволяют маркировать более сложные молекулы (т.е. белки, генераторы свободных радикалов, металломехи, фторофоры, биолюминесцентные прекурсоры), которые могут нормально разлагаться или эпимеризироваться при более реактивных условиях или повышенных температурах. Кроме того, 18F-маркированных соединений SiFA могут быть быстро очищены с помощью простых методов извлечения твердой фазы.
Эта методология маркировки использует метод «4 падения», в котором используются только первые 4 капли основного раствора elution при улавливании, пойманном в ловушкуno 18F'fluoride от картриджа «MA». Эта модификация была сделана, чтобы уменьшить количество базы в растворе на складе ФтораNo 18,так как это ухудшило бы moiety SiFA, если бы запасфтора 18 F'fluorideсодержал всю базу от раствора elution. Ранее, оксоляная кислотабыла добавлена в раствор запаса Фторф, чтобы уменьшить базовую, или небольшой аликвот бульон был использован вместо всего раствора, который был расточительным. Метод «4 капли» представляет собой последнюю итерацию протокола маркировки SiFA.
Поскольку молекула-предшественник и помеченный конечный продукт химически идентичны, они не могут быть отделены друг от друга во время очистки, а молярная активность конечного инъекционного является полной зависимостью от количества прекурсора, используемого для изотопного обмена. Имея слишком высокую долю немаркированного предшественника в окончательном решении уменьшит возможность помечены SiFA-лиганд связать его предполагаемой молекулярной цели из-за конкуренции с немаркированным предшественником. Таким образом, активность моляров полностью зависит от количества прекурсора, который используется для маркировки. Как правило, 20-100 нмоль прекурсора требуется для воспроизводимых реакций маркировки, и всего лишь 5 нмоль прекурсора был успешно помечен для достижения молярной деятельности 80 ГБК / змоль и выше.
Небольшие молекулы и пептиды, производные строительным блоком SiFA (например, SiFA-octreotate), могут быть помечены18Фхтором в один шаг; однако, маркировка SiFA белков требует двухступенчатого протокола. Небольшая, высокореактивная группа SiFA-протезирования (например,No 18F'SiFB) должна быть подготовлена и среагирована с данным белком, а помеченный белок должен быть очищен HPLC.
Методология маркировки SiFA хорошо поддается синтезу радиофармацевтического комплекта, поскольку очистка HPLC и обширные манипуляции реакцией, как правило, не нужны. Простой "встряхнуть и испечь" стиль комплекты с одной дозы пациента количества SiFA-лиганд может быть легко обрабатываются радиофармации техников, требующих гораздо меньше кривой обучения и времени / труда стоимость, чем с автоматизированным блоком синтеза.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы не имеют подтверждений.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| [18F]F-/H2[18O]O | (Cyclotron produced) | - | - |
| [2.2.2]Cryptand | Aldrich | 291110 | Kryptofix 2.2.2 |
| Acetonitrile anhydrous | Aldrich | 271004 | - |
| Deionized water | Baxter | JF7623 | - |
| Ethanol, anhydrous | Commercial Alcohols | - | |
| Potassium carbonate | Aldrich | 209619 | - |
| QMA cartridge | Waters | 186004540 | QMA SepPak Light (46 mg) cartridge |
| Equipment | |||
| C-18 cartridge | Waters | WAT023501 | C-18 SepPak Light cartridge |
| C18 column | Phenomenex | 00G-4041-N0 | HPLC Luna C18 250 x 10 mm, 5 µm |
| HPLC | Agilent Technologies | - | HPLC 1200 series |
| micro-PET Scanner | Siemens | - | micro-PET R4 Scanner |
| Radio-TLC plate reader | Raytest | - | Radio-TLC Mini Gita |
| Sterile filter 0.22µm | Millipore | SLGP033RS | - |
References
- Wahl, R. L., Buchanan, J. W. Principles and practice of positron emission tomography. , Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia, PA. (2002).
- Wängler, C., Schirrmacher, R., Bartenstein, P., Wängler, C. Click-chemistry reactions in radiopharmaceutical chemistry: Fast & easy introduction of radiolabels into biomolecules for in vivo imaging. Current Medical Chemistry. 17, 1092-1116 (2010).
- Schirrmacher, R., et al. 18F-labeling of peptides by means of an organosilicon-based fluoride acceptor. Angewandte Chemie International Edition. 45, 6047-6050 (2006).
- Kostikov, A. P., et al. Oxalic acid supported Si-18F-radiofluorination: One-step radiosynthesis of N-succinimidyl 3-(di-tert-butyl[18F]fluorosilyl)benzoate ([18F]SiFB) for protein labeling. Bioconjugate Chemistry. 23 (1), 106-114 (2012).
- Cacace, F., Speranza, M., Wolf, A. P., Macgregor, R. R. Nucleophilic aromatic substitution; kinetics of fluorine-18 substitution reactions in polyfluorobenzenes. Isotopic exchange between 18F- and polyfluorobenzenes in dimethylsulfoxide. A kinetic study. Journal of Fluorine Chemistry. 21, 145-158 (1982).
- Schirrmacher, E., et al. Synthesis of p-(di-tert-butyl[18F]fluorosilyl)benzaldehyde ([18F]SiFA-A) with high specific activity by isotopic exchange: A convenient labeling synthon for the 18F-labeling of N-amino-oxy derivatized peptides. Bioconjugate Chemistry. 18, 2085-2089 (2007).
- Kostikov, A., et al. N-(4-(di-tert-butyl[18F]fluorosilyl)benzyl)-2-hydroxy-N,N-dimethylethylammonium bromide ([18F]SiFAN+Br-): A novel lead compound for the development of hydrophilic SiFA-based prosthetic groups for 18F-labeling. Journal of Fluorine Chemistry. 132, 27-34 (2011).
- Wängler, B., et al. Kit-like 18F-labeling of proteins: Synthesis of 4-(di-tert-butyl[18F]fluorosilyl)benzenethiol (Si[18F]FA-SH) labeled rat serum albumin for blood pool imaging with PET. Bioconjugate Chemistry. 20, 317-321 (2009).
- Iovkova, L., et al. para-Functionalized aryl-di-tert-butylfluorosilanes as potential labeling synthons for 18F radiopharmaceuticals. Chemistry. 15, 2140-2147 (2009).
- Wängler, C., et al. One-step 18F-labeling of carbohydrate-conjugated octreotate-derivatives containing a silicon-fluoride-acceptor (SiFA): In vitro and in vivo evaluation as tumor imaging agents for positron emission tomography (PET). Bioconjugate Chemistry. 21, 2289-2296 (2010).
- Ilhan, H., et al. First-in-human 18F-SiFAlin-TATE PET/CT for NET imaging and theranostics. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 46, 2400-2401 (2019).
