Summary
Pozitron emisyon tomografisi için flor-18(18F) etiketli radyofarmasötiklerin sentezi genellikle aylar süren bir deneyim gerektirir. Bir radyotracer içine dahil edildiğinde, silikon-florür alıcı (SiFA) motifi, pahalı ekipman ve hazırlık eğitimi bağımsız basit bir 18F-labeling protokolü sağlar, gerekli öncül miktarını azaltırken ve hafif reaksiyon koşulları kullanırken.
Abstract
Silikon-florür alıcısı (SiFA) olarak bilinen para-ikamedi-tert-butylfluorosilylbenzene yapısal motifi, radyokimyacının alet kitinde radyoaktif [18F] florür içeren ve pozitron emisyon tomografisinde kullanılmak üzere izleyicilere yararlı bir etikettir. Konvansiyonel radyoetiketleme stratejilerine kıyasla, SiFA'dan[18F] florürle flor-19'un izotopik değişimi oda sıcaklığında gerçekleştirilir ve minimum reaksiyon katılımcıları gerektirir. Yan ürünlerin oluşumu böylece ihmal edilebilir ve arınma büyük ölçüde basitleştirilmiştir. Ancak, etiketleme için kullanılan öncümolekül ve son radyoetiketli ürün izotopically ayrık olmakla birlikte, kimyasal olarak aynıdır ve böylece arıtma prosedürleri sırasında ayrılmaz. SiFA etiketi,[18F]florür işleme ve kurutmadan kaynaklanan temel koşullar altında bozulmaya da açıktır. Katı faz çıkarmadan sadece ilk 4 damla[18F] florür kullanıldığı '4 damla yöntemi', reaksiyondaki baz miktarını azaltır, daha düşük azı azı miktarını uzatır ve bozulmayı azaltır.
Introduction
Flor-18 (109 dakikalık yarı ömür, %97 pozitron emisyonu) pozitron emisyon tomografisi (PET) için en önemli radyonüklidler arasında dır. Peptitler ve proteinlerin [18F] florürle etiketlemesi özellikle zordur, çünkü çok adımlı sentezler2'denoluşan yapı taşları gerektirirler. 18F-radiolabeling karmaşıklığını azaltmak için, silikon-florür kabul edici (SiFA) son zamanlarda güveniliraraçlar3 olarak tanıtıldı . SiFA grubu iki üçüncül bütil grubuna bağlı merkezi bir silikon atomu, türevleştirilmiş fenil moiety ve radyoaktif olmayan bir flor atomu oluşur. Üçüncül bütil grupları silikon-florür bağı hidrolitik stabilite vermek, görüntüleme ajanları olarak Konjuge SiFA in vivo uygulamaları için kritik bir özelliktir.
Küçük bir molekül veya biyomoleküle bağlandığında, SiFA yapı taşları radyoaktif [ 18 F] flor-19 flor-18 için nanomolar konsantrasyonları için önemli miktarda radyoaktif yan ürünler oluşturmadan değiştirerek radyoaktif [18F] florür anyonları bağlamak4. Ayrıca, yüksek radyokimyasal verim hızla düşük sıcaklıklarda dipolar aprotik çözücüler SiFA moiety etiketleme ile elde edilir. Bu klasik izotopik değişim reaksiyonları, düşük spesifik aktivite5radiotracers üretmek tezat olduğunu. Bu gibi durumlarda,[18F]florürünün makul bir şekilde dahil edilmesi için büyük miktarlarda öncül (miligram aralığında) kullanılmalıdır. SiBA'lar kullanılarak yapılan izotopik değişim reaksiyonları, kinetik çalışmalar ve yoğunluk fonksiyonel teori hesaplamaları6,7ile doğrulanan çok daha verimlidir. Etiketli SiFA'lar, hem etiketli hem de etiketlenmemiş SiFA bileşikleri kimyasal olarak aynı olduğundan katı faz ekstraksiyonu ile kolayca saflaştırılır. Bu, öncül molekülün ve etiketli ürünün iki farklı kimyasal tür olduğu ve yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) ile radyolabeling den sonra ayrılması gereken geleneksel radyoetiketli izleyicilerden farklıdır. SiFA yapı taşları, küçük moleküller, proteinler ve peptidler kullanılarak [18F] florür ile karmaşık arınma prosedürlerinden yoksun tek ve iki aşamalı etiketleme protokolleri ile başarıyla etiketlenebilir (Şekil 1)4,8,9. Ayrıca, bazı SiFA etiketli bileşikler kan akışı ve tümörler için vivo görüntüleme ajanları güvenilir10. SiFA kimyasının basitliği, eğitimsiz araştırmacıların bile radyotracer sentezi ve gelişimi için[18F] florür kullanmalarını sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
DİkKAT: 18F'nin radyoaktif izotop olduğunu ve bu nedenle yeterli korumanın arkasındaki tüm prosedürleri yerine getirmek gerektiğini unutmamak gerekir. Kurşun kalkanı bu tür radyasyoniçin uygundur. Bu prosedürün tamamı boyunca radyasyon algılama rozetleri taktığından emin olun. Ayrıca, sentezden sonra herhangi bir şeye dokunmadan önce eldivenleri hemen atın, çünkü radyoaktif aktivite ile kontamine olabilir. Kollar, eller ve ayaklar kirlenme kontrol etmek için el ayak monitörleri yanı sıra gözleme Geiger sayaçları yararlanın.
1. 18F-anion azeotropic kurutma
NOT: Şekil 2A, bu yordamın ~10 dk süren bir iş akışı grafiğini gösterir.
- Ön koşul bir kuaternary metil amonyum (QMA) anyon değişim kartuş(Tablo Malzemeler)kartuş üzerinden 0,5 M K2CO3 (10 mL) geçirerek, deiyonize su (10 mL) takip.
- [18F]F-/[ 18 O]H2O (100−500 MBq) sulu çözeltisini, erkek ten erkek adaptöre kullanarak ön koşullu QMA kartuşu ile ters yönden geçirin. [18O]H2O'yu atın.
NOT: Bu adımlar otomatik bir sentez modülü kullanılarak veya şırınga üzerinde ek koruma kullanılarak gerçekleştirilebilir. - Sabit[18F] florür anonslarını QMA kartuşundan hazırlanmış bir çözeltiye [2.2.2]cryptand (Malzeme Tablosu) (10 mg), 0.2 M K2CO3 (50 μL, 10 μmol) ve asetonitrilenin (1 mL) kalın duvarlı v-vial'da elitleyin ve vial'ı kapatın.
NOT: Bu damlalarda QMA'dan radyoaktif[18F] florür ünün çoğunluğu olarak sadece ilk dört damla kullanılır. Bu,[18F] florür lüle çözeltisinde ileri ye taşınan baz miktarını azaltır, bu da SiFA moiety'nin bozulmasını önlemek için gereklidir. - Şişeyi kapatın ve sıcak bir plaka üzerine yerleştirilmiş 90 °C mineral yağ banyosuna yerleştirin. Şişe kapağının septumuna bir havalandırma iğnesi ve argon gazı akışına bağlı bir iğne yerleştirin. Argon nazik akışı altında çözücüler buharlaşmak için 5 dakika bekleyin. Azeotropik co-buharlaşmayı kolaylaştırmak için 1 mL asetonitril ekleyerek kalan su izlerini çıkarın. Kuruluk sağlamak için bu adımı 2x tekrarlayın.
- Çözücü gözle görülür bir şekilde çıkarıldıktan sonra argon akışını durdurun ve şırıngaları şişe başlığından çıkarın ve şişeyi yağ banyosundan çıkarın.
- Kurutulmuş[18F] florür tercih reaksiyon çözücü refore resuspend.
NOT: Bu durumda, asetonitril (1 mL) son derece reaktif bir stok çözümü oluşturmak için eklenir [18F-]F- (100−500 MBq). Bu çözüm artık etiketleme için kullanılabilir.
2. Tek adımlı SiFA-ligand etiketleme
NOT: Şekil 2B, bu yordamın ~15 dk süren bir iş akışı grafiğini gösterir.
- Etanol (10 mL) ve distile su (10 mL) ile durulayarak bir C-18 kartuşu(Malzeme Tablosu)ön koşul.
- [18F-]florür stok çözeltisini SiFA etiketli öncül (100 μL, 20−100 nmol) içeren bir reaksiyon şişesine ekleyin. Çözeltiyi karıştırmadan etiketleme reaksiyonuna oda sıcaklığında 5 dakika devam edin.
NOT: Reaksiyon için ne kadar aktivite istendiğine bağlı olarak tüm stok çözeltisi eklenebilir veya bir aliquot eklenebilir. - Reaksiyon karışımını 0,1 M fosfat tamponu (9 mL) içeren 20 mL'lik bir şırıngayla hazırlayın ve etiketli izleyiciyi tuzağa düşürmek için çözeltiyi ön koşullu C-18 kartuşu ile geçirin.
- Kartuşun distile suyla yıkayın (5 mL), ardından C-18 kartuşundan etanol (300 μL) ile sıkışmış tracer'ı temizleyin ve enjeksiyon için steril fosfat tamponuyla seyreltin (3 mL).
- Saflaştırılı[18F]SiFA-tracer'ı steril bir filtreden geçirin.
NOT: Küçük hayvan görüntüleme için net bir PET hayal elde etmek için, bölümlenmiş hasta dozu 5−8 MBq arasında olmalıdır. İnsan kullanımı için, bölümlenmiş hasta dozu 200−300 MBq arasında olmalıdır. - Radyokimyasal saflığın %95'ten büyük olduğunu doğrulamak için ters fazlı C-18 sütunu yla donatılmış bir HPLC sistemine saflaştırılı[18F]SiFA-tracer'in küçük bir aliquot 'u (~4 MBq) enjekte edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Basit SiFA izotopik değişimi yüksek derecede radyokimyasal birleşme elde edebilirsiniz [18F]florür (%60−90) minimum miktarda sentetik karmaşıklıkla(Şekil 1). Moleküllerin çoğu arınma için HPLC'yi dahil etmeden [18F] florürle tek adımda radyoetiketli olabilir (Şekil 2). Radyo-HPLC kalite kontrol amacıyla kullanılabilir, nihai ürünün ultraviyole (UV) emicilik tepe radyo zirvesi ile çakışmalıdır 95% toplam pik alanı(Şekil 3). Radyo-HPLC kromatogramuv aktif veya radyoaktif yabancı maddelerin önemli bir oluşumu ortaya çıkarırsa, öncül hafif temel radyoetiketleme koşulları altında kararlı olmayabilir. Organik bir çözücüde çözünmüş oksalik asit seyreltik bir çözelti [18F] florür stok çözeltisi temelliği düşürmek için bir çaba SiFA-öncüsü eklenmeden önce eklenebilir; ancak, temelliği çok fazla düşürmek [18F] florür anion nükleofili azalacak. Bu nedenle, gerekli oksalik asit azı miktarı deneysel olarak önceden belirlenmelidir. Alternatif olarak, etiketli SiFA-ligand, yabancı maddelerin oluşumu önemli ama yönetilebilir ise adım 2.3 sonra HPLC tarafından saflaştırılmış olabilir. HPLC çözücüsi saflaştırılmış SiFA-ligand'dan çıkarmak için HPLC saflaştırmasından sonra 2.4 ve ötesi adımlarına ihtiyaç duyulmaya devam edecektir.
[18F] florür Kolayca SiFA-ligand dahil değilse, çözünürlüğü ile ilgili sorunlar olabilir ve tercih edilen başka bir aprotik çözücü reaksiyon için asetonitril yerine kullanılabilir. Protik çözücüler, etanol gibi, başarıyla kullanılmıştır ancak ısıtma gerektirebilir. Radyo-ince tabaka kromatografisi (radio-TLC) ile reaksiyonun izlenmesi, etiketleme protokolünde yapılan değişikliklerin sonucunu, standart silika TLC plakası üzerindeki taban çizgisine yapışacağı şeklinde hızlı bir şekilde yardımcı olabilir [18F]florür.
Etiketli SiFA-ligand, eluted çözeltisinde görünen ve kartuşta görünmeyen etkinliğin büyük bir kısmıyla belirtildiği gibi, 2.3 adımda C18 kartuşundan geçerse, kullanılan kartuşun fazının değiştirilmesi gerekebilir. Polar SiFA-ligands daha büyük bir C18 kartuş veya bazı hidrofilik özelliklere sahip bir C18 reçine içeren çift fazlı kartuş gerekebilir.
Pet gibi in vivo uygulamalar için de siFA-ligands etiketli kullanılabilir. Örneğin, etiketli küçük molekül [18F]SiFA-PSMA (Şekil 4A) bir fare modelinde implante edilmiş bir tümör ksenogreftini görüntülemek için kullanılmıştır (Şekil 4B). SiFA-tracer 60 dakika üzerinde olumlu tümör alımı görüntülenen, hangi rekabetçi bir inhibitör tarafından bloke edilebilir(Şekil 4C). Daha etkileyici bir şekilde,18F etiketli peptid [ 18F]SiFAlin-TATE (Şekil 5A) pet (Şekil 5B) ve PET /CT (Şekil 5C)11ile bir kanser hastasında metastatik nöroendokrin tümörleri görüntülemek için kullanılmıştır .
Şekil 1: SiFA 18F-radiolabeling iş akışına genel bakış. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Tipik SiFA 18F-radiolabeling protokolü. (A) Azeotropik kurutma [18F]florür. (B) Katı faz çıkarma yoluyla SiFA etiketleme reaksiyonu ve saflaştırma. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3:[18F]SiFA-PSMA'nın katı faz ekstraksiyonu saflaştırması sonrası son radyo-HPLC kromatogramı, kalite kontrol için alınır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Etiketli SiFA-ligandların uygulanması. [18F]SiFA-PSMA radyotracer yapısı. (B) Sol omuz üzerinde LNCaP ksenogreft tümörü taşıyan bir farenin yeniden oluşturulmuş görüntüsü,[18F]SiFA-PSMA ile 60 dk post enjeksiyon (p.i.) ile. (C) Tümör ve kas dokularında [18F]SiFA-PSMA alımı için zaman aktivitesi eğrileri 60 dk üzerinde, bloke edici ajan olarak 300 μg DCFPyL önceden uygulanması veya olmadan. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Etiketli SiFA-ligandların uygulanması. [18F]SiFA-TATE radyotracer yapısı. (B) [18F]SiFA-TATE ile metastatik endokrin tümörlü bir insan kanser hastasının PET görüntüsü yeniden oluşturuldu. (C) Enine ve sagital düzlemlerde aynı hastanın PET/CT görüntüleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
SiFA etiketleme kimyası, oda sıcaklığında yapIlebilen olağanüstü verimli izotopik değişim reaksiyonu kullanan ilk 18F-etiketleme yönteminden birini temsil eder. Tipik bir radyokimyasal reaksiyon bir eleme veya ikame yolu ile florür-reaktif işlevsellik ile [18F] florür reaksiyonu yoluyla bir karbon-flor bağı oluşumuna dayanır. Bu reaksiyon koşulları genellikle serttir, aşırı pH veya yüksek sıcaklıkta gerçekleştirilir ve HPLC gibi zahmetli ve zaman alıcı teknikler kullanılarak çıkarılması gereken yan ürünler veya reaksiyon katılımcıları ile yüklüdür. SiFA etiketleme tekniği ile etiketleme öncüsü ve 18F etiketli bileşik kimyasal olarak aynıdır. Ayrıca reaksiyon çok hafif koşullarda devam ettiği için genellikle yan ürünler gözlenmez. Bu özellikler, normalde daha reaktif koşullarda veya yüksek sıcaklıklarda ayrıştırılabilen veya epimerize edilebilen daha karmaşık moleküllerin (yani proteinler, serbest radikal jeneratörleri, metal-çekatlar, floroforlar, biyolüminesans öncüleri) etiketletilmesimümkün olur. Ayrıca, 18F etiketli SiFA içeren bileşikler basit katı faz çıkarma teknikleri kullanılarak hızlı bir şekilde saflaştırılabilir.
Bu etiketleme metodolojisi '4 damla yöntemini' kullanır, burada temel elüsyon çözeltisinin sadece ilk 4 damlası qma kartuşundan[18F] florür eluting yaparken kullanılır. Bu modifikasyon [18F] florür stok çözeltisi baz miktarını azaltmak için yapıldı [18F] florür stoku elüsyon çözeltisi tüm baz içerdiği takdirde SiFA moiety düşürür gibi. Daha önce,[18F] florür stok çözeltisine temelliği azaltmak için oksalik asit eklenmiştir veya tüm çözelti yerine stoğun küçük bir aliquot'u kullanılmıştır, ki bu savurganlıktı. '4 damla yöntemi' SiFA etiketleme protokolünün en son yinelemesini temsil eder.
Öncü molekül ve etiketli nihai ürün kimyasal olarak aynı olduğundan, arınma sırasında birbirlerinden ayrılamazlar ve son enjekte edilebilirin molar aktivitesi böylece izotopik değişim için kullanılan öncül miktarına tamamen bağlıdır. Nihai çözümde etiketlenmemiş öncül bir kısmının çok yüksek olması, etiketli SiFA-ligand'ın etiketlenmemiş öncül ile rekabet nedeniyle amaçlanan moleküler hedefini bağlama fırsatını azaltacaktır. Bu nedenle, molar etkinliği tamamen etiketleme için kullanılan öncül miktarına bağlıdır. Tipik olarak, tekrarlanabilir etiketleme reaksiyonları için 20−100 nmol prekürsör gereklidir ve 80 GBq/μmol ve daha yüksek molar aktivitelerini gerçekleştirmek için 5 nmol kadar az öncül başarıyla etiketlenmiştir.
SiFA yapı taşı (örneğin, SiFA-octreotate) ile türemiş küçük moleküller ve peptidler tek adımda [18F] florür ile etiketlenebilir; ancak, proteinlerin SiFA etiketleme iki adımlı bir protokol gerektirir. Küçük, son derece reaktif bir SiFA-protez grubu (örneğin, [18F]SiFB) hazırlanmalı ve verilen proteinle reaksiyona girmelidir ve etiketli protein daha sonra HPLC tarafından saflaştırılmalıdır.
SiFA-etiketleme metodolojisi, HPLC arınması ve yaygın reaksiyon manipülasyonu genellikle gerekli değildir gibi radyofarmasötik kiti sentezler kendini ödünç. Basit 'sallamak ve pişirmek' tarzı kitleri bir SiFA-ligand tek hasta doz miktarları ile kolayca radyopharmacy teknisyenleri tarafından ele olabilir-çok daha küçük bir öğrenme eğrisi ve zaman / işçilik maliyeti gerektiren otomatik bir sentez ünitesi ile daha.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Yazarların hiçbir takdiri yok.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| [18F]F-/H2[18O]O | (Cyclotron produced) | - | - |
| [2.2.2]Cryptand | Aldrich | 291110 | Kryptofix 2.2.2 |
| Acetonitrile anhydrous | Aldrich | 271004 | - |
| Deionized water | Baxter | JF7623 | - |
| Ethanol, anhydrous | Commercial Alcohols | - | |
| Potassium carbonate | Aldrich | 209619 | - |
| QMA cartridge | Waters | 186004540 | QMA SepPak Light (46 mg) cartridge |
| Equipment | |||
| C-18 cartridge | Waters | WAT023501 | C-18 SepPak Light cartridge |
| C18 column | Phenomenex | 00G-4041-N0 | HPLC Luna C18 250 x 10 mm, 5 µm |
| HPLC | Agilent Technologies | - | HPLC 1200 series |
| micro-PET Scanner | Siemens | - | micro-PET R4 Scanner |
| Radio-TLC plate reader | Raytest | - | Radio-TLC Mini Gita |
| Sterile filter 0.22µm | Millipore | SLGP033RS | - |
References
- Wahl, R. L., Buchanan, J. W. Principles and practice of positron emission tomography. , Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia, PA. (2002).
- Wängler, C., Schirrmacher, R., Bartenstein, P., Wängler, C. Click-chemistry reactions in radiopharmaceutical chemistry: Fast & easy introduction of radiolabels into biomolecules for in vivo imaging. Current Medical Chemistry. 17, 1092-1116 (2010).
- Schirrmacher, R., et al. 18F-labeling of peptides by means of an organosilicon-based fluoride acceptor. Angewandte Chemie International Edition. 45, 6047-6050 (2006).
- Kostikov, A. P., et al. Oxalic acid supported Si-18F-radiofluorination: One-step radiosynthesis of N-succinimidyl 3-(di-tert-butyl[18F]fluorosilyl)benzoate ([18F]SiFB) for protein labeling. Bioconjugate Chemistry. 23 (1), 106-114 (2012).
- Cacace, F., Speranza, M., Wolf, A. P., Macgregor, R. R. Nucleophilic aromatic substitution; kinetics of fluorine-18 substitution reactions in polyfluorobenzenes. Isotopic exchange between 18F- and polyfluorobenzenes in dimethylsulfoxide. A kinetic study. Journal of Fluorine Chemistry. 21, 145-158 (1982).
- Schirrmacher, E., et al. Synthesis of p-(di-tert-butyl[18F]fluorosilyl)benzaldehyde ([18F]SiFA-A) with high specific activity by isotopic exchange: A convenient labeling synthon for the 18F-labeling of N-amino-oxy derivatized peptides. Bioconjugate Chemistry. 18, 2085-2089 (2007).
- Kostikov, A., et al. N-(4-(di-tert-butyl[18F]fluorosilyl)benzyl)-2-hydroxy-N,N-dimethylethylammonium bromide ([18F]SiFAN+Br-): A novel lead compound for the development of hydrophilic SiFA-based prosthetic groups for 18F-labeling. Journal of Fluorine Chemistry. 132, 27-34 (2011).
- Wängler, B., et al. Kit-like 18F-labeling of proteins: Synthesis of 4-(di-tert-butyl[18F]fluorosilyl)benzenethiol (Si[18F]FA-SH) labeled rat serum albumin for blood pool imaging with PET. Bioconjugate Chemistry. 20, 317-321 (2009).
- Iovkova, L., et al. para-Functionalized aryl-di-tert-butylfluorosilanes as potential labeling synthons for 18F radiopharmaceuticals. Chemistry. 15, 2140-2147 (2009).
- Wängler, C., et al. One-step 18F-labeling of carbohydrate-conjugated octreotate-derivatives containing a silicon-fluoride-acceptor (SiFA): In vitro and in vivo evaluation as tumor imaging agents for positron emission tomography (PET). Bioconjugate Chemistry. 21, 2289-2296 (2010).
- Ilhan, H., et al. First-in-human 18F-SiFAlin-TATE PET/CT for NET imaging and theranostics. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 46, 2400-2401 (2019).
