Summary
세포 재프로그래밍은 다능성 세포 상태를 조절하고 유지하는 주요 유전자의 도입을 요구합니다. 기술된 프로토콜은 바이러스/통합 방법 없이 인간 진피 섬유아세포로부터 유도된 만능 줄기 세포(iPSCs) 콜로니의 형성을 가능하게 하지만, 세포 방어 메커니즘을 감소시키는 면역 회피 인자와 결합된 비변형 RNA(NM-RNAs)를 사용한다.
Abstract
유도 된 만능 줄기 세포 (iPSCs)는 현재까지 현재 치료 할 수없는 질병의 관리, 부상당한 조직의 재구성 및 재생 및 신약 개발을위한 다능성 세포의 유망한 공급원으로 간주 될 수 있습니다. 거부의 낮은 위험, 감소 된 윤리적 문제 및 재프로그래밍 잠재력의 차이없이 젊은 환자와 노인 환자 모두에서 얻을 수있는 가능성과 같은 iPSCs의 사용과 관련된 모든 장점에도 불구하고, 극복해야 할 문제 여전히 많다. 실제로, 바이러스 및 통합 바이러스로 행해진 세포 재프로그래밍은 감염을 일으킬 수 있고 필요한 유전자의 도입은 수용자 세포의 게놈 불안정성을 유도하여 클리닉에서의 사용을 손상시킬 수 있다. 특히, c-Myc 유전자의 사용에 대 한 많은 우려가 있다, 그것의 돌연변이 유도 활동에 대 한 여러 연구에서 잘 알려진. 섬유아세포는 세포 재프로그래밍에 적합한 세포 집단으로 나타났으며, 분리및 배양이 용이하고 최소 침습성 피부 펀치 생검에 의해 수확된다. 여기에 설명된 프로토콜은 시료 처리에서 세포 배양, 시약 및 소모품 선택, 세척 및 준비, 상업적 수단에 의한 세포 재프로그래밍에 이르기까지 전체 절차에 대한 상세한 단계별 설명을 제공합니다. 수정되지 않은 RNA(NM-RNAs) 기반 리프로그래밍 키트. 선택된 리프로그래밍 키트는 iPSCs및 작은 콜로니에 인간 진피 섬유아세포의 효과적인 재프로그래밍을 허용하고 작은 콜로니는 표준 데이터 시트에 대하여 수정되더라도, 첫번째 형질전환 후에 24 시간 일찍 보일 수 있습니다. 이 프로토콜에 사용되는 재프로그래밍 절차는 바이러스 벡터 기반 방법으로 인한 감염의 위험없이 안전한 재프로그래밍의 이점을 제공하고 세포 방어 메커니즘을 감소시키며 xeno-free iPSC의 생성을 허용합니다. 추가 임상 응용을 위해 필수인 중요한 기능.
Introduction
세포 재프로그래밍은 iPSC1로알려져 있는 다능성 줄기 세포로 바디의 모든 체세포 세포를 변환하는 새로운 기술을 나타냅니다. 성인 체세포세포를 다능성 및 미분화 상태로 다시 재프로그래밍할 가능성은 다능성 세포의 사용과 관련된 빈약한 가용성 및 윤리적 문제에 의해 부과된 한계를 극복하였으며, 이전에는 인간 배아(배아 줄기 세포 또는ESC)에서만유래할 수 있었다2,3,4. 2006년 다카하시 카즈토시와 야마나카 신야는 4개의 특정 유전자(Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc)를 인위적으로 추가하여 피부에서 다능성 세포로의성인 체세포가 최초로 변환되는 선구적인 연구를 수행했습니다 5. 1 년 후, 톰슨의 실험실에서 수행 된 작업은 4 개의 유전자 (Oct4, Sox2, Nanog, Lin28)의 다른 조합의 변환에 의해 iPSCs로 체세포의 성공적인 재프로그래밍으로 이어졌다6.
iPSCs는 재생 의학 및 약리학과 같은 다양한 분야의 과학자와 연구자에게 다양한 기회를 제공하며, 다른 질병을 연구하고 치료할 수 있는 훌륭한 플랫폼이며, 그(것)들이 파생되는 환자의 특성의 유전형 반사와 더불어. iPSCs의 사용은 다음과 같은 몇 가지 장점을 제공합니다 : 세포의 완전히 자가 기원으로 인한 면역 반응의 위험 감소; 세포 라이브러리를 생성할 수 있는 가능성, 새로운 약물과 그들의 부작용에 대 한 반응을 예측 하는 중요 한 도구, 그들은 지속적으로 자체 갱신 하 고 다른 세포 종류를 생성할 수 있습니다. 및 약물 투여를위한 맞춤형 접근 법을 개발할 수있는 기회7,8,9.
다양한 기술은 현재, 재프로그래밍 인자의 발현을 유도하기 위해 알려져 있으며, 이들은 두 가지 주요 범주에 포함된다: 비바이러스 및 바이러스 벡터 기반 방법10,11,12,13. 비 바이러스성 방법은 mRNA 형질감염, miRNA 감염/형질감염, PiggyBac, 미니서클 벡터 및 에피솜 플라스미드 및 엑소좀10,11,12,13을포함한다. 바이러스 기반 방법은 아데노바이러스, 센다이 바이러스 및 단백질과 같은 비통합 바이러스를 포함하며, 레트로바이러스 및 렌티바이러스10,11,12,13과같은 바이러스를 통합한다.
여러 연구에 따르면, 세포 리프로그래밍의 효과성 측면에서 이러한 방법들 사이에서 유의한 차이가 발견되지 않았으며, 따라서 적합한 방법의 선택은 사용되는 세포 유형 및14,15를수득한 iPSCs의 후속 적용에 따라 엄격하게 의존한다. 언급된 모든 방법은 단점을 보여 준다, 예를 들어, 센다이 바이러스는 모든 세포 유형에 효과적이지만, iPSCs를 얻기 위해 많은 구절이 필요합니다; 에피솜에 의한 재프로그래밍은 혈액 세포에 우수하지만 섬유아세포에 대한 표준 배양 조건의 수정이 필요합니다. PiggyBac 방법은 매력적인 대안을 나타낼 수 있지만 인간 세포에 대한 연구는 여전히 제한적이며 약한10,11,12,13. 엑소좀은 나노 소포생리학적으로 세포에 의해 모든 체액으로 분비됩니다. 최근 연구에 따르면, 그들은 세포 간 통신에 대 한 책임 및 중요 한 생물학적 프로세스에 역할을 가질 수 있습니다., 세포 증식 등, 마이그레이션 및 분화. 엑소좀은세포막(16)의동일한 조성을 공유하기 때문에 완전히 자연적인 메커니즘을 가진 수용자 세포로 mRNA 및 miRNA를 수송하고 전달할 수 있다. 따라서, 엑소좀은 재프로그래밍을 위한 유망한 차세대 기술이지만, 그들의 내용에 의해 체세포세포를 재프로그래밍할 수 있는 잠재력은 아직 조사 중이다. 바이러스 벡터 기반 방법은 수신자 세포에 재프로그래밍 유전자를 전달하기 위해 수정 된 바이러스를 사용합니다. 이 기술은, 리프로그래밍의 높은 효율에도 불구하고, 세포 내의 바이러스의 통합이 감염, 기형종 및 게놈 불안정성을 담당할 수 있기 때문에 안전한 것으로 간주되지 않는다17.
iPSCs 콜로니를 생성하는 다음 프로토콜은 야마나카와 톰슨의 리프로그래밍 칵테일을 결합하고 NM-RNA 및 면역 회피 인자를 필요로하는 방법의 사용을 기반으로 합니다. 이 방법의 사용 뒤에 근거는iPSCs18로복부 피부에서 성인 인간 섬유아세포의 신속하고, 간단하고 매우 효과적인 재프로그래밍을 허용하는 프로토콜, 과학 적인 지역 사회 내의 퍼지는 것입니다.
제안 된 방법의 강점은 사실, 성능의 용이성과 iPSC를 획득하는 데 필요한 짧은 시간입니다. 또한, 방법은 세포 방어 메커니즘 및 바이러스 벡터의 사용을 방지, 관련 문제에 대 한 책임.
표준 프로토콜에 대하여, 다음과 같은 변형이 이루어졌다: (1) 결합섬유아세포는 트립시네화 전에 48시간 동안 0.1% 혈청에 배치됨으로써 통로 4에서 동기화되었다; (2) 배양세포 밀도 및 시약의 부피는 6웰 플레이트 대신 24웰 멀티웰 플레이트의 활용도를 조정하였다; (3) 재프로그래밍 실험은 대기(21%O2) 또는 저산소(5%O2)조건을 가진 인큐베이터 대신 5%CO2인큐베이터를 사용하여 수행하였다.
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Protocol
인간 조직에서 견본은 대학 병원 페데리코 II 지침을 관찰하는 동안 헬싱키의 선언에 따라 수집되었다. 이 연구에 관여하는 모든 환자는 서면 동의를 제공했습니다.
1. 보급품 및 문화 미디어 준비
- 수술용 가위 1쌍, 미세 집게 2세트, 미세 한 두 쌍, 미세 분절 가위 2쌍, 멸균 병 1개, 500mL 멸균 병, 250mL 멸균 병.
- 100mm 플레이트, 60mm 플레이트, 35mm 플레이트, 일회용 메스, 50 mL 멸균 튜브, 15 mL 멸균 튜브 및 100mm 유리 판을 준비합니다. 사용할 준비가 될 때까지 멸균 조건에서 기기를 보관하십시오.
- 사용하기 전에 22mm x 22mm 커버 안경을 세척하고 살균하십시오. 이를 위해, 유리 접시에 커버 안경을 놓고 70 % 에탄올로 덮고 에탄올을 흡입하기 전에 몇 초 동안 기다립니다. 커버 안경을 오븐에서 37°C에서 건조시키고 오토클레이브합니다.
- 이중 증류수에 시판되는 분말 염을 용해시키고 0.35 g의 중탄산나트륨을 첨가하여 행크의 균형 잡힌 염액(HBSS) 1L을 pH 7.4로 준비합니다. 멸균 후드 하에서 여과하여 살균하고 사용할 때까지 +4°C에서 보관하십시오.
- 멸균 1x 인산완충식염수(PBS) 500 g을 용해시켜 인산염 모노베이직 칼륨 0.1 g, 염화칼륨 칼륨 0.1g, 염화나트륨 4.0g, 인산나트륨 디베이직 0.575g을 멸균 이중 증류수로 준비합니다. pH 값(7.4)을 확인하고 여과에 의해 멸균 후드 하에서 멸균합니다. 사용할 때까지 +4°C에서 보관하십시오.
- 멸균 후드 하에서 HBSS의 45 mL에 10% 태아 소 혈청 (FBS)의 5 mL을 추가하여 트립신 스톱 솔루션 (TSS)의 50 mL을 준비하십시오. 사용할 때까지 +4°C에서 보관하십시오.
- 멸균 후드 하에서 10% FBS와 0.5% 페니실린 및 스트렙토마이신(펜/스트렙)으로 보충된 덜베코의 변형된 독수리 배지(DMEM)를 사용하여 250 mL의 덜베코 변형 독수리 배지를 사용하여 섬유아세포 분리(I-DMEM)를 준비합니다. 사용할 때까지 +4°C에서 보관하십시오.
- 0.1% FBS와 0.5% 펜/스트렙을 무균 후드 로 보충한 250 mL의 DMEM을 사용하여 섬유아세포 동기화(S-DMEM)를 위해 DMEM을 준비합니다. 사용할 때까지 +4°C에서 보관하십시오.
2. 인간 진피 섬유아세포의 분리
참고: 아래에 보고된 2.1단계에서 2.3단계는 멸균 후드 아래에서 수행해야 합니다. 직경 약 0.8 cm를 측정하는 원통형 샘플은 대강 1에서 2 x 106 섬유아세포를 산출합니다.
- HBSS 용액으로 100mm 접시에 복부에서 갓 얻은 인간의 피부 샘플을 씻으소서. 부드럽게 흔들어 혈액과 기타 생물학적 액체를 제거하십시오. 단계를 세 번 반복하여 각 세척시 HBSS 용액과 플레이트를 교체합니다.
- 샘플을 100mm 플레이트에 놓고 미세한 집게와 가위를 사용하여 머리카락과 지방을 제거하고 메스로 해부하여 흉터, 더러운 (예 : 피부펜으로 도면으로 인한 것) 또는 화상 부위를 피하기 위해 2mm x 1mm 조각 (총 16 개의 조각)을 얻습니다. 조직의.
- 각 35mm 접시에 4개의 작은 조각을 넣고 멸균 된 22mm x 22mm 커버 유리로 덮습니다. 미세 집게를 통해 조정합니다. I-DMEM의 1.5 mL를 추가합니다.
- 약 15일 동안 또는 세포가 85% 합류에 도달할 때까지 37°C에서 5%CO2로 플레이트를 배양합니다. 배양 배지를 3일마다 변경하고 매일 거꾸로 된 상 대비 현미경을 사용하여 세포의 성장을 확인합니다.
3. 인간의 피부 섬유 아세포의 확장
참고: 아래에 보고된 단계는 인큐베이터에서 수행되는 단계를 제외하고 멸균 후드에서 수행해야 합니다.
- 커버 안경을 미세 한 집게로 들어 올려 100mm 접시 에 거꾸로 놓고 1 x 멸균 PBS로 씻으십시오.
- 샘플의 조각을 제거하고 1x 멸균 PBS로 플레이트를 씻어 폐기하십시오.
- 1x PBS를 제거하고 트립신-EDTA(에틸렌디아미네테트라아세트산)의 3 mL및 1 mL을 추가하여 각각 100mm 접시와 35mm 접시에 넣은 안경을 덮습니다. 37 °C에서 5 %CO2로5 분 동안 배양하십시오.
- 각 35mm 접시에 100mm 접시에 5 mL의 TSS와 2 mL의 TSS를 추가하여 트립시니화를 차단합니다. 현탁액을 15 mL 멸균 튜브로 수집하고, 400 x g에서 4°C에서 원심분리기를 5분 동안 수집합니다.
- 상급자를 흡인하고 I-DMEM의 12 mL에서 펠릿을 다시 일시 중단합니다. 셀 서스펜션을 각 60mm 플레이트에 대해 3 mL aliquots로 분할합니다.
- 37 °C에서 5 %CO2로배양하십시오. 매일 매체를 변경합니다. 75%의 합류에 도달할 때까지 배양에 세포를 유지하십시오.
- 플레이트에서 배지를 흡인하고 1x PBS로 빠르게 세척합니다.
- 회절(3.3단계 및 3.4단계)을 3회 반복하여 4항에서 세포를 얻었다. 각 60mm 접시에 트립신-EDTA 1.5 mL과 TSS 3 mL을 사용하십시오. 셀을 1:3으로 분할합니다.
- I-DMEM을 S-DMEM으로 대체하여 세포를 동기화하고 37 °C에서 48 시간 동안 배양하여 5 %CO2로배양하십시오.
- 다음을 준비합니다(셀 동기화 중).
- 5.0 mL의 FBS와 0.5 mL의 L-글루타민을 44.5 mL의 고급 DMEM(A-DMEM)에 첨가하여 섬유아세포 팽창 배지를 준비하고+ 4°C에 저장한다.
- 9개의 멸균 RNase-free 튜브각각에 다음을 결합하여 섬유아세포 재프로그래밍을 위한 총 NM-RNA-리프로그래밍 칵테일을 준비합니다: OSKMNL NM-RNA의 32 μL, EKB NM-RNA의 24 μL, NM-microRNAs의 5.6 μL (9 개의 양현에 대한 최종 부피).
- 섬유아세포 재프로그래밍을 위한 총 NM-RNA-리프로그래밍 칵테일의 각 튜브를 멸균, RNase-free 튜브에서 4개의 15.4 μL 일회용 양상으로 나누고 -80°C(36개의 aliquots에 대한 15.4 μL 최종 부피)에 보관합니다.
4. iPSCs에 진피 섬유 아세포의 재 프로그래밍
- 일 0: 셀 시딩
참고: 4.1.1단계에서 4.1.3단계, 4.1.8~4.1.9단계는 멸균 후드하에서 수행해야 합니다. 지하 멤브레인 매트릭스 (BMM) 젤은 실온에서 빠르게 겔화됩니다. 따라서 냉장고에서 밤새 얼음에 BMM을 해동하고, 얼음 차가운 혈청이없는 매체로 희석하고 미리 냉각 된 파이펫, 팁 및 튜브를 사용하는 것이 좋습니다.- 100 μL의 BMM으로 각 웰을 코팅하여 24웰 플레이트를 준비하고 세포를 파종하기 전에 37°C에서 적어도 1시간 동안 배양한다.
- 배양 세포와 플레이트에서 배지를 흡인하고 신속하게 1x PBS로 세척합니다.
- 5단계에서 세포를 얻기 위해 트립시니화(단계 3.3 및 3.4단계)를 반복한다. 상월체를 흡인하고 적절한 부피의 섬유아세포 팽창 배지에서 펠릿을 재중단시켰다(단계 3.10 참조).
- 70 % 알코올로 혈전계를 준비하고 청소하십시오.
- 1.5 mL 튜브에 10 μl의 트리판 블루와 10 μL의 셀 서스펜션을 부드럽게 혼합하여 용액을 준비하고 실온에서 1-2 분 동안 배양합니다. 5분 이상 배양하지 않도록 주의하십시오.
- 용액의 피펫 10 μL을 혈세포계내로 하여 역상 대비 현미경의 무대에 배치하여 계산한다. 실행 불가능한 세포는 청색이되고, 생존 가능한 세포는 얼룩이 없을 것입니다.
- 혈세포계 챔버의 적어도 2 제곱에서 세포를 계산합니다. 다음 계산을 적용하여 총 셀 수를 구합니다.
셀 의 총 수 = (계산 된 셀 / 제곱 수의 총 수) x 2 x 10 x 셀 현탁액의 총 볼륨 - 섬유아세포의 500 μL당 2.5 x 104 세포의 밀도를 얻기 위해 희석을 수행하여, 총 계수 된 세포 수에 기초하여. 적절한 부피의 섬유아세포 팽창 배지에서 펠릿을 다시 중단시다.
- 피펫 500 μL의 셀 현탁액을 24웰 플레이트의 각 웰내로. 37°C 및 5%CO2에서밤새 세포를 배양한다.
- 1일차: 트랜스펙션
참고: 모든 작동 표면 및 소모품(예: 장갑, 병, 멸균 후드 표면, 파이펫터)은 절차를 시작하기 전에 RNase를 제거하기 위한 세척제로 세척해야 합니다. 멸균 후드에서 4.2.2, 4.2.4-4.2.8 단계를 수행합니다.- 37 °C 수조에서 제노 프리, 무혈청, 저성장 인자 인간 ESC / iPSC 배양 배지 (XF / FF 배양 배지)를 따뜻하게하십시오.
- 각 우물에서 오래된 배지를 제거하고 미리 데운 XF/FF 배양 배지 500 μL로 교체하십시오.
- 37°C에서 5%CO2 미만에서 6시간 이상 배양한다.
- 실온에서 총 NM-RNA 리프로그래밍 칵테일의 5 개의 15.4 μL aliquots를 해동 한 다음 얼음위에 놓습니다.
- 각 알리쿼트에 234.6 μL의 환원 혈청 배지를 넣고 부드럽게 피펫을 3-5회 첨가하고 각 배지를 TUBE A(RNA + 감소-혈청 배지)로 라벨을 붙입니다.
- 라벨 5 멸균, RNase-free 0.5 mL 튜브를 TUBE B로 혼합하고 합성 siRNA 형질감염 시약 6 μL을 244 μL의 감소 된 혈청 배지 (RNA-트랜스펙션 시약 + 환혈성 혈청 배지)와 혼합합니다.
- 각 튜브 B의 내용물을 TUBE A 드롭와이즈에 첨가합니다(NM-RNA 형질감염 복합액의 최종 부피를 500 μL 획득). 튜브의 바닥을 눌러 혼합합니다. 실온에서 15분 동안 배양합니다.
- 500 μL ~ 4개의 웰(총 20개의 웰에 도달하기 위해)의 5개의 aliquots에서 NM-RNA 형질감염 복합용 액액 125μL을 추가하고 플레이트를 기울이고 배지에 파이펫팅을 합니다. 부드럽게 흔들어 서 섞으세요. 나머지 4개의 웰을 참조로 사용합니다.
- 37 °C에서 15 시간 동안 배양, 5 %CO2.
- 2-4일: 트랜스펙션 완료
- 매체를 흡인합니다. 멸균 후드 아래 1일째와 같이 형질전환 절차를 반복합니다.
- 5-10일: 미디어 변경
- 배지를 흡인하고 멸균 후드 아래에서 신선하고 미리 데운 XF/FF 배양 매체와 교환합니다.
- 37 °C, 5%CO2에서밤새 배양한다.
- 상 대비 현미경으로 매일 모니터링하는 iPSC 콜로니의 형성을 관찰할 때까지 배양하십시오.
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Representative Results
프로토콜의 목적은 NM-RNA에 기초한 비통합 재프로그래밍 방법을 사용하여 복부 피부로부터 분리된 진피 섬유아세포를 재프로그래밍하여 특정 인자의 발현을 유도하는 것이었다. 이러한 목표를 달성하기 위해, 인간 진피 섬유아세포는 배턱 수술을 받은 환자의 피부 표본으로부터 분리되었고 iPSCs는 NM-RNA 및 마이크로RNA 기술을 결합한 상업적 기성 용 재프로그래밍 키트에 의해 Oct4, Sox2, Klf4, CMyc, Nanog, Lin28 리프로그래밍 인자 및 E3, K3, B18 면역 회피 인자를 도입하여 생성되었다. 프로토콜의 타임라인은 그림 1에요약되어 있습니다.
인간 섬유아세포는 배양 1주일 이내에 복부 피부 의 샘플에서 자랐으며(그림2A)2주 이내에 85% 합류에 도달하였다(그림2B). 세포는 플라스틱 배양 접시에 접착제 성장을 특징으로하고 이들의 형태는 길쭉한 스핀들 모양(그림 2C)에서평평하고 별 모양으로 다양하였다(도 2D). 섬유아세포 형태와 배양내의 배열은 BMM에 파종한 후 극적으로 변화하였고, 그들은 길쭉한 형태를 획득하고 얇은 분지 구조를 형성하도록 배열되었다(도3A). 작은 식민지는 첫 번째 형혈에서 1 일째에 배양에서 이미 볼 수 있었다(그림 3B)그들의 크기는 시간이 지남에 따라 점진적으로 성장, 그 수는 7 일까지 증가하고 다음 날 사이에 안정적으로 남아있는 동안 7 일 과 14(그림 3C,D),아마 더 큰 식민지를 형성하기 위해 병합 작은 식민지의 결과로.
재프로그래밍 절차는 항생제없는 매체를 사용하여 수행되기 때문에 미생물 오염이 주요 문제이며 멸균 조건이 보장되지 않는 경우(그림 4)오염을 방지하기 위한 표준 절차를 채택하십시오 (예 : 장갑 착용, 모든 표면에서 먼지 제거, 70 % 에탄올로 모든 표면 및 장비를 청소하고, 발견되지 않은 세포 배양 단계로 말하는 것을 피하십시오).
그림 1: 프로토콜 타임라인. 복부 피부에서 인간 섬유아세포의 격리 및 재프로그래밍의 연대표. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 진피 섬유아세포의 격리 및 배양. 피부 파편(A)에서섬유 아세포의 대표적인 이미지. 섬유아세포는 약 14일(B)에 합류하여 스핀들형(C)과 별모양(D) 표현형을 보였다. 피부 조각은 흰색 별으로 표시됩니다. 배율 막대 = 200 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 피부 섬유아세포 재프로그래밍 진행. BMM에 시드된 세포는 배열 및형태(A)에서현저한 변화를 보였다. iPSCs의 작은 콜로니는 첫 번째 형질감염후24 시간 까지 형성되었으며, 그 크기는 7 일째(C)및 14(D)에서점진적으로 증가했으며, 그 수는 1 일째와 7 일 사이에 증가했지만 첫 번째 형질 감염에서 7 일과 14 일 사이에 안정적으로 유지되었습니다. 배율 막대 = 500 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 재프로그래밍 절차 중 미생물 오염. 상 대비 현미경 을 사용하여 대표적인 이미지는 재프로그래밍 절차 동안 섬유아세포의 미생물 오염을 나타낸 다. 배율 막대 = 500 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
iPSCs는 재생 의학 응용 분야에서 가장 유망한 세포 후보로 빠르게 부상하고 있으며 질병 모델링 및 약물검사를위한대단히 유용한 도구로3,8. 여기에 제시된 프로토콜은 특정 장비 또는 리프로그래밍 기술에 대한 이전의 경험이 필요하지 않은 간단하고 효율적인 절차로 피부 펀치 생검의 크기를 갖는 샘플로부터 인간 iPSCs의 생성을 설명합니다.
도금 밀도 및 증식 속도 영향 재프로그래밍 효율성으로 성공 확률을 높이기 위해 섬유아세포 분리 및 배양을 최적화하는 것이 가장 중요합니다. 또한, 최근에는 진피 섬유아세포가 리프로그래밍 기술에 다르게 반응하고, 구체적으로는 복부 영역의 피부로부터 분리된 섬유아세포가 다른 신체 부위로부터 분리된 진피 섬유아세포보다 더 쉽고 용이하게 재프로그래밍된다는 보고가있다 18. 따라서, 세포 증식속도에 기초하여 도금 밀도를 재프로그래밍하고 정의하기 위해 체세포를 정확하게 선택하는 것이 중요하다. 이 목적을 위해, 본 프로토콜은 또한 복부 피부에서 진피 섬유아세포를 분리하는 방법과 절차를 용이하게하고 가속화하기 위해 시험관 내에서 전파하는 방법에 대해 지시합니다.
재프로그래밍에 앞서, 섬유아세포는 세포기억(18)을 지우기 위해 통로 5에 도달하기 위해 전파되었고, 통과가 만능상태(19)의유도를 가속화할 수 있다는 보고된 증거를 준수한다. 더욱이, 우리의 경험에 따르면, 배양에 있는 섬유아세포는 가변 증식 특성을 전시하고, 따라서 우리는 섬유아세포를 동기화하고 세포 집단에 있는 가변성을 감소시키기 위하여 추가 단계를 소개하여 프로토콜을 수정했습니다.
야마나카와 톰슨의접근법5,6에서기인하는 재프로그래밍 요인의 조합을 소개하는 상업적인 NM-RNAs 기지를 둔 키트를 사용하여, mRNA 기지를 둔 재프로그래밍20를향상하기 위하여 입증된 miRNA와 더불어, 인간 진피 섬유아세포는 iPSC에 성공적으로 재프로그래밍될 수 있고 작은 식민지는 첫번째 transfed 의 24 시간 후에 일찌기 명백해집니다. mRNA 기지를 둔 재프로그래밍의 주요 이점은, 실제로, 세포의 낮은 수의 아주 낮은 aneuploidy 비율 및 재생 의학에서 사용을 위해 안전한 이 방법으로 생성된 iPSCs를 만드는 통합의 완전한 부재와 더불어20를 다시 프로그램될 때조차, 식민지의 초기 출현입니다. 더욱이, 이 프로토콜에 사용되는 상용 키트는 세포독성 및 면역원성 NM-RNAs21,22에의한 세포 사멸을 방지함으로써 리프로그래밍의 효율을 향상시키는 것으로 알려진 면역조절 인자를 공동 전달한다.
리프로그래밍에 사용되는 키트는 6웰 멀티웰 플레이트용으로 설계되었지만, 우리는 세포 밀도를 최적화하고 24웰 멀티웰 플레이트의 활용을 위해 시약의 부피를 조정하여 피부 펀치 생검으로부터 인간 iPSC 생성에 효과적인 프로토콜을 만듭니다. 더욱이,O2 대조군을 가진 조직 배양 인큐베이터에 대한 필요성이 여러저자(20,23)에 의해 보고되고 있지만 키트 제조사에 의해 권장되며, 여기에 기술된 프로토콜에 따라 우리는 표준 5%CO2 인큐베이터에서 복부 피부로부터 인간 진피 섬유아세포를 재프로그래밍하였다. 따라서, 절차는 대기(21%O2)또는 저산소(5%O2)배양 조건에 대한 필요 없이 임의의 세포 배양 실험실에서 수행될 수 있지만, 이들은 리프로그래밍효율(24,25)을더욱 향상시킬 수 있다.
그럼에도 불구하고, 우리는 연구 목적으로 사용될 수있는 작은 피부 표본 iPSCs에서 파생시키기 위해 비 인간 동물 유래 시약을 사용했습니다. 가장 매력적인 응용 프로그램은 조직 과 장기의 재생을위한 것이지만, iPSCs는 다른 질병을 모델링하는 데 사용되어 왔으며 둘 다 근본적인 분자 메커니즘을 조사하고 특정 약물 및치료법을 개발3,26.
놀랍게도, 적절한 제노 프리 시약에 대한 동물 유래 시약을 대체하는 동일한 프로토콜은 임상 사용을 보증하는 완전한 xeno-free 배양 환경에서 성인 인간 섬유아세포의 iPSC로 재프로그래밍을 허용합니다.
그러나 무거운 워크로드를 고려해야 합니다. 우리의 의견으로는, 주말 동안 수행해야 하는 단계를 포함하여 실험을 신중하게 미리 계획하고 동기화 단계 동안 모든 형질 감염 시약을 준비하는 것이 중요합니다. 실제로, 형질감염은 4일 동안 매일 수행되어야 하며, 그 후, 세포는 매일 모니터링되어야 하며 배지는 매일 교체되어야 한다.
또한, iPSC 식민지의 정확한 식별은 형태학적 기준에 의해서만 근거할 수 없습니다. 따라서, 새로 유래된 iPSCs는 세포 및 분자 분석을 통해 다중 다능성 마커의 발현을 검색하는 것을 특징으로 할 필요가 있다. 널리 받아들여지는 마커는 NANOG, OCT4, SOX2, TRA-1-60, TRA-1-81 및 SSEA4를 포함하며, 이는 면역세포화학적 분석 및 반정량적 또는 정량적 RT-PCR을 이용한 유전자 발현 분석에 의해 식별될 수 있다. 알칼리성 인산화효소 활성이 다능성 줄기 세포에서 업조절되는 것으로 나타났기 때문에, 이러한 효소 활성의 검출은 iPSCs를 식별하고재프로그래밍(27,28)의발생을 확인하기 위해 용이하게 수행될 수 있다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
저자는 인정이 없습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL serological pipet | Falcon | 357551 | Sterile, polystyrene |
| 100 mm plates | Falcon | 351029 | Treated, sterile cell culture dish |
| 15 mL sterile tubes | Falcon | 352097 | Centrifuge sterile tubes, polypropylene |
| 24-well plates | Falcon | 353935 | Clear, flat bottom, treated multiwell cell culture plate, with lid, sterile |
| 25 mL serological pipet | Falcon | 357525 | Sterile, polystyrene |
| 35 mm plates | Falcon | 353001 | Treated, sterile cell culture dish |
| 5 mL serological pipet | Falcon | 357543 | Sterile, polystyrene |
| 50 mL sterile tubes | Falcon | 352098 | Centrifuge sterile tubes, polypropylene |
| Advanced DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Gibco | 12491-015 | Store at 2-8 °C; avoid exposure to light |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Sigma- Aldrich | D6429-500ml | Store at 2-8 °C; avoid exposure to light |
| Fetal Bovine Serum | Sigma- Aldrich | F9665-500ml | Store at -20 °C. The serum should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles |
| Hank's Balanced Salt Solution | Sigma- Aldrich | H1387-1L | Powder |
| L-glutamine | Lonza | BE17-605E | Store at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles |
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | INVITROGEN | 13778-030 | Synthetic siRNA Transfection Reagent; store at 2-8 °C |
| Matrigel | CORNING | 354234 | Basement Membrane Matrix, store at -20 °C. Avoid multiple freeze-thaws. |
| Neubauer Chamber | VWR | 631-1116 | Hemocytometer |
| NutriStem XF Culture Medium | Biological Industries | 05-100-1A-500ml | Xeno-free, serum-free, low growth factor human ESC/iPSC culture medium. Store at -20 °C. Upon thawing, the medium may be stored at 2-8 °C for 14 days. Media should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles. |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-062-100ml | Reduced-Serum Medium; store at 2-8 °C; avoid exposure to light |
| Penicillin and Streptomycin | Sigma- Aldrich | P4333-100ml | Store at -20 °C. The solution should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles |
| Potassium Chloride | Sigma- Aldrich | P9333 | Powder |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sigma- Aldrich | P5665 | Powder |
| RNase-free 0.5 mL tubes | Eppendorf | H0030124537 | RNase-free sterile, microfuge tubes, polypropylene |
| RNase-free 1.5 mL tubes | Eppendorf | H0030120086 | RNase-free sterile, microfuge tubes, polypropylene |
| RNaseZAP | INVITROGEN | AM9780 | Cleaning agent for removing RNase |
| Sodium Bicarbonate | Sigma- Aldrich | S5761 | Powder |
| Sodium Chloride | Sigma- Aldrich | S7653 | Powder |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma- Aldrich | 94046 | Powder |
| StemRNA 3rd Gen Reprogramming Kit | Reprocell | 00-0076 | Third Generation NM-RNAs-based Reprogramming Kit for Cellular Reprogramming of Fibroblasts, Blood, and Urine. Store at or below -70 °C. |
| Trypsin-EDTA | Sigma- Aldrich | T4049-100ml | Store at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles |
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