Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Isolering av voksen Human dermal fibroblaster fra abdominal hud og generering av indusert Pluripotent stamceller ved hjelp av en ikke-integrering metode

Published: January 19, 2020 doi: 10.3791/60629
* These authors contributed equally

Summary

Cell omprogrammering krever innføring av nøkkel gener, som regulerer og opprettholder pluripotent celle tilstand. Protokollen beskrevet gjør det mulig dannelsen av indusert Pluripotent stamceller (iPSCs) kolonier fra menneskelig dermal fibroblaster uten viral/integrere metoder, men bruker ikke-modifisert RNAs (NM-RNAs) kombinert med immune Evasion faktorer redusere cellulære forsvar mekanismer.

Abstract

Indusert Pluripotent stamceller (iPSCs) kan betraktes, til dags dato, en lovende kilde til pluripotent celler for forvaltningen av tiden botemiddel sykdommer, for rekonstituering og regenerering av skadde vev og for utvikling av nye legemidler. Til tross for alle fordelene knyttet til bruk av iPSCs, for eksempel lav risiko for avvisning, den minsket etiske problemstillinger, og muligheten til å få dem fra både unge og gamle pasienter uten noen forskjell i deres omprogrammering potensial, problemer med å overvinne er fortsatt mange. Faktisk celle omprogrammering utført med viral og integrere virus kan føre til infeksjoner og innføring av nødvendige gener kan indusere en genomisk ustabilitet i mottaker cellen, svekke deres bruk i klinikken. Spesielt er det mange bekymringer om bruk av c-myC genet, godt kjent fra flere studier for sin mutasjon-inducing aktivitet. Fibroblaster har dukket opp som egnet celle befolkning for mobilnettet omprogrammering som de er enkle å isolere og kultur og høstes av en minimalt invasiv hud punch biopsi. Protokollen som beskrives her gir en detaljert steg-for-steg beskrivelse av hele prosedyren, fra utvalgs behandling for å oppnå cellekulturer, valg av reagenser og forsyninger, rengjøring og forberedelser, til celle omprogrammering ved hjelp av en kommersiell ikke-modifisert RNAs (NM-RNAs)-basert omprogrammering sett. Den valgte omprogrammering Kit tillater en effektiv omprogrammering av menneskelig dermal Fibroblast til iPSCs og små kolonier kan sees så tidlig som 24 timer etter den første transfeksjoner, selv med modifikasjoner med hensyn til standarddata arket. Den omprogrammering prosedyren som brukes i denne protokollen gir fordelen av en trygg omprogrammering, uten risiko for infeksjoner forårsaket av viral vektor-baserte metoder, reduserer cellulære forsvarsmekanismer, og tillater generering av Xeno iPSCs, alle kritiske funksjoner som er obligatoriske for videre kliniske anvendelser.

Introduction

Cell omprogrammering representerer en ny teknologi for å transformere hver somatiske celle i kroppen til en pluripotent stilk cellen, kjent som iPSC1. Muligheten for omprogrammering en voksen somatiske celle tilbake til en pluripotent og udifferensierte staten har overvunnet grensene pålagt av dårlig tilgjengelighet og etiske problemstillinger knyttet til bruk av pluripotent celler, tidligere bare derivable fra menneskelige embryo (embryonale stamceller eller ESC)2,3,4. I 2006 gjennomførte Kazutoshi Takahashi og Shinya Yamanaka en banebrytende studie som oppnådde den første konverteringen av voksne somatiske celler fra huden til pluripotent celler ved kunstig å legge til fire spesifikke gener (Oct4, Sox2, Klf4, c-myC)5. Et år senere, arbeidet utført i Thomson laboratorium førte til vellykket omprogrammering av somatiske celler i iPSCs av Transduction av en annen kombinasjon av fire gener (Oct4, Sox2, Nanog, Lin28)6.

iPSCs tilbyr en rekke muligheter til forskere og forskere i ulike felt, for eksempel regenererende medisin og farmakologi, er en utmerket plattform for å studere og behandle ulike sykdommer sammen med en genotypisk refleksjon av egenskapene til pasienten de er avledet fra. Bruken av iPSCs gir flere fordeler, inkludert: den reduserte risikoen for immunrespons på grunn av en helt autologous opprinnelse av celler; muligheten for å skape et celle bibliotek, et viktig verktøy for å forutsi responsen til nye legemidler og deres bivirkninger, som de er i stand til å kontinuerlig selv fornye og generere ulike celletyper; og muligheten til å utvikle en tilpasset tilnærming for Drug Administration7,8,9.

Ulike teknikker er kjent i dag, for å indusere uttrykk for omprogrammering faktorer og de er inkludert i to hovedkategorier: ikke-viral og viral vektor-baserte metoder10,11,12,13. Ikke-viral metoder inkluderer mRNA transfeksjoner, miRNA infeksjon/transfeksjoner, PiggyBac, minicircle vektorer og episomal plasmider og exosomes10,11,12,13. Viral-baserte metoder inkluderer ikke-integrere virus, slik som Adenovirus, Sendai virus og proteiner, og integrere virus som retrovirus og lentivirus10,11,12,13.

Ifølge flere studier, ingen vesentlige forskjeller har blitt lagt merke til blant disse metodene i forhold til effektiviteten av celle omprogrammering, derav valget av egnet metode strengt avhenger av celletypen som brukes og på påfølgende anvendelser av iPSCs oppnådd14,15. Alle de nevnte metodene viser ulemper, for eksempel Sendai viruset er effektivt på alle celletyper, men krever mye passasjer for å få iPSCs; omprogrammering av episomes er utmerket for blodlegemer, men trenger modifisering av standard kultur forhold for fibroblaster; den PiggyBac metoden kan representere et attraktivt alternativ, men studier i menneskelige celler er fortsatt begrenset og svak10,11,12,13. Exosomes er nano-blemmer fysiologisk utskilles i alle kroppsvæsker av celler. Ifølge nyere studier, er de ansvarlige for intercellulære kommunikasjon og kan ha en rolle i viktige biologiske prosesser, for eksempel celle spredning, migrasjon og differensiering. Exosomes kan transportere og overføre mRNA og miRNA til mottaker celler med en helt naturlig mekanisme, som de deler den samme sammensetningen av cellemembranen16. Derfor er exosomes en lovende ny generasjon teknikk for omprogrammering, men deres potensial til å programmere somatiske celler av innholdet deres er fortsatt under etterforskning. Viral vektorer-baserte metoder bruker virus endret for å formidle omprogrammering gener til mottaker celler. Denne teknikken, til tross for den høye effektiviteten av omprogrammering, er ikke betraktet som sikker, som integrering av viruset i cellen kan være ansvarlig for smitte, teratomer og genomisk ustabilitet17.

Følgende protokoll for å generere iPSCs kolonier kombinerer Yamanaka ' s og Thompson ' s omprogrammering cocktail og er basert på bruk av en metode som krever NM-RNAs og immune Evasion faktorer med mulighet til å utføre den i Xeno-frie forhold. Begrunnelsen for bruken av denne metoden er å spre, innenfor det vitenskapelige samfunnet, en protokoll som tillater en rask, enkel og svært effektiv omprogrammering av voksne menneskelige fibroblaster fra abdominal hud til iPSCs18.

Styrkene til den foreslåtte metoden er faktisk den enkle ytelsen og den korte tiden som trengs for å få iPSCs. Videre metoden unngår cellulære forsvar mekanismer og bruk av viral vektorer, ansvarlig for relevante problemstillinger.

Når det gjelder standardprotokollen, ble følgende endringer gjort: (1) Confluent fibroblaster ble synkronisert ved passering 4 ved å plassere i 0,1% serum for 48 h før trypsinization; (2) Cellular tetthet for kultur og volumet av reagenser ble justert for utnyttelse på en 24-brønn multi-brønn plate i stedet for en 6-brønn plate; (3) omprogrammering eksperimentet ble utført ved hjelp av en 5% CO2 inkubator i stedet for en inkubator med atmosfærisk (21% o2) eller hypoxic (5% o2) forhold.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Prøvene fra menneske vevet ble samlet inn i henhold til Declaration of Helsinki mens de observerte retningslinjene for Universitetssykehuset Federico II. Alle pasienter som er involvert i denne studien, leverte skriftlig samtykke.

1. utarbeidelse av rekvisita og kultur Media

  1. Rengjør og autoklav ett stort par kirurgisk saks, to sett med fin tang, to par microdissecting saks, 1 L steril flaske, 500 mL steril flaske, og en 250 mL steril flaske.
  2. Klargjør 100 mm plater, 60 mm plater, 35 mm plater, en gangs skalpeller, 50 mL sterile rør, 15 mL sterile rør, og en 100 mm glassplate. Oppbevar instrumentene under sterile forhold til de er klare til bruk.
  3. Rengjør og sterilisere 22 mm x 22 mm deksel briller før bruk. For dette stedet dekke briller i en glassplate, dekke dem med 70% etanol og vente i noen sekunder før aspirating etanol. La dekkglassene tørke i en ovn ved 37 ° c og deretter autoklav dem.
  4. Forbered 1 L av Hank ' s balansert saltløsning (HBSS) ved pH 7,4 ved å oppløse kommersielt tilgjengelige pulverisert salter i dobbel destillert sterilt vann og legge 0,35 g av natrium bikarbonat. Steriliseres ved filtrering under en steril hette og oppbevares ved + 4 ° c til bruk.
  5. Forbered 500 mL sterilt 1x fosfat-bufret-saltvann (PBS) ved å oppløse 0,1 g av kalium fosfat enbasisk, 0,1 g kalium klorid, 4,0 g natriumklorid og 0,575 g natrium fosfat dibasic i sterilt dobbelt destillert vann. Kontroller pH-verdien (7,4) og sterilisere under en steril hette ved filtrering. Oppbevares ved + 4 ° c til bruk.
  6. Klargjør 50 mL Trypsin stopp løsning (TSS) ved å tilsette 5 mL av 10% fosterets storfe serum (FBS) til 45 mL HBSS under en steril hette. Oppbevares ved + 4 ° c til bruk.
  7. Forbered Dulbecco ' s modifiserte Eagle medium for Fibroblast isolering (I-DMEM) med 250 mL av Dulbecco ' s modifiserte Eagle medium (DMEM) supplert med 10% FBS og 0,5% penicillin og Streptomycin (penn/strep) under en steril hette. Oppbevares ved + 4 ° c til bruk.
  8. Klargjør DMEM for fibroblaster synkronisering (S-DMEM) med 250 mL DMEM supplert med 0,1% FBS og 0,5% penn/strep under en steril hette. Oppbevares ved + 4 ° c til bruk.

2. isolering av Human dermal fibroblaster

Merk: trinn 2,1 til 2,3 som rapporteres nedenfor, må utføres under en steril hette. En sylindrisk prøve som måler ca 0,8 cm i diameter gir 2 x 106 fibroblaster ved passering 1.

  1. Vask fersk prøven av menneskelig hud fra magen i en 100 mm rett med HBSS løsning. Rist forsiktig for å fjerne blod og andre biologiske væsker. Gjenta trinn tre ganger, endre HBSS-løsningen og platen ved hver vask.
  2. Plasser prøven i en 100 mm plate, Fjern hår og fett ved hjelp av fin pinsett og saks, og analysere den med en skalpell for å få 2 mm x 1 mm fragmenter (for totalt 16 fragmenter) unngå arr, skitne (f. eks, som følge av tegninger med dermographic penn) eller brente områder av vevet.
  3. Plasser 4 små fragmenter i hver 35 mm rett, dekk med et sterilt 22 mm x 22 mm deksel glass. Juster ved hjelp av fine tang. Tilsett 1,5 mL av I-DMEM.
  4. Ruge platene ved 37 ° c i 5% CO2 i ca 15 dager eller til cellene nå 85% samløpet. Endre kultur medium hver 3 dager og sjekk utvekst av celler ved hjelp av en invertert fase-kontrast mikroskop daglig.

3. utvidelse av Human Skin fibroblaster

Merk: trinnene som rapporteres nedenfor, må utføres under en steril hette, bortsett fra trinnene som utføres i inkubator.

  1. Løft dekselet brillene med fin tang, legg dem opp-ned i 1 100 mm parabol og vask med 1x steril PBS.
  2. Fjern fragmenter av prøvene og kast dem, vask platene med 1x steril PBS.
  3. Fjern 1x PBS og tilsett 3 mL og 1 mL Trypsin-EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) for å dekke briller plassert i 100 mm parabol og 35 mm retter, henholdsvis. Ruge i 5 min ved 37 ° c med 5% CO2.
  4. Blokker trypsinization ved å legge til 5 mL TSS til 100 mm fatet og 2 mL TSS til hver 35 mm rett. Samle suspensjonen i 15 mL sterile rør, sentrifuger ved 400 x g ved 4 ° c i 5 min.
  5. Aspirer supernatanten og resuspend pellet i 12 mL av I-DMEM. Del celle fjæringen i 3 mL alikvoter for hver 60 mm plate.
  6. Ruge ved 37 ° c med 5% CO2. Endre mediet daglig. Hold cellene i kulturen til de når en samløpet av 75%.
  7. Aspirer mediet fra platene og vask raskt i 1x PBS.
  8. Gjenta trypsinization (trinn 3,3 og 3,4) tre ganger for å få celler i avsnitt 4. Bruk 1,5 mL Trypsin-EDTA og 3 mL TSS i hver 60 mm rett. Del cellene 1:3.
  9. Synkroniser cellene ved å erstatte i-DMEM med S-DMEM og ruge for 48 h ved 37 ° c med 5% CO2.
  10. Klargjør følgende (under celle synkroniseringen).
    1. Klargjør Fibroblast ekspansjons medium ved å tilsette 5,0 mL FBS og 0,5 mL L-glutamin til 44,5 mL avansert DMEM (A-DMEM), oppbevares ved + 4 ° c.
    2. Forbered total NM-RNA-omprogrammering-cocktail for Fibroblast omprogrammering ved å kombinere følgende i hvert av 9 sterile RNase-frie rør: 32 μL av OSKMNL NM-RNA, 24 μL av EKB NM-RNA, 5,6 μL av NM-microRNAs (61,6 μL slutt volum for 9 alikvoter).
    3. Dividere hvert rør med 61,6 μL av total NM-RNA-omprogrammering cocktail for Fibroblast omprogrammering i fire 15,4 μL en gangs alikvoter i sterile, RNase-frie rør og oppbevares ved-80 ° c (15,4 μL endelig volum for 36 alikvoter).

4. omprogrammering av dermal fibroblaster til iPSCs

  1. Dag 0: celle seeding
    Merk: trinn 4.1.1 til 4.1.3 og 4.1.8 til 4.1.9 må utføres under en steril hette. Kjeller membran matrise (BMM) gels raskt ved romtemperatur. Derfor er det sterkt anbefalt å tine BMM over natten på is i et kjøleskap, fortynne det med iskaldt serum fritt medium og bruke pre-avkjølt pipets, tips og rør.
    1. Forbered en 24-brønn plate ved å dekke hver brønn med 100 μL av BMM og ruge i minst 1 time ved 37 ° c før seeding cellene.
    2. Aspirer mediet fra tallerkener med celler i kultur og vask raskt i 1x PBS.
    3. Gjenta trypsinization (trinn 3,3 og 3,4) for å hente celler i avsnitt 5. Aspirer supernatanten og resuspend pellet i et passende volum av fibroblaster ekspansjons medium (se trinn 3,10).
    4. Forbered og rengjør hemocytometer med 70% alkohol.
    5. Forbered en løsning ved å blande forsiktig 10 μL av trypan blå og 10 μL av celle fjæring i 1,5 mL rør, og ruge i 1 – 2 min ved romtemperatur. Vær forsiktig så du ikke ruge lenger enn 5 min.
    6. Pipetter 10 μL av oppløsningen i hemocytometer plasserer den på scenen i et omvendt fase kontrast mikroskop for å telle. Ikke-levedyktige celler vil være blå, mens levedyktige celler vil bli unstained.
    7. Tell cellene i minst 2 kvadrater av hemocytometer kammeret. Bruk følgende beregning for å få det totale antallet celler:
      Totalt antall celler = (totalt antall telte celler/kvadrat tall) x 2 x 10 x totalt volum av celle fjæring
    8. Utfør en fortynning for å oppnå en tetthet på 2,5 x 104 celle per 500 μL av fibroblaster ekspansjons medium, basert på det totale antallet telte celler. Resuspend pellet i et passende volum av fibroblaster ekspansjons medium.
    9. Pipetter 500 μL av celle oppheng i hver brønn av 24-brønn plate. Ruge celler over natten ved 37 ° c og 5% CO2.
  2. Dag 1: Transfeksjoner
    Merk: alle arbeidsflater og forsyninger (f.eks. hansker, flasker, sterile hette overflater, repetisjonspipetter) må rengjøres med rengjørings reagens for fjerning av RNase før prosedyren startes. Utfør trinn 4.2.2, 4.2.4 – 4.2.8 under en steril hette.
    1. Varm opp Xeno-fri, serum fri, lav vekstfaktor menneskelig ESC/iPSC kultur medium (XF/FF kultur medium) i en 37 ° c vannbad.
    2. Fjern det gamle mediet fra hver brønn og Bytt det ut med 500 μL av forvarmet XF/FF kultur medium.
    3. Ruge ved 37 ° c under 5% CO2 i minst 6 timer.
    4. Tin fem 15,4 μL alikvoter av total NM-RNA omprogrammering-cocktail ved romtemperatur, og plasser den på is.
    5. Tilsett 234,6 μL av redusert serum medium til hver alikvot, forsiktig pipette 3 – 5 ganger og merk hver enkelt som tube A (RNA + redusert-serum medium).
    6. Etikett 5 sterile, RNase-Free 0,5 mL rør som tube B og bland 6 μL av syntetisk siRNA transfeksjoner reagens med 244 μL av redusert serum medium (RNA-transfeksjoner reagens + redusert serum medium).
    7. Legg innholdet i hver TUBE B til et rør A dråpevis (for å oppnå 500 μL endelig volum av NM-RNA transfeksjoner kompleks løsning). Bland ved å trykke på bunnen av røret. Ruge ved romtemperatur i 15 min.
    8. Tilsett 125 μL av NM-RNA-transfeksjoner kompleks løsning fra hver av de fem alikvoter på 500 μL til 4 brønner (for å nå totalt 20 brønner), vippe platen og pipettering dråpevis inn i mediet. Bland ved å rocking forsiktig. Bruk de resterende 4 brønnene som referanse.
    9. Ruge for 15 t ved 37 ° c, 5% CO2.
  3. Dag 2 – 4: Fullfør transfeksjoner
    1. Aspirer mediet. Gjenta transfeksjoner prosedyren som på dag 1 under den sterile hetten.
  4. Dag 5 – 10: medie endringer
    1. Aspirer mediet og Bytt ut med friskt, forvarmet XF/FF kultur medium under en steril hette.
    2. Ruge over natten ved 37 ° c, 5% CO2.
    3. Hold i kulturen til observere dannelsen av iPSC kolonier overvåking daglig av en fase-kontrast mikroskop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Målet med protokollen var å programmere dermal fibroblaster isolert fra abdominal hud ved hjelp av ikke-integrering omprogrammering metode basert på NM-RNAs for å indusere uttrykk for spesifikke faktorer. For å oppnå dette målet, menneskelige dermal fibroblaster ble isolert fra huden eksemplarer av pasienter som gjennomgår mageplastikk kirurgi og iPSCs ble generert innføre Oct4, Sox2, Klf4, cMyc, Nanog, Lin28 omprogrammering faktorer og E3, K3, B18 immune Evasion faktorer av en kommersiell klar til bruk omprogrammering kit som kombinerer NM-RNA og microRNA teknologi. Tidslinjen for protokollen oppsummeres i figur 1.

Human fibroblaster outgrew fra prøver av abdominal hud innen en uke med kultur (figur 2A) og nådde 85% samløpet innen to uker (figur 2B). Celler var preget av lim vekst på plast kultur retter og deres morfologi varierte fra langstrakt og spindel-formet (figur 2C) til flatet og Star-formet (figur 2D). Fibroblast morfologi og ordning i kultur dramatisk endret etter seeding på BMM, da de kjøpte en langstrakt morfologi og arrangert for å danne tynne utvidet strukturer (Figur 3A). Små kolonier var allerede synlige i kulturen på dag 1 fra første transfeksjoner (Figur 3B) og deres størrelse vokste progressivt over tid, mens deres antall økte til dag 7 og deretter forble stabil mellom dag 7 og dag 14 (Figur 3C, D), sannsynligvis som et resultat av mindre kolonier sammenslåing for å danne større kolonier.

Siden omprogrammering prosedyren utføres ved hjelp av antibiotika frie medier, mikrobiell forurensning er et stort problem, og det kan forekomme (Figur 4) hvis sterile forhold ikke er garantert vedta standard prosedyrer for å hindre forurensning (f. eks iført hansker, fjerne støv fra alle overflater, rense alle overflater og utstyr med 70% etanol, unngå å snakke under trinn med avdekket cellekultur plater).

Figure 1
Figur 1: tidslinje for protokoll. Tidslinje for isolering og omprogrammering av menneskelig fibroblaster fra abdominal hud. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: isolering og kultur av dermal fibroblaster. Representative bilder av fibroblaster utvekst fra huden fragmenter (A). Fibroblaster nådde samløpet i ca 14 dager (B) og viste spindel-formet (C) og Star formet (D) fenotype. Hud fragmenter indikeres av en hvit stjerne. Scale bar = 200 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Skin Fibroblast omprogrammering progresjon. Celler seeded på BMM viste en markert endring i ordningen og morfologi (a). Små kolonier av iPSCs dannet så tidlig som 24 h etter den første transfeksjoner (B) og deres størrelse økte gradvis på dag 7 (C), og 14 (D), mens deres antall økte mellom dag 1 og dag 7, men forble stabil mellom dag 7 og 14 fra første transfeksjoner. Scale bar = 500 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: mikrobiell forurensning under omprogrammering prosedyre. Representative bilde ved hjelp av fase-kontrast mikroskopi viser en mikrobiell forurensning av fibroblaster kultur under omprogrammering prosedyren. Scale bar = 500 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

iPSCs er raskt fremstår som den mest lovende celle kandidat for regenererende medisin applikasjoner og som et enormt nyttig verktøy for sykdoms modellering og narkotika testing3,8. Protokollen som presenteres her beskriver generering av menneskelige iPSCs fra en prøve å ha på størrelse med en hud punch biopsi med en enkel og effektiv prosedyre som ikke krever noe spesifikt utstyr eller tidligere erfaring med omprogrammering teknologi.

Det er av primær betydning for å optimalisere Fibroblast isolasjon og kultur for å øke sjansen for suksess, som plating tetthet og spredning rate innvirkning omprogrammering effektivitet. Videre har det nylig blitt rapportert at dermal fibroblaster reagerer forskjellig på omprogrammering teknologi, og spesielt fibroblaster isolert fra huden i mageregionen er lettere og lett omprogrammeres enn dermal fibroblaster isolert fra andre kroppsområder18. Derfor er det viktig å nøyaktig velge somatiske celler for å programmere og definere plating tetthet på grunnlag av celle sprednings hastighet. Til dette målet instruerer den foreliggende protokollen også om hvordan man isolerer dermal fibroblaster fra abdominal hud og hvordan man sprer dem in vitro for å lette og akselerere prosedyren.

Før omprogrammering ble fibroblaster overført for å nå passasje 5 for å slette celle minnet18 og i samsvar med rapporterte bevis for at passaging kunne akselerere induksjon av pluripotent tilstand19. Videre, ifølge vår erfaring, fibroblaster i Kultur utstillingen variable proliferativ egenskaper, slik vi endret protokollen ved å innføre et ekstra trinn for å synkronisere fibroblaster og redusere variasjon i cellen befolkningen.

Ved hjelp av en kommersiell NM-RNAs-basert kit som introduserer en kombinasjon av omprogrammering faktorer som følge av Yamanaka ' s og Thomson tilnærming5,6, sammen med miRNA som har vist seg å forbedre mRNA-baserte omprogrammering20, kan Human dermal fibroblaster være vellykket omprogrammeres til IPSC og små kolonier blir klart så tidlig som 24 timer etter den første transfeksjoner. De viktigste fordelene med mRNA-baserte omprogrammering er faktisk den tidlige fremveksten av kolonier selv når et lavt antall celler er omprogrammeres20 sammen med en svært lav avvik hastighet og fullstendig fravær av integrasjon som gjør iPSCs generert med denne metoden trygt for en bruk i regenererende medisin. Videre er det kommersielle settet som brukes for denne protokollen co-leverer immunmodulatorer faktorer som er kjent for å forbedre effektiviteten av omprogrammering ved å hindre cellen død forårsaket av cytotoksisk og immunogenic NM-RNAs21,22.

Selv om settet brukes til omprogrammering ble designet for 6-brønn multi-brønn plate, vi optimalisert cellulær tetthet og justert volumet av reagenser for utnyttelse på en 24-brønn multi-brønn plate for å gjøre protokollen effektivt for generering av menneskelige iPSCs fra en hud punch biopsi. Dessuten, selv om behovet for en vev kultur inkubator med O2 kontroll er rapportert av flere forfattere20,23 og anbefalt av Kit produsenten, etter protokollen beskrevet her vi omprogrammeres menneskelig dermal fibroblaster fra abdominal hud i en standard 5% co2 inkubator. Derfor kan prosedyren utføres i en hvilken som helst cellekultur laboratorium uten behov for atmosfærisk (21% o2) eller hypoxic (5% o2) kultur forhold, selv om disse kan ytterligere forbedre omprogrammering effektivitet24,25.

Likevel brukte vi ikke-menneskelige dyr avledede reagenser til å være avledet fra små hud prøver iPSCs som kan brukes til forskningsformål. Selv om det mest attraktive programmet er for regenerering av vev og organer, iPSCs har blitt brukt for modellering ulike sykdommer og deretter både undersøke på underliggende molekylære mekanismer og utvikle bestemte legemidler og terapier3,26.

Bemerkelsesverdig, ved å erstatte animalsk avledede reagenser for egnede Xeno reagenser, gjør den samme protokollen omprogrammering av voksen humant fibroblaster i iPSCs i et komplett Xeno-fritt kulturmiljø som garanterer deres kliniske bruk.

Den tunge arbeidsbelastningen må imidlertid tas i betraktning. Etter vår mening er det avgjørende å planlegge eksperimentet nøye på forhånd, inkludert trinn som må utføres i helgene, og for å klargjøre alle transfeksjoner reagenser under synkroniserings trinnet. Faktisk skal transfeksjoner utføres hver dag i fire dager, og etterpå må cellene overvåkes hver dag og medium skal skiftes ut på daglig basis.

Videre kan ikke den nøyaktige identifikasjonen av iPSC-kolonier baseres utelukkende på morfologiske kriterier. Derfor, nylig avledet iPSCs må karakteriseres søke etter uttrykk for flere pluripotent markører gjennom cellulære og molekylære analyser. Allment aksepterte markører inkluderer NANOG, OCT4, SOX2, TRA-1-60, TRA-1-81 og SSEA4, som kan identifiseres ved immunocytochemical analyse og ved genuttrykk analyse ved hjelp av semi-kvantitativ eller kvantitativ RT-PCR. Siden alkalisk fosfatase aktivitet har vist seg å være upregulated i Pluripotent stamceller, kan påvisning av slik enzymatisk aktivitet enkelt utføres for å identifisere iPSCs og verifisere forekomsten av omprogrammering27,28.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne har ingen bekreftelser.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mL serological pipet Falcon 357551 Sterile, polystyrene
100 mm plates Falcon 351029 Treated, sterile cell culture dish
15 mL sterile tubes Falcon 352097 Centrifuge sterile tubes, polypropylene
24-well plates Falcon 353935 Clear, flat bottom, treated multiwell cell culture plate, with lid, sterile
25 mL serological pipet Falcon 357525 Sterile, polystyrene
35 mm plates Falcon 353001 Treated, sterile cell culture dish
5 mL serological pipet Falcon 357543 Sterile, polystyrene
50 mL sterile tubes Falcon 352098 Centrifuge sterile tubes, polypropylene
Advanced DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) Gibco 12491-015 Store at 2-8 °C; avoid exposure to light
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) Sigma- Aldrich D6429-500ml Store at 2-8 °C; avoid exposure to light
Fetal Bovine Serum Sigma- Aldrich F9665-500ml Store at -20 °C. The serum should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles
Hank's Balanced Salt Solution Sigma- Aldrich H1387-1L Powder
L-glutamine Lonza BE17-605E Store at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent INVITROGEN 13778-030 Synthetic siRNA Transfection Reagent; store at 2-8 °C
Matrigel CORNING 354234 Basement Membrane Matrix, store at -20 °C. Avoid multiple freeze-thaws.
Neubauer Chamber VWR 631-1116 Hemocytometer
NutriStem XF Culture Medium Biological Industries 05-100-1A-500ml Xeno-free, serum-free, low growth factor human ESC/iPSC culture medium. Store at -20 °C. Upon thawing, the medium may be stored at 2-8 °C for 14 days. Media should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles.
Opti-MEM Gibco 31985-062-100ml Reduced-Serum Medium; store at 2-8 °C; avoid exposure to light
Penicillin and Streptomycin Sigma- Aldrich P4333-100ml Store at -20 °C. The solution should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles
Potassium Chloride Sigma- Aldrich P9333 Powder
Potassium Phosphate Monobasic Sigma- Aldrich P5665 Powder
RNase-free 0.5 mL tubes Eppendorf H0030124537 RNase-free sterile, microfuge tubes, polypropylene
RNase-free 1.5 mL tubes Eppendorf H0030120086 RNase-free sterile, microfuge tubes, polypropylene
RNaseZAP INVITROGEN AM9780 Cleaning agent for removing RNase
Sodium Bicarbonate Sigma- Aldrich S5761 Powder
Sodium Chloride Sigma- Aldrich S7653 Powder
Sodium Phosphate Dibasic Sigma- Aldrich 94046 Powder
StemRNA 3rd Gen Reprogramming Kit Reprocell 00-0076 Third Generation NM-RNAs-based Reprogramming Kit for Cellular Reprogramming of Fibroblasts, Blood, and Urine. Store at or below -70 °C.
Trypsin-EDTA Sigma- Aldrich T4049-100ml Store at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lo, B., Parham, L. Ethical Issues in Stem Cell Research. Endocrine Reviews. 30 (3), 204-213 (2009).
  2. Wong, W. T., Sayed, N., Cooke, J. P. Induced Pluripotent Stem Cells: How They Will Change the Practice of Cardiovascular Medicine. Methodist Debakey Cardiovasc Journal. 9 (4), 206-209 (2013).
  3. Singh, V. K., Kalsan, M., Kumar, N., Saini, A., Chandra, R. Induced pluripotent stem cells: applications in regenerative medicine, disease modeling, and drug discovery. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 2 (2015).
  4. Zacharias, D. G., Nelson, T. J., Mueller, P. S., Hook, C. C. The science and ethics of induced pluripotency: what will become of embryonic stem cells. Mayo Clinic Proceedings. 86 (7), 634-640 (2011).
  5. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  6. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
  7. Yu, Y., Wang, X., Scott, L., Nyberg, S. L. Application of Induced Pluripotent Stem Cells in Liver Diseases. Journal Cell Medicine. 3 (3), 997-1017 (2014).
  8. Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform. Journal Cardiovascular Pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).
  9. Gupta, S., Sharma, V., Verma, R. S. Recent advances in induced pluripotent stem cell (ipsc) based therapeutics. Journal of Stem Cell Research and Therapy. 3 (3), 263-270 (2017).
  10. Andargie, A., Tadesse, F., Shibbiru, T. Review on Cell Reprogramming: Methods and Applications. Journal of Medicine, Physiology and Biophysics. 25, 2422 (2016).
  11. Warren, L., et al. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells using synthetic modified mRNA. Cell Stem Cell. 7 (5), 618-630 (2010).
  12. Malik, N., Rao, M. R. A Review of the Methods for Human iPSC Derivation. Methods in Molecular Biology. 997, 23-33 (2013).
  13. Poleganov, M. A., et al. Efficient Reprogramming of Human Fibroblasts and Blood-Derived Endothelial Progenitor Cells Using Nonmodified RNA for Reprogramming and Immune Evasion. Human Gene Therapy. 26 (11), 751-766 (2015).
  14. Brouwer, M., Zhou, H., Kasri, N. N. Choices for Induction of Pluripotency: Recent Developments in Human Induced Pluripotent Stem Cell Reprogramming Strategies. Stem Cell Reviews and Reports. 12, 54-72 (2016).
  15. Revilla, A., et al. Current advances in the generation of human iPS cells: implications in cell-based regenerative medicine. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 10, 893-907 (2016).
  16. Lee, Y. S., et al. Exosome-Mediated Ultra-Effective Direct Conversion of Human Fibroblasts into Neural Progenitor-like Cells. ACS Nano. 12 (3), 2531-2538 (2018).
  17. Bayart, E., Cohen-Haguenauer, O. Technological overview of iPS induction from human adult somatic cells. Current Gene Therapy. 13 (2), 73-92 (2013).
  18. Sacco, A. M., et al. Diversity of dermal fibroblasts as major determinant of variability in cell reprogramming. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (6), 4256-4268 (2019).
  19. Shan, Z. Y., et al. Continuous passages accelerate the reprogramming of mouse induced pluripotent stem cells. Cellular Reprogramming. 16 (1), 77-83 (2014).
  20. Schlaeger, T. M., et al. A comparison of non-integrating reprogramming methods. Nature Biotechnology. 33 (1), 58-63 (2015).
  21. Drews, K., Tavernier, G., Demeester, J., et al. The cytotoxic and immunogenic hurdles associated with non-viral mRNA-mediated reprogramming of human fibroblasts. Biomaterials. 33, 4059-4068 (2012).
  22. Beissert, T., et al. Improvement of In Vivo Expression of Genes Delivered by Self-Amplifying RNA Using Vaccinia Virus Immune Evasion Proteins. Human Gene Therapy. 28 (12), 1138-1146 (2017).
  23. Mathieu, J., et al. Hypoxia induces re-entry of committed cells into pluripotency. Stem Cells. 31 (9), 1737-1748 (2013).
  24. Wang, Y., et al. Hypoxia Enhances Direct Reprogramming of Mouse Fibroblasts to Cardiomyocyte-Like Cells. Cellular Reprogramming. 18 (1), 1-7 (2016).
  25. Deng, Y., et al. Hypoxia enhances buffalo adipose-derived mesenchymal stem cells proliferation, stemness, and reprogramming into induced pluripotent stem cells. Journal of Cellular Physiology. 234 (10), 17254-17268 (2019).
  26. Karagiannis, P., et al. Induced Pluripotent Stem Cells and Their Use in Human Models of Disease and Development. Physiological Reviews. 99 (1), 79-114 (2019).
  27. Maherali, N., Hochedlinger, K. Guidelines and techniques for the generation of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 3 (6), 595-605 (2008).
  28. Asprer, J. S., Lakshmipathy, U. Current methods and challenges in the comprehensive characterization of human pluripotent stem cells. Stem Cell Reviews and Reports. 11 (2), 357-372 (2015).

Tags

Bioteknologi indusert Pluripotent stamceller (iPSCs) celle omprogrammering dermal fibroblaster ikke-modifisert RNAs NM-RNAs integrasjon-fri metode cellekultur menneskelig regenererende medisin
Isolering av voksen Human dermal fibroblaster fra abdominal hud og generering av indusert Pluripotent stamceller ved hjelp av en ikke-integrering metode
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Belviso, I., Sacco, A. M., Romano,More

Belviso, I., Sacco, A. M., Romano, V., Schonauer, F., Nurzynska, D., Montagnani, S., Di Meglio, F., Castaldo, C. Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method. J. Vis. Exp. (155), e60629, doi:10.3791/60629 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter