Summary
La síntesis de flúor-18 (18F) radiofármacos etiquetados para la tomografía por emisión de positrones normalmente requiere meses de experiencia. Cuando se incorpora en una radiosonda, el motivo del aceptador de fluoruro de silicio (SiFA) permite un protocolo simple de etiquetado de 18F que es independiente de los costosos equipos y entrenamiento preparatorio, al tiempo que reduce la cantidad de precursores necesarios y utiliza condiciones de reacción más suaves.
Abstract
El motivo estructural para-utilizado di-tert-butylfluorosilylbenzene conocido como el aceptador de fluoruro de silicio (SiFA) es una etiqueta útil en el kit de herramientas del radioquímico para incorporar radioactivo [18F]fluoruro en trazadores para su uso en tomografía de emisión de positrones. En comparación con las estrategias convencionales de radioetiquetado, el intercambio isotópico de flúor-19 de SiFA con [18F]fluoruro se lleva a cabo a temperatura ambiente y requiere participantes de reacción mínima. Por lo tanto, la formación de subproductos es insignificante, y la purificación se simplifica en gran medida. Sin embargo, mientras que la molécula precursora utilizada para el etiquetado y el producto radiomarcado final son isotópicamente discretos, son químicamente idénticos y por lo tanto son inseparables durante los procedimientos de purificación. La etiqueta SiFA también es susceptible a la degradación en las condiciones básicas derivadas del procesamiento y secado de [18F]fluoruro. El 'método de 4 gotas', en el que sólo las primeras 4 gotas de elulado [18F]fluoruro se utilizan a partir de la extracción de fase sólida, reduce la cantidad de base en la reacción, facilita cantidades molares más bajas de precursor, y reduce la degradación.
Introduction
Fluorine-18 (109 minutos de vida media, 97% emisión de positrones) es uno de los radionúclidos más importantes para la tomografía por emisión de positrones (PET), un método de imagen no invasivo que visualiza y cuantifica la biodistribución de trazadores radiomarcados para diversas enfermedades1. Los péptidos y las proteínas son especialmente difíciles de etiquetar con [18F]fluoruro porque requieren bloques de construcción formados por sintetizadores de varios pasos2. Para reducir la complejidad de 18F-radiolabeling, el aceptador de flúor de silicio (SiFA) se introdujo recientemente como herramientas confiables3. El grupo SiFA consiste en un átomo central de silicio conectado a dos grupos de butilo terciario, una mitad de fenilo derivatizada y un átomo de flúor no radioactivo. Los grupos de butilo terciarios imparten estabilidad hidrolítica al enlace de silicio-fluoruro, que es una característica crítica para las aplicaciones in vivo de los conjugados SiFA como agentes de imagen.
Cuando se unen a una molécula pequeña o biomolécula, los bloques de construcción de SiFA se unen a los aniones radiactivos [18F]fluoruro mediante el intercambio de flúor-19 por flúor-18 a concentraciones nanomolares sin formar cantidades significativas de productos secundarios radiactivos4. Además, un alto rendimiento radioquímico se logra rápidamente etiquetando la mitad de SiFA en disolventes aproticos dipolares a bajas temperaturas. Esto contrasta con las reacciones clásicas de intercambio isotópico, que producen radiosondas de baja actividad específica5. En estos casos, se deben utilizar grandes cantidades de precursor (en el rango de miligramos) para obtener una incorporación razonable de [18F]fluoruro. Las reacciones de intercambio isotópico sin siefas son mucho más eficientes, como confirman los estudios cinéticos y los cálculos de la teoría funcional de densidad6,7. Los SiFA etiquetados se purifican fácilmente mediante extracción en fase sólida, ya que tanto los compuestos SiFA etiquetados como los no etiquetados son químicamente idénticos. Esto difiere de los trazadores radiomarcados tradicionales, donde la molécula precursora y el producto etiquetado son dos especies químicas diferentes y deben separarse después de la radioetiquetado mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC). El uso de bloques de construcción de SiFA, moléculas pequeñas, proteínas y péptidos se puede etiquetar con éxito con [18F]fluoruro por protocolos de etiquetado de uno y dos pasos desprovistos de complicados procedimientos de purificación(Figura 1)4,8,9. Además, algunos compuestos etiquetados con SiFA son agentes de imagen in vivo fiables para el flujo sanguíneo y los tumores10. La simplicidad de la química siFA permite incluso a los investigadores no entrenados utilizar [18F]fluoruro para la síntesis y el desarrollo de radiosonda.
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Protocol
ADVERTENCIA: Hay que tener en cuenta que 18F es un isótopo radiactivo, por lo que es necesario llevar a cabo todos los procedimientos detrás de un blindaje adecuado. El blindaje de plomo es apropiado para este tipo de radiación. Asegúrese de llevar insignias de detección de radiación durante todo el procedimiento. Además, deseche inmediatamente los guantes antes de tocar cualquier cosa después de la síntesis, ya que pueden estar contaminados con actividad radiactiva. Utilice monitores de pie de mano, así como contadores Geiger de panqueques para comprobar la contaminación de mangas, manos y pies.
1. Secado azeotrópico de 18F-anión
NOTA: La Figura 2A muestra un gráfico de flujo de trabajo de este procedimiento, que tarda 10 minutos.
- Condicionar previamente un cartucho de intercambio de aniones de metil amonio (QMA) cuaternario(Tabla de materiales)pasando 0,5 M K2CO3 (10 ml) a través del cartucho, seguido de agua desionizada (10 ml).
- Pase una solución acuosa de [18F]F-/[18O]H2O (100-500 MBq) a través del cartucho QMA preacondicionado en reversa, utilizando un adaptador macho a macho. Deseche el [18O]H2O.
NOTA: Estos pasos se pueden realizar utilizando un módulo de síntesis automatizado o mediante el blindaje adicional de la jeringa. - Eluir las primeras cuatro gotas de los aniones fijos [18F]fluoruro del cartucho QMA en una solución preparada de [2.2.2]cryptand(Tabla de materiales) (10 mg), 0,2 M K2CO3 (50 l, 10 mol), y acetonitrilo (1 ml) en un v-vial de paredes gruesas, y sellar el vial.
NOTA: Sólo las primeras cuatro gotas se utilizan como la mayoría de los radiactivos [18F]fluoruro se eluye fuera de la QMA en estas gotas. Esto reduce la cantidad de base transportada en la solución de stock [18F]fluoride, que es necesaria para evitar la degradación de la mitad de SiFA. - Sellar el vial y colocarlo en un baño de aceite mineral a 90oC colocado sobre una placa caliente. Inserte una aguja de ventilación y una aguja conectada a una corriente de gas de argón en el tabique de la tapa del vial. Espere 5 minutos para evaporar los disolventes bajo la suave corriente de argón. Retire los restos de agua añadiendo 1 ml de acetonitrilo para facilitar la coevaporación azeotrópica. Repita este paso 2x para garantizar la sequedad.
- Una vez que el disolvente se extrae visiblemente, detenga el flujo de argón y retire las jeringas de la tapa del vial y retire el vial del baño de aceite.
- Resuspenda el fluoruro seco [18F] en el disolvente de reacción de elección.
NOTA: En este caso, se añade acetonitrilo (1 ml) para crear una solución de stock de alta reactiva [18F-]F- (100-500 MBq). Esta solución ahora se puede utilizar para el etiquetado.
2. Etiquetado SiFA-ligand de un solo paso
NOTA: La Figura 2B muestra un gráfico de flujo de trabajo de este procedimiento, que tarda 15 minutos.
- Preacondicionar un cartucho C-18(Tabla de Materiales)enjuagándolo con etanol (10 ml) y agua destilada (10 ml).
- Añadir la solución de stock de fluoruro [18F-]a un vial de reacción que contenga un precursor con la etiqueta SiFA (100 l, 20 x 100 nmol). Deje que la reacción de etiquetado continúe durante 5 minutos a temperatura ambiente sin agitar la solución.
NOTA: Se puede añadir toda la solución de stock o una alícuota, dependiendo de la cantidad de actividad que se desee para la reacción. - Extraiga la mezcla de reacción en una jeringa de 20 ml que contenga un tampón de fosfato de 0,1 M (9 ml) y pase la solución a través del cartucho C-18 preacondicionado para atrapar el trazador etiquetado.
- Lavar el cartucho con agua destilada (5 ml), luego eluir el trazador atrapado del cartucho C-18 con etanol (300 l) y diluir con tampón de fosfato estéril para inyección (3 ml).
- Pase el trazador purificado [18F]SiFA a través de un filtro estéril.
NOTA: Para obtener un PET claro imagine para imágenes de animales pequeños, la dosis del paciente particionada debe estar entre 5 x 8 MBq. Para uso humano, la dosis del paciente particionada debe estar entre 200-300 MBq. - Inyectar una pequeña alícuota (4 MBq) del trazador purificado [18F]SiFA-tracer en un sistema HPLC equipado con una columna C-18 de fase inversa para confirmar que la pureza radioquímica es superior al 95%.
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Representative Results
El intercambio isotópico SiFA simplista puede lograr un alto grado de incorporación radioquímica de [18F]fluoruro (60-90%) con una cantidad mínima de complejidad sintética (Figura 1). La mayoría de las moléculas pueden ser radioetiquetadas con [18F]fluoruro en un solo paso sin involucrar HPLC para purificación (Figura 2). Radio-HPLC se puede utilizar con fines de control de calidad, en el que el pico de absorción ultravioleta (UV) del producto final debe coincidir con su pico de radio superior al 95% de área pico total(Figura 3). Si el cromatograma radio-HPLC revela una formación significativa de impurezas uvactivas activas o radiactivas, el precursor puede no ser estable en las condiciones de radioetiquetado ligeramente básicas. Se puede añadir una solución diluida de ácido oxálico disuelto en un disolvente orgánico a la solución de stock de[18F]fluoruro antes de la adición al precursor de SiFA en un esfuerzo por reducir la basicidad; sin embargo, bajar demasiado la basicidad disminuirá la nucleofilia del anión[18F]fluoruro. Por lo tanto, la cantidad molar de ácido oxálico necesaria tendrá que ser determinada experimentalmente de antemano. Alternativamente, el SiFA-ligand etiquetado puede ser purificado por HPLC después del paso 2.3 si la formación de impurezas es significativa pero manejable. Los pasos 2.4 y posteriores seguirán siendo necesarios después de la purificación de HPLC para eliminar el disolvente HPLC del siFA-ligand con etiqueta purificada.
Si el[18F]fluoruro no se incorpora fácilmente a SiFA-ligand, puede haber problemas con la solubilidad y se puede utilizar otro disolvente aprotico de elección en lugar de acetonitrilo para la reacción. Los disolventes proticos, como el etanol, se han utilizado con éxito, pero pueden requerir calentamiento. El monitoreo de la reacción por cromatografía de capa radiodelgada (radio-TLC) puede resultar rápidamente en la identificación del resultado de cualquier cambio realizado en el protocolo de etiquetado como no incorporado [18F]fluoruro se adherirá a la línea de base en una placa TLC de sílice estándar.
Si el SiFA-ligand etiquetado pasa a través del cartucho C18 en el paso 2.3, como lo indica la mayor parte de la actividad que aparece en la solución eludided y no en el cartucho, es posible que deba cambiar la fase del cartucho utilizado. Polar SiFA-ligands puede necesitar un cartucho C18 más grande o un cartucho de doble fase que contenga una resina C18 con algunas características hidrófilas.
Los SiFA-ligands etiquetados también se pueden utilizar para aplicaciones in vivo como el PET. Por ejemplo, la molécula pequeña etiquetada [18F]SiFA-PSMA (Figura 4A) se utilizó para tomar imágenes de un xenoinjerto tumoral implantado en un modelo de ratón (Figura 4B). El trazador SiFA mostró una captación de tumores favorable durante 60 minutos, que podría ser bloqueada por un inhibidor de la competencia(Figura 4C). Más impresionantemente, el péptido 18F-etiquetado [18F]SiFAlin-TATE (Figura 5A) se utilizó para tomar imágenes de tumores neuroendocrinos metastásicos en un paciente de cáncer a través de PET (Figura 5B) y PET/CT (Figura 5C)11.
Figura 1: Visión general del flujo de trabajo de etiquetado de radio de F de SiFA 18. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Protocolo típico de radioetiquetado SiFA 18F. (A) Secado azeotrópico de [18F]fluoruro. (B) Reacción y purificación del etiquetado SiFA mediante extracción en fase sólida. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Cromatograma radio-HPLC final después de la purificación de extracción en fase sólida de [18F]SiFA-PSMA, tomada para el control de calidad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Aplicación de siFA-ligands etiquetados. (A) Estructura de la radiosonda [18F]SiFA-PSMA. (B) Imagen reconstruida de un ratón que lleva un tumor de xenoinjerto LNCaP sobre el hombro izquierdo, 60 minutos después de la inyección (p.i.) con [18F]SiFA-PSMA. (C) Curvas de actividad temporal para la ingesta [18F]SiFA-PSMA en tumores y tejidos musculares de más de 60 min, con o sin administración previa de 300 g de DCFPyL como agente bloqueador. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Aplicación de siFA-ligands etiquetados. (A) Estructura de la radiosonda [18F]SiFA-TATE. (B) Imagen petanca reconstruida de un paciente de cáncer humano con tumores endocrinos metastásicos con [18F]SiFA-TATE. (C) Imágenes PET/CT del mismo paciente en los planos transversal y sagital. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La química del etiquetado SiFA representa uno de los primeros 18métodos de etiquetado F que emplean una reacción de intercambio isotópico extraordinariamente eficiente que se puede realizar a temperatura ambiente. Una reacción radioquímica típica se basa en la formación de un enlace carbono-fluorina a través de una reacción de [18F]fluoruro con una funcionalidad reactiva con flúor a través de una vía de eliminación o sustitución. Estas condiciones de reacción son a menudo duras, se realizan a pH extremo o alta temperatura, y están cargados de subproductos o participantes de reacción que deben ser eliminados utilizando técnicas laboriosas y que consumen mucho tiempo como HPLC. Con la técnica de etiquetado SiFA, el precursor de etiquetado y el compuesto etiquetado con 18F son químicamente idénticos. Por otra parte, no se observan productos secundarios generalmente ya que la reacción procede en condiciones muy leves. Estas características permiten etiquetar moléculas más complicadas (es decir, proteínas, generadores de radicales libres, metal-quelatos, fluoróforos, precursores bioluminiscentes) que normalmente pueden descomponerse o personificarse en condiciones más reactivas o temperaturas elevadas. Además, 18compuestos que contienen SiFA con etiqueta F se pueden purificar rápidamente utilizando técnicas simples de extracción en fase sólida.
Esta metodología de etiquetado utiliza el 'método de 4 gotas', en el que sólo se utilizan las primeras 4 gotas de la solución de elución básica cuando se eluyen el fluoruro atrapado [18F]fuera de un cartucho QMA. Esta modificación se realizó para reducir la cantidad de base en la solución de stock[18F]fluoruro, ya que degradaría la mitad de SiFA si el stock de[18F]fluoruro contenía toda la base de la solución de elución. Anteriormente, el ácido oxálico se agregaba a la solución de stock de[18F]fluoruro para reducir la basicidad, o se utilizaba una pequeña alícuota de la culata en lugar de toda la solución, que era derrochadora. El 'método de caída 4' representa la última iteración del protocolo de etiquetado SiFA.
Dado que la molécula precursora y el producto final etiquetado son químicamente idénticos, no pueden separarse entre sí durante la purificación y, por lo tanto, la actividad molar del inyectable final depende totalmente de la cantidad de precursor utilizado para el intercambio isotópico. Tener una fracción demasiado alta de una fracción de precursor sin etiquetar en la solución final disminuirá la oportunidad del SiFA-ligand etiquetado de unir su objetivo molecular previsto debido a la competencia con el precursor sin etiquetar. Por lo tanto, la actividad molar depende totalmente de la cantidad de precursor que se utiliza para el etiquetado. Típicamente, 20-100 nmol de precursor es necesario para reacciones de etiquetado reproducibles, y tan poco como 5 nmol de precursor ha sido etiquetado con éxito para lograr actividades molares de 80 GBq / émol y superior.
Las moléculas pequeñas y los péptidos derivados con el bloque de construcción SiFA (por ejemplo, SiFA-octreotate) se pueden etiquetar con [18F]fluoruro en un solo paso; sin embargo, el etiquetado de proteínas SiFA requiere un protocolo de dos pasos. Un grupo prótesis SiFA pequeño y altamente reactivo (por ejemplo, [18F]SiFB) tiene que ser preparado y reaccionado con la proteína dada, y la proteína etiquetada debe ser purificada por HPLC.
La metodología de etiquetado SiFA se presta bien a las síntesis de kit radiofarmacéuticos, ya que la purificación de HPLC y la manipulación de reacciones extensas no son normalmente necesarias. Los simples kits de estilo "agitar y hornear" con cantidades de dosis de un solo paciente de un SiFA-ligand podrían ser manejados fácilmente por técnicos de radiofarmacia, lo que requiere una curva de aprendizaje mucho más pequeña y un costo de tiempo/trabajo que con una unidad de síntesis automatizada.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores no tienen reconocimientos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| [18F]F-/H2[18O]O | (Cyclotron produced) | - | - |
| [2.2.2]Cryptand | Aldrich | 291110 | Kryptofix 2.2.2 |
| Acetonitrile anhydrous | Aldrich | 271004 | - |
| Deionized water | Baxter | JF7623 | - |
| Ethanol, anhydrous | Commercial Alcohols | - | |
| Potassium carbonate | Aldrich | 209619 | - |
| QMA cartridge | Waters | 186004540 | QMA SepPak Light (46 mg) cartridge |
| Equipment | |||
| C-18 cartridge | Waters | WAT023501 | C-18 SepPak Light cartridge |
| C18 column | Phenomenex | 00G-4041-N0 | HPLC Luna C18 250 x 10 mm, 5 µm |
| HPLC | Agilent Technologies | - | HPLC 1200 series |
| micro-PET Scanner | Siemens | - | micro-PET R4 Scanner |
| Radio-TLC plate reader | Raytest | - | Radio-TLC Mini Gita |
| Sterile filter 0.22µm | Millipore | SLGP033RS | - |
References
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