Summary
细胞重新编程需要引入关键基因，这些基因调节和维持多能细胞状态。所述方案使诱导多能干细胞（iPSCs）菌落的形成来自人类皮肤成纤维细胞，无需病毒/整合方法，但使用非修饰RNA（NM-RNA）结合免疫逃逸因子减少细胞防御机制。
Abstract
诱导多能干细胞（iPSCs）可被视为迄今为止一个有前途的多能细胞来源，用于管理目前无法治疗的疾病、重建和再生受伤组织以及开发新药。尽管与使用 iPSC 相关的所有优势，例如拒绝风险低、道德问题减少，以及有可能从年轻和老年患者那里获得这些差异，而他们的重新编程潜力没有任何差异，但需要克服的问题仍然很多。事实上，使用病毒和整合病毒进行的细胞重新编程会导致感染，而引入所需基因会导致受体细胞的基因组不稳定，从而损害其在临床上的使用。特别是，有许多关于使用c-Myc基因的关注，从几项研究中，它因其突变诱导活性而广为人知。纤维细胞已成为细胞重新编程的合适细胞群，因为它们易于分离和培养，并且通过微创性皮肤冲活检进行收获。此处描述的协议提供了整个过程的详细分步描述，从样品加工到获取细胞培养、试剂和用品的选择、清洁和制备，以及通过商业方式对细胞重新编程基于非改性RNA（NM-RNA）的重新编程套件。所选择的重新编程试剂盒允许对iPSC进行有效的人体皮成纤维细胞重新编程，并且在第一次转染后24小时就可以看到小菌落，即使对标准数据表进行修改也是如此。该协议中使用的重新编程过程具有安全重新编程的优点，无需病毒载体方法引起的感染风险，减少了细胞防御机制，并允许生成无异种的 iPSC，所有为进一步临床应用而必须提供的关键功能。
Introduction
细胞重新编程是一种新技术，将身体的每一个体细胞转化为多能干细胞，称为iPSC1。将成人体细胞重新编程回到多能和未分化状态的可能性已经克服了与使用多能细胞（以前只能来自人类胚胎（胚胎干细胞或ESC）2、3、4）的多能细胞和伦理问题有关的不良可用性和伦理问题所施加的限制。2006年，高桥和山中信亚进行了一项开创性的研究，通过人工添加四个特定基因（Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc）5，实现了成人体细胞从皮肤转化为多能细胞的首次转化。一年后，在汤姆森实验室进行的工作通过转导四个基因的不同组合（Oct4、Sox2、Nanog、Lin28）6，成功地将体细胞重新编程为iPSC。
iPSCs为不同领域的科学家和研究人员提供了许多机会，如再生医学和药理学，是研究和治疗不同疾病以及基因性反映患者特征的绝佳平台。iPSC的使用提供了几个优点，包括：由于细胞完全自体来源，免疫反应风险降低;创建细胞库的可能性，这是预测对新药及其副作用反应的重要工具，因为它们能够持续自我更新并产生不同的细胞类型;并有机会为药物管理7、8、9开发一种定制方法。
目前已知的各种技术，诱导重编程因素的表达，它们被包括两大类：非病毒和病毒载体的方法10，11，12，13。非病毒方法包括mRNA转染，miRNA感染/转染，PiggyBac，小圆载体和表皮质粒和外体体10，11，12，13。基于病毒的方法包括非整合病毒，如腺病毒、仙台病毒和蛋白质，以及整合病毒，如逆转录病毒和Lenti病毒10，11，12，13。
根据几项研究，这些方法在细胞重新编程的有效性方面没有显著差异，因此，选择合适的方法完全取决于所使用的细胞类型，以及随后的iPSCs应用获得14，15。上述所有方法都显示出缺点，例如，仙台病毒对所有细胞类型都有效，但需要大量通道才能获得iPSC;表皮体重新编程对血细胞是极好的，但需要修改成纤维细胞的标准培养条件;PiggyBac方法可能是一个有吸引力的替代方法，但人类细胞的研究仍然有限，弱10，11，12，13。外泌体是纳米囊泡，由细胞在生理上分泌到所有体液中。根据最近的研究，它们负责细胞间通信，可以在重要的生物过程中发挥作用，如细胞增殖、迁移和分化。外体体可以移植和转移mRNA和miRNA到受体细胞与完全自然的机制，因为他们共享相同的细胞膜16的组成。因此，外体是一种很有前途的新一代重新编程技术，但它们通过内容重新编程体细胞的潜力仍在调查中。基于病毒载体的方法使用经过修饰的病毒，以便将重新编程的基因传送到受体细胞。这项技术，尽管重新编程效率很高，但被认为是不安全的，因为细胞内的病毒整合可以导致感染、畸马细胞瘤和基因组不稳定17。
以下协议，以生成iPSC菌落结合山中和汤普森的重新编程鸡尾酒，并基于使用的方法，要求NM-RNA和免疫逃逸因子，并有可能在无异种条件下执行。使用这种方法的原理是在科学界传播一种协议，允许将成人成纤维细胞从腹部皮肤重新编程到iPSC18中快速、简单和高效的重新编程。
实际上，该方法的优点在于性能的简便性和获得 iPSC 所需的时间短。此外，该方法避免了细胞防御机制和病毒载体的使用，负责相关问题。
关于标准协议，进行了以下修改：（1） 在通道4处同步，在胰蛋白酶化前将0.1%的血清放入48小时;（2） 对培养细胞密度和试剂体积进行调整，以利用24孔多孔板代替6孔板;（3） 重新编程实验使用5%CO2培养箱，而不是具有大气（21%O2）或低氧（5%O2）条件的培养箱。
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Protocol
人体组织标本是根据《赫尔辛基宣言》采集的，同时遵守费德里科二世大学医院的指导方针。参与这项研究的所有患者均提供书面同意。
1. 用品和文化媒体的准备
- 清洁和高压灭菌一把大手术剪刀，两套细钳子，两对微解剖剪刀，1 L无菌瓶，500 mL无菌瓶和250 mL无菌瓶。
- 准备 100 mm 板、60 mm 板、35 mm 板、一次性手术刀、50 mL 无菌管、15 mL 无菌管和 100 mm 玻璃板。在无菌条件下存放仪器，直到准备好使用。
- 使用前清洁和消毒 22 mm x 22 mm 盖眼镜。为此，将盖玻璃放在玻璃板中，用70%乙醇盖住它们，等待几秒钟后再将乙醇吸气。让盖眼镜在37°C的烤箱中干燥，然后高压灭菌。
- 在pH 7.4下制备汉克平衡盐溶液（HBSS）1升，在双蒸馏无菌水中溶解市售的粉状盐，并加入0.35克碳酸氢钠。在无菌罩下通过过滤进行消毒，并储存在+4°C下，直到使用。
- 在无菌双蒸馏水中溶解0.1克磷酸钾单基、0.1克氯化钾、4.0克氯化钠和0.575克磷酸钠二基基，制备500 mL的无菌1x磷酸盐缓冲盐（PBS）。检查 pH 值 （7.4），并通过过滤在无菌罩下进行消毒。储存在+4°C，直到使用。
- 通过在无菌罩下将 5 mL 的 10% 胎儿牛血清 （FBS） 添加到 45 mL 的 HBSS 中，制备 50 mL 的胰蛋白酶停止溶液 （TSS）。储存在+4°C，直到使用。
- 使用 250 mL 的 Dulbeco 改性鹰介质 （DMEM） 制备 Dulbecco 的改性 Eagle 介质，在无菌罩下辅以 10% FBS 和 0.5% 青霉素和链霉素（笔/链球菌）。制备杜德贝克的改性鹰介质。储存在+4°C，直到使用。
- 使用 250 mL 的 DMEM 为成纤维细胞同步 （S-DMEM） 准备 DMEM，在无菌罩下辅以 0.1% FBS 和 0.5% 笔/链球菌。储存在+4°C，直到使用。
2. 人类皮肤纤维细胞的隔离
注：下面报告的步骤 2.1 到 2.3 必须在无菌罩下执行。直径约0.8厘米的圆柱形样品在通道1处产生2 x 106成纤维细胞。
- 用HBSS溶液在100毫米的菜中清洗从腹部新鲜获得的人体皮肤样本。轻轻摇动以去除血液和其他生物液体。重复此步骤三次，每次清洗时更换 HBSS 溶液和板。
- 将样品放入100毫米的盘子中，用细钳子和剪刀去除头发和脂肪，并用手术刀解剖，以获得2毫米x1毫米碎片（共16个碎片），避免疤痕、脏污（例如，由用真成像笔绘图产生的）或烧伤区域 组织。
- 将 4 个小碎片放入每个 35 mm 盘中，用无菌 22 mm x 22 mm 盖玻璃盖住。通过精细钳子进行调整。添加 1.5 mL 的 I-DMEM。
- 在5%CO2中37°C孵育板约15天，或直到细胞达到85%汇合。每3天更换一次培养基，每天使用倒相对比显微镜检查细胞的外生长。
3. 人类皮肤纤维细胞的扩张
注：以下报告的步骤必须在无菌罩下执行，但在培养箱中执行的步骤除外。
- 用细钳提起盖眼镜，将其倒置放在一个 100 mm 的盘子中，用 1x 无菌 PBS 清洗。
- 取出样品的碎片并丢弃，用1x无菌PBS清洗板。
- 去除1x PBS，加入3 mL和1 mL的胰蛋白酶-EDTA（乙二胺四乙酸），以覆盖分别放置在100毫米盘子和35毫米盘子中的玻璃杯。在37°C下孵育5分钟，CO2为5%。
- 将 5 mL 的 TSS 添加到 100 mm 的盘中，将 2 mL 的 TSS 添加到每个 35 mm 的盘中，从而阻止胰蛋白酶化。将悬浮液收集到15 mL无菌管中，在4°C下以400 x g离心5分钟。
- 吸气上清液，在 I-DMEM 的 12 mL 中重新悬浮颗粒。将细胞悬架分成3 mL等分，每个60毫米板。
- 在37°C孵育，CO2为5%。每天更改媒体。将细胞保存在培养中，直到它们达到75%的汇合。
- 从板中吸出介质，快速在 1x PBS 中洗涤。
- 重复胰蛋白酶化（步骤3.3和3.4）三次，在通道4处获得细胞。在每个 60 毫米的盘中使用 1.5 mL 的胰蛋白酶-EDTA 和 3 mL 的 TSS。拆分单元格 1：3。
- 将I-DMEM替换为S-DMEM，在37°C下孵育48小时，CO2为5%。
- 准备以下内容（在单元格同步期间）。
- 通过向 44.5 mL 先进的 DMEM （A-DMEM） 中加入 5.0 mL 的 FBS 和 0.5 mL 的 L-谷氨酰胺，制备成纤维细胞膨胀介质，储存在 +4 °C。
- 在9个无菌RN酶管中分别组合以下：32 μL OSKMNL NM-RNA-RNA、24 μL EKB-RNA、5.6 μL NM-微RNA（9个无脂酶的61.6μL最终体积），准备用于成纤维细胞重编程的全NM-RNA再编程鸡尾酒。
- 将每管 61.6 μL 的总 NM-RNA 重新编程鸡尾酒进行成纤维细胞重编程，在无菌、无RN酶管中分成四个 15.4 μL 一次性等分，并储存在 -80°C （15.4 μL 最终体积，用于 36 个等分）。
4. 对 iPSC 的皮下纤维细胞重新编程
- 第 0 天：细胞播种
注： 步骤 4.1.1 到 4.1.3 和 4.1.8 到 4.1.9 必须在无菌罩下执行。基底膜基质（BMM）凝胶在室温下快速。因此，强烈建议在冰箱的冰上过夜解冻 BMM，用无冰血清介质稀释，并使用预冷却移液器、吸头和管。- 在37°C下，用100μL的BMM涂层每口孔，孵育至少1小时，然后播种细胞，准备24孔板。
- 从培养细胞的板中吸出培养基，并在1xPBS中快速洗涤。
- 重复胰蛋白酶化（步骤3.3和3.4），在通道5处获得细胞。吸气上清液，在适当的成纤维细胞膨胀介质中重新悬浮颗粒（参见步骤3.10）。
- 用 70% 酒精准备和清洁细胞计。
- 在1.5 mL管中轻轻混合10μl的锥体蓝色和10μL的细胞悬浮液，并在室温下孵育1⁄2分钟，制备溶液。小心不要孵育超过5分钟。
- 将溶液10μL的移液器放入造流仪中，将其置于倒相对比显微镜的舞台上进行计数。非活细胞将是蓝色的，而活的细胞将不受染色。
- 在血细胞计室的至少2个方块中计算细胞。应用以下计算可获得单元格的总数：
细胞总数 = （计数的细胞/平方数总数） x 2 x 10 x 细胞悬浮总量 - 根据计数细胞的总数，执行稀释以获得每500μL成纤维细胞扩张介质的密度为2.5 x 104细胞。在适当的成纤维细胞膨胀介质中重新悬浮颗粒。
- 将500μL的细胞悬浮液放入24孔板的每个孔中。在37°C和5%CO2下孵育细胞过夜。
- 第1天：转染
注：所有工作表面和用品（如手套、瓶子、无菌罩表面、移液器）必须在开始手术前用清洁试剂进行清洁，以去除RNase。在无菌罩下执行步骤 4.2.2、4.2.4~4.2.8。- 在37°C水浴中加热无异种、无血清、低生长因子的人类ESC/iPSC培养基（XF/FF培养基）。
- 从每个井中取出旧介质，并将其替换为 500 μL 的预加热 XF/FF 培养基。
- 在 37°C 下 5% CO2下孵育至少 6 小时。
- 在室温下解冻五种15.4 μL等分的NM-RNA重编程鸡尾酒，然后将其放在冰上。
- 在每个等分中加入234.6 μL的减血清介质，轻轻移液3~5次，并将每个介质标记为TUBE A（RNA + 降血清培养基）。
- 标签 5 无菌，无RNase 0.5 mL管作为TUBE B，将6μL合成siRNA转染试剂与244μL的减血清培养基（RNA转染试剂+减血清培养基）混合。
- 将每个TUBE B的含量添加到一个按滴管（以获得500μL的NM-RNA转染复合溶液的最终体积）。通过敲击管的底部进行混合。在室温下孵育15分钟。
- 从5个500μL的5个等分中各加入125μL的NM-RNA转染复合溶液到4口井（达到总共20口井），倾斜板，移液滴入介质。轻轻摇动混合。使用剩余的 4 口井作为参考。
- 在37°C下孵育15小时，CO2孵育5%。
- 第2天-4天：完成转染
- 吸气介质。在无菌罩下重复第 1 天的转染程序。
- 第 5 天-10 天：媒体更改
- 吸气介质，在无菌罩下与新鲜预加热的 XF/FF 培养介质进行交换。
- 在37°C，5%CO2下孵育过夜。
- 保持培养，直到观察iPSC菌落的形成，每天监测通过相对比显微镜。
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Representative Results
该协议的目的是使用基于NM-RNA的非集成重编程方法重新编程从腹部皮肤分离的皮肤成纤维细胞，以诱导特定因子的表达。为了实现这一目标，从接受腹部粘动手术的患者的皮肤标本中分离出人类皮肤成纤维细胞，通过结合NM-RNA和微RNA技术的商业即用重新编程试剂盒，产生了Oct4、Sox2、Klf4、cMyc、Nanog、Lin28重新编程因子和E3、K3、B18免疫逃逸因子。协议的时间表如图1所示。
人类成纤维细胞在培养后一周内从腹部皮肤样本中流出（图2A），两周内达到85%汇合（图2B）。细胞的特点是塑料培养皿上的粘合生长，其形态从长方形和主轴形（图2C）到扁平和星形（图2D）。在BMM上播种后，成纤维细胞形态和培养的排列发生了戏剧性的变化，当他们获得一个细长的形态并排列成薄的分支结构（图3A）。从第一次转染开始，小群落在第1天的文化中已经可见（图3B），其规模随着时间的推移而逐渐增大，而其数量直到第7天才增加，然后在第7天和第14天之间保持稳定（图3C，D），这可能是由于较小的菌落合并形成更大的殖民地。
由于重新编程程序使用无抗生素介质进行，微生物污染是一个主要问题，如果无菌条件得不到保证，则可能发生（图4），采用标准程序来防止污染（例如，戴手套、清除所有表面的灰尘、使用 70% 乙醇清洁所有表面和设备、避免在与未覆盖的细胞培养板的步骤中交谈）。
图 1：协议时间线。从腹部皮肤分离和重新编程人类成纤维细胞的时间表。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：皮肤成纤维细胞的隔离与培养。从皮肤碎片（A）中生长成纤维细胞的代表性图像。成纤维细胞在大约14天（B）内到达汇合体，并显示出主轴形（C） 和星形 （D） 表型。皮肤碎片由白星表示。刻度条 = 200 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：皮肤成纤维细胞重新编程进展。在BMM上播种的细胞在排列和形态上有明显的变化.iPSC的小群早在第一次转染（B）后24小时形成，其大小在第7天（C）和14（D）逐渐增加，而其数量在第1天至第7天之间增加，但从第一次转染的第7天至第14天之间保持稳定。刻度条 = 500 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
图4：重新编程过程中的微生物污染。使用相对比显微镜的代表性图像，显示在重新编程过程中对成纤维细胞培养的微生物污染。刻度条 = 500 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
iPSC正在迅速成为再生医学应用最有前途的细胞候选者，并作为疾病建模和药物测试的非常有用的工具3，8。此处介绍的协议描述了从具有皮肤冲孔活检大小的样本中生成人类 iPSC，其程序简单而高效，不需要任何特定设备或以前重新编程技术的经验。
优化成纤维细胞隔离和培养以提高成功机会至关重要，因为电镀密度和增殖率会影响重新编程效率。此外，最近有报道称，皮肤成纤维细胞对重新编程技术的反应不同，具体来说，从腹部区域皮肤分离的成纤维细胞比从其他身体区域分离的皮肤成纤维细胞更容易和容易地重新编程。因此，准确选择体细胞进行重新编程，并根据细胞增殖率定义电镀密度就显得尤为重要。为此，本协议还指导了如何从腹部皮肤分离皮肤成纤维细胞，以及如何在体外繁殖它们，以减轻和加速手术。
在重新编程之前，成纤维细胞被传播到通道5，以清除细胞记忆18，并符合报告的证据，通过可以加速诱导多能状态19。此外，根据我们的经验，培养中的成纤维细胞具有可变增殖特性，因此我们通过引入一个额外的步骤来同步成纤维细胞并减少细胞群的变异性来修改协议。
使用基于NM-RNA的商业试剂盒，引入由Yamanaka和Thomson的方法5，6产生的重新编程因子的组合，以及已被证明能改进基于mRNA的重新编程20的miRNA，人类皮肤成纤维细胞可以成功地重新编程到iPSC，并且小菌落在第一次转染后24小时就变得明显。基于mRNA的重新编程的主要优点是，即使低数量的细胞被重新编程20，并且异常失调率非常低，并且完全没有集成，使得用这种方法产生的iPSC在再生医学中是安全的，但殖民地的早期出现也是如此。此外，用于该协议的商业试剂盒共同提供免疫调节因子，已知通过防止细胞毒性和免疫性NM-RNA21、22引起的细胞死亡来提高重新编程的效率。
虽然用于重新编程的试剂盒专为 6 孔多孔板而设计，但我们优化了细胞密度，并调整了试剂的体积，以便用于 24 孔多孔板，以使该协议对通过皮肤冲孔活检生成人类 iPSC 有效。此外，即使几个作者报告需要具有O2控制的组织培养箱，并且由试剂盒制造商推荐，我们按照此处描述的协议，在标准 5% CO2培养箱中重新编程腹部皮肤的人类皮肤成纤维细胞。因此，这个程序可以在任何细胞培养实验室进行，而无需大气（21%O2）或缺氧（5%O2）培养条件，虽然这些可能进一步提高重新编程效率24，25。
尽管如此，我们使用非人类动物衍生试剂从可用于研究目的的小型皮肤标本iPSC中提取。虽然最有吸引力的应用是组织和器官的再生，iPSCs已经用于建模不同的疾病，然后既研究潜在的分子机制，并开发特定的药物和疗法3，26。
值得注意的是，用动物衍生试剂代替适当的无异种试剂，同样的方案允许在完全无异种的培养环境中将成人成人成纤维细胞重新编程到iPSC中，从而保证其临床使用。
然而，需要考虑繁重的工作量。我们认为，提前仔细规划实验至关重要，包括周末需要执行的步骤，并在同步步骤期间准备所有转染试剂。事实上，转染是每天进行四天，之后，细胞需要每天监测和介质每天更换。
此外，iPSC菌落的精确识别不能仅仅基于形态标准。因此，需要对新衍生的iPSCs进行特征化，通过细胞和分子分析来寻找多种多能标记的表达。广泛接受的标记包括NANOG、OCT4、SOX2、TRA-1-60、TRA-1-81和SSEA4，可以通过免疫细胞化学分析和使用半定量或定量RT-PCR的基因表达分析来识别。由于碱性磷酸酶活性已被证明在多能干细胞中具有高调节性，因此，这种酶活性的检测可以很容易地进行，以识别iPSCs并验证重新编程27、28的发生。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者没有承认。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL serological pipet | Falcon | 357551 | Sterile, polystyrene |
| 100 mm plates | Falcon | 351029 | Treated, sterile cell culture dish |
| 15 mL sterile tubes | Falcon | 352097 | Centrifuge sterile tubes, polypropylene |
| 24-well plates | Falcon | 353935 | Clear, flat bottom, treated multiwell cell culture plate, with lid, sterile |
| 25 mL serological pipet | Falcon | 357525 | Sterile, polystyrene |
| 35 mm plates | Falcon | 353001 | Treated, sterile cell culture dish |
| 5 mL serological pipet | Falcon | 357543 | Sterile, polystyrene |
| 50 mL sterile tubes | Falcon | 352098 | Centrifuge sterile tubes, polypropylene |
| Advanced DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Gibco | 12491-015 | Store at 2-8 °C; avoid exposure to light |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Sigma- Aldrich | D6429-500ml | Store at 2-8 °C; avoid exposure to light |
| Fetal Bovine Serum | Sigma- Aldrich | F9665-500ml | Store at -20 °C. The serum should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles |
| Hank's Balanced Salt Solution | Sigma- Aldrich | H1387-1L | Powder |
| L-glutamine | Lonza | BE17-605E | Store at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles |
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | INVITROGEN | 13778-030 | Synthetic siRNA Transfection Reagent; store at 2-8 °C |
| Matrigel | CORNING | 354234 | Basement Membrane Matrix, store at -20 °C. Avoid multiple freeze-thaws. |
| Neubauer Chamber | VWR | 631-1116 | Hemocytometer |
| NutriStem XF Culture Medium | Biological Industries | 05-100-1A-500ml | Xeno-free, serum-free, low growth factor human ESC/iPSC culture medium. Store at -20 °C. Upon thawing, the medium may be stored at 2-8 °C for 14 days. Media should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles. |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-062-100ml | Reduced-Serum Medium; store at 2-8 °C; avoid exposure to light |
| Penicillin and Streptomycin | Sigma- Aldrich | P4333-100ml | Store at -20 °C. The solution should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles |
| Potassium Chloride | Sigma- Aldrich | P9333 | Powder |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sigma- Aldrich | P5665 | Powder |
| RNase-free 0.5 mL tubes | Eppendorf | H0030124537 | RNase-free sterile, microfuge tubes, polypropylene |
| RNase-free 1.5 mL tubes | Eppendorf | H0030120086 | RNase-free sterile, microfuge tubes, polypropylene |
| RNaseZAP | INVITROGEN | AM9780 | Cleaning agent for removing RNase |
| Sodium Bicarbonate | Sigma- Aldrich | S5761 | Powder |
| Sodium Chloride | Sigma- Aldrich | S7653 | Powder |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma- Aldrich | 94046 | Powder |
| StemRNA 3rd Gen Reprogramming Kit | Reprocell | 00-0076 | Third Generation NM-RNAs-based Reprogramming Kit for Cellular Reprogramming of Fibroblasts, Blood, and Urine. Store at or below -70 °C. |
| Trypsin-EDTA | Sigma- Aldrich | T4049-100ml | Store at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles |
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